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VOL. 23 No 1 REVISTA CIENTÍFICAAÑO 2013

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS Y BIOLÓGICASFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIAUNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

Actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa por extractos de 18 especies vegetalesnativas de Guatemala usadas en el tratamiento de afecciones nerviosas

Ortiz, D., Valdez, A., López, L., Gaitán, I., Paz, M., Cruz, S., Álvarez, L y Armando CáceresFacultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala

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Resumen

Los síndromes neurodegenerativos producen deterioro de la memoria y conducta. Una de las patologíasmás frecuentes es la Enfermedad de Alzheimer, asociada a la disminución de los niveles delneurotransmisor acetilcolina (AC), consecuencia del aumento en acetilcolinesterasa (ACE), motivopor el cual los tratamientos se centran en fármacos que aumentan los niveles de AC e inhiben la ACE.Estudios en distintas partes del mundo han descrito algunos metabolitos secundarios vegetales comoposible fuente para inhibir la actividad de la enzima. Con el objetivo de encontrar inhibidores de laACE se evaluó la actividad de extractos (diclorometano y metanol) de plantas nativas usadas en eltratamiento de afecciones nerviosas (Brugmansia candida, Cassia reticulata, Chaptalia nutans,Chiranthodendron pentadactylon, Dorstenia contrajerva, Erythrina berteroana, Lantana camara,Lippia graveolens, Petiveria alliacea, Phlebodium pseudoaureum, Pimenta dioica, Salvia microphylla,Solanum nigrescens, Tagetes lucida, Ternstroemia tepezapote, Valeriana prionophylla, Vernoniadeppeana y Wigandia urens var. caracasana). La evaluación se realizó por bioautografía en capafina y microcolorimetría. Por bioautografía se demostró actividad inhibitoria en todas las especiesestudiadas, pero al cuantificar la actividad ninguno inhibe el 50% a 1 mg/mL. Tres especies quemostraron actividad (L. camara, T. lucida y V. prionophylla) fueron fraccionadas por particiónlíquido:líquido para conocer si al purificar las fracciones se mejora la actividad. Se demostró quelas particiones no aumentaron la actividad. Además se encontró actividad moderada en extractos deD. contrajerva, L. graveolens y W. urens var. caracasana. Se continuarán los estudios de estasespecies para determinar si tienen algún potencial de utilización.

Palabras clave: Lantana camara, Tagetes lucida, Valeriana prionophylla, Wigandia urens var.caracasana, Lippia graveolens, Chaptalia nutans.

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Abstract

Neurodegenerative syndromes generate memory and behavior deterioration, usually in the elderly.The most common is Alzheimer´s disease, which is associated with decreased levels of acetylcholine(ACh) after an increase of acetylcholinesterase (AChE). Worldwide studies have described somesecondary metabolites from plants that might inhibit the enzyme activity or retard neuronal deterioration.With the aim of finding inhibitors of AChE, activity was evaluated in extracts (dichloromethane andmethanol) of 18 medicinal and aromatic plants used in Guatemala for nervous or memory disorders(Brugmansia candida, Cassia reticulata, Chaptalia nutans, Chiranthodendron pentadactylon, Dorsteniacontrajerva, Erythrina berteroana, Lantana camara, Lippia graveolens, Petiveria alliacea, Phlebodiumpseudoaureum, Pimenta dioica, Salvia microphylla, Solanum nigrescens, Tagetes lucida, Ternstroemiatepezapote, Valeriana prionophylla, Vernonia deppeana and Wigandia urens var. caracasana). AChEinhibition was assessed qualitatively by two bioautographic TLC assays and quantitatively by akinetic microcolorimetric evaluation. The results demonstrated activity by bioautography in all speciesat screening concentration (5 µl), but when quantified by microcolorimetry no significant activity(>50%) was demonstrated at 1 mg/mL. Three of the species with shown activity (L. camara, T. lucidaand V. prionophylla) were partitioned to see if the liquid:liquid partions presented more activity, butthis did not increase the activity. Intermediate activity was also found in extracts from C. nutans, D.contrajerva var. houstoni, L. graveolens and W. urens var. caracasana. Studies will continue regardingthe antioxidant activity in order to determine whether there might be some potential use.

Keywords: Lantana camara, Tagetes lucida, Valeriana prionophylla, Wigandia urens var. caracasana,Lippia graveolens, Chaptalia nutans.

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Introducción

La adquisición y mantenimiento de la memoriaes una función multicausal dependiente defactores individuales, colectivos, nutricionales,históricos, traumáticos y ambientales, los quese ven fuertemente influenciados cuando losprocesos son acumulativos, degenerativos osimplemente por la edad de los individuos. Alconjunto de síntomas y signos que se desarrollancon la pérdida progresiva de la memoria se lesclasifican como síndromes neurodegenerativosque son procesos patológicos del sistemanervioso central que aparecen con el paso deltiempo y que se caracterizan por desórdenesneurológicos que repercuten dañando las célulascerebrales, deteriorando así la memoria y elmovimiento. Entre ellos se destacanespecialmente las enfermedades de Alzheimer(EA), Parkinson y Huntington. (Houghton, Ren& Howes, 2006; Rubinstein, 2006).

El hallazgo más importante asociado con lapérdida de la memoria y habilidades motoras esla disminución del neurotransmisor acetilcolina(AC), por aumento de los niveles de la enzimaacetilcolinesterasa (ACE). El proceso se complicaconforme se reduce la síntesis de la AC, elaumento de su destrucción, los procesosinflamatorios y la formación de placas •-amiloides. (Houghton et al., 2006; Rubinstein,2006).

Los tratamientos son escasos y la mayoría sevinculan con la inhibición de la ACE paradisminuir la destrucción de AC y garantizarmayores niveles en beneficio de la salud cerebral.Se han investigado muchos compuestos con estapropiedad pero aún no hay un fármaco deelección para este fin (Chopra, Misra & Kuhad,2011).

Estudios en los últimos años han demostradoque algunas especies vegetales pueden presentarmoléculas que tienen actividad inhibitoria de laACE (IACE), e inclusive han servido de basepara el desarrollo de medicamentos que puedenusarse para prevenir o retrasar el desarrollo deEA o bien disminuir la severidad de los síntomas(Akhondzadeh & Abbasi, 2006; Howes & Perry,2011; Kim, Lee & Lee, 2010; Perry & Howes,2010; Wilkinson, 2007) particularmente mediantela droga galantamina aislada de varias especiesde la familia Amaryllidacdeae (Marco &Carreiras, 2006).

La biodiversidad es una fuente de moléculasesperando ser descubiertas para el desarrollo denuevos productos para el bienestar humano.Estudios realizados en otras partes del mundodemuestran que la biodiversidad puede ser unafuente de moléculas para contrarrestar lossíndromes degenerativos, principalmente en loque respecta a su act ividad IACE,particularmente en Asia, Europa y Africa.

La presente investigación tuvo como objetivoevaluar la actividad IACE de los extractosdiclorometánicos y metanólicos de 18 especiesvegetales medicinales y aromáticas seleccionadaspor ser nativas y usarse tradicionalmente paratratar afecciones nerviosas, neurológicas o dela memoria. En los extractos positivos se hizouna partición líquido-líquido para orientarestudios futuros de fraccionamiento bioguiadoque permitan aislar y elucidar la estructuraresponsable de la actividad.

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Materiales y Métodos

Obtención y colecta del material vegetal

Plantas: Basado en información etnobotánica deplantas usadas en Guatemala para los trastornosneurológicos, muestra de las 18 especies deplantas fueron recolectadas de las tierras decultivo o de campos de manejo de acuerdo con

buenas prácticas de colecta y determinadas poruno de los autores (LEA). Las muestras fueronprocesadas conforme a técnicas convencionalesde secado depositando un ejemplar de herbarioen el Herbario del Laboratorio de ProductosNaturales Farmaya (CFEH) (Tabla 1). Las plantasfueron secadas a temperatura ambiente hastaobtener <10% de humedad.

Tabla 1. Plantas medicinales y aromáticas usadas para desórdenes nerviosos y de la memoria en Guatemala

Extracción: De los materiales secos se pesaron500 g, se pasaron por un tamiz y se colocaronen un percolador donde se agregó disolventeapolar (diclorometano) durante 5 días conrecambios diarios del disolvente hasta extraerla mayoría de metabolitos; el menstruo extraídose concentró a presión reducida a una temperaturainferior a los 45°C en un rotavapor conrecuperación del disolvente. El proceso se repitióutilizando disolvente polar (metanol). A cadaextracto se le determinó el porcentaje derendimiento a partir del material vegetal seco.

Partición líquido:líquido: Con base en losresultados preliminares de TLC y sugerenciasde la literatura, tres extractos (L. camara, T.lucida y V. prionophylla ) fueron líquido: líquidodividido sucesivamente con hexano, cloroformo,acetato de etilo y metanol. Chiranthodendronpentadactylon Larr., Dorstenia contrajerva L.,Lantana camara L., Lippia graveolens HBK,Petiveria alliacea L., Phlebodium pseudoaureumCav. Lellinger, Salvia microphylla HBK, Tageteslucida Cav., Ternstroemia tepezapote Schlecht& Cham. y Valeriana prionophylla Stand.

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Metodología

Bioautografía con Fast Blue B: La ACE sedisolvió en 150 mL de amortiguador Tris-HClal 0.05M de pH 7.8. Se agregó albúmina desuero bovino (150 mg) con el fin de estabilizarla enzima durante el bioensayo. La soluciónmadre se conservó a 4°C., se introdujeron lasplacas en un disolvente adecuado (acetona oisopropanol) y luego se secaron cuidadosamente.Se activaron las placas de CCF por 5 min a100°C. Se asperjaron con la enzima (ACE), sesecaron las placas y se incubaron a 37°C por 20min, se asperjaron con acetato 1-naftilo (250mg) en EtOH (100 mL) y sal de Fast Blue BNo. 48 (400 mg) en agua destilada (160 mL).Esta última disolución se hizo inmediatamenteantes de usarla, para evitar a descomposición.Placa recién asperjada con solución de fast blueB y -acetato de 1-naftilo (Peng & Zhao, 2009;Yang et al., 2009).

Técnica microcolorimetríca: Se evaluó la IACEde los extractos a una concentración de 1 mg/mL.En placas de microtitulación se colocaron 25µL de ioduro de acetiltiocolina 15mM (ATCI),125 µL de DTNB 3mM, 50 µL de Tris-HCLpH8 con 0.1% albúmina de suero bovino y 25µL de diluciones de cada extracto. Se midióocho veces la absorción a 405 nm cada 17segundos. Se agregó 25 µL de ACE a cada pozoy nuevamente se midió ocho veces la absorcióna 405 nm cada 17 segundos. El valor deabsorbancia obtenido en cada muestra fuecomparado con el blanco y control, queevidenciaban el 0% y 100% de actividadinhibitoria respectivamente y de esta manera secalculó el porcentaje de inhibición.

Interpretación: al presentarse la positividad y alhaber calculado los índices de reacción de laactividad de cada extracto, se realizó la

caracterización química (Adsersen, Gaugin,Gudiksen & Jäger, 2006)

Resultados

Se colectaron 18 especies y se prepararon 23extractos de las hojas, rizomas o raíces condiclorometano y metanol. Donde losrendimientos de cada una de ellas variaronampliamente, en el caso de diclorometano elrendimiento varió de 7.85±0.79% (S.microphylla) y 7.70±0.80% (W. urens var.caracasana.) a 0.37±0.01% (P. alliacea); en elMeOH la variación del rendimiento fue de33.40±3.40% (V. prionophylla) a 3.40±0.02%%(T. tepezapote).

La IACE se evaluó mediante el procedimientocualitativo de CCF donde la mayoría de losextractos mostraron bandas de decoloración pordos bioautografias a una concentración de 5 mL.Un método microcolorimetrico se establecióutilizando eserina para la validación delprocedimiento. Ninguno de los extractosinhibieron la ACE más del 50% usando unaconcentración de 1 mg/ml. La mejor inhibiciónse logró por medio de la extracción CH2Cl2 dela raíz de D. contrajerva var. houstonii (35±13%),V. prionophylla (25±15%), los extractos deMeOH de flores de W. urens var. caracasana(43±12%) y la raíz de C. nutans (29±20%) (Tabla2).

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*% inhibición por 1 mg/mL

Tabla 2. Rendimiento de extracción y actividad IACE por 23 extractos

Los tres extractos (L. camara, T. lucida y V. prionophylla) particionados se analizaron por ensayosde bioautografía CCF demostrando actividad a una concentración de 5 µL, pero cuando se cuantificómediante el método microcolorimétrico, los resultados fueron moderados. En el caso de L. camara,el extracto en cloroformo mostró 38±6% de inhibición, mientras que el extracto de T. lucida mostróactividad en las cuatro particiones en 28-35% (Tabla 3).

Tabla 3. Rendimiento de particiones secuenciales y actividad IACE por tres extractos seleccionados

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Discusión

De acuerdo con una revisión global realizadapor Adams, Gmünder y Hamburger (2007) másde 150 especies vegetales en diversaspreparaciones y mezclas se utilizan paratrastornos cognitivos, en América Central y elCaribe por lo menos cinco especies se utilizanen el contexto de los trastornos cerebralesrelacionados con la edad, tres de ellas (B.candida, L. camara y T. lucida.) se incluyeronen esta investigación. De estos sólo L. camarase ha estudiado anteriormente, demostrando queno existe ninguna actividad en los extractos deetanol y agua (Vinutha et al., 2007). Extractosde otra especie de este género, Lantana grisebaciidemostró poca actividad IACE (etanol22.5±2.5%; agua 10.8±1.0%) para el ensayomicrocolorimétrico (Carpinella, Andrione, Ruiz& Palacios, 2010). En el caso de T. lucida no seencontraron estudios anteriores, aunque losextractos de Tagetes minuta han demostrado unabuena actividad IACE (etanol 44.4±12.3%; agua63.6±4.6%) (Carpinella et al., 2010.).

De las otras especies con una inhibiciónintermedia de ACE encontramos D. contrajervavar. houstonii (raíz), V. prionophylla (raíz), W.urens var. caracasana (flor) y C. nutans (raíz)las cuales son dignas de adicionales estudios,ya que la inhibición fue interesante y estaactividad se describe por primera vez.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo logísticopor parte del Laboratorio Farmaya para larecolección de las plantas, determinación ysecado, y el apoyo financiero por parte el ConsejoNacional de Ciencia y Tecnología (CONCYT),proyecto FODECYT 39-2008.

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