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1 INTRODUCCION En la presente investigación, se refiere al tema de la Caracterización de bacterias metalofijadoras de mercurio, presentes en las aguas del Río Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael), en la parroquia Tenguel, y que mediante la técnica de PCR-DGGE a través de su subunidad 16s RNA, para trabajos futuros de bioremediación de aguas contaminadas por metales pesados causados por la industria y la minería. Debido al alto desarrollo de la actividad industrial, la contaminación al medio ambiente y la destrucción de la flora y fauna de los ríos del Ecuador, es importante la ejecución de proyectos de investigación para establecer técnicas para remediar todo el daño ambiental causado durante estas últimas décadas. La característica principal de esta investigación, es proporcionar la información necesaria para poder realizar
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INTRODUCCION
En la presente investigacioacuten se refiere al tema de la Caracterizacioacuten de
bacterias metalofijadoras de mercurio presentes en las aguas del Riacuteo Gala
(aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguel y que mediante
la teacutecnica de PCR-DGGE a traveacutes de su subunidad 16s RNA para trabajos
futuros de bioremediacioacuten de aguas contaminadas por metales pesados
causados por la industria y la mineriacutea Debido al alto desarrollo de la actividad
industrial la contaminacioacuten al medio ambiente y la destruccioacuten de la flora y
fauna de los riacuteos del Ecuador es importante la ejecucioacuten de proyectos de
investigacioacuten para establecer teacutecnicas para remediar todo el dantildeo ambiental
causado durante estas uacuteltimas deacutecadas
La caracteriacutestica principal de esta investigacioacuten es proporcionar la informacioacuten
necesaria para poder realizar futuros trabajos relacionados con la buacutesqueda de
microorganismos con la finalidad de ser utilizados como maquinaria en
procesos de remediacioacuten bioloacutegica Cuya razoacuten es el desarrollo minero de esa
zona puesto que posee los riacuteos maacutes contaminados del sur del paiacutes y seguacuten
datos obtenidos del riacuteo Gala en sus aguas ya no se encuentran peces y la
calidad de las mismas no es apta para el consumo humano gracias a las altas
concentraciones de metales pesados entre ellas podemos citar las mas
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mortales como el plomo y el arseacutenico que se encuentran disueltas en la columna
de agua y conlleva a consecuencias graves cuando la misma es ingerida
(REF) El intereacutes de este proyecto es determinar la presencia de bacterias
metalofijadoras del geacutenero pseudomona en el agua por su caracteriacutestica
bioloacutegica estas bacterias presentan un gran rango de resistencia a metales
pesados entre estos el mercurio y un grupo pequentildeo de estas tienen
capacidad metalofijadoras y metaloreductoras Ademaacutes proporcionaraacute una
base para la realizacioacuten de proyectos futuros de similares caracteriacutesticas
pudiendo aumentar el nuacutemero de geacuteneros de bacterias metalofijadoras para
efectos de bioremediacioacuten y como tratamiento de efluentes contaminados
Esta caracterizacioacuten de bacterias del riacuteo Gala tiene como fin el otorgar a los
pobladores la seguridad de una raacutepida recuperacioacuten de las condiciones del
agua a su estado original de esta manera reduciremos los impactos de salud
causados por la contaminacioacuten El beneficio ambiental que va contribuir esta
investigacioacuten es el de proporcionarnos informacioacuten fundamental para la
realizacioacuten de meacutetodos de remediacioacuten de aguas contaminadas por metales
pesados declinando los compuestos toacutexicos presentes en las agua utilizando
bacterias propias del medio sin recurrir a la adicioacuten de especies extranjeras
que a largo plazo podriacutean desplazar a las especies bacterianas residentes de la
zona de esta forma podremos ejecutar este tipo de tratamiento a los efluentes
de las mineriacuteas y demaacutes industrias que produzcan estos compuestos
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El marco teoacuterico se lo realizoacute revisando una serie de libros y publicaciones
cientiacuteficas basadas en el mismo principio que tiene este proyecto varias de
estas investigaciones detallaban la presencia de bacterias del geacutenero
pseudomona en el agua que mediante experimentos y pruebas determinaban
la capacidad de las mismas para resistir y fijar metales pesados En la mayoriacutea
de la investigacioacuten se pudo determinar la utilizacioacuten de una bacteria la
Pseudomona aeruginosa que son organismos que presentan estas
caracteriacutesticas Las investigaciones se basaban en la coleccioacuten de muestras de
agua contaminada que mediante unos meacutetodos de filtracioacuten eran incubadas y
luego aisladas en medios cultivos selectivos una vez obtenida la cepa
resistente estas seraacuten caracterizadas y aisladas las cuales se las sometiacutea a
prueba de resistencia al mercurio a diferentes concentraciones mediante la
teacutecnica de PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) que consiste
en un rastreo molecular utilizando fragmento de genes ribosomales
previamente realizando una extraccioacuten y purificacioacuten de ADN de las muestras
obtenidas El material geneacutetico extraiacutedo colocado en un gel de agarosa y
mediante una tincioacuten se puede establecer la longitud y distribucioacuten de las
bandas Gracias a esta distribucioacuten y a la aplicacioacuten de iacutendices de diversidad
se podraacute determinar la presencia de las bacterias de intereacutes
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CAPITULO 1
11 OBJETIVO
Caracterizar mediante la teacutecnica PCR-DGGE las bacterias del geacutenero
pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Riacuteo
Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguelrdquo
12 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1 Determinar la presencia de bacterias metalofijadoras del geacutenero
pseudomona en las aguas del riacuteo Gala por medio del DGGE
2 Caracterizar cepas aisladas dentro de los geacuteneros pseudomonas
mediante la caracterizacioacuten quiacutemica implementando medios de cultivos
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selectivos pruebas de resistencia y fijacioacuten de mercurio
3 Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad
metalofijadora y con lo cual se procederaacute a la caracterizacioacuten de las
mismas
4 Por medio de los valores arrojados por los indicadores determinaremos
la estructura poblacional bacteriana
13 JUSTIFICACION
Desde sus inicios la industria minera ha sido una fuente importante de
ingresos y de trabajo para el paiacutes gracias al desarrollo de la misma debemos
el incremento de la tasa de empleo La mineriacutea informal contribuye con la
contaminacioacuten de los cuerpos de agua mediante sus efluentes sin previo
tratamiento proveen compuestos toacutexicos y metales pesados generados por
este tipo de mineriacutea contaminando los riacuteos y alterando la biodiversidad
presente en estos ecosistemas de manera negativa El riacuteo Gala del recinto San
Rafael parroquia Tenguel en la provincia del Guayas era un lugar de
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actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
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no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
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es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
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de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
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CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
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teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
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determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
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Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
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rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
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concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
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La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
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Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
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Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
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2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
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6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
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22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
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depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
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en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
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tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
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energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
2
mortales como el plomo y el arseacutenico que se encuentran disueltas en la columna
de agua y conlleva a consecuencias graves cuando la misma es ingerida
(REF) El intereacutes de este proyecto es determinar la presencia de bacterias
metalofijadoras del geacutenero pseudomona en el agua por su caracteriacutestica
bioloacutegica estas bacterias presentan un gran rango de resistencia a metales
pesados entre estos el mercurio y un grupo pequentildeo de estas tienen
capacidad metalofijadoras y metaloreductoras Ademaacutes proporcionaraacute una
base para la realizacioacuten de proyectos futuros de similares caracteriacutesticas
pudiendo aumentar el nuacutemero de geacuteneros de bacterias metalofijadoras para
efectos de bioremediacioacuten y como tratamiento de efluentes contaminados
Esta caracterizacioacuten de bacterias del riacuteo Gala tiene como fin el otorgar a los
pobladores la seguridad de una raacutepida recuperacioacuten de las condiciones del
agua a su estado original de esta manera reduciremos los impactos de salud
causados por la contaminacioacuten El beneficio ambiental que va contribuir esta
investigacioacuten es el de proporcionarnos informacioacuten fundamental para la
realizacioacuten de meacutetodos de remediacioacuten de aguas contaminadas por metales
pesados declinando los compuestos toacutexicos presentes en las agua utilizando
bacterias propias del medio sin recurrir a la adicioacuten de especies extranjeras
que a largo plazo podriacutean desplazar a las especies bacterianas residentes de la
zona de esta forma podremos ejecutar este tipo de tratamiento a los efluentes
de las mineriacuteas y demaacutes industrias que produzcan estos compuestos
3
El marco teoacuterico se lo realizoacute revisando una serie de libros y publicaciones
cientiacuteficas basadas en el mismo principio que tiene este proyecto varias de
estas investigaciones detallaban la presencia de bacterias del geacutenero
pseudomona en el agua que mediante experimentos y pruebas determinaban
la capacidad de las mismas para resistir y fijar metales pesados En la mayoriacutea
de la investigacioacuten se pudo determinar la utilizacioacuten de una bacteria la
Pseudomona aeruginosa que son organismos que presentan estas
caracteriacutesticas Las investigaciones se basaban en la coleccioacuten de muestras de
agua contaminada que mediante unos meacutetodos de filtracioacuten eran incubadas y
luego aisladas en medios cultivos selectivos una vez obtenida la cepa
resistente estas seraacuten caracterizadas y aisladas las cuales se las sometiacutea a
prueba de resistencia al mercurio a diferentes concentraciones mediante la
teacutecnica de PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) que consiste
en un rastreo molecular utilizando fragmento de genes ribosomales
previamente realizando una extraccioacuten y purificacioacuten de ADN de las muestras
obtenidas El material geneacutetico extraiacutedo colocado en un gel de agarosa y
mediante una tincioacuten se puede establecer la longitud y distribucioacuten de las
bandas Gracias a esta distribucioacuten y a la aplicacioacuten de iacutendices de diversidad
se podraacute determinar la presencia de las bacterias de intereacutes
4
CAPITULO 1
11 OBJETIVO
Caracterizar mediante la teacutecnica PCR-DGGE las bacterias del geacutenero
pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Riacuteo
Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguelrdquo
12 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1 Determinar la presencia de bacterias metalofijadoras del geacutenero
pseudomona en las aguas del riacuteo Gala por medio del DGGE
2 Caracterizar cepas aisladas dentro de los geacuteneros pseudomonas
mediante la caracterizacioacuten quiacutemica implementando medios de cultivos
5
selectivos pruebas de resistencia y fijacioacuten de mercurio
3 Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad
metalofijadora y con lo cual se procederaacute a la caracterizacioacuten de las
mismas
4 Por medio de los valores arrojados por los indicadores determinaremos
la estructura poblacional bacteriana
13 JUSTIFICACION
Desde sus inicios la industria minera ha sido una fuente importante de
ingresos y de trabajo para el paiacutes gracias al desarrollo de la misma debemos
el incremento de la tasa de empleo La mineriacutea informal contribuye con la
contaminacioacuten de los cuerpos de agua mediante sus efluentes sin previo
tratamiento proveen compuestos toacutexicos y metales pesados generados por
este tipo de mineriacutea contaminando los riacuteos y alterando la biodiversidad
presente en estos ecosistemas de manera negativa El riacuteo Gala del recinto San
Rafael parroquia Tenguel en la provincia del Guayas era un lugar de
6
actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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88
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
3
El marco teoacuterico se lo realizoacute revisando una serie de libros y publicaciones
cientiacuteficas basadas en el mismo principio que tiene este proyecto varias de
estas investigaciones detallaban la presencia de bacterias del geacutenero
pseudomona en el agua que mediante experimentos y pruebas determinaban
la capacidad de las mismas para resistir y fijar metales pesados En la mayoriacutea
de la investigacioacuten se pudo determinar la utilizacioacuten de una bacteria la
Pseudomona aeruginosa que son organismos que presentan estas
caracteriacutesticas Las investigaciones se basaban en la coleccioacuten de muestras de
agua contaminada que mediante unos meacutetodos de filtracioacuten eran incubadas y
luego aisladas en medios cultivos selectivos una vez obtenida la cepa
resistente estas seraacuten caracterizadas y aisladas las cuales se las sometiacutea a
prueba de resistencia al mercurio a diferentes concentraciones mediante la
teacutecnica de PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) que consiste
en un rastreo molecular utilizando fragmento de genes ribosomales
previamente realizando una extraccioacuten y purificacioacuten de ADN de las muestras
obtenidas El material geneacutetico extraiacutedo colocado en un gel de agarosa y
mediante una tincioacuten se puede establecer la longitud y distribucioacuten de las
bandas Gracias a esta distribucioacuten y a la aplicacioacuten de iacutendices de diversidad
se podraacute determinar la presencia de las bacterias de intereacutes
4
CAPITULO 1
11 OBJETIVO
Caracterizar mediante la teacutecnica PCR-DGGE las bacterias del geacutenero
pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Riacuteo
Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguelrdquo
12 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1 Determinar la presencia de bacterias metalofijadoras del geacutenero
pseudomona en las aguas del riacuteo Gala por medio del DGGE
2 Caracterizar cepas aisladas dentro de los geacuteneros pseudomonas
mediante la caracterizacioacuten quiacutemica implementando medios de cultivos
5
selectivos pruebas de resistencia y fijacioacuten de mercurio
3 Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad
metalofijadora y con lo cual se procederaacute a la caracterizacioacuten de las
mismas
4 Por medio de los valores arrojados por los indicadores determinaremos
la estructura poblacional bacteriana
13 JUSTIFICACION
Desde sus inicios la industria minera ha sido una fuente importante de
ingresos y de trabajo para el paiacutes gracias al desarrollo de la misma debemos
el incremento de la tasa de empleo La mineriacutea informal contribuye con la
contaminacioacuten de los cuerpos de agua mediante sus efluentes sin previo
tratamiento proveen compuestos toacutexicos y metales pesados generados por
este tipo de mineriacutea contaminando los riacuteos y alterando la biodiversidad
presente en estos ecosistemas de manera negativa El riacuteo Gala del recinto San
Rafael parroquia Tenguel en la provincia del Guayas era un lugar de
6
actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
4
CAPITULO 1
11 OBJETIVO
Caracterizar mediante la teacutecnica PCR-DGGE las bacterias del geacutenero
pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Riacuteo
Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael) en la parroquia Tenguelrdquo
12 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1 Determinar la presencia de bacterias metalofijadoras del geacutenero
pseudomona en las aguas del riacuteo Gala por medio del DGGE
2 Caracterizar cepas aisladas dentro de los geacuteneros pseudomonas
mediante la caracterizacioacuten quiacutemica implementando medios de cultivos
5
selectivos pruebas de resistencia y fijacioacuten de mercurio
3 Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad
metalofijadora y con lo cual se procederaacute a la caracterizacioacuten de las
mismas
4 Por medio de los valores arrojados por los indicadores determinaremos
la estructura poblacional bacteriana
13 JUSTIFICACION
Desde sus inicios la industria minera ha sido una fuente importante de
ingresos y de trabajo para el paiacutes gracias al desarrollo de la misma debemos
el incremento de la tasa de empleo La mineriacutea informal contribuye con la
contaminacioacuten de los cuerpos de agua mediante sus efluentes sin previo
tratamiento proveen compuestos toacutexicos y metales pesados generados por
este tipo de mineriacutea contaminando los riacuteos y alterando la biodiversidad
presente en estos ecosistemas de manera negativa El riacuteo Gala del recinto San
Rafael parroquia Tenguel en la provincia del Guayas era un lugar de
6
actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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87
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
5
selectivos pruebas de resistencia y fijacioacuten de mercurio
3 Extraer ADN a partir de las cepas de pseudomonas con capacidad
metalofijadora y con lo cual se procederaacute a la caracterizacioacuten de las
mismas
4 Por medio de los valores arrojados por los indicadores determinaremos
la estructura poblacional bacteriana
13 JUSTIFICACION
Desde sus inicios la industria minera ha sido una fuente importante de
ingresos y de trabajo para el paiacutes gracias al desarrollo de la misma debemos
el incremento de la tasa de empleo La mineriacutea informal contribuye con la
contaminacioacuten de los cuerpos de agua mediante sus efluentes sin previo
tratamiento proveen compuestos toacutexicos y metales pesados generados por
este tipo de mineriacutea contaminando los riacuteos y alterando la biodiversidad
presente en estos ecosistemas de manera negativa El riacuteo Gala del recinto San
Rafael parroquia Tenguel en la provincia del Guayas era un lugar de
6
actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
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23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
6
actividades turiacutesticas y de pesca pero por la contaminacioacuten dejoacute de serlo ahora
es un lugar donde sus aguas causan enfermedades a los pobladores y la
pesca no se desarrolla por la extincioacuten de algunas las especies en dicha zona
En el 2007 estudios realizados de Medio Ambiente del Municipio de Guayaquil
determinaron que las aguas del riacuteo Gala se encuentran contaminadas con
mercurio y arseacutenico disuelto en el agua y por otros componentes como cromo
mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto en sus sedimentos Esto es
un problema criacutetico que se presenta hoy en diacutea en el riacuteo esta contaminacioacuten no
solo afecta al sector anteriormente nombrado es el denominador comuacuten en los
riacuteos que se encuentran en las zonas mineras Y por consiguiente la
recuperacioacuten de la flora y de la fauna de los mismos El presente estudio tiene
como objeto determinar la presencia de microorganismos en el riacuteo que fijen los
principales metales disueltos en el agua como son el mercurio y el arseacutenico
Implementaros como biorrediadores para futuros proyectos puestos que los
metales que fijan son muy toacutexicos y mortales
El beneficio del proyecto seraacute buscar un microorganismo capaz de retirar el
mercurio o el arseacutenico disuelto en el agua contribuyendo enormemente a la
recuperacioacuten de las condiciones iniacuteciales de las aguas no solo del riacuteo Gala si
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
7
no que de todos los riacuteos que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria
Los pobladores de la zona seraacuten altamente beneficiados con este proyecto y
que recuperar las condiciones del riacuteo implica una reduccioacuten de las
enfermedades producidas por las aguas contaminadas y recuperacioacuten de la
pesca artesanal de la zona A maacutes de los pobladores los mineros tambieacuten
obtendraacuten un beneficio de este proyecto con la obtencioacuten de las bacterias
podriacutean realizar proceso de tratamiento de efluentes reduciendo los costos que
la remediacioacuten ambiental conlleva
La presencia de mercurio y arseacutenico en la columna de agua los
microorganismos pueden generar en ellos mecanismos bioloacutegicos de
absorcioacuten o transformacioacuten de los metales por parte de estas bacterias El
geacutenero pseudomona es un grupo de bacterias Gram-negativa de gran actividad
remediadora debido que ellas realizan procesos de reduccioacuten y trasformacioacuten
de hidrocarburos y compuestos contaminantes en el medio
Para la caracterizacioacuten de bacterias se implementaraacute la teacutecnica DGGE la cual
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
8
es ampliamente usada en Biorremediacioacuten tratamiento de Aguas Residuales
tratamiento de agua potable Formacioacuten de bio-peliacuteculas identificacioacuten de
contaminantes microbianos Esta teacutecnica permite el reconocimiento del
microorganismo a traveacutes de un sistema de huella digital Ademaacutes permite
evaluar la factibilidad del uso de los microorganismos seleccionados mediante
sistemas de monitoreo a bajo costo que determinaraacuten la estabilidad y el eacutexito
de estos microorganismos en los ecosistemas de trabajo
La teacutecnica molecular DGGE es raacutepida y nos proveeraacute de un perfil de la
diversidad geneacutetica de una comunidad bacteriana presente en el riacuteo Tenguel
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por un determinado
amplicoacuten Este meacutetodo no soacutelo permite la identificacioacuten de las bacterias sino
tambieacuten la cuantificacioacuten de las mismas en la muestra exponiendo la
dominancia relativa de alguna especie bacteriana especiacutefica
Conocemos que apenas de 01 a 10 de la poblacioacuten bacteriana total es la
proporcioacuten de ceacutelulas cultivables en medios convencionales El uso de DGGE
nos provee de informacioacuten mucho maacutes confiable de la diversidad bacteriana real
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
9
de una muestra Razones por las cuales se estaacuten remplazando todos los
meacutetodos tradicionales por meacutetodos moleculares para el estudio y anaacutelisis de
comunidades bacterianas
La teacutecnica DGGE se fundamenta en la discriminacioacuten de dos cadenas dobles de
ADN de igual tamantildeo pero con diferencias en cuanto a su secuencia asiacute la
energiacutea necesaria para llegar a su desnaturalizacioacuten es diferente Esto nos
permite definir una cantidad aproximada de fragmentos de ADN de igual tamantildeo
que tienen secuencias con diferente contenido de GC
Estos perfiles se caracterizan por la posicioacuten (ausencia o presencia de
amplicones particulares) el nuacutemero e intensidad relativa de los amplicones
donde cada especie distinta se encontraraacute representada por una determinada un
amplicoacuten Colectando estos perfiles los podremos utilizar en meacutetodos
estadiacutesticos que raacutepidamente pueden proporcionarnos una caracterizacioacuten de la
estructura poblacional y la dinaacutemica si se realizan estudios espacio temporales
en la misma zona de muestreo varias veces The method is a powerful one and
can rapidly provide a tangible characterization of community diversity and
composition and shifts in population can be readily demonstrated
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
10
CAPITULO 2
21 ANTECEDENTES
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados a nivel de agua suelo y aire como consecuencia del desarrollo
industrial Las industrias generan una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados
puede ser tratada con diferentes meacutetodos que pueden ser fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos
mientras que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como
una teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores Estas
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
11
teacutecnicas utilizan microorganismos presentes en el propio medio para realizar la
tarea de la depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados
Los procesos de biorremediacioacuten emplean ceacutelulas vivas biomasas
biopoliacutemeros absorbentes y una variedad de hongos algas y bacterias que son
hoy en diacutea utilizados como bioabsorbentes de metales pesados Muchas
investigaciones se han realizado para determinar los efectos de los metales
pesados en bacterias de cultivo y en las poblaciones naturales microbianas
El mecanismo de resistencia para metales pesados ha sido estudiado en E
Coli en Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosas De esta uacuteltima
se han realizado estudios realizados en muestras aisladas de lagos plantas de
tratamientos efluentes industriales La Pseudomona aeruginosa es la bacteria
maacutes utilizada para realizar bioensayos de modo que detecta concentraciones
bajas de metales pesados en agua Este tipo de bacteria es utilizada
ampliamente debido principalmente a su presencia mayoritaria en aguas
contaminadas y es un efectivo paraacutemetro para determinar riesgos en la salud
En un estudio realizado se efectuacuteo el analisis de las muestras representativas
de seis lagos en Muskoka en la provincia de Ontario en Canada la eleccioacuten de
estos lagos se dio a la documentacioacuten del Ministerio del Medio Ambiente local
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
12
determinoacute que contenian altas concentraciones de mercurio en sus aguas Esta
documentacioacuten demuestra que las pseudomonas presentes en estos lagos
conteniacutean el mayor porcentaje de resistencia al mercurio a diferencia de otros
lagos con menor concetracion del mismo Indicando que se encontraban
aproximadamenres 20 a 30 aislados colectados en las playas de cinco de los
seis lagos (REF) Los aislados de pseudomonas presentaban casi el mismo
porcentaje de resistencia que los aislados de pseudomonas presentes en los
efluentes de las plantas de tratamiento del alcantarillado Asiacute se establecioacute una
correlacioacuten entre los serotipos y los tipos de fagos entre las P aeroginosa
presente en los cinco lagos y en el acantarillado [1]
En conclusioacuten determinaron que el 65 de los aislados que presentan
resistencia al mercurio provienen de los sedimentos Las P aeruginosa
presentaba una serie de mecanismos diferentes para la resistencia al mercurio
ella tambien exhibe resistencia multiple no solo para el mercurio si no tambien
para el arseacutenico y cadmio La resistencia la cadmio se presentaba como una
reconformacioacuten de su membrana generando una impermeabilidad para dicho
compuesto Se pudo descubrir otro mecanismos entre ellos la presencia de
un metabolito capaz de trasformar HgCl2 en mercurio metaacutelico [1]
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
13
Los genes que determinan la resistencia hacia el mercurio no son
cromosoacutemicos Estableciendoce que presentan un factor de traslado de
resistencia estos genes pueden contener tambieacuten genes asociados a la
resistencia de cobalto niacutequel y cadmio asiacute como genes para la resistencia de
antibioacuteticos Aunque algunos cientiacuteficos certifican que los genes de resistencia
de metales se encuentran mediados por los genes encargados de la
resistencia de antibioacuteticos [1]
Al igual que las P aeruginosas existen otras bacterias capaces de reducir el
mercurio y este grupo de bacterias son utilizadas en los laboratorios para
tratamiento de aguas contaminadas Las bacterias Pseudomonas putidas son
bacterias que se presentan en los sedimentos y en los suelos con mayor
porcentaje que las P aeruginosa estas bacterias tambieacuten presentan accioacuten
metalorreductoras de mercurio y estaacute ampliamente utilizadas en tratamientos
de suelos contaminados (REF)
En fabricas productoras de Cloralcali (una sustancia quiacutemica que contiene cloro
y que se usa en el procesamiento quiacutemico) en procesos de elaboracioacuten de
amalgamas presenta un mayor uso de mercurio Antes las aguas de desecho
en los procesos de elaboracioacuten de amalgamas eran vertidas directamente en el
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
14
rio y lagos En muestras de lagos aledantildeos a la zona de descarga se pudieron
aislar las bacterias de tipo P putida en zonas donde la concentracioacuten de
mercurio era de 50 ug de mercurio por litro Los aislados fueron identificados
por la unidad 16s ribosomal de la secuencia de DNA En el experimento la
maacutexima concentracion de HgCl trasformada por la P putida fue de 70mg por
litro en medio soacutelido y 10 mglitros en medio liacutequido (REF) Los niveles de
mercurio son determinados por ldquoflameless cold vapor absorption spectroscopyrdquo
meacutetodo que determina el contenido de mercurio presente en muestras de 5 ml
las muestras deben de ser diluidas hasta concentraciones de 100 ug por litros
La remosioacuten de mercurio por parte de las bacterias en esta zona fue realizada
en tres muestras separadas A B y C En la muestra A se presenta una
eficiencia de remosioacuten del 97 en la muestra B (Tabla 6) se determinoacute la
maxima efciencia en la remosioacuten del mercurio que teniacutea en flujo de salida 3mgl
mientras en la entrada se determinoacute concentraciones de 50 a 60 uglitro [2]
Maacutexima capacidad de reduccioacuten de mercurio
El nivel de resistencia de mercurio es mayor en medio soacutelido que en medio
liacutequido la determinacioacuten depende de la densidad bacteriana La maacutexima
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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87
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
15
concentracioacuten de mercurio registrada para la reduccioacuten del mismo por bio-filtros
de bacterias metalofijadoras se encuentra entre 7 a 9 mgl [2]
Para la remosioacuten del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos toacutexicos Estos
meacutetodos consisten en tratar de forma bioloacutegica fiacutesica y quiacutemica agua
contaminada con mercurio a las cuales se les agragaban sustancias como
fosfato monobasico de potasio fosfato dibaacutesico de potasio sulfato de amonio
como sustancia de crecimiento (Figura 2) Mediante un meacutetodo mecaacutenico que
es la aireacioacuten se procedia a realizar el proceso de detoxificacioacuten de forma
fiacutesico-quiacutemica Para el proceso de destoxificacioacuten bioloacutegica se utilizaron
bacterias resistentes al mercurio en un mix Esto generaba que las bacterias
aerobicas por mecanismos enzimaacuteticos reduciacutean el ion mercurio hacia
mercurio volatil por efecto de las marcurio reductasas [3]
Hg + NADP+ + H+ = Hg2+ + NADPH
El elemento resultante es facilmente removido por el medio de crecimiento En
altas concentraciones de mercurio se presentaban una alta congregacioacuten de
precipitados de mercurio como el Hidroacutexido de mercurio Oxido de mercurio
compuestos que presentan una solubilidad baja El birreactor era ineficiente
para trabajar en concentracioacuten exorbitantes de mercurio que se encontraban
entre 20 a 30 mg [4]
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
16
La tasa de crecimiento de la Pseudomona aeruginosa y la tasa de
destoxificacioacuten se determinaba utilizado ldquolow-inoculum batch culturesrdquo La
concentracioacuten inicial de ceacutelulas estaacute ajustada aproximadamente 100 celml y una
concentracioacuten inicial de mercurio menos de 2 microgramos de Hg2 por ml La
destoxificacioacuten del mercurio era determinada por la viabilidad de las ceacutelulas [5]
El mercurio es un compuesto quiacutemico ampliamente distribuido alrededor de la
tierra Muchas formas de mercurio son toacutexicas para los seres vivos Pero
existen organismos capaces de resistir la toxicidad del mercurio y de degradar
algunas formas quiacutemicas de este metal contribuyendo en procesos normales
del ciclo global del mercurio en el medio ambiente Se han determinado cinco
tipos de mecanismos de resistencia para los compuestos de mercurio siendo el
mecanismo de resistencia de mercurio inorgaacutenico el maacutes estudiado La
resistencia al mercurio de este tipo de bacterias se encuentra relacionada por
los genes del ldquomer operoacutenrdquo localizados en los plaacutesmidos de las bacterias Este
estudio ha demostrado que se encuentra presente tanto en bacterias Gram-
positivas como en Gram-negativas Estudios determinaron que las resistencias
a este metal variacutean por las regiones y zonas geograacuteficas ademaacutes se determina
que sus antepasados adoptaron este mecanismo en respuesta a las emisiones
de mercurio generadas por las erupciones volcaacutenicas [6]
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
17
Los organismos meacutetalo-resistentes a los metales generalmente son organismos
termoacutefilos y acidoacutefilos Las bacterias presentan genes que permiten el transporte
de metales como nutrientes esenciales para el crecimiento de las bacterias y
como mantenimiento del equilibrio intracelular
En estudios realizados sobre la Resistencia a metales pesados se determinoacute
que las bacterias y hongos son los que presentan una mayor tolerancia hacia
niveles altos de metales Las muestras obtenidas fueron colocadas en medios
de crecimiento multi-metal que conteniacutea Ag As Bi Cd Cr Co Cu Hg Li Mo
Pb Sn and Zn por diferentes a diferente concentracioacuten de metal en
disoluciones Las muestras fueron analizadas por espectrofotometriacutea
Despueacutes de dejar incubar las muestras se obtuvo un total de 72 aislados de las
que conteniacutean una contraccioacuten de metales de 10-7 Luego estas muestras fueron
re-incubadas en concentraciones de 10-6 con 58 aislados a 10-5 con 50 aislados
a 10-4 con 31 aislados y 16 aislados a 10-3 Lo que indica que los
microorganismos presenta una residencia a los metales y su efectividad en
procesos de remediacioacuten va a depender de la concentracioacuten de los metales
contaminantes y a condiciones fiacutesicas del medio Puesto que las bacterias
presentes en los aislados con la concentracioacuten 10-3 son las maacutes aptas para
implementarlas en procesos de biorremediacioacuten [7]
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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85
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
18
Disentildeo de un bio-filtro a escala de banco para la bio-destoxificacioacuten de
mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas
aeruginosa)
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas por esto las tecnologiacuteas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las teacutecnicas convencionales para la eliminacioacuten y
recuperacioacuten de metales (Ehrlich L 1997) A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacioacuten basada en un disentildeo de bio-filtracioacuten el cual se define como
todo proceso bioloacutegico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
volaacutetiles orgaacutenicos e inorgaacutenicos presentes en la fase liquida y gaseosa Los
microorganismos son los responsables de la degradacioacuten bioloacutegica de los
contaminantes volaacutetiles contenidos en corrientes de agua residual [8]
Al identificar los puntos de descargas directas sobre el humedal tomamos la
zona identificada La metodologiacutea de laboratorio se desarrollo en seis etapas
1 La primera consistioacute en la caracterizacioacuten de las propiedades fiacutesico-
quiacutemicas del sistema acuaacutetico
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
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313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
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por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
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transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
19
2 En la segunda etapa se aislaron colonias tiacutepicas de Pseudomona de las
muestras colectadas en campo en dos diferentes medios de agar (agar f
y King B) de la muestra tomada se inocularon 10ml al 90 de medio de
cultivo
3 La tercera etapa se refiere a las pruebas bioquiacutemicas las cuales
consistieron en tres pruebas presuntivas y tres pruebas confirmativas
para la deteccioacuten de Pseudomona aeruginosa
4 La cuarta etapa consistioacute en la determinacioacuten de la concentracioacuten de
mercurio tomando concentraciones de HgCl2 al 07 10 y 20 con
el fin de realizar el escalamiento de voluacutemenes miacutenimos de capacidad
bio-detoxificadora
5 En la quinta etapa se construyoacute a escala de banco un bio-filtro aerobio
de arrastre por gravedad tomando como base los estudios de (Calderoacuten
1999) Utilizando como soportes evaluados en teacuterminos de volumen de
saturacioacuten porosidad y densidad el carboacuten mineral turba escoria y
aserriacuten
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
20
6 Por uacuteltimo a los medios de soporte del bio-filtro con una concentracioacuten
HgCl2 (Cloruro de Mercurio II-) al 2 se inoculo Pseudomona
aeruginosa por medio de aspersioacuten con el propoacutesito de determinar la
obtencioacuten de una bio-peliacutecula sobre cada uno de los medios obteniendo
en cada uno de ellos excepto el aserriacuten una peliacutecula blanquecina
delgada[8]
Cuyos resultados resaltan que la mayor eficiencia en la remocioacuten se presentoacute
cuando la cepa de P aeruginosa fue inmovilizada en turba alcanzando
porcentajes del 97 Considerando este resultado se concluye que puede ser
posible la utilizacioacuten de materiales de desecho como la turba para lograr la
formacioacuten de bio-peliacuteculas por parte de P aeruginosa a temperatura de 20degC y
recirculacioacuten permanente
En la inoculacioacuten de cepas de Pseudomona aeruginosa sobre los medios de
soporte se obtuvo una bio-peliacutecula que fue evaluada durante ocho diacuteas
haciendo seguimiento al crecimiento de los microorganismos sobre los lechos
filtrantes la cual se hizo cada vez maacutes visible a excepcioacuten del aserriacuten Lo cual
indicoacute que existe un consorcio microbiano que puede crecer en estos soportes
donde las Pseudomonas aeruginosas presentaron una alta bio-acumulacioacuten
reportaacutendose en las concentraciones finales de mercurio al final del sistema[8]
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
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313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
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por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
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transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
21
22 MARCO TEORICO
En la actualidad existen serios problemas de contaminacioacuten ambiental
localizados en todos los niveles como agua suelo y aire por consecuencia del
desarrollo industrial Que genera una serie de contaminantes que alteran las
condiciones normales de los sistemas bioloacutegicos llegando en unos casos a ser
problemas irreversibles
Seguacuten el EPA la contaminacioacuten del ambiente significa contaminaciones
debido a la descarga (en cualquier medio medioambiental) oacute el escape de
cualquier sustancia de alguacuten proceso que sea capaz de causar el dantildeo al
hombre o cualquier otro organismo viviente presente en el ambienterdquo
La recuperacioacuten de estos sistemas contaminados puede ser recuperada
mediante tratamientos de remediacioacuten como son los meacutetodos fiacutesicos quiacutemicos y
bioloacutegicos Siendo los tratamientos fiacutesicos y quiacutemicos los maacutes costosos mientras
que las remediacioacuten bioloacutegica o la biorremediacioacuten se presenta como una
teacutecnica de recuperacioacuten maacutes barata comparada con los anteriores y en las
cuales implementan microorganismos nativos para realizar la tarea de la
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
22
depuracioacuten de las aguas y suelos contaminados Si pensaacuteramos en la calidad
del agua seguramente vendriacutea a nuestra mente la idea de que el agua ldquoidealrdquo es
aquella formada solamente por hidroacutegeno y oxiacutegeno es decir aquella que
responda a la archiconocida foacutermula H2O Sin embargo el agua encontrada en
estado natural nunca estaacute en estado puro sino que presenta sustancias
disueltas y en suspensioacuten Estas sustancias pueden limitar de modo igualmente
natural el tipo de usos del agua En la naturaleza el agua adquiere una
variedad de constituyentes orgaacutenicos e inorgaacutenicos
Inorgaacutenicos son aportados mediante el contacto con el ambiente contacto con
la atmoacutesfera (gases) contacto con la tierra (minerales) y contacto con
ambientes contaminados por el hombre La lluvia disuelve los gases presentes
en la atmoacutesfera entre ellos nitroacutegeno oxigeno dioacutexido de carbono y dioacutexido de
azufre En su circulacioacuten por encima y a traveacutes de la corteza terrestre el agua
reacciona con los minerales del suelo y de las rocas lo que le aporta
principalmente sulfatos cloruros bicarbonatos de sodio y potasio y oacutexidos de
calcio y magnesio Las actividades humanas aportan una variada gama de
componentes inorgaacutenicos que llegan a los cuerpos de agua por escurrimientos
o por vertidos directos Orgaacutenicos son aportados por escurrimientos que han
estado en contacto con vegetacioacuten recayente con excremento de animales o
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
23
en desechos de la vida acuaacutetica En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de la
mineriacutea acuiacutefera que se localiza en los sectores de las estribaciones externas de
las cordilleras de los andes han desarrollado un acelerado desordenado e
incontrolado crecimiento industrial y al mismo tiempo generan grandes dantildeos
al ambiente como la contaminacioacuten del aire por la evaporacioacuten de mercurio
aguas contaminas por grandes descargas de este metal cianuro y soacutelidos que
contienen metales pesados Ademaacutes de efectos ambientales tambieacuten se han
generado problemas sociales como la presencia de poblaciones mineras que
carecen de servicios elementales y se encuentras expuesto a un peligro de
contaminacioacuten En la eacutepoca de los 70 el sector industrial crecioacute de forma
acelerada situaacutendose las industrias en Quito y Guayaquil y en menor escala en
Cuenca Lo que ha incrementado en estas ciudades grandes condiciones de
contaminacioacuten de los recursos hiacutedricos por compuestos quiacutemico y metales al
aire por emisioacuten de gases y los suelos por desechos industrias Los riacuteos y
esteros que cruzan entre estas ciudades soportan una gran capacidad de
compuestos contaminantes debido a un descuidado control de las aguas
negras que son vertidas sin tratamiento alguno a los riacuteos y esteros
En los uacuteltimos antildeos el deterioro ambiental en el paiacutes los problemas legales
institucionales econoacutemicos que no estimulan la gestioacuten ambiental ciencia y
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
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85
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
24
tecnologiacutea participacioacuten de la poblacioacuten civil educacioacuten no presenta una
poliacutetica educativa e informativa en materia ambiental informacioacuten y participacioacuten
de la poblacioacuten civil [9]
En los estudios realizados por el departamento de gestioacuten ambiental del
municipio de Guayaquil gracias al monitoreo realizado el 27 de Diciembre del
2007 en el Riacuteo Gala aguas abajo del (recinto san Rafael) demostraban que
sus aguas se encontraban contaminadas por mercurio y arseacutenico de acuerdo a
los criterios de calidad admisibles para la preservacioacuten de la flora y fauna en
agua dulce seguacuten Libro VI Anexo I del texto unificado de la legislacioacuten
ambiental secundaria determinoacute la presencia de contaminantes en los
sedimentos como cromo mercurio cobre arseacutenico vanadio niacutequel y cobalto
De los cuales el mercurio arseacutenico y vanadio superaban en 2414 12 y 712
veces el liacutemite maacuteximo permisible determinado por los criterios de calidad del
agua En el riacuteo Gala aguas abajo se presenta una contaminacioacuten en menor
grado en sus sedimentos [10]
El Ministerio de Energiacutea y Minas es responsable de las poliacuteticas y manejo de los
recursos energeacuteticos del Ecuador sus funciones se estructuran sobre el
concepto de promover el desarrollo armoacutenico y sustentable de los sectores
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
25
energeacutetico y minero del paiacutes Las funciones del Ministerio son las de regular
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburiacuteferas y mineras promover la
inversioacuten nacional y extranjera precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano La actividad minera en la zona examinada data de maacutes de treinta
antildeos Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las Aacutereas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 31 ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el periacuteodo de 1996 a 1998 La compantildeiacutea
indica que la contaminacioacuten relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador ha sido monitoreada y el impacto evaluado durante 5 ocasiones
en los antildeos 1996-1998 Los estudios incluyeron 4 aacutereas de Ponce Enriacutequez
Santa Rosa Portovelo ndash Zaruma y Nambija Los principales medios
investigados fueron agua de riacuteos y estuarios sedimentos de riacuteo y fauna
acuaacutetica
Los resultados del monitoreo indicaron que la mineriacutea ha causado
considerables impactos ambientales siendo maacutes severos los de las aacutereas
Portovelo-Zaruma y Ponce Enriacutequez Los principales contaminantes son
cianuro metales pesados y mercurio Las fuentes maacutes importantes de los
contaminantes son los relaves descargados directamente o indirectamente en
los riacuteos por los sistemas inadecuados de disposicioacuten La descarga de los
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
26
contaminantes ha causado la extincioacuten de toda la fauna acuaacutetica superior en
ciertos tramos de riacuteos Ademaacutes en varios lugares la mala calidad del agua
imposibilita su uso para el consumo humano irrigacioacuten o criaderos acuaacuteticos
Los metales pesados y el mercurio son incorporados al medio con vida (bioacutetico)
de los riacuteos y estuarios afectados sin embargo el impacto de la mineriacutea en otras
actividades econoacutemicas como la produccioacuten de bananas y el cultivo de
camarones seguacuten ese estudio de 1998 es considerada insignificante El
mismo estudio sentildeala que si los relaves fueran confinados en diques de
retencioacuten adecuados se podriacutean solucionar esencialmente todos los problemas
referentes a la contaminacioacuten con metales pesados determinaacutendose como
prioritario para la mitigacioacuten los riacuteos Puyango Siete y Gala Chico
Entre las principales empresas mineras de se encuentran aledantildeas al riacuteo Gala
estaacuten
QUEBRADA FRIA
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
Superficie 308 hectaacutereas mineras
COOPERATIVA MINERA BELLA RICA
Ubicacioacuten Cantones Pucaraacute y Ponce Enriacutequez
Cuencas Riacuteo Chico y Gala
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
27
Superficie 1300 hectaacutereas mineras
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca Tenguel
Aacuterea concesionada 64 hectaacutereas mineras
ANDREINA
Ubicacioacuten Parroquia Tenguel
Cuencas Riacuteo Gala
Superficie 36 hectaacutereas mineras
DISPOSICIONES ESPECIacuteFICAS PARA LA MINERIacuteA
A continuacioacuten se presenta las disposiciones y leyes a favor de la preservacioacuten
del ambiente
311 Ley de Mineriacutea Ley No 126 Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991 Art 79 Estudios de impacto ambiental Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten deberaacuten
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
28
prevenir mitigar controlar rehabilitar y compensar los impactos ambientales y
sociales derivados de sus actividades estudios que deberaacuten ser aprobados por
la Subsecretariacutea de Medio Ambiente del Ministerio de Energiacutea y Minas
Art 81 Tratamiento de aguas Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del riacuteo o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas libres de contaminacioacuten para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna
312 Reglamento Ambiental de Actividades Mineras Decreto Ejecutivo No
625
Registro Oficial No 151 de 12 de septiembre de 1997
Art 3 Objeto El presente Reglamento tiene por objeto promover el desarrollo
sustentable de la mineriacutea en el Ecuador a traveacutes del establecimiento de normas
y procesos para prevenir controlar mitigar rehabilitar y compensar los efectos
que las actividades mineras puedan tener sobre el medio ambiente y la
sociedad
Art 10 Clasificacioacuten Para los fines establecidos en la Ley de Mineriacutea y el
presente reglamento los estudios orientados a una gestioacuten ambientalmente
adecuada de la actividad minera que estaacuten obligados a presentar los titulares
de derechos mineros y las entidades del sector puacuteblico que realicen actividades
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
29
mineras a la Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Energiacutea y
Minas por intermedio de las Direcciones Regionales de Mineriacutea de la
correspondiente jurisdiccioacuten se clasifican en
a) Evaluacioacuten Preliminar de Impacto Ambiental
b) Evaluacioacuten de Impacto Ambiental y
c) Auditoriacutea Ambiental
Art 61 Amalgamacioacuten Cuando el proceso de recuperacioacuten mineral contemple
el uso de mercurio deberaacute realizarse acatando estrictamente las Normas para la
utilizacioacuten de Mercurio en la Actividad Minera establecidas mediante Acuerdo
Ministerial No 338 publicado en el Registro Oficial No 286 del 29 de septiembre
de 1989 En todo caso se utilizaraacuten cilindros amalgamadores retortas
reactivadores de mercurio y principalmente equipos de proteccioacuten personal Se
evitaraacute por todos los medios el contacto directo de los trabajadores con este
elemento El mercurio antes y despueacutes de su uso deberaacute ser cuidadosamente
almacenado y guardado en recipientes hermeacuteticamente cerrados para evitar su
fuga Se prohiacutebe terminantemente el uso directo de mercurio en molinos de
cualquier tipo y en canalones Los efluentes producidos en la etapa de
amalgamacioacuten deberaacuten ser recolectados y almacenados en reservorios
impermeabilizados los mismos que al cierre de las operaciones seraacuten
rehabilitados de acuerdo a lo establecido en los estudios ambientales
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
30
313 Reglamento General Sustitutivo del Reglamento General de la Ley de
Mineriacutea Decreto Ejecutivo No 1415 Registro Oficial No 307 de 17 de abril del
2001 Art 1 Intereacutes Nacional Prioritario La actividad manera de utilidad puacuteblica
e intereacutes nacional prioritario se considera fundamental para el desarrollo
sostenible armoacutenico y equilibrado del paiacutes
De la Proteccioacuten al Medio Ambiente
Art 67 Evaluacioacuten y aprobacioacuten de los estudios ambientales Los estudios
programas planes de manejo auditoriacuteas y presupuestos ambientales que
presenten los titulares de derechos mineros respecto de sus concesiones
mineras o plantas de beneficio fundicioacuten y refinacioacuten seraacuten evaluados por la
Unidad Ambiental Minera de la Direccioacuten Nacional de Mineriacutea y aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambiental del Ministerio de Minas y Petroacuteleos
misma que se encargaraacute del seguimiento de velar por el cumplimiento de los
estudios ambientales directamente o a traveacutes de firmas auditoras
independientes calificadas [11]
SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
31
El artiacuteculo 14 inciso segundo del Reglamento Ambiental para actividades
mineras dice ldquoAmpliacioacuten de estudios Las actividades adicionales que se
describen en estos estudios de evaluacioacuten de impactos ambientales
ampliatorios soacutelo podraacuten iniciarse una vez que estos sean aprobados por la
Subsecretariacutea de Proteccioacuten Ambientalrdquo
El artiacuteculo 11 literal c) de la Ley de Mineriacutea expresa que para ejecutar las
actividades mineras en lagos lagunas y embalses o en sitios destinados a la
captacioacuten de agua para las poblaciones y en distancias de hasta 200 metros
medidos horizontalmente desde los mismos se requiere de informes otorgados
por las siguientes autoridades e instituciones la Corporacioacuten para el Desarrollo
de la Regioacuten de las Provincias de Azuay Cantildear y Morona Santiago Centro de
Reconversioacuten Econoacutemica de las Provincias del Azuay Cantildear y Morona Santiago
CREA Para el caso del aacuterea de ubicacioacuten del dique construido en la concesioacuten
ldquoLas Paralelasrdquo para la retencioacuten de las colas no cuenta con los informes
mencionados Los principales problemas ambientales del recurso agua en las
concesiones examinadas hacen referencia a la contaminacioacuten generada por la
descarga de las aguas residuales provenientes de la exploracioacuten y explotacioacuten
de las minas se realiza la acumulacioacuten y conservacioacuten de los relaves en sitios
que no reuacutenen las miacutenimos requisitos ambientales nacionales y mundiales para
su funcionamiento es asiacute que las aguas superficiales de las llamadas ldquocolasrdquo
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
32
por proceso de decantacioacuten generan aguas contaminadas las cuales caen en
otra piscina de relaves se repite este fenoacutemeno y luego esta agua residual se
descarga directamente a la primera fuente de agua de drenaje natural las
cuales constituyen verdaderas alcantarillas abiertas que recogen en sus cauces
la descarga de los interceptores de aguas residuales domeacutesticas de sus
respectivas aacutereas de drenaje En especial el riacuteo Chico tributario del Tenguel
en el tramo localizado dentro de la concesioacuten Las Paralelas la Unidad
Ambiental Minera el concesionario procedioacute a la construccioacuten de un dique
localizado en la cuenca del riacuteo Chico La Subsecretariacutea Ambiental del Ministerio
emitioacute por dos ocasiones informes de paralizacioacuten de los trabajos y retiro del
dique solicitando la suspensioacuten de la construccioacuten no obstante se ha hecho
caso omiso de estas disposiciones habieacutendose culminado los trabajos
encontraacutendose represado su contenido y a punto de desbordarse
En consecuencia los riacuteos materia de anaacutelisis con excepcioacuten del Gala cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencioacuten de la comunidad de ldquoEl
Shumiralrdquo conjuntamente con la Fundacioacuten Ecoloacutegica ldquoDefensores del Riacuteo
Galardquo presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar condiciones
ambientales no aceptables pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes riberentildeos debido a las concentraciones de contaminacioacuten quiacutemica
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
33
por metales pesados ademaacutes de la carga de materiales soacutelidos suspendidos
como consecuencia de la actividad de las canteras y gravilleras
Desde el punto de vista geograacutefico la zona de las cuencas de los riacuteos motivo de
anaacutelisis constituyen las maacutes importantes zonas extractivas del Ecuador con el
70 de las explotaciones La zonas motivo de estudio comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacioacuten del riacuteo Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa Riacuteo Siete Municipio de El Guabo Riacuteo Tenguel y Gala
Municipio de Ponce Enriacutequez en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil
En estas aacutereas se geo-referenciaron con la utilizacioacuten del GPS y de la estacioacuten
de referencia que posee el Ministerio de Energiacutea y Minas 10 industrias la
mineriacutea y las actividades relacionadas con ella consideradas como industrias
fundamentalmente degradadoras del ambiente En las zonas de mineriacutea se
presenta la ocurrencia de avalanchas de residuos mineros materiales arenosos
y lodosos que taponan tuberiacuteas y cubren caminos y galeriacuteas Igualmente el
impacto sobre el paisaje la calidad del aire y la calidad del agua son muy altos
Las minas y canteras se convierten en amenaza para asentamientos que han
crecido paralelo a las explotaciones [12]
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
34
Dado el crecimiento de la industria minera produjo grandes impactos al
ambiente como la introduccioacuten de metales pesados a los efluentes entre ellos
los maacutes toacutexicos como el Arseacutenico y el Mercurio El mercurio es el metal pesado
maacutes toacutexico de los demaacutes y es uno de los compuestos riesgosos para la salud
Normalmente el mercurio presenta una presencia normal en el medio pero la
actividad antropoloacutegica ha incrementado la concentracioacuten de este compuesto en
el medio El mercurio puede permanecer en el medio acuoso en los
sedimentos y presente dentro del sistema de organismos superiores como en
peces o mamiacuteferos [13]
Reportes indican que las concentraciones de mercurio en peces marinos y de
agua dulce exceden los valores de salud puacuteblica internacionalmente
recomendados Ademaacutes se ha estimado que el 95 del mercurio total en
peces puede corresponder a metilmercurio (CH3Hg) Esta forma quiacutemica es tres
veces maacutes toacutexica que el mercurio elemental y las sales inorgaacutenicas Por otro
lado la exposicioacuten a metilmercurio en humanos proviene casi exclusivamente del
consumo de peces (Olivero y Johnson 2002)
Ciclo del mercurio
El mercurio estaacute presente en el medio ambiente de diversas formas y su
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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87
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
35
transformacioacuten de una forma a otra puede ocurrir tanto en sedimento agua y
aire siendo catalizada por variados sistemas bioloacutegicos Los conocimientos
acerca del ciclo bio-geoquiacutemico del mercurio a nivel mundial se han
incrementado considerablemente en los uacuteltimos antildeos En la atmoacutesfera estaacute
ampliamente distribuido en forma de gas y partiacuteculas Entre el 90-95 de este
elemento es gaseoso El mercurio existe en cuatro estados de oxidacioacuten Hg0
Hg22+ Hg2+ y Hg4+ Este uacuteltimo estado ha sido descubierto recientemente en
el 2007 El estado de oxidacioacuten Hg2+ es el maacutes estable del mercurio Las tres
primeras especies se considera que coexisten en el equilibrio asiacute todo el
mercurio inorgaacutenico disuelto en aguas oceaacutenicas existe en forma disociada
como ion [HgCl2]- En las fuentes de agua continentales sin embargo donde
hay poco cloruro el mercurio puede existir como Hg(OH)2
La interconversioacuten en medio acuoso entre distintos estados de oxidacioacuten del
mercurio requiere la presencia de microorganismos El mercurio es emitido a la
atmoacutesfera a partir de fuentes naturales y antropogeacutenicas en forma de vapor
elemental (Hg0) posteriormente precipitado por las lluvias que lo depositan en
los cuerpos de agua y finalmente en el sedimento desde donde es metilado y
luego bio-acumulado (Downs et al 1998) Las formas maacutes solubles de
mercurio (por ejemplo Hg2+) son sintetizadas a traveacutes de la conversioacuten de Hg0
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
36
a Hg2+ Hg 10487731048773 Hg2+ + 2e- Esta reaccioacuten de oxidacioacuten ocurre en presencia de
microorganismos aeroacutebicos en el que participa la catalasa una enzima
importante en el ciclo del oxiacutegeno Los microorganismos aeroacutebicos tambieacuten
pueden llevar a cabo la oxidacioacuten del mercurio a partir del HgS en el sedimento
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato El ioacuten mercuacuterico (Hg2+) sin
embargo puede ser reducido en un proceso de desintoxicacioacuten por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucleoacutetido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucleoacutetido oxidado) El NAD es una coenzima cuya funcioacuten es actuar
como agente en la transferencia de aacutetomos de hidroacutegeno en las reacciones de
oxidacioacuten ndash reduccioacuten
Un grupo de metales son necesarios para el desarrollo de las bacterias dado a
que presentan parte esencial de si estructura y componentes celulares pero en
algunos casos estos metales no se encuentran disponibles en el ambiente o las
concentraciones presentes en el medio no son las suficientes para el normar
crecimiento las bacterias Pseudomonas aeruginosas requiere la presencia de
hierro para su replicacioacuten tanto como en el organismo infectado como en el
media ambiente [14]
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como bio-
sensores en el caso de las Pseudomonas que producen sentildeales en presencia
de contaminantes como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema bioloacutegico Los microorganismos son capaces de detectar el maacutes
miacutenimo cambio y la presencia de contaminantes lo que genera un meacutetodo maacutes
eficaz y con costos reducidos que implementando meacutetodos quiacutemicos
exhaustivos [15]
Una serie de microorganismos pueden movilizar metales de lixiviados presentes
en el agua a traveacutes de la quelacioacuten por metabolitos y sideroforos y la metilacioacuten
da como resultado componentes celulares del organismo fijacioacuten dentro de la
ceacutelula o la precipitacioacuten como sustancias insolubles orgaacutenicas o inorgaacutenicas
Estos mecanismos son muy importantes para la retencioacuten de compuestos
metaacutelicos solubles presentes en la columna de agua Presenta como una
alternativa de remover metales de la fase acuosa [16]
La solubilizacioacuten microbiana de los metales de los lixiviados productos de
procesos mineros como la extraccioacuten de oro uranio entre estos se encuentran
uacuteltimamente usados en esta industria Este proceso se realiza implementando
microorganismos quimiolitotrofos pertenecientes a un grupo denominado
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
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Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
38
extremophilo gracias a su gran resistencia a latas condiciones de acidez (pH 1
a 30) y a la presencia de metales altamente toacutexicos Existen diferentes
especies de organismos capaces de realizar este proceso [17]
Una importante proporcioacuten de moleacuteculas contaminantes sobre todo aquellas
con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la
naturaleza son catabolizados lentamente y asiacute se acumulan persistiendo en el
ecosistema Surge asiacute el concepto de biorremediacioacuten que consiste
baacutesicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos
indiacutegenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien
convertirlos en especies quiacutemicas menos toacutexicas y asiacute menos nocivas [18]
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos casi siempre moacuteviles por uno o varios flagelos polares son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo soacutelo implementa la viacutea oxidativa Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental de estos pasan a infectar a los demaacutes organismos superiores
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tiacutepico
oportunista que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibioacuteticos [19]
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
39
La bacteria Pseudomona aeruginosa es una bacteria patoacutegena oportunista que
causa una septicemia severa que a veces es letal Infecta al tracto respiratorio
al tracto urinario infecta quemaduras y la sangre La mayoriacutea de las infecciones
causadas por este microorganismo son generalmente intratables debido a la
gran resistencia de este organismo a los antibioacuteticos [20]
Arseacutenico es otro de los contaminantes presentes en el agua peligrosos para la
vida acuaacutetica es un compuesto que prevalece maacutes tiempo en el medio Los
mejores medios para eliminar estos compuestos es mediante el uso de
microorganismos que reduzcan el arsenito a arsenate que es un compuesto
pocos soluble y con menor toxicidad Las Pseudomonas lubricans presentan
una mayor resistencia hacia el arseacutenico con concentraciones maacutes de 3mgl
En la actualidad se los utiliza como proceso de remediacioacuten en zonas con
efluentes contaminados por arseacutenico [21]
El impacto ambiental de los contaminantes metaacutelicos en suelos y sedimentos
es estrictamente dependiente de la capacidad de interaccioacuten de eacutestos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquiacutemicas y bioloacutegicas de su entorno que pueden ser Biodisponibilidad La
toxicidad de los metales pesados es muy alta Su accioacuten directa sobre los seres
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
40
vivos ocurre a traveacutes del bloqueo de las actividades bioloacutegicas es decir la
inactivacioacuten enzimaacutetica por la formacioacuten de enlaces entre el metal y los grupos -
SH (sulfhidrilos) de las proteiacutenas causando dantildeos irreversibles en los diferentes
organismos Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre
un ser vivo eacutestos deben encontrarse disponibles para ser captados por eacuteste es
decir que el metal debe estar biodisponible El concepto de bio-disponibilidad
se encuentra iacutentimamente relacionado con las condiciones fisicoquiacutemicas del
ambiente que determinan la especiacioacuten y por lo tanto la concentracioacuten de
metal libre y laacutebil Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminacioacuten por metales pesados de un ambiente conocer su bio-
disponibilidad es decir la concentracioacuten de metal libre y laacutebil presente en la
muestra
Bio-lixiviacioacuten es un mecanismo de solubilizacioacuten que es utilizado en la industria
minera Por intermedio de la accioacuten microbiana los metales presentes en los
minerales resultan extraiacutedos en fase acuosa Tal es el caso de la obtencioacuten de
Cu por la oxidacioacuten de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio
de la accioacuten de las bacterias Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans
Bio-absorcioacuten es un fenoacutemeno ampliamente estudiado en la biorremediacioacuten de
diversos metales pesados como el cadmio cromo plomo niacutequel zinc y cobre
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
41
Los microorganismos utilizados como bio-absorbentes aislados a partir de
ecosistemas contaminados retienen los metales pesados a intervalos de
tiempo relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos
metales Esto minimiza los costos en un proceso de remediacioacuten ya que no
requiere el agregado de nutrientes al sistema al no requerir un metabolismo
microbiano activo Los fenoacutemenos de bio-absorcioacuten se caracterizan por la
retencioacuten del metal mediante una interaccioacuten fisicoquiacutemica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular Esta interaccioacuten se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular pertenecientes a partes
de moleacuteculas componentes de las paredes celulares como por ejemplo
carboxilo amino hidroxilo fosfato y sulfhidrilo
Bio-acumulacioacuten es un mecanismo celular que involucra un sistema de
transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno
celular con gasto de energiacutea Este consumo energeacutetico se genera a traveacutes del
sistema H+-ATPasa Una vez incorporado el metal pesado al citoplasma eacuteste
es secuestrado por la presencia de proteiacutenas ricas en grupos sulfhidrilos
llamadas metalotioneiacutenas o tambieacuten puede ser compartimentalizado dentro de
una vacuola como ocurre en hongos Algunos ejemplos de este proceso son
muy interesantes como el caso de acumulacioacuten de uranio por la bacteria
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
42
Pseudomonas aeruginosa el cual fue detectado iacutentegramente en el citoplasma
al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae
Bio-mineralizacioacuten es cuando los microorganismos son capaces de precipitar
metales y radionuclidos como carbonatos e hidroacutexidos mediante un mecanismo
de resistencia codificado en plaacutesmidos Este mecanismo aparece por el
funcionamiento de una bomba que expulsa el metal toacutexico presente en el
citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el
interior celular Esto produce una alcalinizacioacuten localizada sobre la superficie
celular externa y por lo tanto la precipitacioacuten del metal pesado Otra forma de
precipitar los metales es a traveacutes de la formacioacuten de sulfuros o fosfatos como
resultado de alguna actividad enzimaacutetica celular Un ejemplo de ello es la
precipitacioacuten de sulfuros metaacutelicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias
reductoras de sulfato (10 21) o la acumulacioacuten de CdS en la pared celular de
las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa Bio-
transformacioacuten es un proceso que involucra un cambio quiacutemico sobre el metal
pesado como por ejemplo en el estado de oxidacioacuten o metilacioacuten Esta
transformacioacuten bioloacutegica de los metales pesados que resultan toacutexicos mediada
por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles
en agua o bien compuestos volaacutetiles El ejemplo maacutes claro es el ciclo del Hg en
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
43
la naturaleza donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el
catioacuten Hg2+ a Hg0 y otros organismos pueden luego metilarlo dando como
producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg que son volaacutetiles y auacuten maacutes toacutexicos que el
propio Hg
En la quimio-absorcioacuten mediada por microorganismos se pueden describir
aquella clase de reacciones en donde los microorganismos bio-mineralizan un
metal formando un depoacutesito primario Este depoacutesito primario funciona como
nuacutecleo de cristalizacioacuten con la subsecuente deposicioacuten del metal de intereacutes
promoviendo y acelerando asiacute el mecanismo de mineralizacioacuten Cualquiera de
los mecanismos microbianos descritos remueve los metales pesados de
efluentes contaminados Los microorganismos autoacutectonos que sobreviven en
sitios contaminados han desarrollado mecanismos de resistencia yo tolerancia
que nos son uacutetiles a la hora de la implementacioacuten de procesos de
biorremediacioacuten En conclusioacuten el rol de los microorganismos es fundamental
en los ciclos bio-geoquiacutemicos de los metales y su utilizacioacuten en los procesos de
biorremediacioacuten de desechos soacutelidos y liacutequidos es esencial para el cuidado del
medio ambiente [22]
En la actualidad la proteccioacuten ambiental representa valores millones a los $ 280
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010 Estos valores
van aumentando cada diacutea Estos valores equivalen a la industria quiacutemica
mundial y es como si empleaacuteramos a tres millones de personas iquestPor queacute elegir
un proceso bioloacutegico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece haber una gama completa de tecnologiacuteas Debido a que
microorganismos tienen la capacidad de adaptacioacuten a una variedad de
contaminantes tanto orgaacutenicos como inorgaacutenicos es importante tener en
cuenta desde el principio de que los microorganismos no pueden destruir los
metales Sin embargo pueden la movilidad de los metales influir en el medio
ambiente mediante la modificacioacuten su composicioacuten quiacutemica y o caracteriacutesticas
fiacutesicas Procesos quiacutemicos tambieacuten pueden hacer esto pero no viven
microorganismos esencialmente minutos faacutebricas de productos quiacutemicos capaz
de generar una variedad de moleacuteculas La eliminacioacuten de metales de diversas
corrientes acuosas utilizando procesos bio-absortiva y bio-acumulativa ha
recibido importante atencioacuten
ldquoCon el crecimiento previsto de la environmental technology mercado la
confianza que tenemos son que la biologiacutea del campo de las soluciones de
captura de una proporcioacuten cada vez mayor de la mismardquo Los signos no son
alentadores en la actualidad por varias razones entre ellas la relativa falta de
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
45
interdisciplinario de investigacioacuten el desarrollo de medio ambiente
biotecnologiacuteas se percibe tan mundano fondos suficientes para promover la
demostracioacuten de nuevos tecnologiacuteas y productos que compiten tecnologiacutea
probada conservadurismo y la tecnologiacutea Bio-cientiacuteficos los cientiacuteficos y los
ingenieros tienen que trabajar maacutes de cerca y apreciar sus fortalezas y
contribuciones respectivas
El potencial de la combinacioacuten de un proceso bioloacutegico con un proceso fiacutesico-
quiacutemico adecuado probado podriacutea superar algunas de estas limitaciones y
reservas En general la comunidad estaacute preocupada por la biotecnologiacutea con
el potencial de la industria farmaceacuteutica y industrias agriacutecolas Se ha previsto
que estas bio-industrias nuevos podriacutean crecer a las empresas millones de
doacutelares Puede que haya pasado desapercibido que los servicios de agua
tienen en las uacuteltimas deacutecadas pasoacute sumas similares que ofrecen y mejoran
las instalaciones de tratamiento de aguas residuales domeacutesticas No son pocos
en su caso mejores ejemplos de la versatilidad y la capacidad de las bacterias
de su utilizacioacuten en el medio ambiente [23]
La naturaleza ha demostrado algunos de los mecanismos sutiles y complicados
de control selectivo de la movilidad de los contaminantes metaacutelicos en el medio
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
46
ambiente Sin embargo la aplicacioacuten de esta ciencia a la tecnologiacutea ha sido
decepcionante Un pequentildeo nuacutemero de estudios de la planta piloto se han
realizado para investigar el potencial de los microorganismos (principalmente
bacterias) para extraer metales de los residuos liacutequidos pero soacutelo un sistema
en los uacuteltimos 15 antildeos ha sido comercializado Para explicar esta falta de
aplicacioacuten es importante comprender la eficacia robustez y fiabilidad de los
procesos bioloacutegicos fundamentales con los metales y su capacidad de competir
con las tecnologiacuteas fiacutesico-quiacutemicas probadas Para poder determinar coacutemo se
encuentras conformadas la colonias bacterianas en cultivos independientes la
PCR-DGGE es utilizada par determina la composicioacuten bacteriana y la
diversidad presentes en cualquier medio Esta teacutecnica molecular nos permite
determinar de una forma maacutes precisa Utilizando primers especiacuteficos para
determinar los genes de una especie especifica La capacidad del DGGE nos
proporciona una imagen visual directa de la diversidad bacteriana en la muestra
si no que tambieacuten nos permite determinar la presencia de especies dominantes
dentro de la misma muestra [24]
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
47
CAPITULO 3
31 METODOLOGIA
DISENtildeO EXPERIMENTAL
Los trabajos previos realizados sobre bacteriologiacutea en el aacuterea de estudio han
sido enfocados a la contaminacioacuten minera de ahiacute la importancia de desarrollar o
enfocar investigacioacuten ecoloacutegica relacionada con las poblaciones bacterianas
existentes En el estudio propuesto se lleva a cabo con tres muestras recogidas
en el centro del riacuteo Gala A estas muestras se les practicaraacute una serie de
pruebas microbioloacutegicas para determinar las bacterias heteroacutetrofas de tipo
pseudomonas existentes Por medio de cultivos en placas de agar Mc Conkey y
despueacutes en agar nutritivo continuando con la tincioacuten de Gram se obtendraacuten las
cepas puras Gram negativas Posteriormente mediante la utilizacioacuten de pruebas
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
48
bioquiacutemicas se estableceraacute en forma confirmatoria la presencia de bacterias
pertenecientes al geacutenero pseudomona
Sistema de coordenadas
Es de uso comuacuten para la ejecucioacuten de muestreos en un riacuteo El eje ldquoXrdquo seraacute la
zona central del rio el eje ldquoYrdquo se dirige a la derecha e izquierda (anchura) y el
eje Z hacia debajo de la superficie (profundidad) respectivamente (Grafico 3)
Meacutetodos de Muestreo de Bacterias
El muestreo que se realizaraacute seraacute tipo de estratificado puesto que las muestras
a ser tomadas seraacuten por capas o estratos de condiciones homogeacuteneas Es un
muestreo muy utilizado en Ecologiacutea Estos muestreos sirven para confirmar
alguacuten tipo de distribucioacuten y caracterizacioacuten de bacterias heteroacutetrofas en el riacuteo
Gala
Para dicho efecto se realizaraacute el siguiente procedimiento
Se tomaran muestras en tres puntos diferentes con la finalidad de abarcar
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
49
de manera horizontal el riacuteo (x y z)
Las muestras seraacuten tomadas en la superficie y a un metro maacuteximo de
profundidad
Se tomaraacuten las muestras con la botella de Van Dorf
Caracteriacutesticas de la botella Van Dorf
- Botella de muestreo Van Dorf horizontal de 1 Lt
- Posee mecanismo de gatillo horizontal el cual es activado por un
mensajero metal
- Los eacutembolos proveen un adecuado sello y previenen la mezcla de la
muestra con las capas intermedias de agua durante el ascenso
- Los materiales no corrosivos de la botella previenen de cualquier
contaminacioacuten de la muestra de agua
- Posee drenaje para vaciar la aliacutecuota de muestra
Se realizaraacute una coleccioacuten en cada una de las pleamares y en cada una
de las bajamares
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
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17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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87
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23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
50
Gala 2525m3s 465Km2
Z = 4375 ndash pleamar
Z = 035020 ndash bajamar
Horario de muestreo GRAFICO [4] y Tabla 1
Utilizando frascos de vidrio esteacuteriles de 250 ml de capacidad para las muestras de aguas
Y frascos de vidrio color aacutembar esteacuteriles de 250 ml para la parte profunda (1m)
Con esto se obtuvieron las siguientes muestras (Tabla 2)
Despueacutes del muestreo seraacuten conservadas en refrigeracioacuten lo antes
posible y ser analizado en un periacuteodo no mayor a las siguientes ocho
horas
A las muestras se les haraacuten una serie de filtraciones para colectarlas y
asiacute obtener un mayor nuacutemero de bacterias para luego ser cultivadas en
placas de Agar de pseudomona King A por lo que se siguioacute un
procedimiento especiacutefico asiacute determinar el nuacutemero de bacterias
formadoras de colonias presentes en las muestras colectadas ademaacutes
de realizar algunas series de pruebas que revelen la existencia de
bacterias heteroacutetrofas metalofijadoras a partir de esto se cultivaran
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
51
enun caldo de cultivo a las colonias de pseudomonas para la obtencioacuten
de cepas puras
Meacutetodo de la membrana filtrante para el anaacutelisis microbioloacutegico del agua
La teacutecnica de filtracioacuten de voluacutemenes conocidos que vamos a utilizar para
retener el mayor nuacutemero de bacterias se realiza traveacutes de un filtro Millipore de
acetato de celulosa 045microm de poro [25] Se colocaraacute la membrana filtrante
esteacuteril sobre el centro del portafiltro con la superficie cuadriculada hacia
arriba
Ensamblaremos el equipo colocando el dispositivo de filtracioacuten Se filtraraacuten100
ml de agua a traveacutes del portafiltro y proceder a filtrar para retener las bacterias
[26] A continuacioacuten removeremos la parte superior del portafiltro transfirieacutendo
la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo Esperar
aproximadamente 20 minutos permitiendo la adhesioacuten de la membrana al
medio Incubaremos las placas a las diferentes temperaturas y tiempos
posteriormente las membranas seraacuten colocadas en las placas que contienen
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
52
agar de pseudomona King A y se incubaraacute a 28ordmC durante 24-48 horas Las
ceacutelulas viables depositadas sobre el filtro originaraacuten colonias
CONTEO MICROBIOLOGICO
La lectura de los cultivos se la realizaraacute 28H a partir de la siembra con un
contador de colonias tomando en cuenta uacutenicamente aquellos platos donde el
resultado oscilaba entre 25 a 250 unidades formadoras de colonias [29]
(UFCml oacute UFCg) Se aplicaraacute seguacuten el criterio de Bonde (1977) Se
caracterizaraacute morfoloacutegicamente las colonias empleando la tincioacuten de Gram
Nota Si se sospecha que el agua contiene un alto nuacutemero de bacterias
es conveniente diluir la muestra antes de la filtracioacuten
Cultivo de las bacterias
Se sabe que el liacutemite maacuteximo permitido de mercurio en riacuteos 00002 mgl
Rio gala (00002 x 2414 veces mas del rango normal) 00048 mgl
00048
mgl
lowast1000microl
mglowastl
1000ml=00048microl ml
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
53
Equipos
Autoclave
Caacutemara esteacuteril
Equipo de filtracioacuten (Millipore)
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Membranas de filtracioacuten Millipore de 045microm
Bomba de vaciacuteo
Pinzas esteacuteriles
Muestra de colonias bacterianas
Asa de platino
Espaacutetula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodoacuten
Alcohol potable
Tubos de 15 ml
Porta-tubos para tubos de 15 ml
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
54
Porta tubos para tubos de ensayo
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agar Kin de pseudomonas
Agua destilada
Agua destilada esteacuteril
Cloruro de mercurio
Pasos
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A Al culmino de la incubacioacuten contaremos las colonias
en sus respectivas membranas Se expresaraacute los resultados como unidades
formadoras de colonias (ufc) por 100 ml de agua considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucioacuten Se seleccionaraacute las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado Obteniendo la seleccioacuten procederemos a aislar
las colonias sospechosas especificadas en el agar selectivo y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A donde creceraacuten
en condiciones de pH de 7 (+-2)
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
55
Una vez aisladas las colonias realizaremos inoculaciones a un medio liacutequido
(cultivo puro) Se esperar las 24 horas para la incubacioacuten
Se tomaraacute una pequentildea cantidad de la colonia y sembrando en un caja Petri
que contenga medio soacutelido rayaacutendolo en forma de estriacuteas
Cuando esteacute listo el cultivo se haraacuten diluciones del cloruro de mercurio
En la Tabla 3 se muestran la diferentes concentraciones de cloruro de mercurio
1rsquo000000ml 1000 microl
1ml X microl
001 microl en 1ml de solvente = 1ppm 10 microl en 1ml de solvente
= 1000ppm
C1lowastV 1=C2lowastV 2
V1=iquest 500 ppmlowast1000 micro l
1000 ppmiquest
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
56
Nota -son ocho tipos de colonias maacutes probables encontradas No
recomendamos usar diluciones a partir de 10-1 debido a que la
concentracioacuten encontrada en el riacuteo es de 00048microlml
Para la preparacioacuten del agar de pseudomona se le antildeade un volumen final de
cada dilucioacuten (1000 microl) Obteniendo un total de 40 cajas Petri (Tabla 4)
Re procederaacute a realizar una nueva incubacioacuten las diferentes colonias de
pseudomonas obtenidas en el paso anterior donde se la cultivo a las diferentes
concentraciones de cloruro de magnesio en condiciones aeroacutebicas
La incubacioacuten se realiza en una incubadora a 28degC en una estufa durante 24
horas Luego se realizara un conteo de las UFC obtenidas en cada muestra
Se determinara cual dilucioacuten ofrecioacute mayor eficacia metalofijadora seguacuten la
capacidad de crecimiento de las UFC Se seleccionar las colonias de la caja
petri que obtuvo mejor rendimiento metalofijador
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
57
Una vez realizados todos estos pasos se procede a Aplicar la metodologiacutea de la
DGGE a cada una de las colonias seleccionadas
METODO DE DGGE
Para dicho meacutetodo de rastreo molecular utilizaremos un equipo para DGGE
(electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacioacuten) para analizar
poblaciones microbianas basadas en amplificaciones de fragmentos de genes
ribosomales (CBS Scientific Co DGGE ndash 2001- Rev B) Figura 6
Siguiendo el protocolo descrito por (G Muyzer EC de Waal and AG
Uitterlinden 1993) La utilidad de eacutesta diferenciacioacuten radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con eacutestas caracteriacutesticas es muy comuacuten
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la teacutecnica PCR Entonces
para dicho efecto nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6) con gradiente
quiacutemico lineal de 40 - 60 desnaturalizante (Urea-formamida) Se lo
condicionaraacute a 60ordmC de electroforesis 10acute20 voltios5 h 150 voltios Gracias al
gen ribosomal de la subunidad 16S y las variaciones en eacuteste gen definiraacuten los
grupos taxonoacutemicos en las bacterias que se encuentran en una colonia
especiacutefica de las secuencias de estos genes seraacuten utilizadas para poder realizar
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
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- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
58
los respectivos anaacutelisis de la composicioacuten de comunidades microbianas en las
muestras ambientales recogidas o tambieacuten para determinar raacutepidamente a que
taxoacuten pertenece una cepa bacteriana
EXTRACCIOacuteN DEL DNA Y PURIFICACIOacuteN DEL DNA
Para obtener el DNA completo aplicaremos el meacutetodo detallado por Soluciones
QPCR Protocolo y Teacutecnicas Cultek 022006 el mismo que utiliza CTAB ndash Fenol
ndash Cloroformo para la extraccioacuten y purificacioacuten consecuente e Isopropanol para
lograr un buen precipitado El DNA lo purificaremos gracias a la teacutecnica
puntualizada por Smit et al 1997 durante el cual se usaraacute un Sistema de
Purificacioacuten fundamentado en filtros (Wizardreg PCR Preps DNA Purification
System) El Kit comercial Wizard genomic DNA purification kit [27] nos
serviraacute para purificar material geneacutetico de las ceacutelulas de cultivo bacteriano Para
la realizacioacuten de este y otros meacutetodos se debe seguir las instrucciones del
fabricante (esta teacutecnica es la que vamos a utilizar en el laboratorio para purificar
DNA y se describiraacute posteriormente sus pasos para la obtencioacuten de dicho
material)
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
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28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
59
Moacutedulo central
Se Cultivan los microorganismos en el medio maacutes adecuado o en 5-10mL de
medio de cultivo O si vamos a utilizar las placas de agar recogemos las
colonias con un asa esteacuteril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensioacuten
(33mL de NaCl 3M 10mL de Tris 1M pH 80 20mL de EDTA 05M pH 80
585mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL) Si se utiliza medio de
crecimiento centrifugar las colonias durante 5min a 3600timesg a 4degC eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensioacuten
Se centrifugar la suspensioacuten durante 5min a 3600timesg a 4degC Se eliminar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 378mL de buffer de suspensioacuten
Se le antildeade 200μL de SDS al 20 y se mezclar completamente mediante
inversioacuten Se incuba la mezcla a 37degC durante 30min Antildeadir 20μL de proteinasa
K (20mgmL) mezclar y continuar incubando a 37degC durante otro 30min Se
inocula 720μL de NaCl (5M) homogenizar la mezcla y antildeadir 600μL de CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y se mezclar por inversioacuten
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
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10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
60
Se incuba a 65degC durante 10min y a 37degC durante 5min Luego se le Agrega un
volumen igual de PCI (25241 fenol-cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y se
centrifugar a 1500timesg durante 15min Se Traspasar la fase acuosa superior a un
nuevo tubo Antildeadir un volumen igual de CI (241 cloroformo-alcohol isoamiacutelico) y
centrifugar durante 15min a 1500timesg
Traspasamos la fase acuosa superior a un nuevo tubo Antildeadir 25 voluacutemenes de
etanol friacuteo al 95 mezclar por inversioacuten y mantener a -70degC durante 30min
Centrifugamos durante 30min a 14500timesg Eliminar el sobrenadante y secar el
pellet mediante vaciacuteo Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl
10mM EDTA 1mM pH 80) Antildeadir 1μL de una dilucioacuten 13 en agua esteacuteril de
RNasa T1 Incubar la mezcla a 37degC durante 1h y Centrifugar a 19900timesg
durante 2min
Se traspasaraacute la fase acuosa superior a un nuevo tubo antildeadiremos 01
voluacutemenes de acetato soacutedico 3M y mezclar bien Precipitar el DNA con 25
voluacutemenes de etanol friacuteo al 95 Mantener a -70degC durante 20-30min
Centrifugar durante 8min a 19900timesg Eliminar el sobrenadante Lavar el pellet
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
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85
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
61
con 500μL de etanol al 70 y volver a centrifugar durante 8min Se descartar el
sobrenadante secar el DNA a vaciacuteo (15-30min) y disolver el pellet de DNA en
100-400μL de agua esteacuteril
Despueacutes de realizar la extraccioacuten de ADN se debe medir la concentracioacuten con
un espectrofotoacutemetro diluir una aliacutecuota 120 (15μL en 285μL de H2O) y leer a
λ = 260nm La A260 es igual a la concentracioacuten de DNA en grL
PCR (16SrRNA) DEL DNA BACTERIANO
La amplificacioacuten exponencial del DNA por PCR - DGGE permitiraacute obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anaacutelisis
subsecuentes lo cual lo realizaremos mediante la teacutecnica ya descrita por
Schaefer et al (2001) Las bacterias seraacuten extraiacutedas a partir de los cultivos
liacutequidos en los cuales se las aisloacute previamente estas cadenas de ADN seraacuten
amplificadas por PCR - DGGE usando los primers PRBA338F-GC (5
acuteGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAG-3acute) y 518Rndash1 (5acute-ATTACCGCGGCTGCTGG-3acute)
complementarios de la regioacuten conservada 16S RNA con 35 ciclos termales
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
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5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
62
Condiciones de la reaccioacuten de PCR para el gen 16S rRNA [27](Tabla 5)
Condiciones para el termociclador para la reaccioacuten de PCR para el gen 16SrRNA [27] (Tabla 6)
Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (BiondashRad) Para
amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S
Tincioacuten
Para el proceso de la tincioacuten se emplearaacute la tincioacuten SYBR Green I lo que nos
permite determinar las muestras de una forma raacutepida Lebaron et al (2001)
encuentran que las ceacutelulas tentildeidas con SYBR Green I tienen mayor
fluorescencia y se obtiene mejor discriminacioacuten de la fluorescencia del fondo
(ruido) en comparacioacuten con ceacutelulas tentildeidas con otros fluorocromos
Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara
digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
Anaacutelisis de Imagen
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
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5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
63
Para el anaacutelisis de los fragmentos y genotipado usaremos el programa Gene
Profiler y Adobe Photo Shop para realizar un mejor anaacutelisis ElWindows 1D Gel
AnalysisGene Profiler is a complete software package that uses automatic lane
and peak finding to detect the presence of bands in a gel or blot and calibrate
them for size and intensity software es un
paquete completo que nos ayuda a detectar la presencia de bandas en un gel y
a calibrar los tamantildeos e intensidad de los mismos By using calibration markers
in each gel electrophoresis run Gene Profiler can automatically calculate the
molecular weight (Mr) isoelectric point (pI) and concentration values of any DNA
fragment or polypeptide band detectedMediante el uso de marcadores de
calibracioacuten en cada serie de electroforesis en gel el Gene Profiler puede
calcular automaacuteticamente el peso molecular (Mr) punto isoeleacutectrico (pI) y los
valores de concentracioacuten de cualquier fragmento de ADN o banda polipeptiacutedica
detectado Furthermore the sophisticated software module is capable of
correcting and analyzing distorted gel images (lanes that slant curve or smile)
ensuring the highest degree of accuracy possible Ademaacutes el moacutedulo de
software es capaz de corregir y analizar las imaacutegenes distorsionadas de gel
asegurando el maacutes alto grado de precisioacuten posible
Iacutendices de Diversidad
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
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Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
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11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
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19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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87
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25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
64
Empleando los Iacutendices de diversidad podremos examinar la estructura de la
comunidad bacteriana muestreada cuyos caacutelculos se resolveraacuten con distintas
formulas para establecer las poblaciones Tambieacuten para empezar y dar una
buena aproximacioacuten podemos utilizar la cineacutetica de reasociacioacuten de moleacuteculas
de AND y con ello estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas que
encontremos
El meacutetodo es sencillo y se basa en que a partir del ADN purificado al
desnaturalizarse forma bandas simples Y la tasa de reasociacioacuten de estas
bandas depende del nuacutemero de secuencias similares Asiacute en una comunidad
con muchas especies entre mayor sea la complejidad maacutes lenta seraacute la
reasociacioacuten de secuencias de ADN similares Debido a que el ADN de simple
banda absorbe maacutes fuertemente a 260nm que el de doble banda el grado de
reasociacioacuten puede medirse utilizando un espectrofotoacutemetro (Torsvick 1994
Paul y Clark 1996) Se verifica la integridad del mismo despueacutes de realizar
electroforesis de 5 μg de ADN en un gel de agarosa a 08 (pv) con
amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato pH 76 1 mM Na2middotEDTA) durante 2h a
80V y tentildeido con SYBR Green I (05 mg mL-1) para luego efectuar las
reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa
Riqueza de especies (S)
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
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10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
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12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
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14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
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32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
65
La riqueza de especies es el iacutendice de diversidad maacutes simple (LUDWIG Y
REYNOLDS 1988) y consiste en la cantidad de especies existentes en un aacuterea
determinada La abundancia estaacute dada por la cantidad de especies (bandas)
observados en total Este iacutendice define el nuacutemero de organismos que se
encuentran presentes en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
[28]
No toma en cuenta la proporcioacuten y distribucioacuten de cada especie en la
comunidad se refiere a un anaacutelisis meramente cuantitativo
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
S= de bandas detectadas
La riqueza especiacutefica en siacute es un concepto simple de interpretar que se
relaciona con el nuacutemero de especies presentes en la comunidad Entonces
puede parecer que un iacutendice apropiado para caracterizar la riqueza de especies
de una comunidad sea el lsquonuacutemero total de especiesrsquo (S) Sin embargo es
praacutecticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y como
S depende del tamantildeo de la muestra es limitado como iacutendice comparativo
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
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5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
66
Los iacutendices que proponemos ademaacutes de (S) para medir la riqueza de especies
de manera independiente al tamantildeo de la muestra debe basarse en la relacioacuten
entre S y el lsquonuacutemero total de individuos observadosrsquo o (n) que se incrementa
con el tamantildeo de la muestra
Entre estos iacutendices se destacan el iacutendice de Margalef (1958) cuya foacutermula es
la siguiente
R1=Sminus1ln (n)
Iacutendice de ShannonndashWeaver
Este iacutendice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacioacuten indefinidamente grande esto es una poblacioacuten efectivamente
infinita La ventaja de este iacutendice es que eacutel lleva en consideracioacuten el nuacutemero de
las especies y las especies dominantes En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE o sea que toma en cuenta el
nuacutemero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi 2003) [28]
Se calcula por medio de la siguiente ecuacioacuten
H =minussumi=1
S
πlnπ
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
67
Donde
π es la intensidad relativa de las bandas en un perfil
Igualdad u homogeneidad (Evenness)
Si todas las especies en una muestra (nuacutemero de bandas presentes en DGGE)
presentan la misma abundancia (intensidad relativa de las bandas) el iacutendice
usado para medir la de equitabilidad deberiacutea ser maacuteximo y por lo tanto deberiacutea
decrecer tendiendo a cero a medida que las abundancias relativas se hagan
menos equitativas [29] Hurlbert (1971) destacoacute que todos los iacutendices de
equitabilidad mantendriacutean esta propiedad si son expresados como una medida
que especifica que tan similar es la abundancia de las distintas especies Su
caacutelculo se realiza a partir del iacutendice de riqueza de especies (S) y el iacutendice de
Shannon-Weaver (H)
Se calcula con la siguiente ecuacioacuten
E= Hlog(S ) (Para cualquier base)
E= HminusHminHmaxminusHmin
Disentildeo estadiacutestico sobre los resultados arrojados por los iacutendices de
diversidad
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
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Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
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8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
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23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
68
La biodiversidad o diversidad bioloacutegica se define como la variabilidad de los
organismos vivientes de todas las fuentes incluyendo entre otros los
organismos terrestres marinos y de otros ecosistemas acuaacuteticos asiacute como de
los complejos ecoloacutegicos de los que forman parte esto incluye diversidad dentro
de especies entre especies y de ecosistemas (UNEP 1992 citado por Moreno
2001)
Para estimar estadiacutesticamente la diversidad se debe
1 Tener un buen conocimiento de la composicioacuten taxonoacutemica
2 Considerar que todos los individuos asignados a una clase (especie)
son ideacutenticos Es decir no se reconoce la variabilidad que puede
existir entre por ejemplo etapas del desarrollo de la bacteria (quiste-
espora ndashetapa vegetativa etc)
La diversidad en una muestra bacteriana es una variable nominal las
categoriacuteas son las especies y por lo tanto el uacutenico valor de tendencia central que
puede obtenerse es la moda (categoriacutea con mayor frecuencia en este caso la
especie maacutes abundante) siendo imposible calcular un promedio o una mediana
Siacute puede medirse la dispersioacuten la distribucioacuten de las observaciones entre
categoriacuteas que se relacionan con el concepto de diversidad
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
69
CAPITULO 4
41 ANAacuteLISIS DEL PROYECTO
1 Analizar la importancia de este estudio y los impactos positivos que podriacutean
tener en las poblaciones aledantildeas como al desarrollo cientiacutefico del paiacutes
2 Tenemos la confianza de la presencia microorganismos con capacidad
metalo-fijadora debida a que las aguas del riacuteo se encuentran contaminadas
con mercurio y demaacutes metales gracias a la accioacuten minera el cual es un
sustento para la poblacioacuten de Tenguel
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
70
42 INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
1 Se espera que mediante el implemento de la teacutecnica de DGGE para la
caracterizacioacuten de las bacterias se pueda determinar la predominancia
organismos Gram negativos en especial la existencia de geacuteneros
pseudomona en el riacuteo Gala para el uso de las mismas en futuros procesos
de biorremediacioacuten
2 La aislacioacuten ulterior de las bacterias con mayor potencialidad de resistencia
y fijacioacuten al mercurio para lograr la obtencioacuten mantenimiento y
almacenamiento de cepas puras
3 Utilizar las cepas puras aisladas para estudios posteriores y pruebas
bioquiacutemicas sobre su capacidad metalo-fijadora
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
71
4 Se estableceraacute una liacutenea base de la presencia de los microorganismos
presentes en el Rio Gala y asiacute contribuir con el desarrollo tecnoloacutegico y
cientiacutefico vinculados con los procesos de remediacioacuten ambiental y
tratamientos de residuos toacutexicos por parte de la industria minera
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1 Mediante la caracterizacioacuten bioquiacutemica se han implementando medios de
cultivos selectivos pruebas de resistencia y meacutetodos de fijacioacuten de
mercurio se pudo determinoacute bibliograacuteficamente que los geacuteneros
pseudomonas predominaban en zonas con altas concentraciones de
metales pesados
2 Dadas las caracteriacutesticas bioloacutegicas de estos microorganismos (geacutenero
Pseudomona) se asumioacute la existencia de las mismas en el rio Gala
Debido a que se encuentran distribuidas de manera amplia en suelos y
aguas contaminadas con metales pesados
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
72
3 Gracias a las teacutecnicas moleculares (PCR-DGGE) se puede determinar
especiacuteficamente el nuacutemero y especie presentes en las muestras y definir
las especies dominantes dentro de las cepas aisladas
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
74
FIGURA 3
FIGURA 4 TOMA DE MUESTRAS 1
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
Muestras de agua provenientes del riacuteo Gala Microbiologiacutea medio selectivo (pseudomona agar Kin A)
Ensayo Cultivo de cepas en la mezcla agar-mercurio Primer aislamiento de Cepas
Anaacutelisis del ensayo (cepa con mayor capacidad metalofijadoraSegundo aislamiento (Cepa metalofijadora)
Extraccioacuten de ADNPCR
Amplificado 16S rRNA de toda la poblacioacuten bacterianaElectroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
75
361 P 078 B 364 P 076 B000
224
448
712
936
1200
1424
1648
1912
2136
MetrosHORA
FIGURA 5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
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4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
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7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
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10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
76
FIGURA 6ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DEL METODO DGGE [36]
Extraccioacuten del DNA
DNA total incluyendo DNA microbiano de Especies diferentes
Amplificacioacuten por PCR de una regioacuten variabledel ADN ribosomal
Mezcla de los ampliconesde ADN de diferentes especies (mismo tamantildeo pero diferente secuencia)
Muestra recogida del riacuteo Gala
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
77
DGGE anaacutelisis
Muestra especiacutefica Huella digital
Banda de purificacioacuten y secuenciacioacuten
Anaacutelisis de secuencia comparativa con base de datos de secuencias conocidas
Identificacioacuten de especies microbianasTABLAS
TABLA 1
Horahhmm
AlturaMetros
0030 364 P
0630 076 B
1200 361 P
1930 078 B
TABLA 2
Horario Tipo de marea muestras Sup y Prof
3 puntos a la horizontal Replicas
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
78
0030 364 P 2 6 12
0630 076 B 2 6 12
1200 361 P 2 6 12
1930 078 B 2 6 12
Total 8punto 24 48
TABLA 3
Dilucioacuten 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Concentracioacuten 10000ppm 1000ppm 100ppm 10ppm 1ppm 01ppm 001ppm
Concentracioacuten real 500ppm 50ppm 5ppm 05ppm 005ppm
Volumen 1 --- --- 50microl 50microl 50microl 50microl 50microl
Volumen final --- --- 1000 microl 1000microl 1000 microl
1000 microl 1000 microl
Total (8cD) 8000 8000 8000 8000 8000
TABLA 4
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
79
8 cajas petri cu 10-2
8 cajas petri cu 10-3
8 cajas petri cu 10-4
8 cajas petri cu 10-5
8 cajas petri cu 10-6
Total 40 cajas petri
TABLA 5
Componentes de la reaccioacuten Concentracioacuten final 25μl de reaccioacuten
MetodologiacuteaAgua MQ Variable 1730 μlAmortiguador 10x 1x 250 μlMgCl2 15mM 150 μldNTPacutes 1 0 mM de cada dNTP 05 μlIniciador 8for 66 pmolμl 10 μlIniciador 1492 rev 66 pmolμl 10 μlTaq polimerasa 5 Uμl 1 Uμl 02 μlDNA molde 025 mgreaccioacuten 1 μl
Nota Componentes para una reaccioacuten de 25μl
TABLA 6
Temperatura Tiempo
Desnaturalizacioacuten inicial 94ordmC 5 minDesnaturalizacioacuten 94ordmC 30 segAlineamiento 52ordmC 20 seg
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
80
Alargamiento 68ordmC 40 s 35 ciclos del paso 2 al 4Alargamiento final 68ordmC 7 min
TABLA 7
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DICToma de las muestras (aguas abajo del Rio Gala) Transporte y preservacioacuten de muestras Cultivo de las muestras em agar selectivo
A Anaacutelisis de las colonias del genero geacutenero pseudomona
Obtencioacuten de cepas puras en medio liquido de cultivo Bioensayo en AgarMercurio
Anaacutelisis de los crecimientos obtenidas en los distintos cultivos agarmercurio Aislamiento de la UFC con mayor actividad metalofijadora Caracterizacioacuten por el meacutetodo PCR- DGGE Anaacutelisis de los iacutendices de diversidad y de resultados Escritura de publicacioacuten es de resultados
82
ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
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ANALISIS DE COSTO
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
83No ACTIVIDAD
FECHA INICIO
RECURSOS
MATERIALES
RECURSOS
HUMANOS
COSTO DE LA
ACTIVIDAD
1
Toma de las
muestras
(aguas abajo
del Rio Gala)
3 diacuteas
Botellas Boeco-
Germany con tapa
rosca de 250 ml
Botella Van Dorf
Canoa
2
teacutecnico para
toma de
muestras
1 Panguero
76860
2Transporte y
preservacioacuten de
muestras
Hielera
Transporte
Automotor
combustible
Chofer 140rsquo00
3Cultivo de las
muestras1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
King A
Varios
2
Biotecnoacutelog
os
12300
4
Anaacutelisis de las
colonias del
genero
pseudomona
1 mes2
Biotecnoacutelog
os
20000
5
Obtencioacuten de
cepas puras en
medio liquido
de cultivo
Enero TSB
500g4400
6Bioensayo en
AgarMercurio20000
7
Anaacutelisis de los
crecimientos
obtenidas en
los distintos
cultivos
agarmercurio
12000
8
Aislamiento de
la UFC con
mayor actividad
metalofijadora
-----
84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
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84
BIBLIOGRAFIA
1 P R Parrish A C Hendricks J G Eaton Aquatic Toxicology MarkingKimerle editors Baltimore April 1980 Pag 225 ndash 231
2 H von Canstein Y Li K N Timmis W-D Deckwer and I Wagner-Dobler Removal of Mercury from Chloralkali Electrolysis Wastewater by a Mercury-Resistant Pseudomonas putida Strain National Center for Biotechnology (GBF) Germany 1999 Publicacioacuten Cientiacutefica
3 Conly L Hansen y David K Stevens Nutrition Biological and Physio-Chemical remediation of mercury-contaminates hazardous waste USA August 2000 EPA-600-R-92-105 PP 121-125
4 Treatment technologies for Mercury in Soil Waste and Water US environmental Protections Agency Office of Superfund Remediation and technology Innovation Washington DC August 2007
5 Chang JS Hong J Estimation of kinetics of mercury detoxification from low-inoculum batch cultures of Pseudomonas aeruginosa PU21 (Rip64) Department of Chemical and Biochemical Engineering University of California Irvine 92717 USA 1998 Publicacioacuten Cientiacutefica
6 Osborn AM Bruce KD Strike P Ritchie DA Distribution diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon School of
85
Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
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Biological Sciences Donnan Laboratories University of Liverpool UK 1997 Publicacioacuten Cientiacutefica
7 Valentina V Umrania Bioremediation of toxic heavy metals using acidothermophilic autotrophies Department of Microbiology MVM Sc and HSc College Saurashtra University Rajkot 360 002 India 2005 Publicacioacuten Cientiacutefica
8 LAMPREA EDWIN RIVERA TORRES LUIS ALEJANDRO ORTIZ LIZ LOZANO Disentildeo de un biofiltro a escala de banco para la biodetoxificacion de mercurio (Hg) mediante la utilizacioacuten de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa)
9 Informe del paiacutes Ecuador reunioacuten regional sobre calidad de agua potable OPSCEPISREULAB Mayo 1996 pag 3 ndash 7
10 La mineriacutea provoca una alarmante contaminacioacuten en riacuteos de Tenguel 25-04-2008 wwwEcoportalnet
11 Examen Especial Al Control De Explotacioacuten Minera En Las Cuencas De Los Riacuteos Santa Rosa Caluguro Tenguel Y Siete A Cargo De La Direccioacuten Regional De Mineriacutea De El Oro Ministerio Del Ambiente Y Ministerio De Energiacutea Y Minas Ecuador Pag 2-8
12 Resabala Carola Inventario Nacional De Emisiones De Mercurio Y Productos Que Contienen Mercurio ecuador Agosto 2008 Pag 5 8 17-20
13 De Jaysankar And N Ramaiah Characterization Of Marine Bacteria Highly Resistant To Mercury Exhibiting Multiple Resistances To Toxic Chemicals National Institute Of Oceanography Dona Paula India
14 Visca Paolo Colotti Gianni Serino Laura Daniela Verzilo Orsi Nicola y Chiancone Emilia Metal Regulation of Siderophore Synthesis in Pseudomonas aeruginosa and Functional Effects of Siderophore-Metal
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Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
36 Ercolini Danilo PCR-DGGE fingerprint novel strategies for detection of microbes in food Journal of Microbiological Methods Italy 2003
- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
- Equipos
- Materiales
-
- Reactivos
-
- METODO DE DGGE
- Tincioacuten
- Una vez terminada la tincioacuten el gel seraacute fotografiado con ayuda de una caacutemara digital (8 Megapiacutexeles con Zoom oacuteptico)
- Anaacutelisis de Imagen
-
86
Complexes University ldquoLa Sapienzardquo Rome Italy 1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
15 Pool Robert Environmental Contamination Biotechnology and the Law National Research Council Washington August 2000 Summary of a Forum Held at the National Academy of Sciences
16 Geoffrey M Gadd Microbial Metal Transformation Division of Environmental and Applied Biology Biological Sciences Institute School of Life Sciences University of Dundee Dundee DD1 4HN Scotland UK June 2001
17 A Jerez Carlos Biomining Microorganisms Molecular Aspects and Applications in Biotechnology and Bioremediation University of Chile Santiago 2009 pag 239
18 Altamirano Mariacutea Gabriela AISLAMIENTO E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLIacuteTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIOacuteN Provincia de Neuqeacuten ndash Argentina 2001
19 Pumarola Agustiacuten Microbiologiacutea y parasitologiacutea medica Cap 43 MASSON SA Barcelona (Espantildea) 1987 pag 478
20 L Schiller Neal R Monday Steven M Boyd Carol TKeen Noel and E Ohman Dennis Characterization of the Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) Cloning Sequencing and Expression in Echerichia coli Memphis Tennessee 1991 Publicacioacuten Cientiacutefica
21 Abdul Rehman S Awais Butt and Shahida Hasnain Isolation and characterization of arsenite oxidizing Pseudomonas lubricans and its potential use in bioremediation of wastewater Department of Microbiology and Molecular Genetics University of the Punjab New Campus Pakistan 2010
87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
88
biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
89
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- SOBRE LA CONTAMINACIOacuteN HIacuteDRICA
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87
22 L Vullo Diana MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS UNA INTERACCIOacuteN EN BENEFICIO DEL MEDIO AMBIENTE 2003
23 Eccles H Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process BNFL Research and Technology Springfields Preston 2001
24 Ying Kuang Kaori Tani Aidan J Synnott Kazuhito Ohshima Hidetoshi Higuchi Hajime Nagahata Yasunori Tanji Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCRndashDGGE method Department of Bioengineering Tokyo Institute of Technology Japan Department of Bioscience Rakuno Gakuen University Japan 2004
25 Delgado Martin Garcia Hernandez Hormigo Felipe Hardisson de la Torre Aacutelvarez Marante Anaacutelisis Microbioloacutegico y Fisicoquiacutemico del agua de piscinas de la isla de Tenerife Universidad de la Laguna1992 Publicacioacuten Cientiacutefica
26 Goacutemez Yamiris Gonzaacutelez Gonzaacutelez Mariacutea Isabel Chiroles Rubalcaba Sergio y Garciacutea Crucet Cosset Calidad microbioloacutegica del agua utilizada en la Unidad de Hemodiaacutelisis del Instituto de Nefrologiacutea Unidad Nacional de Salud Ambiental Ministerio de Salud Puacuteblica Ciudad de La Habana Cuba 2005
27 Loacutepez cortes Alejandro Maya Yolanda Garciacutea Maldonado Joseacute Diversidad filogeneacutetica de especie de Microcoleus de costras bioloacutegicas de suelo de la peniacutensula de Baja california Centro de Investigaciones bioloacutegicas del noroeste Mexico 2009
28 Aguirre Garrido Joseacute Feacutelix Seguimiento de la comunidad bacteriana en los suelos contaminados por hidrocarburos durante su tratamiento en
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biorreactores de fase semisoacutelida Universidad Autoacutenoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Meacutexico DF 2005
29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
32 EHRLICH L 1997 Biorremediation of heavy metals USA
33 Olivero J Arguello E and Johnson B Human exposure to mercury in San Jorge river basin Colombia (South America) The Science of the Total Environment 2002 28941-47
34 Chasar Liac Scudder Barbarc A Obintewart R Bell Aman Dah And Georger Aiken Mercury Cycling In Stream Ecosystems 3 Trophic Dynamics And Methylmercury Bioaccumulation US Geological Survey Florida Integrated Science Center Geological Survey National Research Program Boulder Colorado 2009 Publicacioacuten Cientiacutefica
35 Stephenson Angela Heavy metal analysis of liquid waste and sediment collected from the Aliaga Petrochemicals plant Aliaga Izmir Turkey Greenpeace Research Laboratory University of Exeter UK September 1996
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-
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-
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-
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29 Morales Vanegas Sarahi de los Angeles Prediccion de conteos microbioloacutegicos en la leche cruda con base en la prueba de azul de metilenoZamorano Honduras 2005
30 Cedentildeo Ricardo Caracterizacioacuten de Comunidades Bacterianas en sistemas de engorde de camaroacuten mediante electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE) Boletiacuten informativo No 133 Ecuador 2005
31 CALDERON F RUEDA A MARTINEZ M Aislamiento e identificacioacuten de microorganismos resistentes y biorremediadores de Hg en aguas contaminadas de la bahiacutea de Cartagena y del humedal de la conejera Santafe de Bogotaacute Tesis Pontificia Universidad Javeriana 1999
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