VOL.30 S-2 CHEMOTHERAPY 1

Clavulanic acidの β-lactamase阻 害 効 果 お よびAmoxicillin

と の 併 用 に よ る 抗 菌 作 用 に つ い て

中 沢 久 ・松浦 正 幸 ・三 橋 進

群馬大学医学部微生物学教室

1)Amoxicillin(AMPC)耐 性 の グ ラム陽 性,グ ラム陰 性 菌 群 に対 して,Amoxicillinに 少 量 の

Clavulanic acid(CVA)を 添 加 す る と著 しい 抗 菌 力 の増 強 が 見 られ た。

2)Amoxicillin耐 性 菌 に お い てAmoxicillinのMIC値 と β-lactamaseの 生産 量 に は 相 関 関

係が 見 られ た。

3)Clavulanic acidはR因 子 由来 の す べ て の型 のPenicillinase(PCase)お よびP.vulgaris,

B.fragilis,P.cepaciaの 生 産 す る セ フ ロキ シマ ーゼ を強 く阻 害 した 。

4)AmexicillinとClavulanicacidの 至 適配 合 比 を 検 討す るた め 各 種 のAmoxicillin耐 性 お よ

び感 受 性菌 に 対 して,AmoxicillinとClavulanic acidの 配合 比 を 変 化 させMIC値 の 比 較 を 行 な

った 。Amoxicillin:Clavulanicacidの 配 合比 が5:1か ら1:5の 間 が 耐性 菌,感 受 性 菌 どち ら

に 対 して も最 も強 い 抗菌 力 を示 した 。

5)BRL25000(Amoxicillin:Clavulanic acid=2:1)の 治 療 実験 中に 集 め られ たAmoxicillin

耐 性菌 に対 してBRL25000はAmoxicillinよ り数 段 強 い 抗菌 力 を示 した 。

6)Amoxicillin耐 性菌 に 対 す る殺 菌 作用 もAmoxicillinにClavulanic acidを 添 加 す る こ とに

よ り増 強 され た 。

7)マ ウス感 染 治 療 実験 に お い てAmoxicillinと 比 較 してClavulanic acid添 加 に よる 治療 効 果

は優 れ て いた 。

Clavulanic acid(CVA)は 英 国 ピー チ ャ ム社 に よっ て

開 発 され た 新 しい β-lactamase阻 害 剤 で あ る1,2)。CVA

は単 独 で は弱 い 抗 菌 力 しか もた な い が,β-lactamaseを

産生 す るベ ニ シ リン耐 性 菌 に 対 して ベ ニ シ リン と併用 す

る ことに よ り β-lactamaseを 阻 害 し併 用 し た ペ ニ シ リ

ン の分 解 を防 ぐこ とが報 告 され て い る3,4)。

わ れ わ れはAmoxicillin(AMPC)とCVAの 併 用 に

よるAMPC耐 性 の グ ラム陽 性,グ ラム陰 性 菌 に 対 す る

抗 菌 作 用,殺 菌 作 用,マ ウス感 染 治療 効 果 な どに つ い て

検 討 を 行 な った 。また 単 離精 製 され た 各 種 β-lactamase

に対 す るCVAの 阻 害 効 果 お よ びAMPCとCVAの 至

適 配 合比 に つ い て も検 討 を 行 な っ た ので そ の 成 績 を報 告

す る。

I.　 実 験 材 料 お よび 方 法

1)使 用薬 剤

AMPCお よびCVAは ビー チ ヤ ム薬 品 よ り提 供 され

た 原 末 を用 い た 。 他 の 薬剤 も各 社 よ りそ れ ぞれ 分 与 を 受

け た ものを 使 用 した。

2)使 用 菌 株

使用 菌 株 はす べ て ヒ ト病 巣 由来株 で群 馬 大 学 医 学部 微

生 物 学 教 室 のstock cultureお よびBRL25000の 治 験

中 に 集 め られ たAMPC耐 性 菌 を用 い た 。

3)使 用 培 地

Minimal inhibitory concentration(MIC)の 測 定 に

はHeart infusien agar(栄 研,HIA),Bactericidal

activityの 測 定 に はAntibiotic medium3(Difco,A

BM 3),β-lactamase調 製株 の 培 養 に はBrain heart

infusion(Difco,BHI)とMedium B〔 酵 母 エ キ ス2g,

ポ リベ ブ トン10g,Na2HPO4・12 H20 8g,KH2PO4 2

g,(NH4)2 SO4 1.2g,グ ル コー ス2g,MgSO4 0.4g,

1l蒸 留 水pH7.4〕 を用 いた 。 嫌 気 性菌 の培 養に はGAM

agar(ニ ッス イ)を 用 い,そ の 他 ペ プ トン水,Brom-

thymol blue(BTB)agarお よび菌 液 の 希 釈 にBuffered

saline containing gelatin(BSG)溶 液 を 用 い た 。

4)抗 菌 力 測 定

HIAを 用 い 日本化 学 療 法 学 会 標 準 法5)に 準 じた 寒 天 希

釈 法に 従 った 。す なわ ち被 検 菌 の ペ プ トン水,37℃,18

時 間 培 養 液(108～10gcells/ml)を106cells/mlに な る

よ うにBSGを 用 いて 希 釈 し,そ の1白 金 耳 を 薬 剤 含有

培 地 に 接 種 し,37℃,18時 間 培 養後,被 検 菌 の 発 育が

認 め られ ない 最 小 濃 度 を もってMICと した 。

5)殺 菌 力測 定

2 CHEMOT HERAPY NOV. 1982

Table 1 Antibacterial spectra of BRL25000, AMPC and CVA against standardstrains of bacteria (106 cells/ml)

試 験菌 をABM3で37℃,18時 間 培 養 し,こ れ を 希

釈 し,最 終 細 菌 濃 度104cells/mlと な る よ う新 た な

ABM3に 接 種 し,振 盪培 養 を 行 な った 。 培 養2時 間 後

薬 剤 を添 加 し,経 時的 に 生 菌 数 を 計測 した 。

6) β-lactamaseの 調 製

β-lactamase産 生 株 をBHIで 前 培 養 し た 菌 液 を

Medium Bに て 大 量 培 養 を 行 な っ た 。penicillinase

(PCase)生 産 株 は5時 間 振 盪 培 養cepharosporinase

(CSase)生 産 株(E.celiを 除 く)は3時 間培 養,inducer

と してPenicillin G(PCG)を 添 加 し さ らに2時 間 培 養

した 。 それ ぞれ の 培 養液 を 冷 却 下 遠心 を 行 な い 集菌 後,

0.05Mリ ン酸 緩 衝液 で2回 洗 浄 し,同 じ緩 衝液 に 懸 濁

した。 この 菌 液 を超 音 波 破 砕 し,10,000×gで30分 遠

心 しそ の上 清 を 酵素 液 と した 。 ま たKt値 の 測 定用 に は

この酵 素 液 をCM-Sephadexま た はDEAE-Cellrese

の カ ラ ム とSephadex G-200の ゲル 〓過 を 行 な っ て さ

らに 精 製 した酵 素 を 使 用 は した。 酵 素 液 の タ ンパ ク定 量

LOWRY6)法 に よ り測 定 した 。

7) β-lactamaseの 活 性 測 定

β-lactamaseの 活 性 測 定 はspectrophotometric法7,8)

で 行 な った。基質 と して500μMのPCGま た は100μM

のCephaloridine(CER)を 用 い,0.05Mリ ン酸 緩 衝

液(pH7.0)で 調製 した 。活 性 単 位IUは,基 質,1μmole

を30℃pH7.0で1分 間 に 分解 す る酵 素 活 性 とし た。

8) マ ウス感 染 治 療 実験

Fig. 1 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPC-resistant S. aureus (106 cells/ml)

ICR系 雄 マウスを1薬 剤濃度 当 り1群20匹 を使用 し

た。試 験菌 をマ ウス腹腔内に感染させ,薬 剤は感染後1

お よび4時 間 目に経 口投与 した。感染7日 後 の生存率か

らED50値 をLITCHFIELD-WILCOXON9)法 に 基 き算 出し

た。

VOL.30 S-2 CHEMOTHERAPY 3

II.　 実 験 結 果

1)標 準菌株を用いての抗菌 スベク トラム

各種標準菌株 に 対す るBRL25000,AMPCお よび

CVAの 抗菌 スベ ク トラムについて 検討を行なった。 そ

の成績をTable 1に 示 した。CVAの 抗菌 力は グラム陽

性菌および グラム陰性菌に対 しほぼ同程度で弱い抗菌力

Fig. 2 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPC-resistant E. coli (106 cells/ ml)

E. coli (41 strains)

Fig. 3 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPC-resistant K. pneumoniae(106 cells/ ml)

K. pneumoniae (23 strains)

を も って い た。MIC値 はPseudomonasに 対 して50～

200μg/ml,そ の 他 の 菌 種 に対 して は12,5～100μg/ml

で あ った。

2)AMPC耐 性 株 に 対す るAMPCとCVAの 併用

効 果

AMPC耐 性菌,6菌 種,149株 に対 し てCVAを1

Fig. 4 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPCP. mirabilis (106 cells/ ml)

P. mirabilis (20 strains)

Fig. 5 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPC-resistant P. vulgaris (106 cells/ ml)

P. vulgaris (24 strains)

4 CHEMOTHERAPY NOV. 1982

μg/mlま た は10μg/mlの 濃 度 でAMPCに 添 加 し,

106cells/ml,1白 金 耳 の 接 種 に おけ る各 菌 種 のAMPC

感 受 性 分 布 に つ い て検 討 を 行 な った 。 紹 果 をFig.1～6

に 示 した 。MIC70値 は 各Fig.よ り読 み と った 。

AMPC耐 性 のS.aureusに 対 してAMPCのMIC70

値 を比 較 して み る と,CVA 1μg/ml添 加 で0.73μg/

ml,10μg/ml添 加 で0.08μg/mlを 示 した 。 これ は そ

れ れ それAMPC単 独のMIC70値,93.3μg/mlの 約1/

120,1/1300で 著 しい低 下を 示 した 。 また 分 布 の ピー ク

値 も50μg/mlか ら0.78μg/ml,0.1μg/mlへ とそれ

ぞ れ6管 お よび9管 の低 下 を示 した(Fig.1)。

AMPC耐 性 のE.coliに 対 し て はAMPC単 独 の

MIC70値 が3,200μg/ml以 上 で あ るの に 対 し,CVA

1μg/ml添 加 で125μg/ml,10μg/ml添 加 で6.52

μg/mlと 著 し く低下 した 。 また約80%の 株 がAMPC

3,200μg/ml以 上 のMICを 示 した がCVA 10μg/ml

の 添 加 に よって6.25μg/mlの 濃 度 で90%以 上 の 株 の

発 育 を阻 止 した(Fig.2)。

AMPC耐 性 のK.pneumoniaeに 対 し て もCVA添

加 に よるAMPCのMIC値 の著 しい 減 少が 示 され た 。

MIC70値 はCVA無 添 加 で3,200μg/ml以 上 の 値 を示

した が,1μg/mlま た は10μg/mlのCVA添 加 に よ

って そ れ ぞれ9.38,0.86μg/mlと 低 下 した 。 約50%

の株 が1,600μg/mlのMICを 示 したがCVA 1μg/ml

添 加 で100μg/ml以 下 のMICに な りさ らに10μg/ml

の添 加 で はす べ ての 株 の 発 育 を3.13μg/mlで 阻 止 した

(Fig.3)。

P.mirabilisに 対 してはCVA無 添 加 のMIC70値 が

590μg/mlで あ るの に 対 しCVA 1μg/ml添 加 で7.67

Table 2 Ki values of CVA

μg/ml,CvA 10μg/ml添 加 で0.78μg/mlを 示 した 。

この値 は そ れ ぞ れAMPC単 独 の 約1/80,1/760で あ っ

た 。 ま た感 受 性 分 布 を調 べ る とAMPC単 独 で は50μg/

mlと800μg/mlの 二峰 性 を示 した がCVA 10μg/ml

添 加 で は ほ とん どの 株 が0.78μg/mlに 集 中 し 一峰 性 と

な った(Fig.4)。

Indole positive Proteusで はP.vulgarisに 対 して

相 乗 効 果が 認 め られ た 。MIC70値 は そ れ ぞれ510μg/ml,

9.72μg/ml,1.17μg/mlと な り,AMPC単 独 の1/50,

1/430の 値 で あ った(Fig.5)。

嫌 気 性 菌 のB.fragilisに 対 して もCVA添 加 に よる

強 い相 乗 効 果 が 認 め られ た 。 調 べ たす べ て の 株 がMIC

100μg/ml以 上 のAMPC耐 性 で あ った が,CVA 1μg/

mlの 添 加 で50%の 株 がAMPC 1.56μg/mlの 濃 度

で発 育 を阻 止 され,10μg/ml添 加 では 約80%の 株 が

0.39μg/mlで 発 育 を阻 止 され た 。MIC70値 は そ れ ぞれ

520μg/ml,16.9μg/ml,0.32μg/mlで あ った(Fig

6)。

3)AMPCのMIC値 と β-lactamaseの 生 産 量

BRL25000の 治験 中に 集 め られ たAMPC耐 性 のE.

coli 121株K.pneumoniae 26株 に つ いてAMPCの

MIC値 と β-lactamaseの 生 産 量 に関 し て検 討 を 行 な っ

た。

E.coliで はMIC値 が100,200,400,800,お よび

800μg/ml以 上 の 株 が そ れ ぞ れ3,3,4,19,92株 ず

つ で,そ れ らの 株 の 生産 す る β-lactamaseの 量 を 比活

性 の 平均 値 でFig.7に 示 した。800μg/ml以 上 のMIC

Fig. 6 Combined antibacterial activity ofAMPC with CVA against AMPC-resistant B. fragilis (106 cells/ ml)

B. fragilis (19 strains)

VOL.30 S-2 CHEMOTHERAPY 5

Fig. 7 Relation between PCase

producing activity andAMPC resistance(106 cells/ ml)

Fig. 8 Relation between PCase producingactivity and AMPC resistance

(106 cells/ ml)

を示 す 株 は100μg/mlのMICを 示 す 株 の約63倍 の

β-1actamaseを 生 産 して お り,　MIC値 の 高 い株 ほ ど β-

lactamaseを 多 く生 産 して い る こ とが 示 され た(Fig.7)。

K.pneumoniaeに つ い て も同様 の検 討 を 行 な った 。

結果 をFig.8に 示 した 。K.pneumoniaeで は 中 等度 耐

性 のMIC 100お よび200μg/mlの 株 が そ れ ぞれ13,

4株 ずつ あ り,高 度 耐 性 のMIC 800お よび800μg/ml

以 上 の株 が そ れ ぞれ2,4株 ず つ あ った 。K.pneumoniae

の 場合 も.E.coliと 同様 の 結 果 でMIC値 の 高 い株 ほ ど

β-lactamaseを 多 く生 産 して いた 。 またMIC 50μg/ml

以 下 の3株 につ い て は β-lactamaseの 生産 量 が 測 定 限

界 以下 で あ った(Fig.8)。

4)各 種 β-lactamaseに 対 す るCVAの 阻 害 効 果

各 菌 種 よ り単 離 精製 され た4種 類 のPCaseと3種 類

の セ フ ロキ シ マ ーゼ お よ び7種 類 のCSaseに 対す る

CVAの 阻害 効 果 を 検 討 した 。

阻害 の 程 度 をKi値 に よ ってTable 2に 示 した 。

CVAはR因 子 由来 のす べ ての タ イプ のPCaseと3種 の

セ フ ロキ シマ ー ゼを 強 く阻 害 し,そ の阻 害 機 構 は競 合 的

拮抗 阻 害 で あ った 。 特 に 臨 床 的 に分 離 され る菌 の生 産 す

るPCaseはI型 とIV型 が ほ とん どで,こ れ らに対 して

Fig. 9 Effect of combination ratio ofAMPC to CVA on MIC againstS. aureus (106 cells/ ml)

Fig. 10 Effect of combination ratioof AMPC to CVA on MICagainst E. coli (106 cells/ ml)

Fig. 11 Effect of combination ratio of AMPCto CVA on MIC against K. pneumoniae

(106 cells/ ml)

6 CHEMOTHERAPY NOV. 1982

Fig. 12 Effect of combination ratio of AMPCto CVA on MIC against P. mirabilis

(106 cells/ ml)

Fig. 13 Effect of combination ratio of AMPCto CVA on MIC against P. vulgaris(106 cells/ ml)

CVAは 強 力な 阻 害 を示 した 。 ま た,P.vulgaris,B.

fragilisお よびP.cepaciaの 生 産 す る セ フ ロキ シ マ ー

ゼ に対 して も強 い阻 害 を 示 し,特 にB.fragilisの 生 産

す る酵 素 に 対 してはKt値 が0.1μMと 最 も強 い阻 害

効 果 を 示 した 。

7種 類 のCSaseに 対 し て はKt値100μM以 上 で

阻 害 を 示 さなか った 。

5)至 適 配 合比 の検 討

S.aureus,E.coli,P.mirabilisのAMPC耐 性 株 と

感 受 性 株 を お の お の25株 ず つ お よ びK.pneumoniae

の中 等 度 耐 性 と高 度耐 性,P.vulgarisの 耐 性 株 を お の

お の25株 ず つ 用 い てAMPCとCVAの 至 適 配 合 比 の

検 討 を 行 な った。AMPCとCVAの 配合 比 を15段 階

に変 化 させ,通 常 の方 法 でMIC測 定 を行 な った 。 そ の

結 果 を50%ま た は90%の 株 の 発 育 を 阻止 す る 濃 度

(AMPCとCVAの 合 計 した 濃 度)で 示 した(Fig.9～

13)。

Fig. 14 Antibacterial activity ofBRL25000 (106 cells/ ml)

Fig. 15 Antibacterial activity ofBR L25000 (106 cells/ ml)

S.anreusの 耐性菌に 対 し てAMPC:CVAの 比が

100:1で 最 も急激 な抗菌 力の増強 が 認め られ2:1で

抗菌力は最高 となった。 さらにCVAの 比率を増加 させ

ると抗菌力は低下 した。感受性株に対 してはAMPC単

独か ら10:1ま でが抗菌 力が強 く,そ れ以上CVAの

比率が増加する と耐性株の場 合 と同様抗菌 力は低下 した

(Fig.9)。

E.coliの 耐性株はAMPC単 独 と比較 して100:1で

16～32倍 の抗菌 力の増加が認め られ,10:1か ら1:1

の間128倍 の抗菌力増加が あった。 さらにCVAの 比率

を増 加 しても抗菌力の変化は認め られ なか った。感受性

株 ではAMPC単 独か ら2:1ま でが抗菌 力が強 く,そ

れ以上CVAの 比 率が増加す ると抗 菌力はわずかに低下

した(Fig.10)。

K.Pneumoniaeに ついては 高度耐性株 と 中等度耐性

株に分けて検討を行な った。 高度,中 等度耐性 と もに

CVAが わずかな比率で含まれ るだけで急激 な 抗菌 力の

VOL,.30 S-2 CHEMOTHERAPY 7

Fig. 16 Antibacterial activity ofBRL 25000 (106 cells/ ml)

Fig. 17 Antibacterial activity ofBRL 25000 (106 cells/ ml)

Fig.18 Antibacterial activity ofBRL 25000 (106 cells/ ml)

Fig. 19 Antibacterial activity ofBRL25000 (106 cells/ ml)

Fig. 20 Bactericidal activity of BRL

25000 on AMPC- resistant E.

coli ML 5005

Fig. 21 Bactericidal activity of BRL

25000 on AMPC- resistant K.

pneumoniae ML5006

8 CHEMOTHERAPY NOV. 1982

Fig. 22 Bactericidal activity of BRL

25000 on AMPC- resistant P.

mirabilis ML5007

Fig. 23 Bactericidal activity of BRL

25000 on AMPC- resistant P.

vulgaris ML5008

増 加が示 された。最 も抗菌力の強 くな る配合比 は高度耐

性株で2:1か ら1:5の 間で,中 等度耐性株では2:1

か ら1:1の 間であ り両者に違 いが認め られた(Fig.11)。

P.mirabilisの 耐性株の場合 もCVAが100:1の 割

合で配合 され るだけで32～64倍 の抗菌力の増強が示 さ

れ,さ らに5:1か ら2:1ま で徐々に抗菌 力が増 して

い った。2:1の 比 率では128～256倍 の抗菌 力増強を示

した。感受性株ではAMPCの 配合比が50%以 下にな

る と徐々に抗菌力が低下 した(Fig.12)。

P.vulgarisで は2:1か ら1:2の 間が 最 も強い抗

菌 力を示 し,AMPC単 独の128倍 の増強があ った。ま

た他の菌種 と同 じく100:1で 急激な抗菌 力増強が認め

られ,CVA比 が1:5以 上になると低下 した(Fig.13)。

5)BRL25000の 抗菌力

BRL25000の 治験中に分離 され たAMPC耐 性のS.

Table 3 In vivo effect of BRL25000 againstexperimental infections of mice

Oral administration

aureus 24株,S.epidermidis 19株,E.coli 121株,

K.pneumoniae 63株,K.oxytoca 12株E.cloacae

20株 に対 す るBRL25000の 抗 菌 力 をAMPCを 対照

と して 測定 した 。

S.aureusに 対 し てBRL25000はMIC70値3.34

μg/mlを 示 しAMPCの33.1μg/mlと 比 較 して 約11

10で あ った(Fig.14)。

S.epidermidisで はMIC70値 が そ れ ぞ れ3.45μg/ml

と75μg/mlを 示 し約1/22の 値 で あ っ た。 またAMP

CのMICが 高 い株 ほ どAMPCとBRL25000のMIC

の 差 が 大 き くな った(Fig.15)。

E.coliで は 集 め られ た 株 の90%以 上 がAMPC 800

μg/ml以 上 の 耐 性 を示 したが,BRL25000 25μg/mlで

80%の 株 の発 育 を阻 止 した(Fig.16)。

K.PneumoniaeとK.oxytocaで はMIC70値 がAM

PCで ど ち ら も800μg/ml以 上 で あ ったがBRL25000

で は そ れ ぞれ6.25と9.98μg/mlで あ った 。Klebsiela

に は 高 度耐 性 と中 等 度 耐 性 株 が あ ったが どち らに 対 して

もBRL25000は 強 い 抗 菌 力 を示 した(Fig.17,18)。

E.ctoacaeで は70%の 株 が800μg/ml以 上,90%

の株 が200μg/ml以 上 の耐 性 を 示 し た が100μg/ml

です べ て の株 の 発 育 を 阻 止 した(Fig.19)。

6)殺 菌 力

AMPC耐 性 のE.coli ML 5005,K.pneumoniae ML

5006,P.mirabilis ML 5007,P.vulgaris ML 5008

に対 して そ れ ぞ れAMPC 400,100,100,200μg/ml

お よびCVA 10μg/mlで は 全 く殺 菌 効 果 を 示 さな せ っ

た が,CVA 5μg/mlとAMPCを そ れ ぞ れ10,3.13,

6.25,3.13μg/mlを 併 用 す る こ とに よっ て 殺 菌 作 用 が

認 め られ た(Fig.20～23)。

7)マ ウ ス感 染 治療 効果

S.aureus ML 5009,E.coli ML 5005,K.pneumo-

niae ML 5006,P.mirabilis ML 5007,P.vulgaris

ML 5008株 を 用 い てBRL25000お よびAMPCの 生

体 内抗 菌 力 を 検 討 した 。AMPC単 独 で は どの 菌 種 と も

VOL.30 S-2 CHEMOTHERAPY 9

高濃度でも治療効果を示 さなか ったが,BRL25000で は

治療 された(Table 3)。

III.　 考 察

CVA単 独では弱い抗菌活性 しか もっていないが,わ

ずかな量 をAMPCと 併用す ることに よりAMPC耐 性

のグラム陽性,グ ラム陰性菌のMICを 低下 させ ること

がで きた。 これ らの耐性菌は β-lactamaseを 生産す る

ことに よりAMPC耐 性を獲得 し,β-lactamase生 産量

とMIC値 は相関す ることが示 された。

β-lactamaseは その基質特 異性,酵 素化学的性状,免

疫学的性質などか らPCase,セ フ ロキ シマーゼ,CSase

の3種 類 のグル ープに分類 されている10)。PCaseは すべ

てR因 子由来の酵素でさ らに4種 類のタイブに分類 され

る。P.vulgaris11),B.fragilis12),P.cepacia13)な どの

生産するセフロキ シマーゼはペ ニシ リン系薬剤 もセ ファ

ロスポ リン系薬剤 も分解す る幅広い基 質特異性を もち,

β-lactamaseに 安定 といわれ るオキ シム系 セファロスポ

リンも分解 して しま う。CSaseは 菌 のchromosome由

来の酵素でセファロスポ リン系薬剤に基質特異性を もっ

ている。CVAは これ らの β-lactamaseの 中のPCaseと

セフロキシマーゼを強 く阻害 した。 これ らの結 果 より,

CVAの 添 加に よるAMPCのMICの 低下はCVAに

よって β-lactamaseが 阻害 され,AMPCが 分解 されな

くなるためである と思慮 された。 また同様な効果は殺菌

力や生体 内抗菌 力で も認め られた。

次にAMPCとCVAの 配合比に関する検討 の結果 よ

り耐性株に対 してはAMPC:CVAが2:1か ら1:5

の間で強い抗菌 力を示 したが,感 受性株に対す る抗菌力

を も含めて考察す ると5:1か ら1:5の 間の配合比で

あれば,耐 性株に も感受性株に も優れた抗菌 力を期待で

きるであろ う。

今後 さらにCVAの β-lactamase阻 害機構 について

詳細な検討が必要である。

文 献

1) BROWN, A. G.; D. BUTTERWORTH, M. COLE, G.

HANSCOMR, J. D. HOOD, C. READING& G. N.

ROLINSON: Naturally occurring ƒÀ- lactamase

inhibitors with antibacterial activity. J.

Antibiot. 2: 668•`669, 1976

2) READING, C.& M. COLE: Clavulanic acid: a

beta- lactamase- inhibiting beta- lactam from

Streptomyces clavuligerus. Antimicr. Agents

& Chemoth. 11: 852- 4357, 1977

3) NEU, H. C.& K. P. Fu: Clavulanic acid, a

novel inhibitor of j9-lactamases. Antimicr.

Agents& Chemoth. 14: 650,•`655, 1978.

4) MATSUURA, M.; H. NAKAZAWA, T. HASHIMOTO&

S. MITSUHASHI: Combined antibacterial acti-

vity of amoxicillin with clavulanic acid aga-

inst ampicillin- resistant strains. Antimicr.

Agents& Chemoth. 17: 908•`911, 1980

5)日 本 化 学 療 法学 会:最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)測

定 法 。Chemetherapy23= 1～2,1975

6) LOWRY, O. H; N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR&

R. J. RANDALL: Protein measurement with

the folin phenol reagent. J. Biol. Chem.

193: 265•`475, 1951

7) WALEY, S. G.: A spectrophotometric assay of

β- lactamase action on penicillins. Biochem.

J. 139: 789•`790, 1974

8) SAMUNI, A.: A direct spectrophotometric assay

and determination of Michaelis constants for

the ƒÀ- lactamase reaction. Anal. Biochem.

63: 17•`26, 1975

9) LITCHFIELD, J. T.& F. WILCOXON: A simplified

method of evaluating dose- effect experiments.

J. Pharmacol. Exp. Ther. 96: 99•`413, 1949

10) MITSUHASHI, S.; S. YAMAGISHI, T. SAwAr& H.

KAWABE: Biochemical mechanisms of plasmid-

mediated resistance. In: R Factor- Drug Resis-

tance Plasmid (RomNsoN, G. N.& A. WATSON,

ed.) Excerpta Medica, Amsterdam, pp. 195•`

254, 1977

11) MATSUBARA, N.; A. YOTSUJI, K. KUMANO, M.

INOUE& S. MITSUHASHI: Purification and some

properties of a cephalosporinase from Proteus

vulgaris. Antimicr. Agents& Chemoth. 19:

185•`187, 1981

12) SATO, K.; M. INOUE& S. MITSUHASHI: Activity

of ƒÀ- lactamase produced by Bacteroides fra-

gilis against newly introduced cephalospo-

rins. Antimicr. Agents & Chemoth. 17: 736•`

737. 1980

13) HIRAI, K.; S. IYOBE, M. INOUE& S. MITSUHASHI:

Purification and properties of a new ƒÀ- 1acta-

mase from Pseudomonas cepacia. Antimicr.

Agents& Chemoth. 17: 355•`358, 1980

10 CHEMOTHERAPY NOV. 1982

β- LACTAMASE INHIBITORY EFFECT OF CLAVULANIC ACID

AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF BRL25000

(CLAVULANIC ACID- AMOXICILLIN)

HISASHI NAKAZAWA, MASAYUKI MATSUURA and SUSUMU MITSUHASHIDepartment of Microbiology, School of Medicine,

Gunma University, Maebashi, Japan

Clavulanic acid (CVA) was isolated from Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 and it has a unique

chemical structure. In the present study the in vitro and in vivo andtibacterial activity of amoxicillin

(AMPC) plus CVA was compared with that of either AMPC or CVA against bacterial strains

resistant to ƒÀ- lactam antibiotics. The results can be summarized as follows.

1) CVA had week antibacterial activity but by the addition of small amount of CVA the antibacterial

activity of AMPC against gram-positive and gram-negative bacteria was markedly increased.

2) The degree of resistance of the AMPC resistant strains was related to the ƒÀ- lactamase producing

activity.

3) CVA inhibited, at a low concentration, all types of penicillin ƒÀ- lactamase (PCase) encoded by

R plasmid and cefuroxime- hydrolysing ƒÀ- lactamases (CXase) produced by P. vulgaris, B. fragilis,

and P. cepacia.

4) The antibacterial activity of various ratios of AMPC to CVA was compared and the most

effective ratio was shown to be between 5: 1 and 1: 5.

5) BRL 25000 (AMPC: CVA= 2: 1) showed potent antibacterial activity against clinical isolates of

the followings bacterial species S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca,

P. mirabilis, P. vulgaris and B. fragilis.

6) BRL 25000 was more effective than AMPC against experimental intraperitoneal infections with

S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis and P. vulgaris in mice.