0350339 Coleglobina ascorbato

8/9/2019 0350339 Coleglobina ascorbato

1/14

3 4 .

COUPLED

OXIDATION OF ASCORBIC ACID

AND

HAEMOGLOBIN

3 .

QUANTITATIVE STUDIES

ON

CHOLEGLOBIN

FORMATION. ESTIMATION

OF HAEMOGLOBIN

AND

ASCORBIC

ACID

OXIDATIONS1

BY R .

LEMBERG, J . W.

LEGGE

A N D

W. H .

LOCKWOOD

From t h e

I n s t i t u t e o f M e d i c a l

R e s e a r c h ,

R o y a l

N o r t h S h o r e

H o s p i t a l ,

S y d n e y

( R e c e i v e d

3

M a r c h 1 9 4 1 )

I N

t h i s

p a p e r we

d e s c r i b e

a

s p e c t r o p h o t o m e t r i c

m e t h o d

a l l o w i n g

u s t o

m e a s u r e

q u a n t i t a t i v e l y t h e d e s t r u c t i o n o f

h a e m o g l o b i n

a n d t h e

f o r m a t i o n

o f

c h o l e g l o b i n

a n d

c h o l e h a e m o c h r o m o g e n

d u r i n g

t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n o f


w i t h

a s c o r b i c

a c i d

a n d

w i t h o t h e r

r e d u c i n g s u b s t a n c e s .

T h e i n f l u e n c e o f v a r i o u s

f a c t o r s , t h e n a t u r e o f t h e

r e a c t a n t s , p H ,

t e m p e r a t u r e a n d

o x y g e n p r e s s u r e , o n

t h e v e l o c i t y

o f t h e

r e a c t i o n

i s

s t u d i e d .

T h e ' o x i d a t i o n o f a s c o r b i c a c i d

d u r i n g

t h e

r e a c t i o n s i s

m e a s u r e d i n t h e

u s u a l way b y

i n d i c a t o r t i t r a t i o n ,

a n d

t h e

r a t i o

o f

m o l e c u l e s o f a s c o r b i c

a c i d o x i d i z e d t o

m o l e c u l e s

o f

c h o l e g l o b i n f o r m e d

i s t h u s

f o u n d .

T h e


d e t e r m i n a t i o n

m e t h o d e n a b l e s

u s ,

a l s o ,

q u a n t i -

t a t i v e l y t o

c o r r e l a t e t h e f o r m a t i o n o f


w i t h t h e

i n c r e a s e

o f

' l a b i l e

i r o n '

a n d -

w i t h t h e y i e l d o f b i l e

p i g m e n t s t o

b e

o b t a i n e d

a f t e r a c i d

s p l i t t i n g ,

t h u s

g i v i n g

u s a much

m o r e c o m p l e t e i n s i g h t

i n t o t h e

r e a c t i o n ;

t h e

r e s u l t s o f

t h e s e s t u d i e s a r e

d e s c r i b e d i n P a r t s

4

a n d

5 .

E X P E R I M E N T A L

S p e c t r o p h o t o m e t r i c


o f c h o l e g l o b i n

f o r m a t i o n

T e c h n i q u e .

A l a r g e n u m b e r o f d i f f i c u l t i e s h a d

t o b e

o v e r c o m e ,

b e f o r e a

r e l i a b l e

t e c h n i q u e c o u l d

b e d e v e l o p e d . T h e s o l u t i o n s

d e r i v e d f r o m

t h e i n c u b a t i o n

o f

o x y h a e m o g l o b i n a n d

a s c o r b i c a c i d

c o n t a i n a

m i x t u r e

o f

o x y h a e m o g l o b i n ,

a

l i t t l e

r e d u c e d

h a e m o g l o b i n , i n s o m e i n s t a n c e s

m e t h a e m o g l o b i n ,

a n d r e d u c e d

a n d

o x y g e n a t e d

c h o l e g l o b i n ;

i n

t h e

l a t e r

s t a g e s

o f

t h e

r e a c t i o - n

t h e

p r e c i p i t a t e

o f

g r e e n

p i g m e n t

a p p e a r s a n d

e v e n i n

t h e

e a r l i e r

s t a g e s

a

s l i g h t c l o u d i n e s s

o c -

c a s i o n a l l y

d e v e l o p s .

I t

i s

e v i d e n t ,

t h e r e f o r e ,

t h a t

s p e c t r o p h o t o m e t r i c s t u d y

o f

t h e

a b s o r p t i o n

o f

t h e s o l u t i o n s a s

s u c h

i s

u s e l e s s . M e a n s

h a d

t o

b e

d e v i s e d

t o

t r a n s f o r m

t h e v a r i o u s d e r i v a t i v e s

o f

p r o t o h a e m a t i n

a n d

o f c h o l e h a e m a t i n i n t o

o n e

d e r i v a t i v e

o f e a c h

a n d

t o e n s u r e

a n

o p t i c a l l y

c l e a r

s o l u t i o n .

T h e

t r a n s f o r -

m a t i o n i n t o t h e

C O - h a e m o c h r o m o g e n s b y C O , NaOH

a n d

N a 2 S 2 0 4

f u l f i l l e d t h e s e

d e m a n d s . T h e

C O - f r e e

h a e m o c h r o m o g e n s

a r e

l e s s

s u i t a b l e ,

b e i n g

l e s s

s t a b l e .

E v e n

i n

t h e

p r e s e n c e o f CO w e f o u n d

i t

n e c e s p a r y

t o

w o r k u n d e r

s t r i c t l y

c o n -

t r o l l e d

c o n d i t i o n s

i n

o r d e r t o

g e t

r e p r o d u c i b l e

r e s u l t s .

S i n c e

N a 2 S 2 0 4

a n d

0 2

y i e l d

p e r o x i d e

w h i c h

p r o d u c e s

c h o l e g l o b i n ,

i t i s

e s s e n t i a l

t o a d d

t h e

r e d u c e r

o n l y

a f t e r t h e

s o l u t i o n

h a s

b e e n

s a t u r a t e d

w i t h c o a l

g a s

a n d

e v e n t h e n t o a v o i d

u n n e c e s s a r y

e x p o s u r e t o

a i r .

- W e

f o u n d

i t

a l s o

n e c e s s a r y

t o

a d d

t h e a l k a l i

o n l y

a f t e r t h e

s o l u t i o n h a d b e e n s a t u r a t e d w i t h

c o a l

g a s .

A

C O - h a e m o g l o b i n

s o l u t i o n ,

w h i c h h a d a n e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t a t

5 7 0

m , u

o f

1 I 0 , g a v e

a s

C O - h a e m o c h r o m o g e n

1

T h i s

w o r k

w a s

c a r r i e d

o u t

u n d e r

a

g r a n t

f r o m

t h e

N a t i o n a l

H e a l t h

a n d

M e d i c a l

R e s e a r c h

C o u n c i l o f

A u s t r a l i a .

3 3 9


2/14

3 4 0 R . LEMBERG, J . W. LEGGE

AND

W. H ; LOCKWOOD

p r o d u c e d

b y

a d d i t i o n o f a l k a l i

a n d

N a 2 S 2 0 4

a f t e r s a t u r a t i o n w i t h c o a l g a s

t h e

e x t i n c t i o n

c o e f f i c i e n t s a t 5 7 0

m , L :

1 P 0 0 ; 1 P 0 1 ; 0 - 9 8 ; 0 9 9 .

When

a l k a l i

w a s

a d d e d

- b e f o r e t h e s a t u r a t i o n w i t h c o a l g a s , t h e

v a l u e s

w e r e

s m a l l e r a n d

t h e v a r i a t i o n

g r e a t e r :

0

8 1 ; 0 - 9 1 ; 0 - 8 0 ; 0

9 0 ;

0 - 9 1 .

T h e

f o l l o w i n g

m e t h Q d

w a s e m p l o y e d . 5 m l .

o f

t h e s o l u t i o n t o b e i n v e s t i g a t e d

w e r e

a t

o n c e

s a t u r a t e d

w i t h

c o a l

g a s

f o r

3

m i n .

T h e

c u r r e n t

o f g a s

w a s

a s r a p i d

a s

t h e

f r o t h i n g

o f t h e s o l u t i o n

a l l o w e d . O n l y i n a f e w i n s t a n c e s d i d we f i n d

i t

n e c e s s a r y t o

a d d a

t r a c e o f

o c t y l

a l c o h o l , w h i c h

t e n d s

t o c a u s e s o m e d e n a t u r a t i o n .

5 0 -

m g . o f N a 2 S 2 0 4

w e r e t h e n

a d d e d , t h e

t u b e o n c e i n v e r t e d a n d

d u r i n g f u r t h e r

p a s s a g e o f

c o a l

g a s

0 . 5

m l .

o f

2 0 6 %

NaOH w a s i n t r o d u c e d . A

v i g o r o u s c u r r e n t

o f

c o a l

g a s

w a s

m a i n t a i n e d

f o r 1 m i n . , a f t e r

w h i c h

t h e s o l u t i o n w a s t r a n s f e r r e d

t o

t h e

s p e c t r o p h o t o m e t e r s c r e w c u p s .

T h e

e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s a t 6 3 0 a n d

5 7 0

m ,

w e r e t h e n

m e a s u r e d w i t h o u t

d e l a y ,

a l t h o u g h

we f o u n d t h e a b s o r p t i o n

o f

t h e

s o l u t i o n s

i n t h e

c u p s t o

c h a n g e

o n l y

v e r y

s l o w l y .

T h e d i l u t i o n t o

t h e

c o n c e n t r a t i o n

s u i t e d f o r

s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t m u s t

b e

c a r r i e d o u t

b e f o r e

t h e a d d i t i o n

o f N a 2 S 2 0 4

a n d a l k a l i : t h e d i l u t i o n

b y t h e a l k a l i h a s ,

o f

c o u r s e ,

t o

b e

c o n s i d e r e d . T h e i n s t r u m e n t u s e d w a s

t h e

H i l g e r V i s i b l e S p e c t r o -

p h o t o m e t e r

d e s c r i b e d

i n

t h e

p r e c e d i n g

p a p e r .

1 2

I 0 -

1 5

9

I

8

-1

P~~~aelnt

7 p

6

~ ~ ~ ~

c o

~~

~

~ ~.

4-

-~~

3

F i . 1

F r a i o n o f c h o e l b n b b c u l d o i a t i o n i

f

h a y e m o g l o b i n

a n d

a s c o r b i c a c

i d .

F i g .

i s h o w s

t h e

c h a i n g e s

o f

t h e a b s o r p t i o n c u r v e s

o f t h e

C O - b a e m o c h r o m o g e n s

d u r i n g

i n c u b a t i o n o f

a

1 - 2

/

o x y h a e m o g l o b i n

s o l u t i o n w i t h 1 0 0

m g . p e r

1 0 0

m l .

O f

a s c o r b i c

a c - i d

a t

3 7

a n d

pH

8 - 5

i n

a

c u l t u r e f l a s k

w i t h o u t

s h a k i n l g

( o f .

P a r t

2 ) .


3/14

FORMATION

OF CHOLEGLOBIN

FROM HAEMOGLOBIN 3 4 1

T h e c o n t i n u o u s l i n e

r e p r e s e n t s

t h e c u r v e o f

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n ,

t h e

i n t e r r u p t e d

l i x n e s

t h o s e

o f

t h e

C O - h a e m o c h r o m o g e n s o b t a i n e d

a f t e r v a r y i n g

t i m e s o f i n c u b a t i o n

w i t h

a s c o r b i c

a c i d . T h e a b s o r p t i o n o f

t h e

C O - c h o l e h a e m o -

c h r o m o g e n a t

6 3 0 m ,u r i s e s , w h i l e

t h a t o f

t h e C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n a t

5 7 0

a n d 5 4 0

m P

d e c r e a s e s , t h e 1 e c r e a s e

o f a b s o r p t i o n

a t 5 4 0

m P

b e i n g

s o m e w h a t

l e s s

t h a n

a t

5 7 0

m , .

Tw o

i s o s b e s t i c

p o i n t s

a r e

o b s e r v e d

a t

5 8 5

a n d

5 2 0

m i x .

O w i n g

t o

t h e

s t e e p

c o u r s e

o f t h e

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n

c u r v e

a t

t h e s e

w a v e -

l e n g t h s

t h e

i s o s b e s t i c

p o i n t c a n n o t

b e d e t e r m i n e d

v e r y a c c u r a t e l y , b u t

t h e

c u r v e s

d i s p l a y

n o

e v i d e n c e

o f t h e f o r m a t i o n

o f m o r e

t h a n

o n e o x i d a t i o n p r o d u c t

d u r i n g

t h e d u r a t i o n o f t h i s

e x p e r i m e n t

( 1 2 0 m i n . ) .

Q u a n t i t a t i v e

e s t i m a t i o n o f


I n o r d e r

t o d e t e r m i n e t h e

c h o l e g l o b i n c o n c e n t r a t i o n i n a m i x t u r e w i t h

h a e m o g l o b i n f r o m

t h e

a b s o r p t i o n

o f t h e

C O - h a e m o c h r o m o g e n s

a t 6 3 0 m , u

i t

i s

n e c e s s a r y t o

know

t h e

s p e c i f i c e x t i n c t i o n

' c o e f f i c i e n t s

o f

C O - c h o l e h a e m o c h r o m o -

g e n

a t t h i s

w a v e - l e n g t h . '

P u r e C O - c h o l e h a e m o c h r o m o g e n

h a s n o t

y e t

b e e n

o b t a i n e d ;

we

c a n ,

h o w e v e r ,

c a l c u l a t e

t h e

s p e c i f i c

e x t i n c t i o n

o f


c h r o m o g e n

f r o m

t h e

m e a s u r e d ' r a t i o b e t w e e n

t h e

d e c r e a s e o f e x t i n c t i o n

a t

5 7 0

m P

a n d t h e

i n c r e a s e a t 6 3 0

m P

i f

d u r i n g t h e

i n c u b a t i o n

o n l y t h o s e c o m p o u n d s

a r e

f o r m e d

w h i c h y i e l d C O - c h o l e h a e m o c h r o m o g e n

o r C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n

w i t h C O ,

NaOH

a n d

N a 2 S 2 0 4 .

T h e d a t a

r e p o r t e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n

i n d i c a t e

t h a t

t h i s i s t h e

c a s e ,

a t l e a s t i n

t h e

i n i t i a l s t a g e s

o f

t h e

i n c u b a t i o n .

I t i s a l s o

n e c e s s a r y

t o know

t h e

r a t i o s

o f

t h e

e x t i n c t i o n

d o e f f i c i e n t s

a t 6 3 0

a n d

5 7 0 m , u

( e m :

E 5 7 0 )

o f

b o t h

C O - c h o l e h a e m . o c h r o m o g e n

a n d

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n .

T h e l a t t e r

r a t i o

c a n

b e

d e t e r m i n e d ;

t h e

a b s o r p t i o n o f

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n

a t

6 3 0 m , u

i s s m a l l a n d

t h e

r a t i o

6 6 0 :

E 5 7

f o r C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n

( 0 - 0 4

a s

a v e r a g e o f

a

l a r g e n u m b e r o f

d e t e r m i n a t i o n s ) h a s o n l y t h e

c h a r a c t e r

o f a c o r -

r e c t i o n

f a c t o r .

T h e

r a t i o

f o r

C O - c h o l e h a e m o c h r o m o g e n

c a n n o t

b e d e t e r m i n e d

c o r r e c t l y ,

b u t w e

a r r i v e d

a t

t h e

c o n c l u s i o n t h a t i t

c a n n o t b e

f a r

f r o m '

2 - 2 2

( c f .

p . 3 3 3 ,

P a r t

2 ) .

I f

we

u s e

t h e s e v a l u e s ,

t h e r a t i o

Em

o f


t o

E 5 7 0

o f

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n , R ,

i s o b t a i n e d b y

t h e

e q u a t i o n :

Q R

Q 0 . 0 4

1 - Q / 2 . 2 2 '

w h e r e

Q i s t h e o b s e r v e d r a t i o

- , E m :

E 6 7 .

R

o u g h t t o

r e m a i n c o n s t a n t d u r i n g

t h e

c o u r s e o f

t h e

r e a c t i o n , i f o u r a s s u m p t i o n

t h a t c h o l e h a e m a t i n d e r i v a t i v e s a r e

t h e

o n l y

r e a c t i o n

p r o d u c t s

i s c o r r e c t .

T a b l e

1

s h o w s t h a t

R i s

a p p r o x i m a t e l y

1 - 0

u n d e r w i d e l y v a r y i n g c o n d i t i o n s o f

t h e

r e a c t i o n . R

d o e s ,

n o t r e m a i n

a b s o l u t e l y

c o n s t a n t

d u r i n g t h e r e a c t i o n , b u t

s u f f i c i e n t l y s o t o i n d i c a t e t h a t

a t

l e a s t

d u r i n g

t h e

e a r l y s t a g e s o f t h e r e a c t i o n

c h o l e g l o b i n i s p r a c t i c a l l y t h e o n l y

p r o d u c t .

L a t e r ,

l o w e r

v a l u e s

o f

R

a r e

f o u n d ,

i n d i c a t i n g

s o m e

f o r m a t i o n o f

b y - p r o d u c t s .

T a b l e

1 .

V a l u e s

o b t a i n e d

f o r

r a t i o ( R )

o f

E 6 6

o f


t o

5 7 0

o f

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n f r o m

m e a s u r e m e n t s

o f a b s o r p t i o n

d e c r e a s e

a t

5 7 0

m ,

a n d

i n c r e a s e

a t 6 3 0

m , u

pH 7 . 2 , 3 7 0 pH 8 - 5 , 3 7 0

p H

8 - 5 ,

2 0

A

A

M m i n .

o f

i n c u b a t i o n

B

M i n .

o f

i n c u b a t i o n R

H r .

o f

i n c u b a t i o n

R

3 0 0 . 9 5

1 5

1 * 0 3

1 9 j

0 . 9 6

4 0

0 . 9 1 3 0

1 - 0 8 3 1

0 . 8 4

8 0

0 - 8 3

4 0 0 - 9 6

1 2 0

0 . 8 4

8 0

0 - 9 2

9 0

0 - 9 4

1 2 0

0 - 8 1


4/14

3 4 2

R .

LEMBERG, J .

W.

LEGGE

AND W. H .

LOCKWOOD

F o r

o u r c a l c u l a t i o n s we

a s s u m e R=1,

i . e . e q u a l

m a x i m a l

e x t i n c t i o n s

o f

C O -


a n d

C O - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n .

T h e

s p e c i f i c

e x t i n c t i o n -

c o e f f i c i e n t

( e x t i n c t i o n o f

a

0 - 1

s o l u t i o n

i n

1

c m .

l a y e r )

o f

C O - p r o t o h a e m o -

c h r o m o g e n

w a s

f o u n d

t o b e 0 - 9 6 5 a t

5 7 0

m u ,

a n d t h e same v a l u e

i s

a s s u m e d

f o r

t h e



o f

C O - c l h o l e h a e m o c h r o m o g e n

a t 6 3 0

m i , .

F o r

t h e

s p e c i f i c

e x t i n c t i o n


a t

6 3 0

m p t

o f

t h e


c h r o m o g e n

p r e p a r e d f r o m ' g r e e n

p i g m e n t '

w e f o u n d

t h e

v a l u e 1 - 0 3 when

t h e


w a s

m e a s u r e d

b y

t h e


o f t h e

t o t a l

i r o n

i n

g r e e n

p i g m e n t .

A

l o w e r

v a l u e

( 0 . 7 6 )

w a s

o b t a i n e d

when t h e


w a s

m e a s u r e d b y

w e i g h i n g t h e p r o t e i n

d e n a t u r e d

b y

f o r m a l i n .

G r e e n

p i g m e n t

a p p e a r s

t h u s t o

c o n t a i n s o m e

p r o t e i n w i t h o u t

s t r o n g

a b s o r p t i o n

a t 63Umu

a n d

w i t h o u t

i r o n .

T h e

c o r r e c t i o n f o r t h e


c o n t e n t

i n

g r e e n p i g m e n t

was

b a s e d

o n

t h e

s a m e d a t a a s t h e c a l c u l a t i o n

o f

R

f r o m

t h e

r a t i o

E m , :

E 5 7 0 ,

b u t t h e

p r o t o -

h a e m a t i n

c o n t e n t

o f

g r e e n p i g m e n t

i s

s m a l l a n d

t h e

c o r r e c t i o n

t h e r e f o r e

o f

much

l e s s

i m p o r t a n c e .

T h e

a g r e e m e n t - o f

t h e v a l u e s o b t a i n e d

f r o m

g r e e n

p i g m e n t

w i t h

t h o s e

o b t a i n e d f r o m

c h o l e g l o b i n - h a e m o g l o b i n s o l u t i o n s c a n ,

t h e r e f o r e ,

b e t a k e n

a s

i n d e p e n d e n t

c o n f i r m a t i o n

t h a t

t h e

v a l u e s a rr i v e d

a t

f o r

R

a n d

f o r t h e


c o e f f i c i e n t a t

6 3 0

m , u

o f


a r e

a p p r o x i m a t e l y c o r r e c t .

W e

c a n

no w d e t e r m i n e

t h e c o n t e n t o f c h o l e h a e m a t i n

a n d


d e r i v a t i v e s

i n

a

s o l u t i o n . I f

E 5 7 0

i S t h e

e x t i n c t i o n

c o e f f i c i e n t a t

5 7 0

m p ,

o f

t h e


s o l u t i o n b e f o r e

i n c u b a t i o n

w i t h a s c o r b i c a c i d , ,

m e a s u r e d

a s

C O -

h a e m o c h r o m o g e n ,

a n d

Em

a n d

e 5 7

t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s

a t

6 3 0 mu

a n d

5 7 0

m , u

a f t e r

i n c u b a t i o n ,

we h a v e :

c h o l e g l o b i n f o r m e d ,

i n

o f

o r i g i n a l

1 0 2 ( 6 ( E 0 -

004

7

2

7

0 - 4 5

6 * g o )

h a e m o g l o b i

0;

n d , u n a l t e r e d

h a e m o g l o b i n =

6 5 7 0

6 5 7 0

I f

c o

0 i s u n k n o w n ,

t h e


p e r c e n t a g e

o f a

m i x t u r j

o f


a n d

1 U ( E 6 3 8 0 / 6 5 7 0

-

0 0 4 )


i s

g i v e n

b y

t h e

e q u a t i o n :

c h o l e g l o b i n =

0 o 9 6

+

0 l 5 5

.

0 / 7 0

E s t i m a t i o n o f

p r o t o h a e m n t i n d e s t r u c t i o n

W e

h a v e

e s t a b l i s h e d t h e

v a l i d i t y o f t h e


m e t h o d b y

e s t i m a t i n g

t h e

d e s t r u c t i o n o f


d u r i n g t h e

i n c u b a t i o ' n o f h a e m o -

g l o b i n w i t h a s c o r b i c

a c i d i n a

s e c o n d w a y . By

t r e a t m e n t o f a


s o l u t i o n c o n t a i n i n g

a s c o r b i c

a c i d w i t h a c e t i c

a c i d a n d e t h e r ,

t h e


c a n

b e

t r a n s f e r r e d a l m o s t

q u a n t i t a t i v e l y i n t o

t h e

e t h e r

a n d

c a n b e

d e t e r m i n e d

s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a s

p y r i d i n e - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n i n t h e

a m m o n i a c a l

e x t r a c t .

I f

t h i s m e t h o d

i s

a p p l i e d

t o c h o l e g l o b i n

s o l u t i o n s , t h e e t h e r

c o n t a i n s

b e s i d e


o n l y

b i l i v e r d i n

w h i c h

i s

r e m o v e d b y

e x t r a e t i o n

w i t h

5H C I ,

a n d

a h s m a l l

a m o u n t o f

b i l i v i o l i n

w h i c h

d o e s

n o t

d i s t u r b

t h e

h a e m a t i n

e s t i m a t i o n .

F o r

t h e


t h e f o l l o w i n g t e c h n i q u e

w a s

a p p l i e d :

l N

m l . o f

g l a c i a l

a c e t i c a c i d

w e r e

a d d e d t o

5

m l . o f

t h e c h o l e g l o b i n

s o l u t i o n a n d t h e

p i g m e n t s

w e r e

b r o u g h t

i n t o

1 5

m l . o f

e t h e r

i n

t h e

m a n n e r u s e d f o r t h e


o f

t h e

b i l e

p i g m e n t s

a n d

d e s c r i b e d

i n d e t a i l i n P a r t 5 . T h e

e t h e r l a y e r

w a s r e p e a t e d l y

e x t r a c t e d

w i t h 5

H C 1 ,

w a s h e d

w i t h w a t e r

a n d f i n a l l y t h e

h a e m a t i n w a s e x -

t r a c t e d

w i t h

a

f e w m l . o f

N / I O

a m m o n i a .

P y r i d i n e

w a s a d d e d t o a


o f

2 0

a n d '

a f t e r r e d u c t i o n w i t h

N a 2 S 2 0 4

t h e

a b s o r p t i o n

a t

A=

5 5 7 m , u

( f i r s t

a b s o r p t i o n b a n d o f

p y r i d i n e

h a e m o c h r o m o g e n )

w a s

m e a s u r e d

s p e c t r o p h o t o -

m e t r i c a l l y .

T h e

m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t

o f

p y r i d i n e - p r o t o h a e m o c h r o m o g e n

a t

5 5 7

m , u

u n d e r

t h e s e c o n d i t i o n s

w a s

f o u n d

t o

b e

3 1 , 0 0 0 .


5/14

FORMATION OF

CHOLEGLOBIN FROM

HAEMOGLOBIN

3 4 3

W e

h a v e made

a n

i n t e r e s t i n g

o b s e r v a t i o n on t h e e f f e c t

o f a s c o r b i c

a c i d

on

t h e

i s o l a t i o n

o f

h a e m a t i n

f r o m s o l u t i o n s o f

o x y h a e m o g l o b i n .

5 m l .

o f

a

0 - 7 2

s o l u t i o n o f


o u g h t

t o y i e l d 1 - 4 0 5

m g .

h a e m i n .

I f 5

m g .

o f

a s c o r b i c

a c i d w e r e a d d e d t o t h e h a e m o g l o b i n

s o l u t i o n

i m m e d i a t e l y b e f o r e

t h e a c i d i f i c a t i o n

w i t h

g l a c i a l a c e t i c

a c i d ,

1 - 3 5

m g . o f h a e m i n

=

9 6

w e r e

r e c o v e r e d f r o m t h e e t h e r .

W i t h o u t

t h e

a d d i t i o n o f

a s c o r b i c

a c i d

1 - 2 9

m g .

=

9 2

/

w e r e

r e c o v e r e d ,

when

t h e

e t h e r

w a s

a d d e d i m m e d i a t e l y

a f t e r

t h e

a d d i t i o n

o f

t h e

g l a c i a l a c e t i c

a c i d ;

w h e n ,

h o w e v e r ,

t h e

a c e t i c

a c i d s o l u t i o n

was

k e p t

f o r 1 5 m i n .

b e f o r e t h e

a d d i t i o n

o f

e t h e r a n d

t h e

s e p a r a t i o n o f

t h e

l a y e r s ,

t h e

a q u e o u s

l a y e r

c o n t a i n e d a

g r e a t

d e a l

o f

h a e m a t i n f i r m l y b o u n d t o p r o t e i n

a n d

n o

l o n g e r

e x t r a c t a b l e

b y

e t h e r ,

a n d

t h e

y i e l d

o f

h a e m i n i s o l a t e d f r o m

t h e e t h e r was

o n l y

0 - 5 1

m g . o r 3 6

o f

t h e t o t a l

h a e m o g l o b i n - h a e m i n .

I f

a c i d

h a e m a t i n

s o l u t i o n i s

k e p t

i n t h e p r e s e n c e

o f

a s c o r b i c a c i d , h o w e v e r ,

t h e

y i e l d

o f h a e m a t i n

d o e s

n o 1 ,

d i m i n i s h .

E v i d e n t l y


p r o t e c t s

t h e

g l o b i n

i n

t h e a c i d

s o l u t i o n f r o m a n

a l t e r a t i o n , p r o b a b l y

o f

o x i d a t i v e

n a t u r e ,

w h i c h

c a u s e s

t h e

p r o t e i n - h a e m a t i n

l i n k a g e

t o b e c o m e

s t a b l e

t o

a c i d .

A

T a b l e

2 . C o m p a r i s o n o f

t h e



o f


f o r m a t i o n

w i t h t h e d i r e c t

m e a s u r e m e n t

o f

h a e m i n

d e s t r u c t i o n


m g . h a e m i n a c c o r d i n g t o

f r o m 5

m l .

h a e m a t i n


C o n d i t i o n s



m e t h o d

I n i t i a l

h a e m o g l o b i n 1 - 3 5

0 0

pH 7 . 2 ,

1 5

m i n .

1 - 2 1 5

1 0 0 .

6 - 9

3 0

119

1 1 . 9 1 4 - 1

pH 8 - 5 ,

1 5 m i n .

1 - 0 8

2 0 - 0

1 7 - 9

3 0

0 9 0 5 3 3

0

3 3 . 3

T a b l e

2

s h o w s

t h a t t h e

p e r c e n t a g e


o f


e s t i m a t e d

b y

t h i s m e t h o d

t a l l i e s

w i t h t h e

p e r c e n t a g e



a s

d e t e r -

m i n e d

b y

t h e


m e t h o d . T h e r a t h e r

l a r g e

d e v i a t i o n s a r e d u e

t o

t h e

f a c t

t h a t t h e e s t i m a t i o n

o f

h a e m a t i n d e s t r u c t i o n

i s

l e s s

e x a c t

t h a n t h e


e s t i m a t i o n

o f


f o r m a t i o n .

M e a s u r e m e n t

o f

t h e

v e l o c i t y

o f c h o l e g l o b i n f o r m a t i o n u n d e r

v a r i o u s c o n d i t i o n s

T a b l e

3

g i v e s

t h e - r e s u l t s o f

m e a s u r i n g

t h e

r e a c t i o n v e l o c i t y

o f

t h e c h o l e g l o b i n

f o r m a t i o n

w i t h

t h i s

m e t h o d

u n d e r

v a r i o u s

c o n d i t i o n s

o f

t e m p e r a t u r e

a n d pH.

E a c h

o f

t h e

v a l u e s

g i v e n

i s t h e

a v e r a g e

o f

a t

l e a s t

t h r e e

p a r a l l e l e x p e r i m e n t s .

T h e



was

0 - 7 2

,

t h a t

o f


1 0 0

m g .

p e r

1 0 0

m l .

a n d

t h e

i n c u b a t i o n

w as

c a r r i e d

o u t

i n

f l a t

c u l t u r e

f l - a s k s

a s

p r e v i o u s l y

d e s c r i b e d .

A s i s

t o

b e

e x p e c t e d

f r o m t h e

n a t u r e o f t h e

e x p e r i m e n t ,

v a r i a t i o n s

a r e

f a i r l y

l a r g e ,

b u t

t h e y

d o

n o t

a f f e c t

t h e

c o n c l u s i o n s

d r a w n

f r o m t h e e x p e r i -

m e n t s i n

a n y w a y .

T a b l e

4

s h o w s t h e

v a r i a t i o n

o f

a

n u m b e r o f

e x p e r i m e n t s

c a r r i e d o u t

u n d e r

t h e

same

c o n d i t i o n s .

I n t h e


i n w h i c h

a

d i s t i n c t


o f

g r e e n p i g m e n t w a s

f o u n d ,

a

s o l u t i o n

o f

t h e


a n d

t h e

f i l t r a t e

w e r e

a n a l y s e d s e p a r a t e l y .

T h e

r e s u l t s

o f


o f

l o n g e r

t h a n

2 h r .

c a n

n o

l o n g e r

b e

c o n s i d e r e d a s

r e l i a b l e ,

s i n c e o t h e r

c o m p o u n d s

w e r e

f o r m e d i n

a d d i t i o n

t o

c h o l e g l o b i n a n d


( c f .

P a r t 2

a n d

a b o v e ) .

T h e r e

i s

a l s o

o c c a s i o n a l l y b a c t e r i a l

c o n t a m i n a t i o n .


6/14

3 4 4

R . LEMBERG,

J . W. LEGGE

AND

W.

E L

LOCKWOOD

r a b l e 3 . C h o l e g l o b i n

a n d


f o r m a t i o n

b y

c o u p l w

o x i d a t i o n

o f


w i t h

a s c o r b i c

a c i d

I n 0 / J

o f

i n i t i a l


D u r a t i o n

o f

C o n d i t i o n s

i n c u b a t i o n

pH 7 - 2 ,

3 7 1 5

m i n .

3 0

,

8 0

1 2 0

7 h r .

1 6

,

pH

8 - 5 ,

3 7 0

1 5

m i n .

3 0

8 0

1 2 0

7 h r .

-

1 6 X , ,

p H 7 - 2 ,

2 5 0

3 0 m i n .

6 0

1 2 0

pH

8 - 5 ,

2 5 0

3 0 m i n .

6 0

9 0

1 2 0

C h o l e -

g l o b i n

6 - 9

1 4 - 1

2 1 - 6

1 7 - 2

2 2 - 4

1 1 - 5

1 7 - 9

3 3 - 3

2 7 - 9

3 6 - 5

2 0 - 0

1 3 - 6

1 - 4

6 - 1

1 1 - 8

5 - 2

1 6 - 5

2 8 - 3

4 2 - 3

Haemo-

g l o b i n

9 2 - 7

8 3 - 1

-

5 5 - 1

4 6 - 2

2 8 - 2

1 3 - 6

8 3 - 2

6 9 - 7

4 9 - 7

3 2 - 9

2 6 - 5

1 4 - 1

8 5 - 5

8 3 - 8

7 6 - 9

8 5 - 6

8 2 - 1

7 4 - 4

5 6 - 1

C h

c h r o

T r a o

T r a c

r h o l e -

P r o t o -

T o t a l

e m o - h a e m o -

c h o l e -

D m o g e n c h r o m o g e n

haem

0 0

6 - 9

0 0

1 4 - 1

1 3 - 0

0 - 8 3 4 - 6

2 1 - 5

2 - 7

3 8 - 7

3 4 - 3

3 - 7

5 6 - 7

0

0

1 7 - 9

, e

i n c l u d e d

i n

f o r m e r 3 3 - 3

1 7 - 6

1 - 5 4 5 . 5

2 0 - 3

2 - 2

5 6 - 8

2 1 - 4

6 - 2

4 1 - 4

1 - 4

-

-

6 - 1

1 1 - 8

5 - 2

1 6 - 5

2 8 - 3

e

i n c l u d e d

i n f o r m e r 4 2 - 3

T a b l e

. 4 .

V a r i a t i o n

in t h e

y i e l d

o f


a n d


3 0 m i n . ,

pH 8 - 5 ,

3 7 0

I n

o f i n i t i a l


.1

A

-,

C h o l e -

g l o b i n

2 2 - 9

3 0 - 2

2 7 - 6

3 5 - 8

4 2 - 4

4 1 - 8

3 2 - 4

3 3 - 3

2 - 7

Haemo-

g l o b i n

8 0 - 3

7 2 - 5

6 9 - 1

6 9 - 4

6 9 - 0

6 0 - 9

6 7 - 0

6 9 - 7 2 - 0

7 - 3

5 - 4

Su m

1 0 3 - 2

1 0 2 - 7

9 6 7

1 0 5 2

1 1 1 - 4

1 0 2 - 7

9 9 - 4

1 0 3 - 1

C h o l e -

g l o b i n

3 0 - 0

.

2 6 - 8

2 7 - 0

2 7 - 9 1 - 0

8 0

m i n . ,

pH

8 - 5 ,

3 7 0

I n

o f

i n i t i a l


Haemo-

g l o b i n

4 9 - 5

4 6 - 1

5 3 - 6

4 9 - 7 2 - 2

C h o l e -

h a e m o -

c h r o m o g e n

1 6 - 5

1 7 - 0

1 9 - 3

1 7 - 6

0 - 8

P r o t o -

h a e m o -

c h r o m o g e n

4 - 0

0 - 4

0 - 2

1 - 5

1 - 2

T o t a l

c h o l e -

haem

4 6 - 5

4 3 - 8

4 6 - 3

4 5 - 5 0 - 9

Su m

1 0 0 - 1

9 0 - 3

1 0 0 - 0

9 6 - 7

S t a n d a r d

d e v i a t i o n

1-8

3-8 1-5

2-1

*

1-5

The r e a c t i o n v e l o c i t y o f

t h e - c h o l e g l o b i n f o r m a t i o n

a t

pH

8 - 5

i s

i n i t i a l l y

more

t h a n

d o u b l e

t h a t

a t

pH

7 - 2 .

The

t e m p e r a t u r e


i s r a t h e r

h i g h

( Q 1 O

o f

t h e i n i t i a l r e a c t i o n

a b o u t

3 - 5 - 4 - 0

b e t w e e n

2 5 0

and

3 7 0 ) .

Th e


o f


i n

t h e

s o l u t i o n r e a c h e s

a

maximum,

w h i c h i s

h i g h e r

a t

2 5

t h a n

a t

3 7 0 ;

a f t e r t h i s i t

r e m a i n s

c o n s t a n t ,

w h i l e

more

g re en

p i g m e n t

i s

f o r m e d . At

f i r s t t h e l a t t e r

c o n t a i n s

l i t t l e

p r o t o h a e m o c h r o m o g e n ,

b u t l a t e r

t h e

p r o p o r t i o n

o f t h e

l a t t e r i n c r e a s e s .

F i n a l l y

t h e

c h o l e g l o l i n


b e g i n s

t o d e c r e a s e .

Up

t o t h i s

p o i n t

t h e r e i s

no

i n d i c a t i o n

o f

b y - r e a c t i o n s ,

t h e

sum o f


a n d

c h o l e h a e m a t i n c o m p o u n d s

b e i n g

a p p r o x i m a t e l y

1 0 0

.

I n

t h e

l a t e r

s t a g e s ,

a t

pH

8 - 5 l a t e r t h a n

a t

pH

- 2 ,

t h e r e i s

e v i d e n t l y d e s t r u c t i o n

o f


by

f u r t h e r o x i d a t i o n .

Su m

9 9 - 6

9 7 - 2

9 0 - 5

8 7 - 6

8 8 - 6

1 0 1 - 1

1 0 3 - 0

9 7 - 6

9 1 - 9

7 4 - 1

8 6 - 9

8 9 - 9

8 8 - 7

9 0 - 8

9 8 - 6

1 0 2 - 7

9 8 - 4


7/14

FORMATION

OF

CHOLEGLOBIN

FROM HAEMOGLOBIN

3 4 5

F o r m a t i o n


b y r e d u c i n g

s u b s t a n c e s

o t h e r

t h a n

a s c o r b i c

a c i d

O f

o t h e r r e d u c i n g

s u b s t a n c e s

r e d u c t o n

i s o f

p a r t i c u l a r

i n t e r e s t .

A n d e r s o n

H a r t [ 1 9 3 4 ]

d e s c r i b e t h e

f o r m a t i o n

o f

g r e e n

p i g m e n t

b y

g l u c o s e + g l y c i n e

+

ammonia

i n

a l k a l i n e p h o s p h a t e

b u f f e r s ,

a n d

i t

i s

p o s s i b l e

t h a t

r e d u c t o n ,

c h e m i c a l l y

c l o s e l y

r e l a t e d

t o

a s c o r b i c

a c i d ,

w a s

t h e

a c t i v e

a g e n t

i n

t h e s e

m i x t u r e s .

C r y s t a l -

l i n e

r e d u c t o n

w a s p r e p a r e d

a c c o r d i n g

t o

v .

E u l e r M a r t i u s

[ 1 9 3 3 ] .

I t

i s

s e e n

f r o m

t h e d a t a

i n

T a b l e

5

t h a t i t u n d e r g o e s

c o u p l e d

o x i d a t i o n

w i t h


T a b l e 5 . F o r m a t i o n

o f


b y

r e d u c i n g

s u b s t a n c e s

o t h e r t h a n

a s c o r b i c

a c i d

pH

7 - 2 ,

3 7 0 ,


0 - 7 ,

r e d u c i n g

s u b s t a n c e s

i n a


e q u i v a l e n t

t o 1 0 0

m g .

p e r 1 0 0

m l .

o f

a s c o r b i c

a c i d ,

i n

t h e

c a s e o f t h i o l a c e t i c

a c i d t o 5 0 m g .

p e r 1 0 0

m l .

o f

a s c o r b i c

a c i d .

I n

o f i n i t i a l h a e m o g l o b i n

C h o l e -

P r o t o -

T o t a l

R e d u c i n g

I n c u b a t i o n

C h o l e -

Haemo- h a e m o -

h a e m o -

c h o l e -

s u b s t a n c e s

t i m e g l o b i n

g l o b i n c h r o m o g e n

c h r o m o g e n

haem

Su m

A s c o r b i c

a c i d

9 0

m i n .

2 5 - 4 6 1 - 9

1 8 - 3

0 - 3

4 3 - 7

1 0 5 - 9

R e d u c t o n

( c r y s t a l l i n e ) 9 0 m i n .

3 3 - 8

5 4 - 6

8 - 4

4 - 6

4 2 - 2 1 0 1 - 4

T h i o l a c e t i c

a c i d 9 0

m i n .

1 9 - 5

7 1 - 5

4 - 2

6 - 6

2 3 - 7

1 0 1 - 8

G l u t a t h i o n e ,

c r y s t a l -

1 9

h r .

2 4 - 4

6 5 - 6 5 - 6

4 - 8

3 0 - 0

A s s u m e d

l i n e

1 0 0

G l u t a t h i o n e ,

p u r i f i e d

1 8 j h r .

6 - 5

S m a l l

amount

i n s o l u b l e

o v e r

C d - s a l t

i n

NaOH

a n d c a u s e s

a s r a p i d

a

f o r m a t i o n

o f


a s a s c o r b i c a c i d .

W e

w e r e ,

h o w e v e r ,

u n a b l e

t o f i n d r e d u c t o n

i n

t h e

m i x t u r e

u s e d

b y A n d e r s o n

H a r t

b y

t h e i n d o p h e n o l

r e d u c t i o n

t e s t .

T h i o l a c e t i c a c i d

a l s o

f o r m e d

c h o l e g l o b i n o n l y

s l i g h t l y

l e s s r a p i d l y

t h a n

d i d

a s c o r b i c

a c i d .

G l u t a t h i o n e

c a u s e d

o n l y

a v e r y s l o w

r e a c t i o n ,

a n d

e v e n

t h i s s e e m s

t o

b e b r o u g h t

a b o u t b y i m p u r i t i e s .

T h e r e

w a s

c o n s i d e r a b l y

l e s s


f o r m e d

when

g l u t a t h i o n e

p u r i f i e d

o v e r

i t s

c a d m i u m

s a l t

was u s e d .

W i t h

c y s t e i n e

n o f o r m a t i o n

o f


w a s o b s e r v e d ,

a l t h o u g h

a

s m a l l

amount o f

g r e e n p r e c i p i t a t e

was

f o r m e d .

B o t h


a n d

c y s t e i n e

c a u s e d

a

c o n s i d e r a b l e

f o r m a t i o n

o f

m e t h a e m o g l o b i n ( c f .

T a b l e 6 ) .

F o r m a t i o n


i n t h e

p r e s e n c e

o f

l o w

c o n c e n t r a t i o n s

o f

a s c o r b i c

a c i d

T h e


d e s c r i b e d

h i t h e r t o

w e r e

c a r r i e d o u t

w i t h

a s c o r b i c

a c i d

c o h e e n t r a t i o n s

o f

5 0 - 1 0 0 m g .

p e r

1 0 0

m l .

I n t i s s u e c e l l s

t h e c o n c e n t r a t i o n

o f

a s c o r b i c

a c i d i s s m a l l e r , o f

t h e

o r d e r o f

5 - 5 0 m g . p e r

1 0 0

m l .

( c f .

G i r o u d

[ 1 9 3 7 ] ) .

I n

g u i n e a - p i g

s p l e e n

w e f o u n d

v a l u e s o f 6 - 1 5 m g .

p e r

1 0 0 m l . w i t h

a n

a v e r a g e

o f

1 0 - 7

m g .

p e r 1 0 0 m l .

W e

h a v e ,

t h e r e f o r e ,

c a r r i e d o u t

some


w i t h

l o w e r a s c o r b i c

a c i d

c o n c e n t r a t i o n s .

I t m u s t

b e b o r n e

i n

m i n d

t h a t w i t h

t h e c o m p a r a t i v e l y

l a r g e


c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d

f o r

t h e q u a n t i t a t i v e s t u d y

o f


f o r m a t i o n ,

t h e s e

s m a l l a m o u n t s o f

a s c o r b i c

a c i d a r e

r a p i d l y

d e s t r o y e d .

I n t h e

t i s s u e s ,

h o w e v e r ,

f r e s h


c a n b e

made

a v a i l a b l e

b y b a c k - r e d u c t i o n

o f

d e h y d r o a s c o r b i c

a c i d w i t h

r e d u c e d

' g l u t a t h i o n e

[ B o r s o o k

e t

a l . 1 9 3 7 ;

S c h u l t z e

e t

a l . 1 9 3 7 - 3 8 ;

c f .

a l s o

G e n e v o i s

C a y r o l ,

1 9 3 9 ] .

L e m b e r g

e t

a l .

[ 1 9 3 8 ,

1 ]

h a v e

s h o w n

t h a t

r e d u c e d


s a v e s

a s c o r b i c

a c i d

f r o m

t h e o x i d a t i o n

b y

h a e m o c h r o m o g e n

a n d

d o e s n o t p r e v e n t

t h e o x i d a t i o n

o f


t o

v e r d o h a e m o c h r o m o g e n .

R e d u c e d


a c c o m p a n i e s

a s c o r b i c

a c i d i n

t h e

c e l l s o f

l i v e r a n d s p l e e n

i n

r a t h e r h i g h

c o n c e n t r a t i o n .

I n

g u i n e a - p i g

s p l e e n

w e

f o u n d

2 0 7

m g .

r e d u c e d


p e r

1 0 0

g .

o f

f r e s h

o r g a n .

W e

h a v e

t h e r e f o r e


8/14

- 3 4 6

R . LEMBERG,

J . W . LEGGE

AND

W.

H .

LOCKWOOD'

s t u d i e d t h e

- a c t i o n

o f

s m a l l


o f a s c o r b i c

a c i d o n


i n t h e

a b s e n c e

a n d i n

t h e p r e s e n c e

o f g l u t a t h i o n e

o n t h e f o r m a t i o n

o f


a n d t h e r e s u l t s

a r e g i v e n i n

T a b l e

6 .

T a b l e 6 . F o r m a t i o n

o f


w i t h

l o w


o f

a s c o r b i c

a c i d

i n

t h e

p r e s e n c e

o f


0 - 1 4

g .

o f


i n

2 0

m l .

p h o s p h a t e

b u f f e r

p H 7 - 2 ,

3 7 0

C 6 3 0

O f

C O -

h a e m o c h r o -

B i l i v e r d i n

A s c o r b i c

m o g e n s a f t e r

a f t e r

a c i d

a c i d GSH

9 0

mim

s p l i t t i n g

S p e c t r o s c o p i c

o b s e r v a t i o n s

m g .

m g .

i n c u b a t i o n

o f

5 m l .

a f t e r

2 i

h r .

i n c u b a t i o n

0 - 2 7

None O x y h a e m o g l o b i n

- 5 0

0 3 9

T r a c e O x y h a e m o g l o b i n

a n d m e t h a e m o -

g l o b i n ;

b a n d 6 3 4

m h d i s a p p e a r i n g

o n r e d u c t i o n

w i t h

N a 2 S 2 0 4

2

0 - 6 2 T r a c e

Band

a t

6 3 0

m r /

r e s i s t a n t

t o

N a 2 S 2 0 4

2

5 0

1 - 0 5

C o n s i d e r a b l e

B a n d

a t

6 3 0

m r

r e s i s t a n t

t o

N a 2 S 2 0 ;

amount

s o m e

g r e e n

p i g m e n t

2 0

2 - 0 7

L a r g e

a m o u n t

B a n d

a t 6 3 0 mZ

r e s i s t a n t

t o

N a 2 S 2 O 4 ;

l a r g e

amount o f

g i e e n

p i g m e n t

Even

s m a l l


( 1 0

m g .

p e r

1 0 0

m l . ) o f


c a u s e

a

n o t i c e a b l e

f o r m a t i o n

o f c h o l e g l o b i n ,

much

l a r g e r t h a n

t h a t p r o d u c e d

by g l u t a -

t h i o n e

i n

a


o f

2 5 0 m g . p e r 1 0 0

m l . I n t h e p r e s e n c e

o f b o t h


a n d a s c o r b i c

a c i d m o r e


i s f o r m e d t h a n b y


a l o n e ,

a n d

t h e

i n c r e a s e

i n

a b s o r p t i o n

i s

s i g n i f i c a n t l y

l a r g e r

t h a n c a n

b e

e x p l a i n e d

b y

a d d i t i v e

e f f e c t .

U n d e r

t h e c o n d i t i o n s

p r e v a i l i n g

i n

t h e

t i s s u e

c e l l h a e m o g l o b i n

m u s t ,

t h e r e f o r e , u n d e r g o

o x i d a t i o n t o

c h o l e g l o b i n .

A c t u a l l y

t h e c o n d i t i o n

i n

t h e

t i s s u e

c e l l s

i s

e v e n

more

f a v o u r a b l e

t h a n -

i n

o u r

e x p e r i m e n t ,

a s

i t

w i l l

b e

s e e n

b e l o w

t h a t l o w o x y g e n

p r e s s u r e

i n c r e a s e s

t h e

r a t e

o f


f o r m a t i o n

w h i l e

n o t

a f f e c t i n g

t h e


o f a s c o r b i c a c i d .

R a t e

o f



a n d

e f f e c t o f

o x y g e n

p a r t i a l p r e s s u r e

o n

t h e o x i d a t i o n o f h a e m o g l o b i n

a n d


T a b l e 7 g i v e s

t h e p e r c e n t a g e

l o s s e s

o f

a s c o r b i c

a c i d

, d u r i n g

t h e

i n c u b a t i o n

o f

a s c o r b i c

a c i d

( 1 0 0

m g . p e r

1 0 0

m l . )

w i t h a

0 7


s o l u t i o w a t

3 7 0

a n d

pH

7 - 2

a n d 8 - 5 ;

t h e

r e a c t i o n

m i x t u r e was

k e p t

i n

f l a t c u l t u r e '

f l a s k s

u n d e r

t h e c o n d i t i o n s

p r e v i o u s l y

d e s c r i b e d .

T a b l e

7 .

A s c o r b i c

a c i d


l 8 s s

o f

a s c o r b i c

a c i d

I n c u b a t i o n

t i m e

i n

m i n .

pH

7 - 2

pH

8 - 5

3 0

1 0

2 6

4 5

-

6 0

2 3

9 0

3 1

4 5

1 2 0

4 0

1 5 5

5 5

1 8 0

5 1

2 2 5

7 4

By

c o m p a r i s o n

w i t h ' t h e

r a t e

o f


f o r m a t i o n

g i v e n

i n

T a b l e

3

t h e

o x i d a t i o n

r a t i o - m o l e c u l e s

o f

a s c o r b i c

a c i d o x i d i z e d

p e r m o l e c u l e s o f

h a e m o -


9/14

FORMATION

QF

CHOLEGLOBIN

FROM

HAEMOGLOBIN

3 4 7

g l o b i n o x i d i z e d

t o

c h o l e g l o b i n - c a n b e

f o u n d f o r

t h e ' t i m e

e x p e r i m e n t s .

T h i s

r a t i o i s 1 0 - 6

a f t e r

3 0

m i n .

a n d

1 1 - 7 a f t e r

8 0

m i n . i n c u b a t i o n

a t

pH

8 - 5 ; a t

pH

7 - 2

t h e

v a l u e s

a r e 9 - 6

a f t e r

3 0

m i n .

a n d

1 4 - 0

a f t e r 1 2 0

m i n . I f 1

m o l .

0 2

i s r e q u i r e d

t o o x i d i z e


t o c h o l e g l o b i n

a n d 0 - 5 m o l . t o

o x k l i z e

a s c o r b i c

a c i d

t o


a c i d ,

a b o u t

o n e - s i x t h

o f t h e

0 2

t a k e n

u p

d u r i n g

t h e f i r s t

3 0 m i n .

a t

e i t h e r

pH i s

u s e d f o r t h e



a n d

f i v e -

s i x t h s f o r

t h a t o f

a s c o r b i c

a c i d .

A c t u a l l y s o m e w h a t m o r e

0 2

w i l l

b e u s e d

f o r t h e

f u r t h e r



a c i d .

I n

o r d e r

t o s t u d y t h e

e f f e c t

o f

t h e

0 2 p a r t i a l

p r e s s u r e o n

t h e

o x i d a t i o n

o f

h a e m o g l o b i n a n d

a s c o r b i c

a c i d a n d

o n t h e

o x i d a t i o n r a t i o

u n d e r

m o r e

d e f i n e d

c o n d i t i o n s

we h a v e c a r r i e d

o u t e x p e r i m e n t s i n

W a r b u r g

f l a s k s

i n

w h i c h t h e

r e a c t i o n

m i x t u r e w a s

s h a k e n

w i t h a i r a n d

w i t h a

n i t r o g e n - a i r

m i x t u r e c o n -

t a i n i n g 2

0 2 .

W e

h a v e s h o w n

[ L e m b e r g e t a l .

1 9 3 8 2 ] t h a t

i n t h e

c o u p l e d


p y r i d i n e


a n d


l o w e r i n g o f t h e

0 2


d e c r e a s e s t h e

o x i d a t i o n

r a t i o f r o m 5 9 i n

0 2 t o 3 2 i n

a i r

a n d t o

1 2

i n

a

n i t r o g e n - a i r

m i x t u r e c o n t a i n i n g

4

0 2 . T h e r a t e o f

o x i d a t i o n

o f

p y r i d i n e -

h a e m o c h r o m o g e n i

w a s

l i t t l e

a f f e c t e d ,

w h i l e

t h a t

o f

t h e

a s c o r b i c

a c i d

o x i d a t i o n

w a s

p r o p o r t i o n a l

t o ' t h e

0 2 p a r t i a l

p r e s s u r e . T a b l e

8 s h o w s

t h a t

i n t h e

c o u p l e d

T a b l e

8 .

E f f e c t o f

0 2 p r e s s u r e

o n


f o r m a t i o n a n d



H a e m o g l o b i n

0 . 7

; a s c o r b i c

a c i d

1 0 0

m g . . p e r 1 0 0 m l . ; pH

7 - 2 ;

3 7 .

T o t a l v o l u m e

o f s o l u t i o n :

2 - 6 m l . ; i n

c e n t r a l c u p , 0 - 4

m l . KOH.

C h o l e -

g l o b i n

A p c o r b i c

i n

o f

( m o l .

0 2

c o n s u m e d ) /

P i p e r i d i n e I n c u b a t i o n

0 2 c o n -

a c i d

o r i g i n a l

F o r m a t i o n ( m o l . c h o l e g l o b i n

0

c o n -

d i t h i o -

t i m e

s u m p t i o n

o x i d a t i o n h a e m o - i n

O x i d a t i o n

f o r m e d )

c e n t r a t i o n

c a r b a m a t e

m i n .

, u m o l .

, u m o l .

g l o b i n

, u m o l .

r a t i o

2 0

A b s e n t

3 0

2 - 4 1

4 - 0 6

4 - 8

0 - 0 5

8 1

4 8

4 5

2 - 9 0 4 - 9 2 9 - 9

0 - 1 0 4 9

2 9

S t a n d i n g

A b s e n t 3 0

1 - 4 8 1 4 - 1

0155

1 0

i n

a i r

2

A b s e n t 3 0

2 - 3 4 4 - 5 2

4 5

3 - 1 1

5 - 8 0

3 8 - 1 0 - 3 8

1 5

8 - 5

2 0

1 0 0

i g .

3 0

4 - 7

4 5

6 - 5

2 3 - 8

0 - 2 3

< 5 4

2 8

2

1 0 0

t g .

3 0

3 - 9

4 5

5 - 1

6 0

0 - 5 8 '1 6

9

o x i d a t i o n

o f


a n d

a s c o r b i c

a c i d t h e

o x i d a t i o n r a t i o

i s

a l s o much

l o w e r w i t h

l o w

0 2

c o n c e n t r a t i o n .

H e r e ,

h o w e v e r ,

t h e

r a t e

o f o x i d a t i o n

o f

a s c o r b i c

a c i d

i s l i t t l e

a f f e c t e d , w h i l e

t h a t o f t h e


f o r m a t i o n i s

g r e a t l y i n c r e a s e d

w i t h

l o w

0 2

c o n c e n t r a t i o n s .

W h a t e v e r

m ay b e

t h e

c o r r e c t e x p l a n a t i o n

o f t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m

( c f .

b e l o w ) ,

i t i s c l e a r t h a t

t h e

l o w

0 2

p r e s s u r e i n t h e t i s s u e

c e l l s

f a v o u r s t h e

o x i d a t i o n

o f


t o


T h e

r a t e o f


f o r m a t i o n

i n

l a k e d

e r y t h r o c y t e s

F o r

t h e


d e s c r i b e d

h i t h e r t o ,

s o l u t i o n s o f

c r y s t a l l i n e

h o r s e

o x y -


w e r e

u s e d . T a b l e 9

g i v e s t h e

m e a s u r e m e n t s o f

t h e

v e l o c i t y

o f


f o r m a t i o n b y

c o u p l e d

o x i d a t i o n

w i t h a s c o r b i c a c i d

u n d e r

t h e

s a m e c o n -

d i t i o n s

a s

t h o s e o f

T a b l e

3 ,

u s i n g , h o w e v e r ,

l a k e d

h o r s e


d i l u t e d

t o

a



o f

0 - 7 2

,

i n s t e a d

o f

t h e

s o l u t i o n

o f


B i o c h e m .

1 9 4 1 ,

3 5

2 3


10/14

3 4 8

R . LEMBERG,

J . W.

LEGGE

AND

W .

H .

LOCKWOOD

T a b l e 9 .

C h o l e g l o b i n f o r m a t i o n

i n

l a k e d c e l l s

w i t h a s c o r b i c a c i d

C h o l e g l o b i n

i n

o f

i n i t i a l h a e m o g l o b i n

L a k e d

I n c u b a t i o n

d e s t r o m a t i z e d

C o n d i t i o n s

t i m e

i n m i n . L a k e d

c e l l s c e l l s

pH

7 * 2 , 3 7 0

1 5 1 - 3 5 - 3

3 0

5 * 1 1 5 * 0

pH

8 5 5 , 3 7 0

1 5

2 2

3 0 3 5

A

c o m p a r i s o n

w i t h

t h e

d a t a

c o m p i l e d

i n T a b l e

3

s h o w s

t h a t

a t

p H 8 - 5 t h e

r e a c t i o n v e l o c i t y i s

a l m o s t t h e s a m e , when l a k e d

h o r s e

c e l l s a r e

u s e d i n s t e a d o f

a

s o l u t i o n

o f

h o r s e


A t

p H

7 - 2 ,

h o w e v e r ,


i s

f o r m e d

much

m o r e

s l o w l y

f r o m l a k e d

r e d

c e l l s .

T h i s i n d i c a t e s

t h e p r e s e n c e i n

t h e e r y t h r o -

c y t e s

o f a

f a c t o r

i n h i b i t i n g

t h e

f 6 r m a t i o n o f c h o l e g l o b i n . T h i s

f a c t o r i s c o n t a i n e d

i n

t h e s t r o m a t a .

When

t h e s t r o m a t a

a r e

r e m o v e d

b y

k e e p i n g

t h e l a ke d

c e l l s

a t

a

pH

o f

5 - 8

i n

t h e

r e f r i g e r a t o r

a n d

c e n t r i f u g i n g ,

t h e


o f

t h e d e s t r o m a t i z e t

r e d

c e l l s

i s

now a t t a c k e d

b y a s c o r b i c a c i d a n d 0 2 a s r a p i d l y a s t h a t

i n a

s o l u t i o n

o f

c r y s t a l l i n e


T h e s e


h e l p

u s

t o e x p l a i n why t h e r e i s n o , o r

a t

l e a s t

o n l y

a

v e r y s l o w ,

f o r m a t i o n

o f


i n

t h e

r e d

c e l l s .

From

t h e

f i g u r e s

g i v e n i n

T a b l e 6

i t c a n b e

c a l c u l a t e d t h a t ,

i n t h e

p r e s e n c e

o f 2 5 0 m g .

p e r

1 0 0

m l .

o f

g l u t a t h i o n e , a s c o r b i c a c i d

i n

a

c o n c e n t r a t i o n o f

1 0 m g . p e r

1 0 0

m l .

i s

s t i l l

a b l e t o

t r a n s f o r m 1 2

o f

0 7


i n t o c h o l e g l o b i n i n

9 0

m i n .

T h e

c o n c e n -

t r a t i o n o f a s c o r b i c

a c i d

i n t h e


i s s t i l l


s m a l l e r .

I n

r a b b i t e r y t h r o c y t e s we f o u n d

o n l y 0 3 5 m g . p e r 1 0 0

m l . ,


l e s s

t h a n

t h e

v a l u e s

r e p o r t e d b y S t e p h e n s

H a w l e y [ 1 9 3 6 ] f o r

human


( 0 8 5 - V 1 2

m g .

p e r

1 0 0

m l . ) ;

i n r a b b i t ' s

p l a s m a

a r e

f o u n d

h i g h e r


t h a n

i n

t h e c e l l s

( 0 . 8 - I 9

m g . p e r 1 0 0

m l . ) ,

w h i l e

S t e p h e n s

H a w l e y

r e p o r t

1 - 1 - 1 * 3 5

m g . p e r

1 0 0

m l .

f o r

n o r m a l human

p l a s m a .

From

o u r

f i g u r e s

i t

c a n

b e

c o n c l u d e d

t h a t t h e m e m b r a n e o f

t h e

r e d c e l l

o f f e r s s o m e p r o t e c t i o n

t o t h e h a e m o -

g l o b i n

c o n t a i n e d

i n

i t

b y

i t s

v e r y

i n c o m p l e t e p e r m e a b i l i t y t o

a s c o r b i c

a c i d

[ c f .

a l s o

B o r s o o k

e t a t .

1 9 3 7 ] .

E v e n

s o

o n e

w o u l d

s t i l l

e x p e c t

a

s l o w ,

b u t

s u b s t a n t i a l



i n

t h e

e r y t h r o c y t e s .

T h i s

i s f u r t h e r

d e c r e a s e d ,

i f

n o t

p r e v e n t e d , b y

t h e

i n h i b i t i n g

f a c t o r

i n

t h e

s t r o m a , w h i c h

i n t h e c e l l i s

p r o b a b l y

s t i l l much

m o r e

e f f e c t i v e

t h a n

i n

t h e

g r e a t

d i l u t i o n i n

w h i c h

i t

i s

p r e s e n t

i n o u r

d i l u t e

l a k e d c e l l

s o l u t i o n s . W h e t h e r t h e s e

f a c t o r s

a r e a b l e

t o

p r e v e n t

t h e

f o r m a -

t i o n o f

c h o l e g l o b i n o r

o t h e r b i l e

p i g m e n t - h a e m o g l o b i n s

i n

t h e .

r e d

c e l l

c o m p l e t e l y ,

i s

d o u b t f u l ,

a n d

t h i s

p r o b l e m

w i l l

b e

d i s c u s s e d

i n

t h e

s u c c e e d i n g

p a p e r .

T h e

p r o t e c t i o n

o f

t h e

p l a s m a


f r o m o x i d a t i o n

b y

t h e r e d c e l l s

[ K a s s a n

R o e , 1 9 4 0 ]

i s

p r o b a b l y

d u e t o t h i s

s t r o m a

f a c t o r

r a t h e r

t h a n

t o

t h e

g l u t a t h i o n e ' o f

t h e

r e d

c e l l ,

w i t h w h i c h

t h e

p l a s m a


i s n o t i n d i r e c t

c o n t a c t ;

B o r s o o k e t a l .

[ 1 9 3 7 ]

d i d

n o t

f i n d

e v i d e n c e f o r

t h e

r e d u c t i o n

o f

d e h y d r o -

a s c o r b i c

a c i d

a d d e d

t o b l o o d . T h e

r a p i d


o f

a s c o r b i c

a c i d i n t h e

b l o o d

f o l l o w i n g h a e m o l y s i s

i s

d u e

t o t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n w i t h

h a e m o g l o b i n .

T h e r e a c t i o n

m e c h a n i s m

I n

P a r t

1 o f

t h i s s e r i e s

[ L e m b e r g

e t

a t .

1 9 3 9 ]

w e h a v e s h o w n t h a t t h e f o r m a t i o n

o f


b y

t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n

o f


w i t h

a s c o r b i c

a c i d c a n n o t

b e

d u e

t o

h y d r o g e n p e r o x i d e

f o r m e d

b y

a u t o x i d a t i o n

o f

a s c o r b i c

a c i d ,

s i n c e

t h e

r e a c t i o n

t a k e s

p l a c e

i n

t h e

p r e s e n c e

o f

c o p p e r

i n h i b i t o r s

w h i c h

p r e v e n t

t h e


11/14

FORMATION

OF

CHOLEGLOBIN

FROM HAEMOGLOBIN

a u t o x i d a t i o n .

N e v e r t h e l e s s ,

h y d r o g e n

p e r o x i d e

a c t i n g o n h a e m o g l o b i n i n t h e

p r e s e n c e o f

a s c o r b i c a c i d ' f o r m s c h o l e g l o b i n .

W e h a v e

e x p l a i n e d t h e s e

f a c t s

b y

a s s u m i n g a s f i r s t

s t e p

o f t h e

r e a c t i o n h y d r o g e n t r a n s f e r

f r o m

a s c o r b i c

a c i d

t o

o x y h a e m o g l o b i n w i t h ' t h e

f o r m a t i o n

o f

a

f e r r o u s

h a e m o g l o b i n - H 2 0 2

c o m p o u n d ,

a n d

h a v e a s s u m e d ' t h e

f o l l o w i n g

c y c l e

X n

o r d e r t o

e x p l a i n

t h e d e s t r u c t i o n

o f

many m o r e


m o l e c u l e s

t h a n


m o l e c u l e s

i n

t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n :

H 4 .

H 2 0 2


Hb

r e d u c e d

h a e m o g l o b m

+

L 2 A A

0 2

H b O 2

o x y h a e m o g l o b m

H b O 2

HbOH

HbOH m e t h a e m o g l o b i n

+

0 2

+

H 2 A

H,A a s c o r b i c a c i d

Hb

W e

a s s u m e t h e

f e r r o u s

h a e m o g l o b i n - h y d r o g e n p e r o x i d e c o m p o u n d

t o

u n d e r g o

a n

i n t r a m o l e c u l a r

p e r o x i d a t i v e

r e a c t i o n ,

t h e

p o r p h y r i n r i n g

b e i n g o x i d i z e d

b y

t h e

0 2

o f . t h e

i r o n - b o u n d


o f t h e same

m o l e c u l e .

T h e

r e a c t i o n m e c h a n i s m o f t h e

f o r m a t i o n

o f

v e r d o h a e m o c h r o m o g e n f r o m

p y r i d i n e - h a e m o c h r o m o g e n b y

c o u p l e d

o x i d a t i o n

w i t h

a s c o r b i c

a c i d

was

e x p l a i n e d

i n

a

s i m i l a r

way [ L e m b e r g e t a l .

1 9 3 8 1 , 2 ] .

W e

h a v e

f o u n d t h a t

h y d r o g e n

p e r o x i d e a c t i n g

o n

p y r i d i n e - h a e m o c h r o m o g e n

i n t h e

p r e s e n c e

o f

a s c o r b i c

a c i d

a n d i n t h e

a b s e n c e

o f

0 2

l e a d s

t o a p r e c u r s o r

o f

v e r d o h a e m o c h r o m o g e n

[ L e m b e r g

e t

a l .

1 9 3 8 , 2 ] .

T h e

g r e e n c o m p o u n d

o b t a i n e d

b y

H a u r o w i t z

[ 1 9 3 7 ]

b y

r e d u c t i o n

o f t h e f e r r i c

p y r i d i n e

h a e m o c h r o m o g e n - h y d r o g e n p e r o x i d e c o m p o u n d b y p y r o -

g a l l o l

i s

a l s o

v e r d o h a e m o c h r o m o g e n .

H y d r o g e n p e r o x i d e

f o r m s


f r o m


i n

t h e

p r e s e n c e

o f

a s c o r b i c a c i d .

W e h a v e

now

f o u n d t h a t e v e n

i n t h e

a b s e n c e o f

r e d u c i n g

s u b s t a n c e s


c a u s e s a

s u b s t a n t i a l f o r m a t i o n

o f


f r o m r e d u c e d

h a e m o g l o b i n ,

w h i l e

much

l e s s

i s

f o r m e d

f r o m


To

3 - 5

m l .

o f

a n

0 7


s o l u t i o n ,

r e d u c e d

b y

e v a c u a t i o n

u n d e r

n i t r o g e n , 05

m l . o f

0 - 6

h y d r o g e n

p e r o x i d e

w a s a d d e d u n d e r

n i t r o g e n .

A f t e r 2

m i n .

a t

2 0

t h e

e x c e s s h y d r o g e n

p e r o x i d e

w a s

d e s t r o y e d

b y

a

d r o p

o f

c a t a l a s e

s o l u t i o n

a n d

t h e

c h o l e g l o b i n c o n t e n t

d e t e r m i n e d

s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y .

I t was

f o u n d

t h a t 1 6

o f

t h e r e d u c e d


h a d

b e c o m e

t r a n s f o r m e d i n t o


I f

o x y -


r e a c t e d

w i t h


u n d e r

t h e

same

c o n d i t i o n s

b u t

i n

a i r , o n l y

7

was t r a n s f o r m e d

i n t o


M e t h a e m o g l o b i n y i e l d e d

6


u n d e r

n i t r o g e n . H y d r o g e n p e r o x i d e

i s

e v i d e n t l y

a b l e t o r e d u c e

some

m e t h a e m o g l o b i n

t o


i p t h e s a m e

way

a s

c a t a l a s e i s

r e d u c e d

t o

i t s

f e r r o u s

f o r m

b y h y d r o g e n

J p e r o x i d e

[ K e i l i n

H a r t r e e , 1 9 3 7 ] .

T h e s e o b s e r v a t i o n s s h o w t h a t t h e e f f e c t o f

t h e

0 2

p r e s s u r e

o n t h e

o x i d a t i o n

r a t i o

( c f .

a b o v e

a n d

T a b l e

8 )

c a n

b e

u n d e r s t o o d

a s

a u t o x i d a t i o n

o f

t h e

f e r r o u s

h a e m o g l o b i n - H 2 0 2 c o m p o u n d

c o m p e t i n g

w i t h i t s

t r a n s f o r m a t i o n t o


T h e

m e t h a e m o g l o b i n - h y d r o g e n

p e r o x i d e

c o m p o u n d

i s known t o

b e

u n s t a b l e

a n d

t o

g i v e

m e t h a e m o g l o b i n .

T h e

f a c t t h a t

h i g h 0 2

p r e s s u r e

l o w e r s

t h e

o x i d a t i o n

r a t i o

c a n n o t

b e

e x p l a i n e d b y

t h e

a s s u m p t i o n

t h a t

t h e a u t o x i d a t i o n o f

a s c o r b i c

a c i d

c o m p e t e s

w i t h

i t s

c o u p l e d

o x i d a t i o n

w i t b

h a e m o g l o b i n ,

s i n c e

e v e n

a t

h i g h

0 2 p r e s s u r e c o p p e r i n h i b i t o r d o e s

n o t

d i m i n i s h t h e o x i d a t i o n

r a t i o

a n d t h e

e f f e c t

o f

0 2 p r e s s u r e

i n

t h e

o x i d a t i o n

r a t i o

i n

t h e p r e s e n c e

- o f

c o p p e r

i n h i b i t o r i s

t h e

s a m e

a s

i n i t s

a b s e n c e .

W e

h a v e

a s c e r t a i n e d t h a t


c a n b e an

i n t e r m e d i a t e

p r o d u c t

i n t h e

c y c l e .

I t

r e a c t s

w i t h

a b o u t

t h e same

v e l o c i t y

a s

o x y h a e m o g l o b i n ,

a n d

t h e

e f f e c t

o f

0 2

p r e s s u r e

o n

t h e

r a t i o

' m o l .

o f

0 2

c o n s u m e d

t o

m o l . o f

2 3 - 2

3 4 9


12/14

3 5 0 R . LEMBERG, J . W.

LEGGE

AND W. H . LOCKWOOD

T a b l e 1 0 .


f o r m a t i o n

f r o m m e t h a e m o g l o b i n

M e t h a e m o g l o b i n

0

7 ; a s c o r b i c

a c i d

1 0 0 m g . p e r

1 0 0 m l . ; pH 7 - 2 ;

3 7 V .

V o l u m e

o f s o l u t i o n : 2 - 6 m l . ; i n c e n t r a l c u p , 0 - 4 m l . KOH.

C h o l e g l o b i n f o r m a t i o n

0 2

I n c u b a t i o n

0 2

I n

o f

R a t i o

c o n c e n -

t i m e

u p t a k e

o r i g i n a l

I n ( m o l .

0 2

c o n s u m e d ) /

t r a t i o n m i n .

i n

, u m o l . h a e m o g l o b i n , u m 6 l .

( m o l .


f o r m e d )

2 0

1

0 - 3 6

1 5

1 * 6 9

3 0

2 * 5 9

4 5 3 - 3 5

8 - 4 0 - 0 9 4 3 6

2

1

0 - 1 3

1 5

1 - 2 0

3 0

2 * 0 0

-

4 5 2 - 9 0

2 4 - 6

0 - 2 7 6

1 0 - 5


f o r m e d '

i s

t h e

same a s

w i t h


( c o m p a r e

T a b l e 1 0

w i t h T a b l e

8 ) .

W h i l e

t h e

e f f e c t s o f

t h e

0 2 p r e s s u r e

on

t h e

o x i d a t i o n

r a t i o s

i n


a n d


f o r m a t i o n

a n d

o n t h e r e a c t i o n

v e l o c i t i e s o f

v e r d o h a e m o -

c h r o m o g e n

f o r m a t i o n

a n d

d e s t r u c t i o n o f a s c o r b i c a c i d

i n

i t

c a n

b e u n d e r s t o o d

b y

t h e n o t i o n

t h a t t h e

a u t o x i d i z a b l e

f e r r o u s haem

c o m p o u n d s u n d e r g o

o x i d a t i o n

o f t h e i r

p r o s t h e t i c

g r o u p s ,

i t

s t i l l

r e m a i n s

u n e x p l a i n e d why

t h e

o p t i m u m

o f t h e

r a t e


f o r m a t i o n

i s

a t

l o w

0 2 p r e s s u r e

( c f .

T a b l e

8 ) ,

w h i l e t h e r a t e

o f


f o r m a t i o n

d o e s

n o t

d e p e n d

o n

0 2 .

S i n c e

t h e

e f f e c t s

o f

t h e

0 2

p r e s s u r e

o n

t h e

o x i d a t i o n

o f a s c o r b i c

a c i d

a l s o

d i f f e r i n

b o t h

c a s e s

i n

a n

a n a l o g o u s

m a n n e r

( a h i g h 0 2 p r e s s u r e

f a v o u r i n g

t h e

d e s t r u c t i o n o f

a s c o r b i c

a c i d

i n

t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n

w i t h

p y r i d i n e - h a e m o c h r o m o g e n ,

b u t

no i n f l u e n c e

O f

0 2

p r e s s u r e

o n

a s c o r b i c

a c i d

- o x i d a t i o n w i t h

h a e m o g l o b i n ) ,

i t i s

l i k e l y

t h a t

a n

e x p l a n a t i o n i

o f

t h e

p h e n o m e n o n

must

b e

c o n c e r n e d

w i t h

t h e

r e a c t i o n

i n i t i a t i n g

t h e

c y c l e ;

t h e

r e a c t i o n

o f


w i t h a s c o r b i c

a c i d .

T h e r e

i s

a

r e m a r k -

a b l e

p a r a l l e l

b e t w e e n


a n d


f o r m a t i o n s

f r o m

o x y h a e -

m o g l o b i n ,

t h e

r a t e s

o f b o t h

r e a c t i o n s

h a v i n g

maxima a t

l o w

0 2 p r e s s u r e s

i n

s p i t e o f

t h e f a c t

t h a t t h e

r e a c t i o n s

r e q u i r e

0 2 .

T h e

r a n g e

i n

w h i c h

t h i s

optimum

i s f o u n d ,

i s o n e

i n w h i c h

t h e r e

i s

p a r t i a l

d i s s o c i a t i o n o f


T h e


o f

B r o o k s

[ 1 9 3 5 ]

make

i t

l i k e l y

t h a t t h e

e x p l a n a t i o n

h a s

t o

b e '

s o u g h t

i n

an i n t e r m e d i a t e

b e t w e e n

H b 4

a n d

H b 4 0 8 ,

e . g . H b 4 0 2 ,

b e i n g

t h e

s u b -

s t a n c e c o n v e r t e d

i n t o

m e t h a e m o g l o b i n .

T h e

same

a p p l i e s p r o b a b l y

t o

c h o l e -

g l o b i n f o r m a t i o n .

B r o o k s

h i m s e l f

r e j e c t s

t h i s


o n

t h e b a s i s o f

c a l c u -

l a t i o n s

i n v o l v i n g

v a r i o u s

c o n s t a n t s w h i c h

h i t h e r t o

h a v e n o t

b e e n

e s t a b l i s h e d

s e c u r e l y .

H i s

o w n


i s ,

h o w e v e r

q u i t e

u n s a t i s f a c t o r y . B e s i d e s

a s s u m i n g

a n

i n h i b i t i o n

b y

0 2

o f

o b s c u r e

n a t u r e ,

h e

b e l i e v e s

t h a t

t h e r a t e

o f


f o r m a t i o n

i s

p r o p o r t i o n a l

t o

t h e


o f

r e d u c e d


w h i c h

i s

d e c r e a s e d b y h i g h 0 2 p r e s s u r e .

B r o o k s o v e r l o o k s t h e

f a c t

t h a t

t h e


o f

r e d u c e d


i s

l o w

a t

h i g h

0 2 p r e s s u r e ,

b e c a u s e

i t

r e a c t s

more

r a p i d l y .

w i t h

0 2 .

T h e r e i s

no

r e a s o n

t o

a s s u m e t h a t

t h i s

r e a c t i o n

s h o u l d

l e a d t o


e x c l u s i v e l y ,

w h i l e

a n o t h e r

r e a c t i o n

o f

r e d u c e d


w i t h

0 2

w o u l d

y i e l d m e t h a e m o g l o b i n .

D I s C U S S I O N

I n

a

p r e v i o u s p a p e r [ L e m b e r g

e t

a l .

1 9 3 8 ,

1 ]

w e h a d

p u t

f o r w a r d

t h e

h y p o -

t h e s i s

t h a t

d e h y d r o a s c o r b i c a c i d ,

f o r m e d

b y

t h e

c o u p l e d

o x i d a t i o n

o f

h a e m o -

g l o b i n

a n d


d u r i n g

t h e

b i l e

p i g m e n t

f o r m a t i o n

i n v i v o ,

i s

r e d u c e d


13/14

FORMATION OF

CHOLEGLOBIN FROM

HAEMOGLOBIN

3 5 1

b a c k

t o a s c o r b i c a c i d

b y

r e d u c e d

g l u t a t h i o n e ,

a n d t h a t o x i d i z e d


i n

t u r n i s

r e d u c e d b y t h e g l u c o s e

d e h y d r o g e n a s e s y s t e m .

T h e

l a t t e r

a s s u m p t i o n

w a s

b a s e d

o n t h e e x p e r i m e n t s o f

Mann [ 1 9 3 2 ] .

M e a n w h i l e

S c h u l t z e e t

a l .

[ 1 9 3 9 ]

h a v e

s h o w n t h a t

n e i t h e r a s c o r b i c

a c i d

n o r g l u t a t h i o n e n o r

a m i x t u r e o f t h e

t w o

s u b s t a n c e s

c a n

a c t a s

a h y d r o g e n - c a r r y i n g s y s t e m

b e t w e e n

n i c o t i n e - h a e m o -

c h r o m o g e n

a n d t h e

g l u c o s e

d e h y d r o g e n a s e

s y s t e m o r

c o e n z y m e ,

T h i s r e s u l t

s c a r c e l y a f f e c t s

o u r h y p o t h e s i s

t h a t t h e

a s c o r b i c a c i d - g l u t a t h i o n e s y s t e m

p l a y s

a n i m p o r t a n t

p a r t

i n t h e

p h y s i o lo g i c a l d e s t r u c t i o n

o f

h a e m o g l o b i n , s i n c e i t i s

n o t

o f

i m p o r t a n c e how t h e


i s

r e s t o r e d . What p r i n c i p a l l y m a t t e r s

i s

t h a t

a s c o r b i c

a c i d

a n d


u n d e r g o

c o u p l e d

o x i d a t i o n u n d e r t h e c o n d i t i o n s

f o u n d i n t h e c e l l s

o f

t h o s e

o r g a n s i n

v h i c h

b i l e

p i g m e n t

f o r m a t i o n

t a k e s p l a c e ;

f o r ' t h i s

we b r i n g f o r w a r d

e v i d e n c e i n t h e

p r e s e n t

p a p e r . S e c o n d l y , a s c o r b i c a c i d

m u s t

b e somehow r e s t o r e d , b e c a u s e t h e

d a i l y h a e m o g l o b i n d e s t r u c t i o n

i n v o l v e s

t h e

o x i d a t i o n

o f

a

l a r g e r

a m o u n t

o f

a s c o r b i c

a c i d

t h a n i s r e p l a c e d i n

t h e f o o d .

T h e

f a c t

t h a t d e h y d r o a s c o r b i c

a c i d h a s a n t i s c o r b u t i c

a c t i v i t y m a k e s i t a l m o s t

c e r t a i n t h a t i t c a n b e r e d u c e d i n v i v o . S e v e r a l a u t h o r s ( c f . a b o v e )

h a v e s h o w n t h a t

r e d u c e d


i s

a b l e

t o

r e d u c e d e h y d r o a s c o r b i c

a c i d

i n

l i v e r c e l l s

a s w e l l

a s

i n

v i v o ,

b u t r e c e n t l y

S c h u l t z e

e t

a l .

[ 1 9 3 7 - 3 8 ] h a v e

t h r o w n

s o m e

d o u b t s o n

t h e

a c t u a l o c c u r r e n c e o f t h i s

r e a c t i o l a

i n v i v o .

W e

a g r e e

w i t h t h o s e a u t h o r s

t h a t

t h e i r

r e s u l t s make

i t

u n l i k e l y t h a t t h e

a s c o r b i c a c i d - g l u t a t h i o n e s y s t e m p l a y s a

m a j o r

r o l e

i n c e l l

r e s p i r a t i o n [ c f . K i n g ,

1 9 3 9 ] .

A

s w e e p i n g

g e n e r a l i z a t i o n

t h a t t h e

r e d u c t i o n o f d e h y d r o a s c o r b i c a c i d

b y g l u t a t h i o n e d o e s

n o t

o c c u r

i n t h e a n i m a l

b o d y w o u l d , h o w e v e r , n o t b e

j u s t i f i e d .

T h e

e x p e r i m e n t s o f S c h u l t z e e t

a l .

[ 1 9 3 7 - 3 8 ,

p .

4 0 3 ]

w e r e c a r r i e d o u t w i t h

a

p r o p o r t i o n

o f g l u t a t hi o ne t o

a s c o r b i c

a c i d w h i c h

was

much l o w e r

t h a n

t h a t a c t u a l l y

0350339 Coleglobina ascorbato

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