Ao 1944

P R O D U C C I O N

D E

A N T I B I O T I C O S

Ao 2000

Los ANTIBIOTICOS son los METABOLITOS microbianos mas importantes

desde el punto de vista MEDICO Y ECONOMICO.

* Produccin actual aproximada de 100.000 Ton/ anuales con un valor de 5 billones de U$S (datos del ao 2000)

Es el ejemplo mas exitoso de la unin entre ciencia bsica y aplicada. Reinvencion de la tecnologia de las fermentaciones * Marca el nacimiento de la moderna industria farmacutica.

Causa principal del aumento de la longevidad y de las expectativas de vida

Principales productos de fermentacion: usos y volumenes de produccionProduct Production Ethanol Citric acid Bakers yeast Glutamic acid (monosodium glutamate) Lysine Lactic acid 50000 Food, Glucono-- l a c t o n e

[t/a] 24000000 450000 300000 270000 90000 50000 50000 100000 10000

Use Food, fuel, chemistry Food (acidfier), pharma, industry (complex formation) Food Food Aminal feed Food, pharma pharma, chemistry (complex formation with Ca2+) pharma oil prodution, emulsifiers, gelling agents, etc.

Antibiotics Biopolymers

a) 12000 antibiotics have been discovered as natural productsb) 150 have been approved for medical use c) Antibiotics are typically too complex to be synthesized fully by chemical synthesis (CONCEPT IN REVISION)

d) Relatively limited number of industrially relevant strains produce antibiotics

Microorganismos productores

Hongos filamentosos (Eumycetes) : Producen el 25 % de los antibioticos conocidosGneros principales: Aspergillus , Monilia, Penicillum, Cephalosporium

.

Penicillum

Aspergillus .

Bacterias: Producen el 75 % de los antibioticos conocidos Actinomycetes : Generos Streptomyces y Nocardia (65%) Pseudomonales y Bacillus (10%)

Caractersticas de los metabolitos secundarios o especiales

No esenciales para el crecimiento Ventajas para la sobrevida en ambientes competitivos Pueden contener precursores no usuales (D-Aminoacidos, etc) Solo en algunos gneros microbianos Se forman por reacciones poco especificas Biosntesis compleja, multienzimatica, Compatibles solo con una baja velocidad de crecimiento. Su produccin esta ligada a condiciones no balanceadas. Rendimientos bajos Estructuras qumicas complejas y diversas

Algunos antibiticos producidos comercialmente Antibitico Bacitracina Mtodo de produccin Microorganismo Fermentacin

Bacillus licheniformis Cefalosporina Fermentacin y Cephalosporium semisintesis sp. Cloramfenicol Sntesis qumica --------------Eritromicina Fermentacin aerbica Streptomyces sumergida erythreus Neomicina Fermentacin Streptomyces fradiae Nistatina Fermentacin con Streptomyces control de oxigeno noursei Penicilinas Fermentacin y Penicillium semisintesis chrysogenum Polimixina Fermentacin Bacillus polymyxa Estreptomicina Fermentacin Streptomyces griseus Tetraciclinas Fermentacin directa o Streptomyces modificacin qumica rimosus, flavus, de la clortetraciclina aureofaciens, antibioticus

Los antibiticos beta-lactamicos son los mas importantes y constituyen el 65% delH Estructura general de las penicilinas R1 N C5

mercado.S12 3

CH3 CH3 O C O-

N

R1Penicilinas naturales Biosinteticas CH2COOBencilo O CH2 CO O Fenoxiacetato CH2C OOBencilo

O

PenicilinaPenicilina G Penicilina G ------------------Penicilina V

Caractersticas

Sensible a cidos Sensible a -lactamasas Poco activa contra Gram -

-------------------------* Acido resistente

Semi-sinteticas PenGPenicilasa 6APA PHECH COO-

Ampicilina

NH2 (D-)

Acido resistente Mayor espectro Sensible a -lactamasas

6 APA (mtodo qumico)

PheN O

CO CH3

Oxacilina

Acido resistente Mayor espectro Resistente a -lactamasas

carbenicilina

Similar a la ampicilina

BIOSINTESIS DE PENICILINA EN PENICILLUM CHRYSOGENUM

Los precursores son los Aminocidos: L- alfa amino adipato (precursor de Lys) , L- Cys y L- Valina (transformada en la forma D- por una racemasa)

ACV sintetasa (pcb AB)

O2

ISOP sintetasa (pcb C)

(pen DE)

Regulacion de la biosintesis

Lys es un inhibidor de la sntesis de penicilina mutantes regulatorias resistentesa analogos o mutantes de secrecion El agregado de -AA libera dicha inhibicin. La sintesis la enzima aciltransferasa esta ligada a crecimiento

El aadido de precursor de cadena lateral acta como estimulante en la sntesis de penicilina G La sntesis de antibiticos es compatible con una baja velocidad de crecimiento .

Inhibidores de la sintesis: glucosa (represion catabolica) NADPH

Esquema de produccion de penicilina

Penicillum notatum (1943) 20 U/mlscreening

Penicillum chrysogenum NRRL (1951)seleccion de esporos rayos X

U.V.Wis Q 176 (1200 U/ml) Lab. Wyeth

BL3- D10

Lilly

A partir de 1973 comienza un programa de desarrollo y mejoramiento de cepas basado en el conocimiento de la biosintesis de penicilinas: empleo de altas concentraciones de aminoacidos y precursores, cepas que no formen compuestos relacionados (hidroxi-penicilina), etc. En el ao 1990, el nivel de produccion de las cepas empleadas era de 85,000 U/ml (aprox. 50 g/L).

ETAPAS DEL PROCESO DE PRODUCCCION

1- Mantenimiento y mejoramiento de cepas

2- Preparacin del inoculo (puede incluir varias etapas segun la escala de produccin) 3- Produccin del antibitico (Escala 240 m3 )

4- Cosecha

5- Purificacin

1- MANTENIMIENTO Se puede partir de esporos o micelio conservados del modo habitual

2- INOCULO Durante esta etapa se prefieren cultivos aireados y agitados en medios ricos con alta velocidad de crecimiento (= 0.1 h-1). Metabolismo aerobico con predominio de las vias de EMP, ciclo de TCA y via de las pentosas. Medio tipo: corn steep liquor+ 2% de un azucar (glucosa o lactosa) + fosfatos + CaCO3 como buffer.

PROCESO DE PRODUCCION

4- Caracteristicas y requerimientos del proceso productivo Parametros criticos: pO 2 /aeration (> 20%), T (25- 27 C), pH (6.5) Condiciones aerobicas. (aireacion y eliminacion del CO2) Fuentes de carbono: Hidratos de carbono simples (lactosa, glucosa o sacarosa) en general no puros ya que resultan muy caros. La fuente de carbono representa un 25% del costo total del proceso. Regulacion catabolica: La glucosa no es compatible con la sintesis de penicilina. Se utiliza entonces lactosa (que permite menor ) o una mezcla de ambos azucares. Hidratos de carbono complejos: almidones, dextrinas, melazas, aceites vegetales y animalescontienen tambien nitrogeno, vitaminas y minerales. Frecuentemente requieren pretratamiento para remover inhibidores. (limitantes). El almidon resulta una fuente de C atractiva pero necesita licuefaccion previa a la esterilizacion y tiene alta viscosidad. Fuentes de carbono mas utilizadas: Melazas (de remolacha o caa), Starch ( From maize, wheat), Starch hydrolyzates (Including dextrins and glucose syrup) Suchrose, Lactose, Cereals, beet, potatoes Of minor importance: Oils & fats, Hydrocarbons (n- alkanes), Sulphite- spent liquor (Byproduct of sulphite pulping), Whey- and lactose permeate (By- product of cheese production)

Fuentes de nitrogeno: se emplean fuentes complejas , por ej, corn steep liquor . El corn steep contiene precursores de cadena lateral, fenil acetico, acetico y lactico, P y S, como asi tambien vitaminas y cofactores. Tambien se puede agregar amonio durante el proceso. Exceso de amonio: inhibicion de la glutamino-sintetasa Falta de amonio: disgregacion del micelio.

Agregado de precursor de cadena lateral: pHO fenil acetico o sus precursores (fenil alanina, fenetil alanina, etc). Se requieren en alta cantidad (aprox. 0.5 g/ g penicilina) por lo cual es uno de los insumos que incide mas en el costo.

Purificacion de la Penicilina 1- 1 st acidic extraction from broth with butylacetate (short contact extraction at pH 3) 2- re- extraction to neutral aqueous buffer 3- 2nd acidid extraction from buffer with butylacetate 4- . Charcoal treatment (decolorizing) 5- . Precipitation of sodium salt with NaAc 6. Vacuum rotary filter, washing 7. Crystal suspension 8. Vacuum rotary filter, washing 9. Drying, warm air

El solvente se destila

Raw PenG, 99.5% pure, yield 90- 92%.

Datos del procesoY X/ S (Biomasse/ g Glucose) maintenance Fermentationsdauer Wachstumsphase Produktionsphase Biomassekonzentration zum Ende [PenG] zum Ende Glucoseverbrauch: - Glucose fr Biomasse - Glucose fr PenG - Glucose fr maintenance (180h) Total Effektiver Y P/ S 0.45 g/ g 0.027g/( g cells* h) 25h 180h 45 kg/ m 3 50 kg/ m 3 100kg/ m 3 44 kg/ m 3 219 kg/ m 3 363 kg/ m 3 0.14 g/ g

PENICILINAS Y CEFALOSPORINAS: ANTIBIOTICOS BETA-LACTAMICOS

BIOSINTESIS

FERMENTACION

7-ACA 7-ADCA

Produccion enzimatica de antibioticos lactamicosPor fermentacionAcilasashidrolasas

expandasa

oxidasas Acilasas Oxidasas hidroxilasas

Acilasas

Sintetasas

Sintetasas

Sintetasas

SINTESIS DE NUEVOS ANTIBIOTICOSUna metodologia que se aplica en la actualidad para la obtencion de nuevos antibioticos (no aislados de la naturaleza) es la incorporacion dentro de un unico organismo, de dos vias ligeramente diferentes de produccion de antibioticos de la misma familia o porciones de las mismas, por medio de plasmidos integrativos, a fin de obtener nuevas combinaciones

ANTIBIOTICOS POLIQUETIDOS EJEMPLOS: TETRACICLINA, ERITROMICINA, ACTINORDINA ORGANISMOS PRODUCTORES: STREPTOMYCES PRECURSORES: ACIDOS GRASOS SIMPLES (de cadena corta)

VENTAJAS PARA SU USO EN INGENIERIA METABOLICA: LOS GENES SE ENCUENTRAN EN CLUSTERS (no excesivamente diseminados) PUEDEN EXHIBIR HIBRIDIZACION CRUZADA (facil de reconocer con secuencias consensos o amplificar con primers no especificos) PRESENTAN SIGNIFICATIVAS HOMOLOGIAS CON LOS GENES DE SINTESIS DE ACIDOS GRASOS por lo que pueden compartir algunas actividades enzimaticas SON REGULADOS POSITIVAMENTE (PUEDE INCREMENTARSE LA PRODUCCION POR SOBREEXPRESION)

ENZIMAS BIOSINTETICAS: POLIQUETIDO SINTETASASDiferencias con la SINTESIS DE ACIDOS GRASOS: 1- Pueden incorporarse residuos de mayor longitud que un acetato (ej, malonil-CoA) 2- Pueden formarse cadenas laterales (ramificaciones) 3- hay reducciones parciales de distintos tipos (grupos enoles y carbonilos)

2- PRODUCCION DE ERITROMICINA EN Saccharopolispora erythrea Involucra 3 genes gigantes que codifican para 3 proteinas de alto PM (300 kDa) Cada gen esta formado por dos repeticiones inexactas que pueden dividirse en 6 modulos. Cada modulo contiene combinaciones de aproximadamente 6 polipeptidos responsables de distintas funciones. Las funciones son: acyltransferasa (AT); acil-carrier protein (ACP); -ceto acyl ACP-sintasa (KS), -ceto acyl ACP-reductasa (KR); dehidrasa (DH) y enoil reductasa (ER). Otras proteinas que pueden estar presentes son: los factores de elongacion y las ciclasas Esta organizacin permite la sintesis combinatoria de nuevas moleculasModulo1 modulo 2AT ACP KS AT KR ACPSS CO CH2 CH3 CO CH2-CH3 CH-0H CH2 CH3

modulo 3 modulo 4KS AT ACP KS AT DH ER KR ACP

modulo 5 modulo 6KS AT KR ACP KS AT KR ACP TE

SCO CH2-CH3 CH-0H CH2-CH3 CH-OH

Clonado de genes biosinteticos de antibioticos La biosintesis incluye de 10 a 30 pasos enzimaticos separados por lo que el clonado de una via completa no es sencillo. Puede hacerse: 1- por complementacion de mutantes (no productoras) con una biblioteca genomica de la cepa salvaje. Se obtienen sucesivas transformantes que se complementan con la biblioteca y asi se aisla toda la secuencia genetica, si la misma se encuentra en un unico cluster. (metodologia empleada para undecilprodigiosin de Streptomyces coelicolor)

2- A partir de la secuencia N terminal de una enzima clave se sintetizan los oligos que sirven de probes para buscar el/los genes que hibridizan con la secuencia. (metodologia empleada para aislar el gen de la isopenicilina N sintetasa de P. chrysogenum)Tener en cuenta que: 1- Muchas de estas cepas forman agregados o filamentos por lo que se debe remover la pared para transformar. 2- Los plasmidos se pierden con facilidad por lo que conviene integrar la informacion al cromosoma