04b. Signaling Sa Povrsine Cel

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na površini ćelije.U mnogim signalnim putevima vezivanje liganda za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu,

dozvoljavajući im da se translociraju u nukleus i da regulišu ( češće stimulišu, a redje inhibišu) transkripciju

njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora moţe da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza koje

se potom translociraju u nukleus i regulišu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori,

prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnosti postojećih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):

Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Bivanlou & Darnell (2002), Science 295:813.).

2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ĆELIJE

Citokinski receptori

i JAK/STAT

signalni putevi

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Janus-Vatican.JPG

4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI

Druga velika klasa receptora na površini ćelije su citokinski receptori čiji

je citosolni domen veoma blisko asociran sa jednim članom familije citosolnih

tirosin kinaza, JAK kinazom (engl. JAnus Kinase).

Treća klasa receptora su receptori tirozin kinaze (engl. Receptor

Tyrosine Kinases - RTKs) čiji citosolni domen ima aktivnost tirozin kinaza, te se

stoga ovi receptori zovu tzv. receptori sa „unutrašnjom” enzimskom aktivnosti.

Mehanizmi kojima se ligandom aktiviraju citokinski receptori i receptori

tirozin kinaze su veoma slični i postoji značajno preklapanje u intracelularnim

putevima transdukcije signala koji se uključuju aktivacijom receptor obe klase.

U nekim drugim slučajevima, receptor je dimer i u odsustvu liganda, a

vezivanje liganda menja konformaciju ekstracelularnih domena obe

subjedinice. Bez obzira da li je monomer ili dimer, u svakom slučaju, formacija

funkcionalnog dimernog receptora prouzrokuje da jedna slabo aktivna citosolna

kinaza fosforiliše tačno odredjene tirozinske ostatke na delu molekule druge

kinaze koji se zove aktivaciona usna. Fosforilacija tirozina u aktivacionoj usni,

aktivira kinaznu aktivnost pomenute kinaze i vodi aktivaciji druge kinaze u

dimeru, kao i nekoliko tirozin kinaznih ostataka u citosolnom domenu receptora.

Fosforilacija ostataka u aktivacionoj petlji je generalni mehanizam kojim se

aktiviraju mnoge kinaze.

4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI

4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedničke

karakteristike signalinga

Slika 4.6. Dimerizacija receptora za

EGF, receptora sa tirozin kinaznom

aktivnosti.

A – Šematski prikaz poloţaja

ekstra-celularnih i transmembranskih

domena EGF receptora. Vezivanje jedne

EGF molekule za monomerni receptor

prouzrokuje izmenu strukture petlje

loicirane izmedju dva EGF-vezujuća

domena monomernog receptora.

Dimerizacija dva identična monomerna

receptora koja su prethodno vezala

ligand se odvija u ravni membrane i to

interakcijom prvenstveno dva

„aktivirana” segmenta sa petljama. B –

Struktura ekstracelularnih domena

dimernog EGF receptora koji su vezali

TGFa, homolog EGF . Uočiti interakciju

izmedju dva „aktivirana” segmenta sa

petljama.



Šematski prikaz položaja ekstra-celularnih i transmembranskih

domena EGF receptora.Vezivanje jedne EGF molekule za monomerni receptor prouzrokuje

izmenu strukture petlje loicirane izmedju dva EGF-vezujuća domena

monomernog receptora. Dimerizacija dva identična monomerna receptora

koja su prethodno vezala ligand se odvija u ravni membrane i to

interakcijom prvenstveno dva „aktivirana” segmenta sa petljama.

Struktura ekstracelularnih domena dimernog EGF receptora koji su vezali TGFa,

homolog EGF .

Uočiti interakciju izmedju dva „aktivirana” segmenta sa petljama.



Slika 4.7. Generalna struktura

ligandom-indukovane aktivacije

RTKs i citokinskih receptora.1 – Citosolni domen RTKs ima katalitičko

mesto proteina tirozin kinaze, dok je citosolni

domen citokinskih receptora asociran sa

odvojenom JAK kinazom. 2 – U oba tipa

receptora, vezivanje liganda prouzrokuje

konformacione promene koje favorizuju

formiranje funkcionalnog dimernog receptora,

pribliţavajući ili dva domena koja imaju

katalitičku atkivnost tirozin kinaze (RTKs) ili

dva citosolna domena koja su asocirana sa

JAK kinazama (citokinski receptori). Ovi

pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi

na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj

usni. 3 – Fosforilacija prouzrokuje da se usna

pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to

dozvoljava da se ATP ili proteinski supstrat

veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge

tirozinske ostake u citoso-lnom domenu

receptora. Dobijeni fosforilisani tirozini

funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl.

docking sites) različitih proteina koji

učestuvuju u transdukciji signala.



Slika 4.7. Struktura ligandom-indukovane aktivacije RTKs.1 – Citosolni domen RTKs ima katalitičko mesto proteina tirozin kinaze. 2 – U oba tipa receptora, vezivanje

liganda prouzrokuje konformacione promene koje favorizuju formiranje funkcionalnog dime-rnog

receptora, pribliţavajući ili dva domena koja imaju katalitičku atkivnost tirozin kinaze (RTKs). Ovi

pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj usni. 3 –

Fosforilacija prouzrokuje da se usna pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to dozvoljava da se ATP ili

proteinski supstrat veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge tirozinske ostake u citosolnom

domenu receptora. Dobijeni fosforilisani tirozini funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl. docking sites)

različitih proteina koji učestuvuju u transdukciji signala.



Slika 4.7. Struktura ligandom-indukovane aktivacije citokinskih receptora.1 – Citosolni domen citokinskih receptora je asociran sa odvojenom JAK kinazom. 2 – U oba tipa receptora,

vezivanje liganda prouzrokuje konformacione promene koje favorizuju formiranje funkcionalnog dimernog

receptora, pribliţavajući citosolna domena koja su asocirana sa JAK kinazama (citokinski receptori). Ovi

pribliţeni domeni potom fosforilišu jedan drugi na mestima tirozinskih ostataka na aktivacionoj usni. 3 –

Fosforilacija prouzrokuje da se usna pomera iz katalitičkog mesta kinaze, te to dozvoljava da se ATP ili proteinski

supstrat veţu. Aktivirana kinaza potom fosforiliše druge tirozinske ostake u citoso-lnom domenu receptora.

Dobijeni fosforilisani tirozini funkcionišu kao mesta za pristajanje (engl. docking sites) različitih proteina koji

učestuvuju u transdukciji signala.



Slika 4.8. Regrutovanje signal-transdukcionih

proteina prema ćelijskoj membrani preko

vezivanja za fosfo-tirozinske ostatke aktviranog

receptora.

Citosolni proteini sa SH2 ili PTB domenima se

mogu vezivati za specifične fosfotirozinske

ostatke aktiviranog RTKs (prikazano na slici) ili

citokinskog receptora. U nekim slučajevima su

signal-transdukcioni proteini fosforilisani ili sa

receptorskom-unutrašnjom ili sa receptorom-

asociranom tirozin kinazom, te se time pojačava

njihova aktivnost. Neki RTKs i citokinski

receptori koriste “multidocking” proteine kao što

je IRS-1 da bi povećali broj signal-transdukcionih

proteina koji se regrutuju i aktiviraju. Posledična

receptor- kinazna fosforilacija IRS-1 kreira fosfo-

tirozinske ostatke koji funkcionišu kao dodatna

“docking” mesta za SH2 domene signal-

trandukcionih proteina.

4.2.2. Citokini utiču na razvoj mnogih tipova ćelija

Struktura eritropoetina (Epo) vezanog za

ekstracelularne domene dimernog

eritropoetinskog receptora.

Epo sdrţi 4 konzervisana dugačka a

heliksa rasporedjena u specifičnom

araţmanu. EpoR monomer je gradjen od

dva subdomena, od kojih svaki ima 7

konzervisanih b lanaca rasporedjenih u

karakterističnom maniru. Ostaci bočnih

lanaca dva heliksa Epo ostvaruju vezu sa

kontaktnom petljom jednog EpoR

monomera, dok se ostaci na druga dva

Epo heliksa vezuju za drugi EpoR

monomer, te time značajno stabilizuju

dimerni receptor. Struktura drugih

citokina i njhovih receptora su slične.(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.

WH Freeman and Company; adaptiorano od Syed i sar.

(1998), Nature 39:511.).

Citokini su familija relativno malih, sekretornih proteina (generalno sadrže oko

160 aminokiselina) koji kontrolišu mnoge aspekte rasta i diferencijacije u

specifičnim tipovima ćelija.

4.2.2. Citokini utiču na razvoj mnogih tipova ćelija

Slika 4.9. Uloga eritropetina u formiranju

eritrocita.Eritroidne progenitorne ćelije koje se nazivaju

eritroidne kolonija-formirajuće jedinice (engl. Colony

Forming Units Erythroid – CFU-E) su derivati

hematopoetskih pluripotentnih stem ćelija koje

takodje daju progenitorne ćelije i za druge tipove

ćelija krvi. U odsustvu eritropoetina CFU-E ćelije

ulaze u apoptozu tj. proces programirane ćelijske

smrti. Vezivanje eritropetina za njegov receptor na

CFU-E indukuje transkripciju nekoliko gena koji

kodiraju proteine koji sprečavaju apoptozu,

dozvoljavajući CFU-E ćelijama da preţive i da prolaze

kroz program od tri do pet završnih deoba ćelije.

Eritropoetin takodje indukuje ekspresiju proteina

specifičnih za eritrocite kao što je globin koji potom

formira hemoglobin, kao i membranski protein

glikoforin i jono-izmenjivački protein. Receptori za

eritropoetin, kao i drugi membranski proteini se gube

sa površine CFU-E ćelija kada one ulaze u proces

diferencijacije. Ukoliko se CFU-E ćelije gaje u kulturi

sa eritropoetinom u polučvrstom medijumu (npr.

sadrţi metilcelulozu), ćelije koje su potomci ne mogu

da se udaljavaju, te svaka CFU-E ćelija produkuje

koloniju od 30-100 eritroidnih ćelija.)

4.2.2. Citokini utiču na

razvoj mnogih tipova ćelija

Slika 4.10. Model signalnih puteva koji se uključuju kao odgovor na hipoksiju, a posredovani su HIF-1.Lokalna koncentracija kiseonika se registruje verovatno „kiseoničnim senzorom” koji zahteva hem-asocirane

proteine (S-heme). Nedostatak kiseonika na senzoru aktivira intermedijere (X) koji potom stimulišu povećanu

produkciju obe subjedinice HIF-1 (engl. Hypoxia Induced Factor 1). HIF-1 aktivira transkripciju gena koji kodiraju

proteine koji posreduju kratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficit kiseonika. HIF-1 aktivira različite ciljne gene

u različitim ćelijama ukazujući time da verovatno deluje u kombinaciji sa drugim proteinima koji regulišu

transkripciju gena. VEGF (engl. Vascular Endothelial Growth Factor) – vaskularni endotelijalni faktor rasta; iNOS

(engl. inducible Nitric Oxide Synthase) – inducibilna azot oksid sintaza; HO-1 (engl. Heme Oxygenase 1).

4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu i aktiviraju

slične puteve signalne transdukcije

Svi citokini imaju sličnu tercijarnu strukturu koju grade četiri duga konzervisana a

heliksa (a-helikoidna struktura) grupisana zajedno u specifičnoj orjentaciji. Slično,

struktura svih citokinskih receptora je ista.

Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili više transmembranskih proteina čiji je

ekstracelularni deo odgovoran za vezivanje citokina, a citoplazmatski deo je

odgovoran za iniciranje signalnih puteva. Ekstracelularni domen je gradjen od dva

subdomena, od kojih svaki ima sedam konzervisanih b lanaca grupisanih zajedno u

specifičnom maniru. Tipični putevi signalne transdukcije se aktiviraju ligand-

indukovanom aktivacijom receptora, približavajući citoplazmatske delove jedne ili više

receptornih molekula u procesu analognom signalingu preko T i B receptora (detaljniji

opis je moguće naći u skripti Molekularna i ćelijska imunologija, Kostić i Andrić, 2007).

Citokini svoj efekat ispoljavaju vezujući se sa velikim afinitetom za svoje receptore koji

pripadaju odredjenim strukturnim familijama (Slika 4.11.). Aktivacija receptora

stimuliše specijalizovane signalne puteve kao što je npr. JAK-STAT signalni put (Janus

tirozin Kinaze u citoplazmi koje fosforilišu STAT-engl. Signal Transducer and Activator

of Transcription). Svi citokinski receptori su vezani sa jednom ili više JAKs. Postoje

četiri identifikovane JAKs sa definisanom strukturom: JAK1, JAK2, JAK3 i Tyr2). Na

primer, receptori za a-interferon su socirani sa JAK1 i Tyr2, dok su receptori za g-

interferon asocirani za JAK1 i JAK2 (Tabela 4.3.).



Tabela 4.3. Neki signalni proteini koji deluju preko citokinskih receptora i

JAK-STAT signalnog puta

LIGANDI JAKs UDRUŢENE sa

RECEPTOROM

AKTIVIRANI

STATs

NEKI ODGOVORI

g-interferon Jak1 i Jak2 STAT1 Aktivira makrofage; povećava

ekspresiju MHC proteina

a-interferon Tyr2 i Jak2 STAT1 i STAT2 Povećava otpornost ćelije na viralne

infekcije

Eritropoetin Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju eritrocita

Prolaktin Jak1 i Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju mleka

Hormon

rasta

Jak2 STAT1 i STAT5 Stimuliše rast indukujući produkciju

IGF-1

GM-CSF Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju granulocita i

makrofaga

IL-3 Jak2 STAT5 Stimuliše ranu produkciju uobličenih

elemenata krvi(Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.



Slika 4.11. Strukture citokinskih receptora.A – Receptori za različite citokine klasifikovani su u familije na osnovu konzervisane

strukture ekstracelula-rnog domena (WSXWS: triptofan-serin-X-triptofan-serin); B - Različiti

citokinski receptori izgrađeni su od specifičnog ligand-vezujućeg lanca koji se nekovalentno

asocira sa signalnom subjedinicom koja je zajednička za receptore različitih citokina.



Tabela 4.4. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptora

PUTEVI SIGNALNE

TRANSDUKCIJE

CITOKINSKI RECEPTOR

KOJI KORISTI DATI

SIGNALNI PUT

SIGNALNI MEHANIZAM

JAK/STAT put Tip I i tip II citokinskih

receptora

JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT

transkripcionih faktora

Signaling TNF

receptora preko TRAF

TNF familija receptora:

TNR-RII, CD40

Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija

transkripcionih faktora

Signaling TNF

receptora preko tzv.

»death« domena

TNF familija receptora:

TNR-RI, Fas

Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze

Tirozin kinaze

povezane sa

receptorima

M-CSF receptor

Receptor faktora stem

ćelija (SCF)

Unutrašnja aktivnost tirozin kinaze u receptoru

G protein signaling Hemokinski receptori GTP zamena i disocijacija Ga:GTP od Gbg,

Ga:GTP aktivira različite ćelijske enzime, ali i neke

druge proteine


slične puteve signalne transdukcijeVezivanje citokina ili indukuje receptorne lance da se oligomerizuju ili da se reorijentišu i

formiraju oligomer. I jedno i drugo dovodi do približavanja asociranih JAKs dovoljno blizu da

bi mogle da se unakrsno/medjusobno fosforilišu, te time povećavaju aktivnost tirozin-kinaznih

odmena. JAK potom fosforiliše tirozine na citokinskom receptoru formirajući tako fosfo-

tirozinske ostatke koji imaju funkciju „docking“ mesta za STATs i druge signal-transdukcione

proteine.

Postoji sedam poznatih STATs (STAT1,STAT2, STAT3, STAT4, STAT5, STAT6 i STAT7), a

svaki od njih ima SH2 domen koji ima dve funkcije. (1) Posreduje vezivanje STAT proteina za

fosfo-tirozinska „docking“ mesta na atkiviranom citokinskom receptoru (ili RTKs). Kada se

STAT veže biva fosforilisan od strane JAK na tirozinskim ostacima, što prouzrokuje njegovu

disocijaciju od receptora. (2) SH2 domeni na oslobodjenom STAT molekulu sada posreduju

vezivanje STAT molkula za fosfo-tirozine drugih STAT molekula, formirajući tako ili STAT

homodimer ili heterodimer. Potom se STAT dimer translocira u nukleus u kome se, u

kombinaciji sa drugim genskim regulatornim proteinima, vezuje za specifičan region na DNK

molekuli, tzv. „DNK element koji odgovara“ (engl. DNA Response Element - DRE), različitih

gena i stimuliše njihovu transkri-pciju (Slika 4.13.). Na primer, kao odgovor na hormon

prolaktin koji stimuliše ćelije mlečne žlezde da produkuju mleko, STAT5 stimuliše transkripciju

gena koji kodira proteine mleka.

Citokinski receptori aktiviraju odgovarajuće STAT proteine zbog toga što SH2 domeni ovih

STAT proteina prepoznaju jedino specifične sekvence fosfotirozinskih „docking“ mesta. Na

primer, aktivirani receptor za a-interferon regrutuje i STAT1 i STAT2, dok aktivirani receptor za

g-interferon regrutuje jedino STAT1. Ukoliko bi se SH2 domen a-interferonskog receptora

zamenio SH2 domenom g-interferonskog receptora, aktivirani hibridni receptor bi regrutovao i

STAT1 i STAT2, kao i a-interferonski receptor sam po sebi.

Svi citokini i njihovi receptori imaju sličnu strukturu

i aktiviraju slične puteve signalne transdukcije

Slika 4.13. JAK-STAT signalni put

aktiviran vezivanjem a-interferona za

svoje receptore.

Vezivanje interferona prouzroku-je ili

dimerizaciju dva odvojena polipeptidna

lanca (kao što je prikazano) ili reorjentiše

recepto-rne lance da formiraju dimer. U

svakom slučaju, asocirani JAK molekuli

se približavaju jedan drugom tako da

mogu da se medjusobno unakrsno

fosforilišu na mestima gde su tirozinski

ostaci, što pokreće proces transdukcije

signala, odnosno aktivira signalni(e)

put(eve). Dva različita receptorna lanca

su asocirana sa različitim JAKs (Tyr2 i

JAK1) te tako regrutuju različite STAT

molekule (STAT1 i STAT2). Aktivirani

fosforilacijom STATs se disociraju od

receptora i formiraju heterodimere koji se

translociraju u nukleus gde se vežu za

specifična mesta na DNK sekvenci

(engl. DNA respo-nse elements) i

zajedno sa dru-gim genskim

regulatornim protei-nima indukuju

transkripciju gena.



Slika 4.14. Pregled intracelularnih puteva transdukcije signala koji se aktiviraju vezivanjem

liganda za eritropetinski receptor (EpoR), tipični citokinski receptor.Četiri velika signalna puta mogu da transdukuju signal od aktiviranog EpoR-JAK (videti donji deo slike

4.7.). Svaki signal-transdukcioni put reguliše transkripciju različitih setova gena. A – U najdirektnijem

putu, transkripcioni faktor STAT5 se fosforiliše i aktivira direktno u citosolu. B – Vezivanje tzv. »linker«

proteina, Grb2 ili Shc za aktivirani EpoR prouzrokuje aktivaciju Ras-MAP kinaznog puta. C i D –

Aktivaciju EpoR prati idukcija dva fosfoinozitidna puta koja se aktviraju regrutovanjem fosfolipaze Cg i

PI3 kinaze na membranu. Povećan nivo Ca2+ i aktivirana protein kinaza B (PKB) takodje modulišu

aktivnost citosolnih proteina koji nisu uključeni u regulaciju transkripcije, nego imaju druge funkcije u

procesima transdukcije signala ili drugim procesima u ćeliji.

4.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Ubrzo nakon otkrića i kloniranja citokina, izlovana je i većina njihovih receptora

različitim eksperimentalnim tehnikama. Genetičkim analizama je potvrdjeno da se

vezivanjem liganda za citokinske receptore aktiviraju dva ključna signal-transdukciona

proteina: JAK kinaza i STAT transkripcioni faktor. Pokazano je da su jedan

(ponekada i dva) od četiri humana JAK proteina i makar jedan od nekoliko STAT

proteina uključeni u signaling u donjem toku signalnog puta svih citokinskih receptora.

Za razumevanje fukcionisanja JAK i STAT proteina uvek se kao primer prezentuje,

najbolje proučen i razjašnjen citokinski signalni put, a to je signalni put koji se uključuje

nakon aktivacije eritropoetinskog receptora (engl. Erythropoietin Receptor – EpoR).

Ovaj signalni put je veoma važan za formiranje zrelih, funkcionalnih eritrocita, a time i

za transport gasova, odnosno opitmalno snabdevanje svih ćelija i tkiva kiseonikom. Svi

početni elementi EpoR-signalnog puta (eritropoetin, EpoR, kao i JAK2) su neophodni za

formiranje adultnog-tipa eritrocita koje normalno počinje dvanaestog dana

embrionalnog razvića kod miša. Embrioni miša kojima nedostaju funkcionalni geni koji

kodiraju ili EpoR ili JAK2 (Slika 4.15) ne mogu formirati adultni-tip eritrocita i često

umiru zbog nesposobnosti da obezbedjuju potrebne i dovoljne količine kiseonika

fetalnim organima.


Slika 4.15. Studije sa mutantnim miševima su pokazale da su i eritropoetinski receptor

(EpoR) i JAK2 esencijani za razvoj eritrocita.

Miševi kod kojih su oba alela za EpoR i JAK2 gene uklonjena (engl. »knocked out«) razvijaju se normalno do

trinaestog embrionalnog dana, a potom počinju da umiru zbog anemije uzrokovane nedostakom eritrocitima-

posredovanog transporta kiseonika do fetalnih organa. Zatamnjeni deo kod normalnog tipa embriona (+/+) je

fetalna jetra koja je glavno mesto produkcije eritrocita u ovoj razvojnoj fazi. Nedostatak boje/zatamnjenja kod

mutantnih embirona (-/-) ukazuje na odsustvo eritrocita koji sadrţe hemoglobin. Sem toga, mutantni embrioni

izgledaju normalno, što ukazuje da je glavna funkcija EpoR i JAK2 u ranom razvoju kod miša da stimulišu

produkciju eritrocita.


Epo se vezuje simultano za ekstracelularne domene dva EpoR

mononomera (videti sliku 4.12.). Aktivacija EpoR rezultira

približavanjem JAKs molekula dovoljno blizu da bi mogle medjusobno

da se fosforilišu unakrsnom fosforilacijom na kritičnim tirozinima

aktivacione usne (videti sliku 4.7). Kao i kod drugih kinaza,

fosforilacija aktivacionih usana prouzrokuje konformacione promene

koje smanjuju Km za ATP ili supstrat koji treba da bude fosforlisan, te

time povećavaju kinaznu aktivnost.

Jedan deo informacija za ovaj mehanizam aktivacije dobijen je u

studijama sa JAK2 mutantima kod kojih su kritični tirozini na

aktivacionim usnama mutirani u fenilalanin. JAK2 mutant se normalno

vezuje za RpoR, ali ne može da bude fosforilisan. Ekspresija ovog

JAK2 mutanta u eritroidnim ćelijama u količinama većim nego što je

uobičajeno potpuno blokira EpoR signaling, zbog toga što JAK2

mutant blokira funkciju normalnog/divljeg-tipa (engl. wild-type)

proteina. Ovakav tip mutacije se naziva dominantna negativna

mutacija i prouzrokuje gubitak funkcije čak i u ćelijama koje nose

kopije normalnog gena (engl. wild-type gene).


Kao što je napomenuto, aktivirane JAK kinaze fosforilišu nekoliko

tirozinskih ostataka na citosolnom domenu receptora. Neki od ovih fosfo-

tirozina potom imaju funkciju veznih mesta za grupu STAT transkripcionh

faktora.

Svi STAT proteini imaju: (1) N-terminalni SH2 domen kojim se vezuju za

fosfo-tirozine receptornog citosolnog domena; (2) centralni DNK-vezujući

domen; (3) C-terminalni domen sa kritičnim tirozinskim ostacima. Kada se

STAT protein veže za aktivirani receptor, C-terminalni tirozini se fosforilišu

sa asociranom JAK kinazom. Ovakav aranžman osigurava da se u

odredjenim ćelijama aktiviraju samo oni STAT proteini sa SH2 domenima

koji mogu da se vežu za odredjeni receptorni protein. Fosforilisani STAT

disocira spontano od receptora, a dva fosforilisana STAT proteina

medjusobno formiraju dimere tako što se SH2 domeni svakog od njih

vezuju za fosfo-tirozine drugog STAT proteina. Zbog dimerizacije se

izlaže signal za nuklearnu lokalizaciju ili nuklearni lokalizacioni signal

(engl. Nuclear Localisation Signal - NLS) (Slika 14.16.), te se STAT dimer

translocira u nukleus, gde se vezuje za specifične pojačivačke sekvence

(engl. enhancer sequences) koje kontrolišu ciljne gene.


Slika 4.16. JAK-STAT singalni put.Prateći vezivanje liganda za citokinski

receptor i aktivaciju asocirane JAK kinaze,

JAK fosforiliše nekoliko tirozinskih ostataka

na receptornom citosolnom domenu (videti

sliku 4.7.). Nakon što se inaktivni

monomerni STAT protein veţe za receptor,

fosforiliše se aktivnom JAK kinazom.

Fosforilisani STATs spontano disociraju od

receptora i spontano se dimerišu. S obzirom

da STAT homodimer ostvaruje dve interakcje

izmedju fosfo-tirozina i SH2 domena, iako je

za stabilizaciju receptor-STAT kompleksa

dovoljna samo jedna ovakva interakcija,

fosforilisani STAT nema tendenciju da

ponovo veţe za receptor.

Različiti STAT proteini aktirivaraju različite gene u različitim

ćelijama. Na primer, u eritroidnim progenitornim ćelijama

stimulacija eritropetinom dovodi do aktivacije STAT5, a ovaj

aktivirani transkripcioni faktor indukuje povećanu eskpresiju

proteina Bcl-xL, koji sprečava programiranu ćelijsku smrt tj.

apoptozu ovih progenitornih ćelija, te im time dozvoljava

da proliferišu i diferenciraju se u eritroidne ćelije

4.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifičnu sekvencu koja okružuje

fosfoserinske ostatke

SH2 domen Src tirozin kinaze se snažno vezuje za bilo koji peptid koji sadrži četiri

kritična ostatka osnovne sekvence: pTyr-Glu-Glu–Ile. Ove četiri aminokiseline ostvaruju

intimni kontakt sa peptid-vezujućim mestom u Src SH2 domenu. Vezivanje liči na

umetanje dvokrakog „zatvarača” (pTyr i Ile bočni lanci peptida) u dvokraku „duplju” u

SH2 domenu. Dva Glu ostatka se veoma tesno fituju i priljubljuju se u i na površinu

SH2 domena izmedju fosfo-tirozinske duplje i hidrofobnog džepa koji prihvata ostatak Ile

Slika 4.16. Površinski model SH2 domena Src kinaze

vezanog za peptid koji ima fosfo-tirozine.

Fosfo-tirozin (Tyr0 i OPO3-) i izoleucin (Ile3) ostaci se

uklapaju u dvokraku duplju na površini SH2 domena. Dva

glutamatna ostatka (Glu1 i Glu2) su vezani za mesta na

površini SH2 domena koja su izmedju dve duplje.

Variranje u hidrofobnoj duplji u SH2 domenima

različitih STAT proteina, kao i drugih signal-

transdukcionih proteina, dozvoljava im da se

vežu za fosfo-tirozine vezane za različite

sekvence, računajući na razliku u njihovim

vezujućim parametrima.

4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Signalom-indukovana aktivacija transkripcije ciljnih gena na neki duži period

može biti jednako opasna za ćeliju kao i jako mala indukcija.

Ćelije moraju biti sposobne i osposobljene da prekinu signal-transdukcioni put

veoma brzo ukoliko i iako ekstracelularni signal ostaje konstantno prisutan.

Intracelularnu transdukciju signala od različitih citokinskih receptora preko

JAK/STAT signal-transdukcionog puta negativno regulišu tri familije proteina:

(1) Fosfataze koje sadrže SH2 domene (engl. SH2-containing Phosphatases –

SHP)

(2) Supresori citokinskog signalinga (engl. Suppressors Of Cytokine Signaling -

SOCS)

(3) Proteini inhibitori aktiviranih STAT proteina (engl. Protein Inhibitors of

Activated STATs – PIAS).

U različitim progenitornim ćelijama odredjene klase proteina imaju ulogu da

prekinu signalnu transdukciju citokinskih receptora, jedni u kratkom periodu (meri

se minutama), a drugi u dužim periodima i trajno.

4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Slika 4.17. Dva mehanizma za prekidanje transdukcije signala od receptora za eritropoetin (EpoR).A – SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna u neaktivnoj formi u nestimulisanim ćelijama. Vezivanje SH2 domena SHP1

proteina za odredjeni fosfo-tirozin aktiviranog receptora „razmaskirava” tj. otkriva fosfatazno katalitičko mesto SHP1 i

pozicionira ga dovoljno blizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacione usne JAK2, što omogućava SHP1 da defosforiliše

tirozin na aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa ovog tirozina inaktiviše JAK kinaznu aktivnost. B – SOCS proteini, čija je

ekspresija indukovana u ertropoetinom-stimulisanim eritroidnim ćelijama, inhibišu ili trajno prekidaju sinaling na duţi period.

Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokira vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (levo).

SOCS boksevi mogu takodje „naciljati” i delovati na proteine kao što je JAK2 preko ubiquitin-proteazomnog puta (desno). Slični

mehanizmi regulišu intracelularnu transdukciju signala i od drugih citokinskih receptora.

4.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazama

Slika 4.17A. Prekidanje transdukcije

signala od receptora za eritropoetin

(EpoR) SHP1 fosfatazama.SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna

u neaktivnoj formi u nestimulisanim

ćelijama. Vezivanje SH2 domena SHP1

proteina za odredjeni fosfo-tirozin

aktiviranog receptora „razmaskirava” tj.

otkriva fosfatazno katalitičko mesto SHP1

i pozicionira ga dovoljno blizu

fosforilisanog tirozina u regionu

atkivacione usne JAK2, što omogućava

SHP1 da defosforiliše tirozin na

aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa

ovog tirozina inaktiviše JAK kinaznu

aktivnost. Slični mehanizmi regulišu

intracelularnu transdukciju signala i od

drugih citokinskih receptora.

4.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinima

Slika 4.17B. Prekidanje

transdukcije signala od

receptora za eritropoetin

(EpoR) SOCS proteinima.SOCS proteini, čija je

ekspresija indukovana u Epo-

stimulisanim eritroidnim ćelija-

ma, inhibišu ili trajno prekidaju

sinaling na duţi period.

Vezivanje SOCS za fosfo-

tirozinske ostatke na EpoR ili

JAK2 blokira vezivanje drugih

signal-transdukcionih proteina

(levo). SOCS boksevi mogu

takodje „naciljati” i delovati na

proteine kao što je JAK2 preko

ubiquitin-proteazomnog puta

(desno). Slični mehanizmi

regulišu intracelularnu transdu-

kciju signala i od drugih

citokinskih receptora.

Slika 4.18. Ubikvitinom-posredovani

proteolitički put.A – 1 – Enzim E1 se aktivira kačenjem molekula

ubiquitina (Ub). 2 – Aktivirani E1 za koga je

zakačena molekula Ub prenosi vezani Ub

molekul do E2. 3 – Ubiquitin ligaza (E3) vrši

transfer Ub molekule vezane za E2 na bočni

lanac sa ostakom koji ima amino grupu (-NH2).

Dodatne molekule se dodaju na ciljni protein

ponavljanjem koraka 1,2 i 3., te se tako formira

poliubiquitirani lanac koji usmerava ciljni

protein prema proteozomu (4). 5 – U okviru

ovog velikog kompleksa, ciljni protein se cepa

na veliki broj malih peptidnih fragmenata. B –

Kompjuterom-generisana slika otkriva da

proteazom ima cilindričnu strukturu sa

poklopcima na svakom kraju središnjeg dela ili

jezgra. Poroteoliza ubiquitinima-etiketiranim

proteinima se odvija duţ unutrašnjeg zida

jezgra.

Ubikvitinom-posredovani proteolitički put.

The Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK)

Cascades

The Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) CascadesSeveral MAPK cascades have been identified in mammalian cells, including the extracellular signal-related kinase pathways

(ERK1/2, ERK5) and the stress activated kinase pathways (JNK/SAPK, p38 MAPK). These pathways are linked to many G

protein-linked cell surface receptors and receptor tyrosine kinases. Thus, most cytokines, growth factors, hormones, and

neurotransmitters can selectively activate these cascades via receptor activation of intracellular second messengers. All MAPK

pathways operate through sequential phosphorylation events to phosphorylate transcription factors and regulate gene

expression. They can also phosphorylate cytosolic targets to regulate intracellular events. These cascades are implicated in the

regulation of cellular proliferation, differentiation, development, cell cycle, and transmission of oncogenic signals.

Akt SignalingThe serine/threonine protein kinase Akt/PKB is the cellular homologue of the viral oncogene v-Akt and is activated by various growth and

survival factors. In mammals, there are three known isoforms of the Akt kinase, Akt1, Akt2, and Akt3. Many cell surface receptors induce

the production of second messengers that activate phosphoinositide 3-kinase (PI3K). Akt is located downstream of PI3K and, therefore,

functions as part of a wortmannin-sensitive signaling, pathway. PI3K generates phosphorylated phosphatidylinositides (PI-3,4-P2 and PI-

3,4,5-P3) in the cell membrane that bind to the amino-terminal pleckstrin homology (PH) domain of Akt. PI-3,4-P2 and PI-3,4,5-P3 also

activate phosphoinositide-dependent kinase (PDK) which phosphorylates Thr308 of membrane-bound Akt. Ser473 is phosphorylated by

integrin-linked kinase (ILK). Activated Akt promotes cell survival through two distinct pathways: 1) Akt inhibits apoptosis by

phosphorylating the Bad component of the Bad/Bcl-XL complex. Phosphorylated Bad binds to 14-3-3 causing dissociation of the Bad/Bcl-

XL complex and allowing cell survival. 2) Akt activates IKK-a which ultimately leads to NF-b activation and cell survival.

Akt Signaling

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na površini ćelije.U mnogim signalnim putevima vezivanje liganda za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu,

dozvoljavajući im da se translociraju u nukleus i da regulišu ( češće stimulišu, a redje inhibišu) transkripciju

njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora moţe da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza koje

se potom translociraju u nukleus i regulišu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori,

prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnosti postojećih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):

Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Bivanlou & Darnell (2002), Science 295:813.).

2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ĆELIJE

04b. Signaling Sa Povrsine Cel

Documents

Transcript of 04b. Signaling Sa Povrsine Cel