05 Validacion de Metodos

Validación de Métodos: Caso práctico

PONENTE: Ma. Estela González Caballero

Documentos de referencia

1.   NMX-‐EC-‐17025-‐IMNC-‐2006(ISO/IEC 17025:2005) 2.   Criterios de aplicación de la norma NMX-‐EC-‐17025-‐IMNC-‐2006 (ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07 (2012-‐02-‐27) 3.   Guías técnicas CENAM 4.   Publicación técnica CNM-‐MRD-‐PT-‐030. Métodos analíTcos adecuados a su propósito. Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados. CENAM

Validación

Verificación de que los requisitos especificados son adecuados para un uso previsto.(VIM 3ª ed.)

Confirmación mediante el suministro de evidencia objeTva de que se han cumplido los requisitos del método para una uTlización o aplicación prevista. NMX-‐CH-‐152-‐IMNC-‐2005

La validación es la confirmación por examen y la provisión de evidencia objeTva de que se cumplen los requisitos parTculares para un uso específico propuesto. 5.4.5.1 NMX-‐EC-‐17025-‐IMNC-‐2006

¿Por qué es necesario validar?

Confiabilidad de las mediciones -‐  Fines comerciales -‐  Evaluación de calidad de los productos -‐  Toma de decisiones Deber éTco -‐  Se Tene evidencia de la medición -‐  PresTgio para el laboratorio Requisito normaTvo -‐  Acreditación

NMX-‐EC-‐17025-‐IMNC-‐2006 (ISO/IEC17025:2005)

5.4.5 Validación de los métodos 5.4.5.2 El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto.

Requisitos

Validación de

métodos

Instrumentos

Analista

Desarrollo del método

CaracterísTcas del Método

CuanTtaTvo

CualitaTvo

Normalizados

AnalíTcos

Físicos

AnalíTcos

Físicos

Cálculos

Kit comerciales

Pruebas rápidas

No Normalizados

Validación Confirmación

Métodos analíticos

Propiedades químicas

Reacción química

Métodos físicos

Propiedades físicas

contenido Medios físicos

CaracterísTcas del Método

Criterios de aplicación de la norma NMX-‐EC-‐17025-‐IMNC-‐2006

(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Criterio: Se cons ideran métodos o procedimientos normalizados, aquellos publicados en Normas Oficiales Mexicanas, Normas Mexicanas o los emiTdos por organizaciones de normalización, extranjeras, regionales internacionales, todas reconocidas, tales como ISO, EN, ASTM, AOAC, EPA, USP, Standar Methods, etc.

Para los métodos no normalizados, propios o desarrollados por el laboratorio, los métodos obtenidos de publicaciones ciengficas, así como los métodos normalizados modificados o ampliados o usados fuera de su alcance propuesto el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objeTva de la validación del método [5.4.5].


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

II. Validación de los métodos. La validación de los métodos debe realizarse de acuerdo a lo siguiente: a. Para los ensayos que involucren mediciones analíTcas: 1. Porcentaje de Recuperación o error relaTvo 2. Límite de detección 3. Límite de cuanTficación


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

4. Intervalo lineal y de trabajo 5. Reproducibilidad 6. RepeTbilidad 7. Sesgo o error 8. IncerTdumbre 9. Sensibilidad 10. SelecTvidad 11. Robustez


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Los métodos analíTcos no siempre miden todo el analito de interés presente en la muestra. El método debe ser designado deliberadamente para determinar solo la forma de interés del analito. Es posible realizar estudios de recuperación de MR, si estos están disponibles; de otra forma se busca la recuperación de la fracción del analito adicionada a una muestra de prueba (forTficada o con “spike”) previa al análisis.

CNM-‐MRD-‐PT-‐030

Recuperación

La fracción del analito adicionada a una muestra de prueba(muestra forTficada o adicionada) se calcula como: Donde: Cf= Concentración del analito en la muestra forTficada Csf= Concentración del analito en la muestra sin forTficar Ca= Concentración del analito adicionada


100% xCCC

Ra

sff −=

Recuperación

Es la mas pequeña canTdad o concentración del analito en la muestra de prueba que puede ser confiablemente disTnguida del cero. IUPAC

La menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero no necesar iamente cuanTficarse ba jo las condiciones establecidas de la prueba. IUPAC

Límite de Detección

Normalmente, para propósitos de validación es suficiente proporcionar un indicaTvo del nivel al cual la detección resulta problemáTca. Para este propósito la aproximación “blanco + 3s” usualmente será suficiente. Cuando el trabajo es para soportar la conformidad con una norma o especificación, probablemente será necesaria una aproximación más exacta


blblL KsYY +=

Límite de Detección

El “límite de cuanTficación“ (LoQ) estrictamente es la concentración más baja del analito que puede ser determinada con un nivel aceptable de precisión de repeTbilidad y veracidad. También se define por diversas convenciones como la concentración del analito correspondiente al valor del blanco de muestra más 5, 6 ó 10 desviaciones estándar de la media del blanco.

Límite de CuanTficación

blblL KsYY +=

El contenido igual o mayor que el menor punto de concentración en la curva de calibración. También se conoce como Límite de Reporte.

Normalmente el Límite de CuanTficación forma parte del estudio para determinar el intervalo de trabajo. Éste no deberá determinarse por extrapolación debajo de la concentración más baja del blanco forTficado.


Límite de CuanTficación

Linealidad: Define la habilidad del método para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito.

Nota: Se deduce que el intervalo lineal es el intervalo de concentraciones del analito dentro del cual los resultados de prueba obtenidos por el método son proporcionales a la concentración del analito.’

Intervalo Lineal y de trabajo

Intervalo (de Medición – de Trabajo): Conjunto de valores del mensurando para los cuales se pretende que el error de un instrumento de medición caiga dentro de límites especificados.

Curva de Calibración: Representación gráfica de la señal de medición como una función de la canTdad de analito.


Dentro del intervalo de trabajo puede exisTr un intervalo de respuesta lineal. La extensión de este intervalo puede establecerse durante la evaluación del intervalo de trabajo. los cálculos de regresión por ellos mismos, son insuficientes para establecer la linealidad. Para hacer esto, puede ser suficiente una inspección visual de la línea y de los residuales. En general, las revisiones de linealidad requieren de al menos 10 puntos a diferentes concentraciones o valores de la propiedad relacionada.


Dentro del intervalo lineal, un punto de calibración puede ser suficiente para establecer la pendiente de la curva de calibración pero en el intervalo de trabajo será necesaria la calibración con varios puntos (preferentemente más de 6). La relación entre la respuesta del instrumento con la concentración no Tene que ser perfectamente lineal para que un método sea efecTvo pero la curva debe ser repeTble día con día.


Precisión bajo condiciones de repeTbilidad Condiciones de repeTbilidad: condiciones bajo las que se obTenen resultados independientes, con el mismo método, sobre muestras idénTcas, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, y uTlizando los mismos equipos de medición durante un corto intervalo de Tempo. ISO 3534-‐1 (NMX-‐CH-‐5725-‐1-‐IMNC-‐2006).

RepeTbilidad

La precisión más pequeña esperada: dará una idea de la clase de variabilidad esperada cuando un método se ejecuta por un solo analista, con un equipo en un período corto de Tempo, es decir, es la clase de variabilidad que se espera entre resultados cuando una muestra se analiza por duplicado

RepeTbilidad

Analizar RepeTciones

(independiente) Qué calcular a parTr de los datos

Mismo analista, equipo y laboratorio, en un período de Tempo corto

10

Determinar la desviación estándar (s) (desviación estándar de repeTbilidad) a cada concentración

Precisión bajo condiciones de reproducibilidad

Condiciones de reproducibilidad: condiciones bajo las cuales los resultados de ensayo se obTene con el mismo método, sobre muestras idénTcas, en laboratorios diferentes, con operadores disTntos uTlizando equipos disTntos. ISO 3534-‐1 (NMX-‐CH-‐5725-‐1-‐IMNC-‐2006).

Reproducibilidad

Si la muestra se analiza por varios laboratorios para fines comparaTvos, entonces una medida de precisión más significaTva a usarse es la reproducibilidad; ésta es la medida de precisión más grande normalmente encontrada. la precisión medida entre diferentes analistas, en períodos de Tempo prolongados, dentro de un solo laboratorio se conoce como “precisión intermedia”. La precisión se determina por lo general en términos de la desviación estándar o la desviación estándar relaTva

Reproducibilidad

Reproducibilidad

Analizar RepeTciones

(independiente) Qué calcular a parTr de los datos

Diferente analista y

equipo, mismo laboratorio, período de Tempo prolongado

10

Determina la desviación estándar de

reproducibilidad dentro del laboratorio a

cada concentración

La diferencia entre el valor esperado de los resultados de prueba y un valor de referencia aceptado.

[ISO 3534-‐1]

Sesgo (veracidad)

Caracteriza al error sistemáTco en un procedimiento analíTco dado y es la desviación (posiTva o negaTva) de la media de los resultados analíTcos con respecto al valor verdadero (conocido o aceptado).

[IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985]

La diferencia entre la media límite (μ) y el valor verdadero (τ); es decir, = μ -‐ τ.

[IUPAC ‘Orange’ Book]

Para verificar la veracidad uTlizando un material de referencia, se determina la media y la desviación estándar de una serie de réplicas de una prueba y se compara contra el valor caracterizado del material de referencia.

Sesgo (veracidad)

MR

MRC

Matriz similar trazabibilidad

MR adicionados

Con MRC puros

MR internos

Caracterizados en el laboratorio.

Control de calidad interna

Sesgo (veracidad)

Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mensurando.

[VIM 1993] IncerTdumbre Estándar u(xi) -‐ la incerTdumbre del resultado de una medición expresada como una desviación estándar.

[ISO GUM]

IncerTdumbre

La incerTdumbre de medición es un parámetro único (usualmente una desviación estándar o un intervalo de confianza) que expresa el intervalo de posibles valores sobre la base de los resultados de medición. Una esTmación de la incerTdumbre de medición considera todos los efectos reconocidos que influyen en el resultado; las incerTdumbres asociadas a cada efecto son combinadas de acuerdo a procedimientos bien establecidos.

IncerTdumbre

Ésta es efecTvamente la pendiente de la curva de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta del instrumento que corresponde a un cambio en la concentración del analito. Cuando se ha establecido que la respuesta es lineal con respecto a la concentración (o sea, dentro del intervalo lineal del método) y se ha determinado la intercepción de la curva de respuesta, la sensibilidad es un parámetro úTl para calcular y usar en fórmulas de cuanTficación.

Sensibilidad

La capacidad de un método para determinar exactamente y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en una matriz de muestra bajo las condiciones de prueba establecidas.

[NATA Tech Note #13]

SelecTvidad (o Especificidad):

La capacidad de un método para medir solamente lo que se pretende que mida.

[AOAC -‐ PVMC] La especificidad es la capacidad de determinar el analito inequívocamente en presencia de componentes los cuales se espera que estén presentes.

[ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95]

Usualmente, la selecTvidad de un método se invesTga mediante el estudio de su capacidad para medir el analito de interés en porciones de prueba a las cuales deliberadamente se han introducido interferencias específicas (aquéllas que se cree probable estén presentes en las muestras). Si no se está seguro de que las interferencias están presentes, la selecTvidad de un método se puede invesTgar estudiando su capacidad de medir el analito comparado con otros métodos o técnicas independientes.

SelecTvidad (o Especificidad):

La robustez de un procedimiento analíTco es una medida de su capacidad de permanecer inalterado por variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso normal.

[ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95]

Robustez

Esto incluye aplicar variaciones deliberadas al método y estudiar el efecto resultante en el desempeño. De esta manera es posible idenTficar las variables que Tene el efecto más significaTvo y en base a ello, controlarlas cuidadosamente cuando se aplica el método. Cuando se requiere mejorar el método, las mejoras se pueden realizar sobre aquellas partes que se sabe, son críTcas.

Robustez

En cualquier método habrá ciertas etapas que, si no se llevan al cabo con suficiente cuidado, tendrán un efecto severo sobre el desempeño del método y pueden dar como resultado que el método no funcione.

b. Para los ensayos que involucren mediciones }sicas:

1. Verificación del desempeño del equipo contra los requerimientos establecidos en el método.

2. Uso de los materiales de referencia requeridos por el método, cuando aplique.

3. Conformidad de las instalaciones y condiciones ambientales del laboratorio con lo establecido en el método.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

4. Perfil, competencia y habilidades del personal que realiza el método conforme a lo establecido por el propio laboratorio o los requerimientos del método o procedimiento.

5. Estudio de repeTbilidad y reproducibilidad en cumplimiento con los criterios de aceptación cuando lo especifique el método, o en su caso los criterios establecidos por el laboratorio mediante los datos de desempeño.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

6. La evidencia de la evaluación de la veracidad y la precisión del método de medición mediante experimentación, que permita evaluar el sesgo y la repeTbilidad del método en el laboratorio, ya sea uTlizando materiales de referencia o mediante una comparación interlaboratorios, consultar la serie de normas NMX-‐CH-‐5725-‐IMNC.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Para todos los Tpos de métodos anteriormente la va l i dac ión de l método debe i n c lu i r l a s especificaciones de los requisitos, determinación de las caracterísTcas del método, una verificación de que se pueden cumplir los requisitos usando dicho método y una declaración en la validez. La evidencia de la validación puede estar contenida en un procedimiento, incluidos o referenciados en el manual de la calidad o incluso en los mismos procedimientos técnicos.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Para la validación adicionalmente el laboratorio debe: a) Mantener registros de la validación en métodos desarrollados por el laboratorio de que el método o procedimiento se ajusta al uso propuesto [5.4.3].

b) Documentar la influencia de los cambios realizados en los métodos no normalizados previamente validados.

c) Documentar y validar las modificaciones a los métodos normalizados. Cuando un método está escrito de una forma y se realiza de otra, es una desviación al método no una modificación.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Para los métodos de ensayo que involucren realizar otras pruebas para la determinación del resultado final, dichas pruebas serán sujetas a evaluación y deben cumplir con los requisitos de la calidad establecidos por el laboratorio, la norma técnica y la norma 17025.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Para las determinaciones basadas exclusivamente en cálculos matemáTcos que requieran resultados de otras pruebas, el laboratorio debe solicitar la acreditación de todas las pruebas que se involucran para obtener los datos para el cálculo final.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

En el caso de que el laboratorio desee acreditar paquetes de marca comercial (kits con reacTvos preparados y precalibrados): Se aclara que los métodos de paquetes de marca comercial solo son úTles como mediciones semicuanTtaTvas o de campo y en ningún momento pueden susTtuir o ser métodos alternos a los métodos normalizados, ya que no son métodos que puedan demostrar que son técnicamente similares o superiores a los establecidos en las normas mexicanas o internacionales.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Las pruebas rápidas publicadas en normas oficiales, nacionales y/o internacionales o por organizaciones técnicas reconocidas, son acreditables cuando el laboratorio se apegue en su totalidad a lo establecido en el método publicado.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Las pruebas rápidas descritas en textos o publicaciones ciengficas importantes o por fabricantes de equipo, así como las desarrolladas o adaptadas por el laboratorio podrán acreditarse siempre y cuando demuestren mediante evidencia objeTva el cumplimiento de los siguientes requisitos que se mencionan de manera enunciaTva más no limitaTva: -‐ Prueba de repeTbilidad y reproducibilidad (r&R). -‐ Comparación de resultados contra el método de referencia oficial.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

-‐ Estandarización empleando MRC o MR. -‐ EsTmación de límites de detección y cuanTficación. -‐ Robustez. -‐ EsTmación de incerTdumbre. -‐  Aseguramiento de la calidad del método y sus resultados

Sin embargo, en caso de que un laboratorio desee acreditar este Tpo de métodos, su solicitud será presentada a los órganos colegiados correspondientes para su análisis y decidir si es facTble su acreditación


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Confirmación de los Métodos. Para métodos o procedimientos normalizados el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objeTva de la confirmación del método para demostrar que cumple las especificaciones del mismo y cuenta con la competencia técnica para realizarlo adecuadamente tomando en consideración sus propias instalaciones, equipo, personal [5.4.2].


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

La confirmación del método debe realizarse de acuerdo a lo siguiente: a. Para los ensayos que involucren mediciones analíTcas: 1. Porcentaje de Recuperación o error relaTvo 2. Límite de detección 3. Límite de cuanTficación 4. Intervalo lineal y de trabajo 5. Reproducibilidad 6. RepeTbilidad 7. IncerTdumbre


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

b. Para los ensayos que involucren mediciones }sicas: 1. Verificación del desempeño del equipo contra los requerimientos establecidos en el método.

2. Uso de los materiales de referencia requeridos por el método, cuando aplique,

3. Conformidad de las instalaciones y condiciones ambientales del laboratorio con lo establecido en el método,


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

4. Perfil, competencia y habilidades del personal que realiza el método conforme a lo establecido por el propio laboratorio o los requerimientos del método o procedimiento.

5. Estudio de repeTbilidad y reproducibilidad en cumplimiento con los criterios de aceptación cuando lo especifique el método, o en su caso los criterios establecidos por el laboratorio mediante los datos de desempeño o mediante la aplicación de cualquier otra técnica estadísTca reconocida.


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

La confirmación del método puede demostrarse también mediante un ensayo de apTtud o una in te r comparac ión en t re l abora to r io s o intralaboratorio (consultar la serie de normas NMX-‐CH-‐5725-‐IMNC).


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

Para confirmación de métodos cualitaTvos cuyo resultado no sea a parTr de una medición, la confirmación del método será aceptada mediante la correcta aplicación del método por parte del laboratorio, considerando sus propias instalaciones, equipo y personal [5.4.2].


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

La validación y/o confirmación del método se deberá realizar en forma inicial y/o cuando existan cambios críTcos en la metodología, equipos, instalaciones, etc. [5.4.2].


(ISO/IEC 17025:2005) MP-‐FE-‐005 -‐07

GUÍAS TÉCNICAS CENAM

Método

Valid

ació

n

Sens

ibili

dad

Sele

ctiv

idad

Rob

uste

z

Rec

uper

ació

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Sesg

o

Lim

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Lim

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y

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raba

jo

Rep

rodu

cibi

lidad

Rep

etib

ilida

d

Ince

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umbr

e

Cromatografía de gases (CG) y de líquidos (CLAR)

Total (3) (1) (1) (2)

Parcial - - - (3) (1) (1) (2)

Conductividad electrolítica

Total -

- - - -

Parcial -

- - - - -

Espectrometría por Absorción Atómica e ICP

Total (3) (1) (1)

Parcial - - - (3) (1) (1)

Espectrometría Ultravioleta –

Visible

Total (3) (1) (1) (2)

Parcial - - - (3) (1) (1) (2)

Guías Técnicas CENAM

Método

Valid

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n

Sens

ibili

dad

sele

ctiv

idad

Rob

uste

z

Rec

uper

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n

Sesg

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Lim

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Lim

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umbr

e

Titulación volumétrica

Total - - (1)

Parcial - - - - (1)

Temperatura en sólidos

Total Se debe seguir lo mencionado en 5.4.5

Parcial

Temperatura en Líquidos


Parcial

Temperatura en Gases


Parcial

pH Total - - - - -

Parcial - - - - - -


(1)  Para el caso donde las mediciones de elementos químicos sean a niveles de concentración de masa altos, no es requisito indispensable la determinación del límite de detección ni del límite de cuanTficación.

(2) Medición durante al menos tres días.

(3)  Sesgo, en algunos casos es evaluado a parTr de la Recuperación.


Por su parTcipación

¡GRACIAS!

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