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COMPENDIODE

MICROBIOLOGIA' DEL SUELO

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SEGUNDA PARTE

BACTERIAS DEL SUELO-

POR

FELIX GALLEGO Y QUEROINGENIERO DE MONTES, PROFESOR DE LA ESCUELA ESPECIAL DEL RAMO

Y COLABORADOR DEL INSTITUTO FORESTAL DE INVESTIGACIONES Y EXPERIENCIAS

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I¡>\.

MINISTERIO DE AGRICULTURA

INSTITUTO fORESTAL DE INVESTIGACIONES Y EXPERIENCIAS

MAD RIO JI- 1949At::iO XX NÚM. 45

NOTAS PRELIMINARES

Para mayor claridad en el desarrollo del estudio de las bacteriasdel suelo, y atendiendo a la finalidad de divulgación que, en ciertomodo tiene este trabajo, antes de abordar el tema concreto del mis­mo hemos juzgado conveniente incluir un capítulo referente a genera­lidades sobre morfología, fisiología y clasificación de las bacterias,que facilite la labor del lector no especializado en Bacteriología; capí­tulo cuya lectura pueden omitir los versados en esta disciplina.

Han servido principalmente de base para la redacción de estasegunda parte las siguientes obras:

BERGEY (D. H.). - Manual 01 determinatiue Bacteriology. (Tercera edicíón.] BailliéreTindall & Cox. Londres, 1930.

EYRE (J. W. H.). - Bacteriological Technique. (Tercera edici6n.) Baíllíére TindalI& COlC. Londres, 1930.

FEIfER (D.). - Untersuchungen Über die Mikrobiologie des Waldbodens. Julius Springer.

Berlín. 1933.FRED (E. B.) Y WAKSMAN (S. A.). - Laboratory Manual 01 General Microbiology,

with special reference to the Microorganisms 01 the soil. McGraw-Hill. Nueva York,año 1928.

MUIR Y RITCHIE. - M anual 01 Bacteriolog-y, (Décima edíción.) Oxford University

Press, 1937.WAKSMAN (S. A.). - Principies 01 soil microbiology. (Seguna edición.) The Wíllíams

& Wilkins Co. Baltírnore, 1932.

WAKSMAN (S. A.) Y STARKEY (L. R.). - Soil and the microbe. John Wiley & Sons ,Inc, Nueva York. 1931.

Igual que en la primera parte, al final de la presente se incluyeun índice bibliográfico, que comprende los trabajos más importantesrelacionados con las materias tratadas en la misma, en los que ellector puede encontrar una más detallada información sobre los diver­sos temas.

CAPITULO I

GENERALIDADES SOBRE LAS BACTERIAS

CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS

Las bacterias son vegetales unicelulares, cuyas células, móvileso inmóviles, de forma variada y tamaño sumamente pequeño, noposeen clorofila ni presentan un núcleo típico claramente diferen­ciado. Se desconoce en ellas la sexualidad. y. normalmente, se multi­plican por división directa, o escisiparidad, formando algunas especies,en condiciones determinadas, esporas endógenas.

Fueron observadas por primera vez, en 1676, por el naturalistaholandés Leeuwenhoeck, poco tiempo después de la invención delmicroscopio simple. Su estudio, abandonado durante un siglo, fuéreanudado, hacia 1780, por O. F. Müller, y, posteriormente, porEhrenberg, en 1833, y Dujardin, en 1841. Sin embargo, no se tuvoun exacto conocimiento de ellas, ni del papel preponderante que des­empeñaban en la génesis de la putrefacción, de las fermentaciones y delas enfermedades infecciosas del hombre y de los animales, hasta losgeniales trabajos de Pasteur y de sus discípulos Joubert, Roux yChamberland. A partir de este momento, la bacteriología, merced alos trabajos de numerosos y valiosos investigadores, ha progresadorápida y considerablemente, sobre todo en la parte referente a lasbacterias patógenas; no pudiendo' decirse 10 mismo respecto a lasbacterias del suelo, por la gran variedad de formas que se encuentranen él y la falta de conocimientos suficientes relativos a muchas deellas (102).

Morfología de las bacterias. - Las células bacterianas presentanun reducido número de formas: redondeadas {Coceas o Micrococous,figura 1 - A), en bastoncillos rectos (Bacillus y Bacterium, fig. 1 - B),curvados (Vibrio, fig. 1 - C) o contorneados en espiral (Spirillum ySpirocha:te. Hg. 1 - D).

El diámetro de las células, en la mayoría de las especies bacteria­nas, es pequeño: de 0,5 (L a 1.5 (L, llegando frecuentemente a 2,5 IJ.

(Bacillus mycoides y Bac. megatherium},

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En casos excepcionales, estas dimensiones pueden alcanzar valo­res más elevados, como en algunas tiobacterias (en ChromatiumOkenii,6 ¡.t de diámetro, yen Achromatium oxalijerum, 9 a 22 (.lo de diá­metro por 15 a 43 ¡.t de longitud), o sumamente bajos, como en losinframicrobios, o microbios filtrantes, cuyo tamaño es tan pequeño,que atraviesan los filtros de porcelana más finos: Asierococcus mycoi­des, causante de la perineumonía de los bóvidos, de 125 a 175 m ¡.t;

los agentes de la agalaxia de las cabras, de 150 a 200 m ¡.t; etc.No deben confundirse estos pequeñísimos microbios - que pueden

percibirse con el microscopio compuesto, utilizando técnicas de sobre­coloración, o microfotografiarse con luz ultravioleta - con los llama­dos virus filtrantes (ultra-virus o virus-proteídos), agentes de nume­rosas enfermedades de los vegetales (mosaicos) y de los animales(fiebre aftosa, encefalitis equina, etc.), cuyas partículas no soncélulas vivas, sino gruesas moléculas dotadas de características es­peciales.

Stanley ha conseguido aislar el virus químico del mosaico deltabaco bajo la forma de un núcleo-proteido cristalizable de pesomolecular muy elevado (17.000.000). La inyección en una planta sanade tabaco de una solución acuosa muy diluída (1/109) de esta subs­tancia cristalizada es suficiente para que aparezca la enfermedad (46).

Gran número de bacterias, sobre todo los micrococcus, son inmó­viles, careciendo de órganos de locomoción; pero entre las baci1iformeshay bastantes que poseen uno o varios flagelos, estando dotadas demovimientos muy vivos. Cuando poseen un solo flagelo (especies mo­

nótricas), éste se encuentra inserto en una de las extremidades de lacélula. Las bacterias que tienen dos flagelos, uno en cada extremo, sellaman anfítricas. Cuando los flagelos se encuentran insertos alrededordel cuerpo de la célula, las bacterias se denominan perítricas, recibiendoel nombre de lofótricas cuando presentan en cada extremidad un grupode flagelos (fig. 2).

Los flagelos no son visibles en vivo, siendo necesario, para po­nerlos de manifiesto, el empleo de técnicas especiales de coloración.Respecto a su naturaleza hay diversidad de pareceres: para unosautores proceden del endoplasma, mientras que otros creen que seoriginan en la capa ectoplásmica.

Estructura de las bacterias. - Las bacterias, observadas, en vivo,al microscopio se presentan como cuerpos refringentes e incoloros, delas formas mencionadas, pudiendo observarse también la movilidady las esporas en aquellas especies que poseen una u otras.

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FIC. I. A.-Cocos: I. MicrococcuS.-2. DiPlococcus.-3. Streptococcus'-4. Staphylo­coccus. - 5. Microc. tetragenus. - 6. Pnsumococcus. (Bncapsulados.) - 7. Sarcina.

B.-BACIl.os: 8. Bac, coli.-g. Streptobacillus (B. anthracis).-Io. Bacilos vacuolados.(B. pestis). - 11. Bacilos encapsulados. - 12 Y 13. Bacilos flagelados.

C.-BSPIlUI,OS: 14. Vibrio. - 15. Spirillum. - 16. Formas flageladas.D.-EsPIROQUHTI<;S: 17. Treponema microdentium.-18. Tre p, gracile.-19. Sp, minus,

(Muir y Rltchie.)

B

FlG. 2. - BACTERIAS FI.AGEI.ADAS: A. Especies monótricas (Pseud. aeruginosa},»:«B. Y C. Especies perítrícas (Eberl"ella I"phi y Bac. sltblilis). - D. Especies lofétricas.

(SP¡I'. undula). Según Migula.

f.a

l~IG. 3. - Distribución de 1a cromatina en las células del Bacillus mycoides.A la izquierda, dos células jóvenes que presentan un filamento axial (f. a.) de croma­

tina; en el citoplasma los glóbulos lipoides son pequeños y poco abundantes.En el centro, en células de más edad, el filamento axial aparece deformado por los

glóbulos lípoides (g. l.}, muy numerosos y de mayor volumen.A la derecha, en dos células adultas, el filamento axial, ruto por los glóbulos Iipoídes,

se disgrega en gránulos de cromatina (cr.). (Según Ouilliermond.)

Para un estudio más detallado de las bacterias hay que procedera su fijación y tinción, aprovechando su afinidad para determinadoscolorantes. Por este medio puede apreciarse que las bacterias presen­tan una masa de protoplasma claramente delimitada, rodeada poruna envoltura, a la que suele denominarse ectoplasma.

El protoplasma de las bacterias no es homogéneo, pudiendo ponersede manifiesto mediante el empleo de colorantes vitales (rojo neutro,verde de metilo, etc.), que poseen una estructura finamente granu­lar. En el protoplasma bacteriano se pueden observar vacuolas máso menos voluminosas, bien centrales o situadas en los extremos; gra­nos de cromatina; gránulos metacromáticos, y en determinadosgrupos, inclusiones de naturaleza diversa; no habiéndose encon­trado, hasta ahora, condriosomas ni núcleo típico claramente dife­renciado.

La existencia del núcleo en las bacterias ha sido y es objeto dediscusión, en el curso de la cual se han emitido las opiniones más dis­pares: desde los que han considerado, como Bütschlii (16), que lasbacterias, análogamente a los espermatozoides, están constituídaspor un gran núcleo rodeado de una tenue capa de citoplasma, que enlas de tamaño pequeño pasa inadvertida, hasta los que niegan la exis­tencia del núcleo en las bacterias, o los que las consideran como ele­mentos vivos primitivos en un grado inferior de evolución, en losque no se ha llevado a cabo el proceso de diferenciación del protoplasmaen núcleo y citoplasma.

Desde luego parece fuera de duda la existencia en las bacterias decromatina en forma de gránulos, que se tiñen perfectamente con loscolorantes de ésta, y presentan la reacción de Feulgen, característicade la cromatina. Hidrolizando las células bacterianas en caliente, me­diante una solución normal de ácido clorhídrico, y tratándolas pos­teriormente con el reactivo de Schiff (fucsina decolorada por anhídridosulfuroso), dichos gránulos se tiñen de púrpura intenso. De aquí quemodernamente se admita por algunos autores (46) que las célulasbacterianas poseen cromatina, como todas las demás, pero que éstase presenta en ellas en forma de un delgado filamento axial o de grá­nulos procedentes del fraccionamiento de éste (núcleo difuso, fig. 3), Yque estas disposiciones rudimentarias son normales en estos seres ycompatibles con el proceso de división celular.

En ocasiones, aparecen en el protoplasma bacteriano gránulosirregulares, teñidos intensamente, a los que se ha denominado gránulosmetacromáticos, por la propiedad que presentan de teñirse en rojo

vivo con los colorantes azules de anilina. Aun cuando no está clara­mente definida su significación fisiológica, pueden proceder, como enlas algas, hongos y protozoarios, de una substancia coloidal que nor­malmente se encuentra disuelta en el jugo celular de las vacuolas, cuyaprecipitación ha sido ocasionada por la acción de los reactivos fijadoreso de los colorantes vitales. Esta substancia (metacromatina o volutina)es una substancia de reserva, fosforada, rica en ácido zimonucleico.

Respecto a la naturaleza de las inclusiones en el protoplasma bac­teriano, se ha encontrado en muchas de ellas el glicógeno; otras, refrin­gentes, están constituídas por gotitas de naturaleza lipoide, y en lastiobacterias se observan inclusiones de azufre coloidal sumamenterefringentes.

El protoplasma se encuentra rodeado por una envoltura, o ecto­plasma, que en ocasiones, utilizando técnicas de sobrecoloración,aparece como un halo alrededor de la bacteria. La zona interna delectoplasma parece ser más densa y delimita claramente la masa proto­plásmica. La naturaleza de la zona externa es variable según las espe­cies: cuando es de naturaleza glutinosa, al verificarse la multiplica­ción de las bacterias, éstas quedan agregadas, formando masas gela­tinosas denominadas zoogleas; por el contrario, cuando carece de estapropiedad, los nuevos individuos se aislan fácilmente, sobre todocuando se desarrollan en un medio flúido, en el que pueden moverselibremente. En algunas especies, el borde exterior del ectoplasma estáclaramente definido, apareciendo el protoplasma envuelto en unacápsula, que puede encerrar una o más de una bacterias (fig. 1 - A).

El ectoplasma tiende a actuar como una membrana semipermeable,y por ello se presentan fenómenos de ósmosis. En soluciones hiper­tónicas, las bacterias plasmolizan, y en soluciones hipotónicas puedellegar a reventar el ectoplasma a consecuencia de la presión de tur­gencia, si bien la intensidad de estos procesos es variable con las espe­cies y la edad de las células.

Reproducción de las bacterias. - Cuando una bacteria se encuen­tra en condiciones de medio favorables, se multiplica por divisiónsimple o escisiparidad. En este proceso aparece en el punto medio dela célula una línea transversal, que no se colorea, y un estrechamientoque termina por estrangularla en dos partes, que pueden separarse opermanecer unidas por más o menos tiempo, según la naturaleza delectoplasma.

En la mayoría de las bacterias, el desarrollo y multiplicación severifican con extraordinaria rapidez: una bacteria puede alcanzar la

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madurez y dividirse en un periodo de veinte a treinta minutos. Supo­niendo que este periodo fuese de una hora, una sola bacteria, en veinti­cuatro horas, daría lugar a la formación de unos diez y siete millonesde individuos. En unos casos, la célula bacteriana aumenta de tamañoantes de dividirse, y en otros se divide previamente, y las dos célulashijas crecen hasta alcanzar el tamaño normal.

Si un pequeño número de bacterias se trasplantan a un medio decultivo adecuado, no empiezan a mu1plicarse inmediatamente, sinoque, por 10 general, transcurre un período de reposo o latencia máso menos largo, a continuación del cual el proceso de multiplicaciónse inicia, pasando por una fase de máximo crecimiento, durante laque el número de bacterias aumenta en proporción geométrica.Después de una fase en la que el número de bacterias vivas permanececasi constante, éste empieza a decrecer, hasta anularse, durante unperíodo más largo, por 10 general, que el de crecimiento, y que puededurar desde unos días hasta unos meses, según las especies y las condi­ciones de conservación del cultivo.

La duración de la fase de latencia depende de las condiciones enque se encuentre el cultivo anterior, siendo nula cuando procedende un cultivo en fase de máximo crecimiento, en cuyo caso las bacte­rias presentan una gran vitalidad.

Si un reducido número de bacterias se siembran distribuidas sobrela superficie, o en el interior, de un medio de cultivo sólido, el desarro­llo y multiplicación de las mismas da lugar a la formación de colonias,perceptibles a simple vista, que presentan formas y peculiaridadescaracterísticas en las distintas especies, que pueden utilizarse comoelementos para su identificación.

Al trasplantar bacterias a un medio de cultivo de condiciones des­favorables, su crecimiento y multiplicación se dificultan sobre manera,dando lugar, en la mayoría de los casos, a la aparición de variacionesque pueden afectar a la forma y tamaño de las mismas y ocasionaralteraciones en el protoplasma, tales como dificultad para la tíncióno aparición de gránulos o glóbulos, a veces de gran tamaño, que setiñen con mucha intensidad. A estas formas anormales se las suele deno­minar formas de involución, y pueden considerarse como elementosdegenerados, ya que al trasplantarlas a un medio de cultivo adecuado,se ve que muchos de los individuos están muertos, y aun los que per­manecen vivos y al multiplicarse regeneran la forma típica específica,muestran en ocasiones que han perdido algunas de las propiedadesoriginales de la cepa o estirpe de que proceden (17).

-u~

Formación de esporas. - En ciertas especies de bacterias, prin­cipalmente en los bacilos, y en determinadas circunstancias, sobretodo cuando las condiciones del medio son desfavorables, el conte­nido protoplásmico se concentra en una masa globular muy refrin­gente, refractaria a la tinción por los métodos ordinarios; masa quetermina por rodearse de una membrana resistente, constituyendo loque se denomina espora. La espora puede formarse en el centro de labacteria (central), en uno de los extremos (terminal) o próxima a unade las extremidades (subterminal). Su diámetro es, por lo general,mayor que el de la bacteria, siendo siempre su longitud menor quela de ésta.

Cuando la espora se encuentra en un medio adecuado y en condi­ciones favorables, germina, es decir, absorbe agua lentamente, hin­chándose, pierde su refrangibilidad y aumenta de tamaño hasta con­vertirse en una bacteria semejante a aquella de que procede. Duranteeste proceso, y según las especies, la membrana de la espora puedesubsistir, convirtiéndose en el ectoplasma de la bacteria (B. leptos­porus), desaparecer por disolución (B. anthracis) o romperse. En esteúltimo caso, la dehiscencia puede ser polar (E. butyricus), bipolar(E. sessile) o ecuatorial (E. subtilis).

Nutrición de las bacterias. - Ya en la primera parte de este trabajohemos dado indicaciones referentes a -la nutrición de las bacterias,que en este ligero compendio completaremos indicando algunos datosrelativos a la composición de las bacterias, en especial de las quehabitualmente se desarrollan en el suelo. Cramer (22) encontró queel contenido de agua de bacterias cultivadas en medios de agar era,por término medio, de 87,71 por 100; la materia seca contenía del50,47 al 51,81 por 100 de carbono, del 6,59 al 7,49 por 100 de hidró­geno, del 12,32 al 13,46 por IOO de nitrógeno y del 7,79 al 10,36 por 100de cenizas. Según Nicolle y Alilaire (72), el contenido en nitrógeno dela materia seca de las bacterias oscila del 8,3 al 10,8 por 100.

La composición mineral de las bacterias depende, en cierto grado,de la composición mineral del medio en que se desarrollan. Cramercomprobó, con el vibrión del cólera cultivado en caldo, que parauna proporción del 2,1 por 100 de p.06 en el medio, el contenido dep.O, en las cenizas del vibrión era del 10,9 por lOO, y que con un7,9 por 100 de p.06 en el medio de cultivo, el contenido en las cenizasdel vibrión se elevaba al 28,7 por 100 de P.06• Sin embargo, no pudocomprobar ocurriera 10 mismo que con el fósforo con los restantes ele­mentos de las cenizas. En el adjunto cuadro se indican las cifras máxi-

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mas y mínimas en que se han encontrado por Rossi (83) los elementos /1'minerales en las cenizas de las bacterias: ,~

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En algunas bacterias (género Asotobader) existe una relacióndeterminada entre el contenido en nitrógeno y fósforo, circunstanciaque ha sido utilizada en el desarrollo de un método para determinarel fósforo asimilable contenido en el suelo.

Respiración de las bacterias. - Atendiendo a sus necesidades deoxígeno. las bacterias se clasifican: en aerobias cuando requieren oxí­geno libre en el medio exterior, y anaerobias aquellas que no sólo nonecesitan oxígeno, sino que la presencia de éste, pasando de un ciertolímite, variable con la especie y la edad del cultivo, perturba su des­arrollo y puede ocasionar su muerte. Liborius (59) estableció dos cate­gorías de anaerobias: las obligadas o estrictas y las facultativas, inclu­yendo en las segundas aquellas bacterias que pueden vivir tanto enpresencia como en ausencia de oxígeno.

Beijerinck (5), teniendo en cuenta que no se conoce ninguna bacte­ria que solamente se desarrolle en una total ausencia de oxígeno, yque hasta las anaerobias estrictas se desarrollan mejor en presenciade pequeñas cantidades de oxígeno libre, estableció dos categoríasde bacterias: las aer6filas, en la que incluía las aerobias y las anaero­bias facultativas, y las microaeráiilas, correspondientes a las anaero­bias estrictas.

Las bacterias anaerobias estrictas toleran una tensión máxima deoxígeno sumamente baja. pudiendo desarrollarse en una total ausenciade dicho gas. Así, el Bac. amylobacter no forma esporas cuando lacantidad de oxígeno excede de unos 25 mgs. por litro, siendo la canti­dad óptima de unos 10 mgs. de oxígeno por litro. (El aire atmosfé­rico, a 180 y 750 mm. de presión. contiene 276 mgs. de oxígeno porlitro.) La primera generación de un cultivo de bacterias anaerobiases más sensible al oxígeno que las siguientes, que pueden desarrollarsemejor en presencia de cantidades limitadas de este gas.

Para la existencia en el suelo de bacterias anaerobias estrictas noes necesario que la atmósfera del suelo esté desprovista de oxígenolibre, sino que basta con la existencia de organismos aerobios, que

. con una activa utilización del oxígeno y producción de anhídrido

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carbónico reduzcan la tensión del oxígeno, creando condiciones favo­rables para el desarrollo de las bacterias anaerobias. Este hecho se pro­duce, por ejemplo, en el caso de las bacterias fijadoras de nitrógenode los géneros Clostridium (anaerobia estricta) y Azotobacter (aerobia),en que las segundas protegen a las primeras, creando una atmósferaadecuada para la anaerobiosis.

Movilidad.- Como hemos indicado anteriormente (pág. 8), exis­ten bacterias dotadas de la propiedad de desplazarse espontánea­mente, en los medios líquidos, con movimientos de naturaleza varia­ble con la especie: rápidos y rectilíneos; lentos, con movimientosimultáneo de oscilación y traslación; de reptación, y, finalmente, detipo he1icoidal, como en los espiroquetes.

El grado de movilidad depende, además de la especie, de la edad,del cultivo, de la naturaleza del medio de cultivo y de las condicionesdel medio exterior, entre las que deben mencionarse la temperaturay el oxígeno. La influencia de este último factor puede apreciarseen algunas especies colocando una gota del cultivo entre el cubre yel portaobjetos. Llega un momento en que cesa el movimiento en elcentro de la preparación, donde se ha agotado el oxígeno, mientraslas bacterias próximas a los bordes del cubre, donde el oxígeno atmos­férico se disuelve en el medio, continúan moviéndose. En ocasiones,el movimiento es más vivo inmediatamente después de la multiplica­ción, mientras que en otros casos persiste con igual intensidad durantetoda la vida de la bacteria, o bien se anula antes de la esporulación.

Algunas bacterias presentan movimientos que les permiten atra­vesar una capa de arena o un filtro de porcelana, propiedad que hasido utilizada por Cambier (filtro de Chamberland) y luego por Carnoty Garnier (tubo conteniendo arena cuarzosa muy fina) para separarlos microbios móviles de los inmóviles y determinar el grado de movi­lidad de los primeros (26).

Elaboración de pigmentos. - Algunas bacterias poseen la pro­piedad de elaborar substancias colorantes, que pueden quedar ence­rradas en el interior de la célula o difundirse en el medio exterior.

Se conoce malla naturaleza de estos pigmentos, que, en su mayorparte, son insolubles en agua y solubles en alcohol, acetona y cloro­formo, pudiendo considerarse algunos de ellos (pigmento amarillo dela Sarcina lutea) como lipocromos, mientras que otros, como la pio­cianina, presentan grandes analogías con los alcaloides.

En la formación de los pigmentos bacterianos influyen diversascondiciones externas, como la constitución química y la reacción del"

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medio, la temperatura y la presencia de oxígeno, que parece ser nece­sario para su formación.

Influencia del medio. - Entre los factores del medio que ejerceninfluencia sobre el desarrollo y actividad de las bacterias, hemos deconsiderar, además del oxígeno, ya estudiado, los siguientes:

a) Luz. - La luz solar directa ejerce una marcada acción sobrela vitalidad de las bacterias, en el sentido de retardar su desarrollo, y,si su acción es prolongada, ocasionar la muerte de los gérmenes.

La luz difusa ejerce análoga influencia, pero mucho más atenuada.No todas las radiaciones del espectro solar actúan con la misma

intensidad: las más activas son las azules y violetas, y las más inno­cuas, las rojas y amarillas. Las radiaciones ultravioletas ejercen unaacción bactericida tanto más enérgica cuanto menor es su longitudde onda, bastando una exposición de diez minutos, en algunos casos,para ejercer una acción letal.

b) TEMPERATURA. - Las bacterias presentan una temperaturamínima, por debajo de la cual no se desarrollan; una temperaturaóptima, a la que el desarrollo se verifica en las mejores condiciones, yuna temperatura máxima, por encima de la cual cesan las actividadesbacterianas.

Tanto los limites de temperatura como el óptimo son diferentessegún las especies bacterianas: las bacterias saprófitas, por 10general,poseen su temperatura óptima entre los 20° y 24°, mientras que paralas parásitas ésta es la del organismo sobre el que viven. El limiteinferior de crecimiento se encuentra, por 10 general, entre los 12° ylos 14° C., y el superior, entre los 42° y los 44° C. Excepcionalmente,se encuentran bacterias que continúan su desarrollo hasta los 50 detemperatura, y otras, las denominadas termáiilas, que manifiestan todasu actividad vital a temperaturas de 600 y 700.

Las temperaturas inferiores a la mínima no ocasionan la muertede las bacterias, sino únicamente la paralización de su actividadvital, pudiendo algunas especies resistir temperaturas sumamentebajas durante períodos prolongados (el B. typhosus y el Stapbylo­coccus aureus han resistido la temperatura del aire líquido -141° du­rante seis meses). Por el contrario, la elevación de algunos grados detemperatura sobre el límite máximo ocasiona efectos dañosos, siendopocas las especies bacterianas no esporuladas que sobreviven a unatemperatura de 55°, prolongada durante un tiempo suficiente.

Se denomina punto térmico letal aquella temperatura que, actuandodurante diez minutos sobre una especie bacteriana, produce su muerte.

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A este respecto, cabe distinguir entre el calor seco y el húmedo. Lasespecies bacterianas, tanto en forma vegetativa como esporulada,tienen un punto térmico letal más bajo para el calor húmedo quepara el calor seco, siendo también más bajos los puntos térmicos le­tales de las formas vegetativas que de las esporas. Así, por ejemplo,mientras que las formas vegetativas del Rae. subtilis mueren a los 60° decalor húmedo, las esporas del mismo resisten la temperatura de 100° du­rante una hora, y mueren en cinco minutos a la de 110°; y segúnKoch, las esporas de esta especie pueden germinar después de haberestado sometidas a una temperatura de 120° de calor seco.

e) DESECACI6N. - El agua es necesaria para el desarrollo de laplena actividad vital de las bacterias; pero, sin embargo, gran nú­mero de bacterias en estado vegetativo pueden resistir un ciertogrado de desecación, variable según las especies, y las restantes condi­ciones del medio: el vibrión colérico muere por desecación en dos otres horas, mientras que el Staphyloeoeeus aureus vive al cabo de diezdías. Las esporas resisten la desecación durante períodos muy largos,algunas de varios años, sobre todo si se mantienen en la obscuridad yexpuestas al aire.

d) AGENTES QUÍMICOS. - Existen numerosas substancias quími­cas que, en contacto con las bacterias, impiden su desarrollo u oca­sionan su muerte. Estas substancias se denominan antisépticos, auncuando en el lenguaje corriente sólo se aplica esta denominación aaquellas substancias que ejercen dicha acción en soluciones muy di­luídas.

La actuación de los antisépticos es variada: mientras unos obranpor coagulación del protoplasma, otros 10 hacen mediante procesosde oxidación, o bien formando productos tóxicos al combinarse con elprotoplasma; no conociéndose en muchos casos el exacto mecanismode su acción, sobre la que influyen gran cantidad de factores, talescomo naturaleza del producto, estado líquido o gaseoso del mismo,concentración en iones-hidrógeno, grado de ionización y de dispersión,temperatura, naturaleza del medio en que se encuentran las bacte­rias, abundancia de éstas, estado de esporulación o no, etc.

Entre los antisépticos más usados se encuentran las sales de losmetales pesados, especialmente mercurio, plata y cobre; algunosácidos, principalmente minerales; determinados agentes oxidante yreductores; aceites esenciales; una gran variedad de compuestosquímicos orgánicos, y algunos colorantes, como el verde brillante,el violeta cristal, el rojo congo, etc.

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e) AGENTES MICROBIANOS. - Los efectos de la convivencia devarios microorganismos pueden ser favorables o desfavorables. Enunos casos son debidos al consumo o modificación de los alimentosdisponibles; en otros, a cambios en las condiciones físicoquímicasdel medio, especialmente la reacción yel potencial de óxidorreducción,y, finalmente, en otros, a la producción de substancias específicas, quepueden ser tóxicas o estimulantes para el desarrollo de otros micro­organismos.

Las investigaciones de los efectos antagónicos entre los micro­organismos se han concretado a las formas patógenas, habiéndoseexperimentado muy poco en 10referente a las reacciones mutuas entrelos numerosos miembros de la población microbiana del suelo. Esteestudio es de suma importancia, ya que los microorganismos, tanto enel suelo como en los abonos orgánicos, llevan a cabo sus numerosasactividades como poblaciones mezcladas y no en cultivo puro.

Algunos organismos elaboran substancias capaces de perturbarsu propio desarrollo (iso-antagonistas); pero son más numerosos losque producen substancias perjudiciales para el desarrollo de otrosmicroorganismos (hetero-antagonistas). A esto se debe el que ciertoshongos y bacterias se desarrollen en cultivos prácticamente puros. aunen medio no esterilizados. Baste citar la producción de ácidos lácticoy butírico por las bacterias correspondientes; de ácido láctico porespecies de Rhisopu«: de alcohol, por levaduras; etc. (I03). Flemingencontró (35) que un hongo del género PeniciUium (el Peno notatus)elabora una substancia de naturaleza no enzimática - a la que se hadenominado «penicilina» - que ejerce una enérgica acción antibiótica.

1) BACTERI6FAGO. - Desde hace mucho tiempo se conocían losprocesos de autolisis en cultivos bacterianos, que, al envejecer, empe­zaban a clarificarse, hasta el extremo de quedar perfectamente trans­parentes al desaparecer en ellos los gérmenes bacterianos. Pero fuéen época relativamente reciente cuando se tuvo conocimiento - porlos trabajos de Twort (1915) con micrococos procedentes de la linfa­vacuna y los de d'Herelle (1917) con el bacilo de la disentería - deque este fenómeno de la disolución o lisis de los gérmenes microbianospodía provocarse con la adición, al medio de cultivo, de un agente, alque se denominó sbaeteriófagce, o, más brevemente, dago», agentecapaz de atravesar los filtros de porcelana más finos, y que presentanotable resistencia al tratamiento con agentes tales como acetona,alcohol, éter, cloroformo, desecación, etc., habiendo comprobadod'Herelle que conservaba su actividad después de sometido durante

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tres días a la acción de sublimado corrosivo al 1/200 o ácido fénicoal 1/100.

Cuando un cultivo joven, en caldo turbio por la presencia de gér­menes bacterianos, se inocula con bacteriófago, se va aclarando gra­dualmente a medida que avanza la lisis, hasta que por fin quedaperfectamente transparente. En los cultivos lisados por la acción delbacteriófago se conserva éste activo durante varios años, como hapodido comprobarse inoculando con ellos un cultivo fresco del mismogermen bacteriano.

Se desconoce la naturaleza del bacteriófago, considerándole unosinvestigadores como un agente vivo o un virus filtrable, mientras quepara otros es simplemente una enzima autoUtica transmisible debacteria a bacteria.

Bacteriófagos obtenidos de fuentes distintas presentan considera­bles diferencias en relación con los organismos sobre los que ejercensu acción disolvente.

Se ha comprobado que las nudosidades de las raíces de algunas legu­minosas contienen un bacteriófago que disuelve las bacterias y ponesu nitrógeno en condiciones de ser asimilado por las plantas (43). Elbacteriófago se encontró no sólo en las nudosidades, sino tambiénen las raíces y en los tallos. Es específico en su acción, y ataca sola­mente a aquellas bacterias que forman nudosidades en las plantas deque se ha obtenido. Este bacteriófago puede obtenerse a partir denudosidades frescas, esterilizándolas exteriormente, triturándolas yponiéndolas en un medio nutritivo; después de cinco días, la soluciónturbia se filtra a través de una bujía Chamberland, y se agregan unoscentímetros del filtrado a un medio inoculado previamente con uncultivo puro de las bacterias de las nudosidades.

Esta operación se repite a los diez días, disminuyendo cada vez lacantidad de líquido usada para la infección, 10 que provoca la acumu­lación del bacteriófago, y agregando algunos centímetros de este me­dio a un cultivo de Bac. radicicola, el enturbiamento de este últimodesaparece a causa de la disolución de las bacterias.

Clasificación de las bacterias. - El método de clasificación basadoen los caracteres morfológicos, de uso corriente en la clasificación delos vegetales superiores, es de muy difícil aplicación en el caso de lasbacterias, a causa del reducido número de formas que éstas presentan,y sobre todo a que estas formas pueden variar fácilmente con lascondiciones del cultivo y con la composición del medio empleado.El B. prodigiosus, por ejemplo, sembrado en medios alcalinos, se pre-

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Modificaciones de forma del Bac. pyocyan6Us con el medio de cultivo(según Guígnard y Charrin).

A. Forma normal en caldo o agar-caldo. - B. En medios conteniendo timol. ..- C. Enmedios con un 4 por 100 de alcohol. - D. En medios con un 0,15 por lOO de bicro­mato potásico. - R En medios con un 7 por 1.000 de ácido bórico. - F. En medios

con un I por 1.000 de creosota.

senta en forma de cocos, y resembrado en un medio ligeramente acidi­ficado con ácido tártrico, adopta la forma de bacilos o espirilos (26).

La multiplicación de hechos como el citado dió lugar a la teoríadel pleomorfismo o polimorfismo de las bacterias, que sostenía la va­riabilidad de formas de las especies bacterianas, en contraposición ala fijeza, relativa, de la forma en la mayoría de las especies animalesy vegetales.

Los primeros mantenedores de esta teoría, entre los que se con­taban Billroth y Nágeli (II y 70), suponían a las bacterias dotadas deuna casi ilimitada plasticidad, en contra de la opinión de Cohn yde Koch, que consideraban a las bacterias en posesión de formas pro­pias, que utilizaron para sus. sistemas de clasificación en géneros yespecies. Modernamente, Lóhnis (64) y algunos bacteriólogos ameri­canos han vuelto a plantear la teoría del pleomorfismo de las bacterias,suponiéndolas dotadas de complejos ciclos de vida, durante los que lasespecies cambian repetidamente de forma.

La teoría del pleomorfismo ha encontrado ruda oposición por par­te de eminentes botánicos, como de Bary (3), quien considera a lasbacterias, a pesar de su elemental constitución, caracterizadas, comootros organismos, por tipos morfológicos, que permiten agruparlassistemáticamente en géneros y especies; y modernamente, por bacte­riólogos como Winogradsky (II4), quien pone en duda la pureza delos cultivos que han servido de base a los pleomorfistas, y atribuye,además, los pretendidos ciclos evolutivos a deformaciones y anorma­lidades, a monstruosidades, ocasionadas por medios de cultivo ycondiciones totalmente inadecuados para su desarrollo normal.

Un ejemplo de esto último se tiene en las experiencias de Gui­gnard y Charrin (46) con el Bac. pyocyaneus: en cultivos en caldo oagar-caldo, se presenta en forma de pequeños bastoncillos de 1 fL

a 1,5 (L X 0,5 (L (fig. A); pero es suficiente añadir al medio de cultivouna débil cantidad de un antiséptico para que el bacilo adopte formasvariadas: en presencia de timol, la de bastoncillos largos (fig. B); conun 4 por 100 de alcohol, la de filamentos delgados (fig. C); con un0,15 por 100 de bicromato potásico, la de filamentos gruesos (fig. D);con un 7 por 1.000 de ácido bórico, la espiralada (fig. E), y con un1 por 1.000 de creosota, la forma de cocos (fig. F). Sin embargo, todasestas formas son anormalidades transitorias debidas al medio, ya queresembrándolas en medio normal, reaparece la forma típica de baciloscortos.

Entre las varias clasificaciones propuestas, atendiendo a la mor-

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fología de las bacterias, nosotros indicaremos la de Waksman (102),que es la de Migula con ligeras variaciones, principalmente en lasbacteriáceas:

l. Formas simples, sin diferenciar, no formando filamentos ni ramificacionesen condiciones normales. ORDEN EUBACTERIAI,ES.

l. - Células en su mayoría esféricas, raramente en bastoncillos: CoccdceasZopf, emend. Migula.

a) División en una dirección con frecuente formación de rosarios:I. Streptococcus, BUlroth.

b) División irregular en todas direcciones; las células se presentanaisladas, en parejas o en masa, pero nunca en rosarios: 2. Mi­crococcus, Cohn.

e) División en tres direcciones, dando lugar a masas cúbicas: 3. Sar­eina, Goodsir.Planostreptococcus, Planococcus y Planosarcina, comprendengrupos semejantes, pero con elementos flagelados.

2. - Células en su mayor parte en bastoncillos, rara vez esféricas o curva-das: Bacteridceas, Zopf. emend. Migula.

a) Sin formación de endosporas: 4. Bacterium, Cohn.

b) Formando endosporas: 5. Bacmus, Cohn.

e) Células con flagelos polares; endosporas formadas rara vez: 6. Pseu­domonas.

3. - Células en su mayoría curvadas o en forma de espiral; rara vez esfé­ricas o en bastoncillos: Spinlaceas, Migula.

a) Células en forma de coma: 7. Vibrio, Müller, emend, Lóffler.

b) Células rígidas de forma de espiral: 8. Spirillum, Ehremberg,emend, Laffler.

e) Células flexuosas de forma de espiral: 9. Spiroehaeta, Ehremberg.

Il. Bacterias incoloras, acumulando azufre en el interior de sus células. ORDENTHIOBACTERIALES.

IIl. Bacterias semejantes a algas. ORDEN FICOBACTERIALES.Este Orden comprende la familia de las Clamidobacteridceas, que poseen

cápsula, incluyendo varias de las llamadas bacterias ferrugínosas,

IV. Bacterias semejantes a hongos. ORDEN MICOBACTERIALES.En este Orden se incluyen frecuentemente los Actinomicetos.

V. Bacterias incluidas en masas mucilaginosas, formando agregaciones seme­jantes a pequeños plasmodíos, que toman al fin aspecto de cuerpos fruc­tíferos de forma más o menos regular. ORDEN MIXOBACTERIALES.Este orden incluye los géneros Myxococcus, Polyan§!ium y Chondro­myees.

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t,),j,,¡'"'I',

Las dificultades, ya mencionadas, que presenta la identificaciéssde las bacterias basándose exclusivamente en sus caracteres mt>rfo­lógicos han obligado a completar la determinación de las esptcies bit:: 7;terianas con el empleo de otros caracteres diferenciales, tales como: '

a) .La forma y aspecto de las colonias en determinado\,~edios

de cultivo. • .""b) Los caracteres de coloración, principalmente su coin~a-

miento con el método de Gram (*); y ~"". ".e) Su comportamiento fisiológico.Para el estudio de las bacterias del suelo, y siguiendo la norma más

corriente, las agruparemos, como Waksman, atendiendo a su comporta­miento fisiológico, del modo que se indica a continuación:

l. Bacterias aut6trofas, estrictas y facultativas.n. Bacterias heter6trofas.

1. - Bacterias fijadoras del nitrógeno atmosférico.2. - Bacterias aerobias que necesitan nitrógeno combi­

nado.3. - Bacterias anaerobias que necesitan nitrógeno com­

binado.

A continuación del estudio de estos grupos de bacterias, y teniendoen cuenta la importancia del proceso de demolición de la celulosa,tanto por la abundancia de este material en el suelo como por elhecho de que hay muchas bacterias del mismo capaces de existirutilizando la celulosa como única fuente de material energético, dedi­caremos un capítulo al estudio de las bacterias que descomponen lacelulosa.

(*) Este método, debido al danés GRAM, está basado en que el protoplasma delas bacterias, cuando se trata sucesivamente por violeta de genciana y una soluciónacuosa de yodo y yoduro potásico, en unas especies bacterianas (Oram-posítívas) tomauna coloración azul obscura, insoluble en el alcohol absoluto, mientras que en otras(Gram-negativas) la coloración desaparece al tratar los frotís con alcohol absoluto.

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CAPITULO 11

BACTERIAS AUTOTROFAS

I

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Las bacterias autótrofas estrictas son microorganismos que obtie­nen su carbono del COI atmosférico, o disuelto en el agua, medianteprocesos de quimiosíntesis (Primera parte, pág. 28), Yla energía indis­pensable para su actividad, por la oxidación de compuestos inorgáni­cos de nitrógeno, azufre, hierro, carbono e hidrógeno. Las transforma­ciones referentes a los compuestos de nitrógeno y azufre son de unagran importancia para los suelos.

Las bacterias autótrofas facultativas pueden obtener su carbonobien del COI atmosférico, o disuelto, o del contenido en diversos com­puestos orgánicos.

La existencia de ambos tipos de bacterias está ligada forzosa­mente a la presencia de las substancias indicadas, cuya oxidaciónconstituye su única fuente de energía, y, en su mayor parte, son inca­paces de descomponer la materia orgánica, cuya presencia, en cir­cunstancias determinadas, puede perturbar su desarrollo (IlI).

Por su mayor importancia en los suelos, sólo nos ocuparemos deta­lladamente de los siguientes grupos de bacterias autótrofas, ordena­dos atendiendo a la fuente de energía que utilizan:

A) Bacterias que utilizan compuestos de nitrógeno.B) Bacterias que utilizan el azufre y sus compuestos (pág. 35).e) Bacterias que utilizan compuestos sencillos de carbono (pá-

gina 39).D) Bacterias que utilizan el hidrógeno (pág. 40).

No trataremos de las bacterias autótrofas, que, como las de losgéneros Leptothrix y SpirophyUum, oxidan compuestos de hierro ymanganeso, porque hasta ahora (86) se desconoce su importancia enel suelo, toda vez que la mayoría de los estudios técnicos se han llevadoa cabo en relación con el agua.

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A) BACTERIAS QUE OBTIENEN SU ENERGíA MEDIANTE LA OXIDA­

CIÓN DE COMPUESTOS DE NITRÓGENO. - Como ya indicamos (Prime­ra parte, pág. 12), las experiencias de Schloesing y Müntz, aplicadasa los suelos por Warington y otros, demostraron la naturaleza bio­lógica del proceso de formación de nitratos en la descomposición de lamateria orgánica; pero al intentar aislar los gérmenes productoresde la transformación se fracasó repetidas veces, debido a deficienciade los métodos empleados: medios orgánicos a base de gelatina; hastaque, en 1890, Winogradsky, que hacía poco tiempo había realizadosus estudios sobre las sulfo y ferrobacterias, tuvo la feliz idea de ensa­yar como medio de aislamiento una solución exclusivamente mineral,a base de sulfato amónico, en la que ciertas bacterias se desarrollaronactivamente, llevando a cabo la nitrificación de la sal amoniacal. Estedescubrimiento fué notable, no sólo por haber permitido el aislamientode las bacterias nitrificantes, sino porque confirmó la existencia - re­cién revelada por los estudios sobre sulfobacterias - de la quimio­síntesis, y, por tanto, de poder que poseían determinadas bacteriasde vivir, como las plantas provistas de clorofila, a expensas de materiamineral exclusivamente.

Winogradsky (108) empleó un medio de cultivo selectivo, en elque sólo pudieran desarrollarse aquellas bacterias capaces de oxidarlos compuestos de amoníaco. El medio usado contenía:

Sulfato amónico (NH,). S0, I gramo.Fosfato bipotásico KaHPO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I •

Agua corriente. 1000

El medio lo distribuía en matraces de fondo plano, colocando encada uno 100 c. c., y de 0,5 a 1 gramo de carbonato de magnesia, este­rilizándolo todo durante quince minutos a una atmósfera de presión.

Los matraces se inoculan con una pequeña cantidad de suelo y seincuban a una temperatura de 25°a 30°.

Igualmente puede emplearse el siguiente medio líquido de cultivopara el aislamiento de bacterias nitrosas (no):

Sulfato amónico (NH,). S0, 1,0 gramos.Fosfato bipotásico K.HPO. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0

Cloruro sódico Na el .... . . . .. . . . . .. .. . . . . .... ol,O

Sulfato magnésico :Mg SO, • ¡H.O..... . . . . . . . . . 0.5Sulfato ferroso Fe SO, . ¡H.O.. . • . . . . . . . . . . . . . Indicios.Carbonato magnésico Mg CO, . . . . . . . . . . . . . . . . • Exceso.Agua destilada....... .. . . . . . . . . . . ..... .. ... . . 1000 gramos.

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A fin de prevenir pérdidas de amoníaco, es preferible esterilizarel carbonato magnésico separadamente. Cuando esté frío, se agregaun exceso de carbonato a cada matraz. La formación de nitritos secomprueba con el reactivo de Tromsdorf (*), y la desaparición delamoníaco, mediante el reactivo de Nessler (*.).

Se agregan dos o tres veces pequeñas porciones de una soluciónestéril de sulfato amónico, a medida que se haya ido agotando la ante­rior, y se hace un trasplante del cultivo a otro matraz con el mismomedio de cultivo, utilizando de preferencia pequeñas porciones delfondo del matraz, en la que las bacterias forman un sedimento sobreel carbonato de magnesio. Después de tres o cuatro trasplantes, elcultivo está 10 suficientemente enriquecido para permitir el aisla­miento de las bacterias.

En el cultivo se encuentran conjuntamente las bacterias nítricasy las nitrosas; mientras existe amoníaco en el medio, las bacteriasnítricas permanecen inactivas, empezando a funcionar tan prontocomo todo el amoníaco ha sido oxidado en nitrito. Si el trasplante sehace durante la primera fase, mientras exista bastante amoníaco enel medio, las bacterias nítricas pueden ser eliminadas completamenteen el transcurso de varios trasplantes consecutivos. Para el aislamientode las bacterias nitrosas pueden emplearse medios' sólidos, como el gel

(*) El reactivo de TROIISDORF se prepara añadiendo lentamente. con agitaciónconstante. una solución hirviente de 20 gramos de cloruro de cinc en lOO c. c. de aguadestilada a una dilución de 4 gramos de almidón en agua. Se continúa calentandohasta que se disuelva la mayor cantidad posible de almidón y la solución sea casclara. Entonces se diluye en agua y se agregan 2 gramos de yoduro de cinc; se completacon agua hasta un litro de volumen; se filtra. y se guarda en la obscuridad en frascosbien tapados.

Para la determinación de nitritos, se colocan tres gotas del reactivo en un 'platUlode porcelana y se agrega una gota de ácido sulfúrico diluido (1 : 3). Se toma con un asade platino una pequeña cantidad del liquido a ensayar y se toca la superficie del reac­tivo: una coloración azul indica la presencia de nitritos.

(**) Reactivo de N.!tSSI,.JtR: Disolver 50 gramos de yoduro potásico en una pe­queña cantidad (alrededor de 35 c. c.) de agua destilada. fria. exenta de amoníaco;afiadir cloruro mercúrico en solución saturada hasta que persista un ligero precipi­tado. Entonces agregar 400 c. c. de una solución al 50 por 100 de potasa. que se hadejado clarificar por sedimentación antes de usarla; se completa el volumen hasta unlitro; se deja reposar durante una semana; se decanta. y se conserva, al abrigo de laluz, en frascos pequeños bien tapados.

Para el uso, se afiade a una gota del reactivo la cantidad del liquido a ensayarque pueda llevar un asa de h1lo de platino: una coloración amarilla de oro indica lapresencia de amoníaco.

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silíceo de Winogradsky, que se prepara mezclando volúmenes igualesde silicato sódico o potásico (peso esp., 1,05 a 1,06) y de ácido clorhí­drico (peso esp., 1,10), echando el primero sobre el segundo. La mez­cla se dializa con papel pergamino, durante varios días, en agua des­tilada. que se renueva frecuentemente, hasta que el dializado sóloproduzca un ligero enturbiamiento con el AgNO.. La solución claracontiene alrededor de un 2 por 100 de ácido silícico, y puede conser­varse durante tres meses en frascos, con tapón de cristal y esterilizado,de 1 IS° a 120°. Además del ácido silícico, se preparan las cuatro solu­ciones siguientes:

[1) (NH.>.SO..................................... 3,0 gramos.K,HPO. 1,0

MgSO•. 7H,O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 C. C.

[2J Solución de sulfato ferroso al 2 por lOO.

[3J Solución saturada de NaCl.

[4] Lechada de maguesia: ,Una suspensión espesa de carbonato demagnesio finamente pulverizado, en agua destilada.

En un matraz se colocan 50 c. c. de la solución de ácido silícico, yse agregan 2,5 c. c. de la solución [1], 1 C. c. de la solución [2] y sufi­ciente cantidad de la [4], para dar a la mezcla un aspecto lechoso.(En sustitución de la magnesia puede usarse una solución al 0,1 por 100

de carbonato sódico.) La mezcla se echa en placas de Petri pequeñas,esterilizadas, y se coloca una gota de la solución [3] en el centro de cadaplaca. Se colocan en posición horizontal, y al cabo de una hora se hasolidificado el medio.

La inoculación se hace, bien en el matraz, o, posteriormente, en lascajas de Petri, colocando una gota sobre la superficie, que se extiendecon una varilla de cristal esterilizada, que se usa sucesivamente parala inoculación de otras dos cajas de Petri, de modo que se obtengauna serie de diluciones. Las cajas se incuban de 25° a 30°.

El desarrollo de organismos en la placa se investiga primeramentemediante pruebas químicas que revelen la formación de nitratos ydesaparición de amoníaco, para 10 que se toman con un asa esterili­zada pequeñas porciones del gel, que se someten a la acción de losreactivos indicados anteriormente. Una vez comprobada la presenciade bacterias nitrosas, se puede alimentar periódicamente el cultivocon la adición de una o dos gotas de una solución estéril de sulfatoamónico al 10 por 100.

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Las diminutas colonias miscroscópicas se estudian mejor sobre elmedio transparente al carbonato sódico, empleando aumentos decincuenta a cien diámetros. Las colonias, incoloras al principio, tomancolor amarillento; más tarde, pardusco, y al final, pardo obscuro. Alcabo de un cierto tiempo, de diez a catorce días, empiezan a aclararsedesde los bordes al centro, hasta quedar incoloras. Sobre el mediolechoso, con carbonato magnésico, se forma algunas veces un halotransparente alrededor de las colonias, debido a la acción del ácidonitroso sobre el carbonato magnésico.

Las bacterias que intervienen en la oxidación del amoníaco enácido nitroso pertenecen a los géneros Nitrosomonas y Nitrosocoocus.

Género Nitrosomonas Winogradsky, 1892.

Las bacterias del género N itrosomonas se caracterizan por tenercélulas móviles en forma de bastoncillos provistos de flagelos polares,que se desarrollan en medios carentes de materia orgánica o que lacontienen en pequeña cantidad.

La especie tipo es la Nitrosomonas europaea Winogradsky, cono­ciéndose otras dos especies, que, con la mencionada, describimos acontinuación, utilizando, como para las restantes especies bacterianas,las descripciones de Bergey en su Manual (9).

Nitrosomonas europaea Winogradsky.

(Aren. Sci. Biol.• S. Petersburgo, l. 1892.)

Bastoncillos de 0,9 a 1 \.A. X 1,1 a 1,8 ¡Jo, presentándose aislados yrara vez en cadenas de tres o cuatro. Poseen un flagelo polar cuyalongitud es tres o cuatro veces la del bastoncillo. Muy rara vez pre­sentan un flagelo en cada extremo.

Se desarrolla fácilmente en medio líquido desprovisto de materiaorgánica, que contenga sulfato amónico, fosfato potásico y carbonatobásico de magnesia. Los individuos se unen, formando zoogleas alre­dedor de las masas de carbonato en el fondo del matraz.

Sobre geles silíceos forma colonias pequeñas compactas, de colorpardo, con bordes netamente definidos.

Convierte en nitritos las sales amoniacales.Habitat: Suelo.

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Nitrosomonas javanensis Winogradsky.(Arc". Sci. Biol .• S. Peters.• l. 1892.)

Bastoncillos pequeños aovados, de 0,2 ¡.t a 0,5 ¡.t de longitud, pro­vistos de un flagelo polar, cuya longitud es unas veinte veces la delbastoncillo.

En medios inorgánicos líquidos se agrupan formando pequeñoscopos o escamas, que se adhieren a las paredes del recipiente, perma­neciendo claro el líquido.

Las colonias en geles silíceos son de forma circularo elíptica.Convierte en nitritos las sales amoniacales.Habitat: Suelo.

Nitrosomonas groningensis Sack.

(C~tralblalt. Bakt., I1, 64: 34; 1925.)

Bastoncillos de 0,4 ¡.t X 0,6 ¡t, inmóviles. Gram negativos.Colonias sobre gelatina: pequeñas, circulares, incoloras y bri-

llantes.Colonias sobre gel silíceo: circulares, compactas, incoloras.Enturbia el caldo.Sobre patata: colonias pequeñas, incoloras.No forma indol.En ausencia del oxigeno, reduce los nitratos a nitritos.En solución de peptona que contenga (NH,).SO, forma nitritos.Ataca lentamente a la celulosa.Puede tomar el carbono del COI atmosférico, de la glucosa, de la

levulosa, de la maltosa, de la sacarosa y de la asparagina.Aerobia.Temperatura óptima: 200.

Habitat: Suelo.

Género Nitrosococcus Winogradsky, 1892.

Bacterias esferoidales grandes, que no se desarrollan en los me­dios ordinarios de cultivo. En el suelo y en medios de cultivo adecua­dos transforman el amoníaco en nitritos.

- 3°-

La especie tipo es

Nitrosococcus nitrosus Migula, Bergey y col.SINONUfIAS. - Nltrosococcus Winog"atlslly (A"ch. Sei. su«: S. Peters.,:I'; 189zt·,· ~>:'

Ann. Inst. Pasl~", s. 577; 1891). Micrococcus nil"osus (Wlnograds~1IIfIgu11 'l-f;Systetn der Balltenetl, 194; 1900). , . , '

'~."" '.Esferas grandes de 1,5 ¡.t. a 1,7 ¡.t. de diámetro, con gruesa me1ll~na

celular, aparentemente inmóviles. . .....Cultivo en gel sillceo: colonias brillantes, grandes, blanquecinas o

amarillentas, granulares.Aerobia.Temperatura óptima: 20° a 25°.Habitat: Suelo.Para el aislamiento de las bacterias nítricas puede partirse:a) De uno de los anteriores medios líquidos en que se haya ago-­

tado el amoníaco, haciendo trasplantes sucesivos sobre medios en que,como el que se indica a continuación, se ha substituído la sal amónicapor nitritos, con los que se consigue la eliminación de las bacteriasnitrosas; o

b) Inoculando con suelo directamente el medio elegido.Como medio líquido puede emplearse el siguiente (40):

Nitrito s6dico (NaNO,) o. o. . . 1,0 gramos.Carbonato s6dico (NaaCO,) o. 1,0 t

Fosfato dipotásico (K,HP04) o.. o 0,5Cloruro sódico (NaCl) 0.5Sulfato magnésico (MgS04' 7H,O) , o.. 0,3Sulfato ferroso (FeS04 • 7Ha0) . . . . . . . . . . . . . . . Indicios.Agua destilada , o o 1000 C. C.

Se colocan porciones de unos 20 c. C. en matraces de Erlenmeyerde ISO c. C., se inoculan y se cultivan a 28°.

Cada siete o diez días se toma con un asa de platino esterilizadauna gota del medio de cada matraz, y se comprueba la desaparición delos nitritos con el reactivo de Trommsdorf, en la forma indicada, yla presencia de nitratos, con la difeni1amina (*), para 10 que se coloca

(*) Para preparar el reactivo de difenilamina, se disuelven 0,7 gramos de dífeníla­mina en una mezcla de 60 c. c. de ácido sulfúrico puro (poe., 1,84) y 28,8 c. c. de aguadestilada; se enfría la mezcla, y se añaden lentamente lId c. c. de ácido clorhídricoconcentrado (p. e., 1,19); se deja reposar hasta el día siguiente, y se decanta, paraseparar la parte de base que precipita. Se conserva en frascos topacio y al abrigo dela luz.

- 3 1

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en una depresión del platillo de porcelana una gota del reactivo yse toca con una gota de la solución que se prueba: una coloraciónazulada indica la presencia de nitratos. Esta prueba no puede reali­zarse en presencia de nitritos, por lo que si la prueba de Trommsdorfes positiva, hay que esperar a que se hayan agotado los nitritos.

Tan pronto como el cultivo acusa la desaparición de los nitritosy la aparición de nitratos, se hacen trasplantes en matraces estérilescon el mismo medio de cultivo. Cuando se han repetido bastantesveces estos trasplantes, como el desarrollo de las bacterias nitrifi­cantes se encuentra favorecido por el medio, terminan por ser lasúnicas que subsisten, evitándose o, por 10 menos, disminuyendo lascontaminaciones. A esta serie de trasplantes, que tienden a aumentaro a enriquecer en un medio de cultivo el número de individuos de unadeterminada especie, suele denomínárseles «cultivos de enriquecí­mientes.

Para el cultivo y aislamiento de las bacterias nítricas puede usarseel siguiente medio sólido:

Nitrito sódico (NaNO,) . . . . .. . . . . 2,0 gramos.Carbonato sódico (Na.CO.) . . . . .. .. . . 1,0 •

Fosfato bipotásico (K,HPO.l . . . . . . . . 0,5

Agar...................................... 15,0

Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 C. C.

El medio esterilizado se coloca en placas de Petri, y una vez solidi- .ficado, se pasa por su superficie una aguja de platino esterilizadaque lleve una gota del cultivo en medio líquido. Las placas inocula­das se incuban a 30° durante dos semanas. La raya inoculada se pre­senta entonces opaca, y en ella se distinguen a simple vista numerosasgotitas redondeadas. Las colonias próximas a la superficie son bri­llantes, ligeramente parduscas, con diámetro de 30 a 5011- y formasvariadas. Las colonias aparecen sobre la superficie como gotas homo­géneas de un diámetro de 100 a 18011-. Sobre agar en bisel, las coloniasson de un blanco sucio, con una gran gota semifluida en la parteinferior.

Como sobre el medio indicado pueden desarrollarse también otrasbacterias del suelo, debe tenerse cuidado para no confundirlas con lasbacterias nítricas. Waksman (102) recomienda seleccionar las colo­nias más pequeñas y combinar el control cuidadoso de la desapari­ción de los nitritos con incubaciones prolongadas de tres semanasa 30°. Las colonias más características se utilizan para el trasplante

32 -

a medios líquidos, empleando las pipetas capilares de Winogradsky,que se obtienen estirando a la lámpara tubos capilares de vidrio.Con la extremidad afilada del capilar esterilizado se toca en la colo­nia elegida, introduciéndola después en el medio líquido, y al golpearligeramente contra el fondo del matraz se rompe dicha extremidad,que queda con el inóculo en el medio líquido. Después de una seriede trasplantes suelen obtenerse algunos que se desarrollan en cultivopuro.

Las bacterias que llevan a cabo la oxidación de los nitritos ennitratos pertenecen al género Nitrobacter Winogradsky 1892, cuyaespecie tipo es Nitrobacter Winogradskyi Buchanan.

Bergey, en su obra citada, reseña las siguientes especies:

1. - Nitrobacter Winogradskyi Buchanan.(Winogradsky, Areh. Sci, Biol., S. Peters., 1: 87; 1892. Buchanan,

Jour. 01 Bact., 3: 180; 1918.)

Bastoncillos cortos, inmóviles, con membrana gelatinosa, de 0,6a 0,8 ¡L x 1 a 1,2 ¡L.

Pueden cultivarse en medios sin materia orgánica.Sobre agar lavado: De siete a diez días, colonias muy pequeñas,

circulares o irregulares, de color pardo claro que tiende a obscurecerse.Sobre gel silíceo: Colonias más pequeñas, pero más densas que

sobre agar lavado.Agar lavado en bisel: De siete a diez días, faja estrecha, agrisada.Caldo mineral: A los diez días, sedimento algodonoso.Oxida los nitritos en nitratos.Aerobia.Temperatura óptima: 250 a 28°.Habitat: Suelo.

2. - Nitrobacter punctatus Sack.(Sack, Centbl, Bakt., H, 62: 20; 1924.)

Bastoncillos largos, inmóviles, de 2 a 3 ¡L de longitud. Gram posi­tivos.

Sobre gelatina: Colonias blancas circulares.Picadura profunda sobre gelatina: Licuación lenta.

Sobre agar nitritos: Colonias blancas circulares, granulares, conborde ondulado.

- 33-

Caldo: No se enturbia.Leche con nitrito y tornasol: Sin cambio.Patata: No se desarrolla.No forma indol.Transforma los nitritos en nitratos.No forma SH•.Hidroliza la celulosa.Puede obtener el carbono del anhídrido carbónico, dextrosa, levu-

losa, lactosa, sacarosa, manita y celulosa, pero no de los carbonatos.Aerobia.Temperatura óptima: 20°.

Habitat: Suelo.

3. - Nitrobacter jlavus Sack.(Sack, Centb], l. BaIlt., 11, 62: 20; 1924.)

Bastoncillos de 0,5 x 2 ¡t, inmóviles. Gram negativos.Picadura sobre gelatina: Crecimiento superficial amarillento. Sin

licuación.Agar nitrito: Colonias circulares, pequeñas, amarillas.Agar en bisel: Línea filiforme amarilla.Caldo: No se enturbia.Leche tornasolada, con nitrito: Sin cambio.Patata: Capa gruesa cremosa.Forma indol.Transforma los nitritos en nitratos.No forma SH•.Hidroliza la celulosa.Puede obtener su carbono del anhídrido carbónico, glucosa, Ievu-

losa, lactosa, sacarosa, manita y celulosa, pero no de los carbonatos.Aerobia.Temperatura óptima: 20°.

Habitat: Suelo.

4. - N iirobacter opacus Sack.(Sack, Centbl. f. Baht., 11, 62: 21; 1924.)

Bastoncillos de 0,2 X 2,0 ¡t, inmóviles. Gram positivos.Gelatina: Colonias circulares color naranja.Picadura en gelatina: Licuación.

- 34-

Agar nitrito: Colonias circulares color naranja.Caldo: Se enturbia y produce sedimento color naranja.Leche tornasolada, con nitrito: Sin cambio.Patata: Capa gruesa, húmeda, color anaranjado rojizo.No forma indol,Transforma los nitritos en nitratos.No forma SR•.Hidro1iza la celulosa.Puede obtener su carbono del anhídrido carbónico, glucosa, 1evu-

losa, lactosa, sacarosa, manita y celulosa, pero no de los carbonatos.Aerobia.Temperatura óptima: 20°.

Habitat: Suelo.

B) BACTERIAS QUE OBTIENEN SU ENERGíA DE LA OXIDACIÓN DEL

AZUFRE Y SUS COMPUESTOS. - Todos los microorganismos necesitanpequeñas cantidades de azufre para la síntesis de su protoplasma. Di­versas bacterias, y aun algunos hongos, parecen ser capaces de oxidarpequeñas cantidades de azufre; pero son pocas las que, como las sulfo­bacterias, actúan sobre cantidades mucho mayores que las necesariaspara elaborar su propia substancia, utilizando el azufre y sus com­puestos como fuente de energía.

Las sulfobacterias, que son capaces de obtener energía de la oxida­ción del azufre y sus compuestos, deben distinguirse de las otras bacte­rias que intervienen en el ciclo del azufre, tales como las que liberanSH. en la hidrólisis de las proteínas o en la reducción de los sulfatos.

De los diferentes grupos de bacterias capaces de oxidar el azufrey sus compuestos, únicamente se encuentran en los suelos las pertene­cientes al género Thiobacillus, que se presentan con gran abundanciaen todos los suelos, sobre todo en los que han recibido como abonoazufre, bien en forma orgánica (aguas residuales de alcantarillado, etcé­tera) o inorgánica.

Del género Thiobacillus se conocen las siguientes especies:

Thiobacillus thioparus Beijerinck.

(Beijerlnck, Centbl. l. Bakt.• n, r r: 593; 1904. Nathanson, Mitt. Zool. Station, Nea­pel, XV: 655; 1903. Düggeli, Die Schwejelba/¡terien. Neujahresblatt Natur], Gesell.,Zuncho año 1919. Suljomonas tbioparus Orla Jen'len.)

Bastoncillos cortos, delgados, móviles, de 0,5 X 3.0 fL.

- 35-

Cultivo en medio líquido. - Como medio de cultivo empleó Beíje-rinck el siguiente:

N~ B.o. . 5H.O ... . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . 5,00 gramos.Na Heo. .... . . .. . . . . . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . 1,00 •

Na. HPO. ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20

NHcCl................................... 0,1

Mg a. 0,1

Agua •.•••....•.•••••.•..••..•.....•• , •. .• 1000 C. C.

El medio, sin esterilizar, se inocula con agua de río o con tierra, yse incuba de 28° a 30°. A los dos o tres días, la superficie del medio secubre con una pe11eu1a de azufre mezclado con bacterias. Haciendoel trasplante al mismo medio se forma la película en veinticuatrohoras.

Cultivo en medio sólido. - En el medio auterior, adicionado conun 2 por 100 de agar, forma colonias amarillas circulares, pequeñas.

Es aerobia y autótrofa, derivando su energía de la oxidación delos tiosulfatos, sulfuros, SR. y del azufre elemental. Reacción óptima:Básica.

Se encuentra en las aguas de mar y de río y en el suelo.

Thiobacillus denitrilicans Beijerinck.

(CenMbl. f. Baht., rr, 11: 597; I904.)

Bastoncillos cortos, de 0,5 X 3 !L de longitud, móviles con ayudade seis a ocho flagelos perítricos.

Cultivo en medio líquido. - Beijerinck empleó el siguiente:

KNO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 gramo~.

Na,CO, .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2

K,HPOc ....•••...............•...•...•.... 0,2

CaCO, 20,0

Azufre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100,0Agua de río o canaL......... .. . . .. .. . . . . . ... 1000 C .c.

El cultivo se hace en frascos, completamente llenos del medio,provistos de tubo de seguridad, incubados a 30°. El desarrollo esescaso.

Cultivo en medio sólido. - Colonias grandes, delgadas, blancas.Es anaerobia y autótrofa, obteniendo el carbono del CO., carbo­

natos y bicarbonatos.Oxida el azufre elemental y los sulfuros.

- 36-

Reacción óptima: pH = 7,9 a 9,1. ídem mínima: pH = 3,5.Se encuentra en las aguas de río y de canal y en el suelo.

Thiobacillus Trautwenii Bergey y col.(Trauwein, Cenibl. l. Bakt., n. 53: 513; 1921.)

Bastoncillos cortos, de 0,5 X 1 a 2 ¡t, móviles. Gram negativos.Cultivo en medio líquido. - No precipita azufre.Cultivo en medio sólido. - Colonias blancas pequeñas, de un milí­

metro de diámetro.Medio de cultivo líquido:

KNO••....................................NaaH P O•..................................

NasSsOs' 5H•O ...........•.................NaHCO•............•.....................

MA·····································Agua destilada .

1,0 gramos,0,2 •

2,0

1,0 •

0,1

1000 C. C.

Medio sólido: El anterior con un 2 por 100 de agar.Aerobia facultativa: Tiene la propiedad de usar los nitratos como

fuente de oxígeno en condiciones anaerobias.Reacción: Límites, pH = 6 Y pH = 10. Óptima: pH = 7,9 a 8,5.Autótrofa facultativa: Oxida los tiosulfatos en ditionatos, tetra­

tionatos y sulfatos, sin precipitar azufre; también puede oxidar elazufre y los sulfuros.

Se desarrolla bien sobre muchos medios orgánicos.Habitat: Aguas de canales y de alcantarillado y en el suelo.

Thiobacillus thiooxidans Waksman y Joffe.(Jout". 01 Bact., 7: 239; 1922.)

•

0,2 gramos.

•0,53,00,25

10.00

1000 C. C.

Bastoncillos cortos, con los extremos redondeados, de 0,5 a 0,8 ¡.&

de longitud, inmóviles. Se presentan aislados o en cadenas cortas.Cultivo en medio líquido. - Como medio líquido, Waksman emplea

el siguiente:(NH.). so•...............................MgSO.· 7H.O .KH.PO•.......•..........................Cael•......•.............................Azufre en polvo , , .. " .Agua destilada .

- 37-

El medio se esteriliza durante treinta minutos en baño de vapor.tres días consecutivos. Cuando el medio se inocula con un cultivofresco de Th. thiooxidans, el desarrollo se manifiesta a los cuatro días,a 25°, por un enturbiamiento uniforme sin formación de película. A losocho días, el cultivo se enturbia fuertemente, y el azufre que flotabaen el medio empieza a depositarse en el fondo.

Si en lugar de un cultivo se utiliza para la inoculación una muestrade suelo que contenga bacterias, el proceso es idéntico, aun cuandose desarrolle con más lentitud.

Como medio sólido puede usarse:

NaaSto, . sHao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 gramos.KHaPO. 3.0

NH.Cl ......................•........ ,... 0,1

CaCl•........... , ,., ,. 0,25

Agar...• ,................................ 20,0

Agua destilada , , .. .. 1000 C. C.

El medio se esteriliza durante quince minutos a una atmósferade presión. Las placas se inoculan con un cultivo líquido y se incubande 250 a 30°. A los cinco o seis días aparecen diminutas colonias de coloramarillo paja o crema, que al microscopio aparecen rodeadas concristales de yeso, procedentes de la acción del HISO. formado so­bre el Ca. El fenómeno es más destacado si se usa fosfato tricálcicoen lugar de cloruro cálcico.

Aerobia.Reacci6n: Límites, pH = 6 YpH = l. Óptima, pH = 2 a 4.Aut6trofa, obtiene su energía mediante la oxidación del azufre

elemental, de los tiosulfatos y, en menor escala, de los sulfuros asulfatos. Utiliza el COI como fuente de carbono, no empleando loscarbonatos.

Hábitat: Suelos de las proximidades de las minas de azufre y suelostratados con azufre.

* • *

Las reacciones desarrolladas en el proceso de oxidación, estudia­das por Winogradsky (107), a partir de H.S, o en condiciones favo­rables a su producción, son las siguientes:

H.S + 1/.o. = H.O + s + 61,1 calorías.S + 1 1/.°. + H.O = H.SO. + 141,2 calorías.

Haso. + CaCO. = CaSO. + H.O + CO•.

Algunas bacterias, como el Th. tbiooxidans, oxidan directamenteel H.S en H.SO., sin formar azufre elemental, mientras que otras,como el Th: thioparus,1iberan azufre alrededor de sus células.

Los tiosulfatos son oxidados por el Th. thioparus de acuerdo conla siguiente reacción (7):

Na. s.0. + ° = Na.SO. + s.

El Th, tIKooxidans los oxida directamente en sulfatos (104):

Na.Sa0. + 20. + lisO = Na.SO. + HaS0•.

El azufre elemental se oxida directamente en ácido sulfúrico:

:aS + 30. + :aBa0 == 2l1sS0,.

En presencia de fosfato tricálcico, el ácido sulfúrico formado reac­ciona, dando primeramente fosfato bicálcico, luego monocálcico yfinalmente ácido fosfórico (102):

Ca. (PO.). + H.SO, + 2H.0 = Ca. (HPO.). + CaSO•. 2H.0.Ca. (RPO.). + R.SO. + 2H.0 = Ca (H.PO.). + CaSO•. 2R.0.Ca (H.PO.). + H.SO. + 2R.0 = 2H.PO. + CaSO•. 2H.0.

Agregando 5 gramos de flor de azufre y 15 gramos de fosfatotricálcico a 100 gramos de suelo, se comprueba que el 85 por 100 delfosfato se ha hecho asimilable al cabo de unas treinta semanas (62).

C) BACTERIAS QUE OBTIENEN SU ENERGiA MEDIANTE LA OXIDA­

CIÓN DE COMPUESTOS SENCILLOS DE CARBONO. - Las bacterias capa­ces de la oxidación de compuestos sencillos de carbono más frecuentesen el suelo son las que pueden oxidar el óxido de carbono formado enlas combustiones incompletas y en la descomposición del estiércol,según la reacción

CO + 1/. O. = COI + 74 calarlas.

y las que oxidan el metano que se produce en la descomposición anaero­bia de la celulosa y otros compuestos orgánicos en los pantanos, es­tercoleros, etc., de acuerdo con la reacción

CH. + 20. = COI + :aR.O + 218 calorías.

Entre las primeras se encuentra la Carboxydomonas oligocarbophila(Beijerinck y Van Delden) Orla Jensen, que se presenta como baston­cillos muy pequeños, de 0,5 X 0,7 a 1 ¡.lo, inmóviles, incoloros, reunidosen masas irregulares por una substancia mucilaginosa.

- 39-

Se desarrolla en medios líquidos desprovistos de materia orgánica,sobre los que forma una gruesa película gelatinosa, yen agar lavadoque contenga las sales minerales necesarias.

Se desarrolla mejor en la obscuridad.Temperatura óptima: 25°.Entre las bacterias del suelo capaces de oxidar el CH, se encuentra

el Methanomonas methanica (S6hngen) Orla Jensen, que se presentaen forma de bastoncillos, de 1,5 a 2 (.L X 2 a 3 (.L, móviles en los cultivosjóvenes por medio de un solo flagelo; en los cultivos viejos parecencasi esféricos.

Cultivado en el siguiente medio, de Sóhngen,

K~PO. ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 gramos.Mg (NH.) PO, • 6Ha0 . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10

CaSO. 0,01

Agua destilada... . . .. 1000 C. C.

en una atmósfera de una parte de CH, y dos de aire, al cabo de dossemanas ha transformado la composición de la atmósfera en la si­guiente (9):

CH, oCO. 78O. 172

También son capaces de oxidar el metano algunas bacterias co­munes, como el Bac. pyoeyaneum y el Bac. [luorescen« líquetaciens(102).

D) BACTERIAS QUE OBTIENEN SU ENERGiA MEDIANTE LA OXI­

DACIÓN DEL HIDRóGENO..- Uno de los gases que se producen abun­dantemente en la descomposición anaerobia de la materia orgánica,además del COI y del CH" es el hidrógeno, existiendo en el suelo va­rias especies de bacterias que lo oxidan según la reacción

H. + 1/.o. = H.O + 68,4 calorías.

Para el estudio de estas bacterias, Niklewski utilizó el siguientemedio (73):

NH,C1 .•• . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 gramos.KH.PO¡ .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 •

:MgSO, • 7Ha0 •....•.. . • . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2

NaHCO................................ I,O

NaCl 0,2

FeCla •. . . • . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o.ooorAgua. . . .. . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . • . 100a C. C.

- 4°-

Para medio sólido, agregar 15 gramos de agar.Los cultivos se colocan bajo una campana de cristal, a través de

la que se hace pasar hidrógeno purificado, desarrollándose los cultivosen tres o cuatro días.

Kaserer empleó un medio formado por (52):

KsHPO, . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 gramos.MgSO, .........•...•..............•.....•.... 0,2 •

NH,Cl....................................... 1,0 •

NaHCO•..................................... 0,5FeCl•...... , ., , .. .. . .. . . .. . . . . . . . . . .. Indicioe.Agua. . . . . • • • • . • • • • . • . . . . • . • . . • • • • • . • . . • . • . • . . 1000 C. C.

En condiciones autótrofas, las bacterias se desarrollan muy len­tamente en este medio: la presencia de pequeñas cantidades de mate­ria orgánica soluble provoca una aceleración en la oxidación del hidró­geno (47).

Entre las bacterias que obtienen su energía mediante la oxidacióndel hidrógeno pueden citarse las siguientes:

Hydrogenomonas pantotropha (Kaserer) Orla ]ensen.(Bacillus pa1JtotroplJus Kaserer, Centbl. Bakt., II, 16: 181; Ig07.)

Se presenta en bastoncillos, de 0,4 a 0,5 fJ. X 1,2 a 1,5 fJ., con extre­mos redondeados, bien aislados o en pares o rosarios; provistos decápsulas; móviles con ayuda de un flagelo polar. Las colonias, en agaro gelatina, son amarillas, lisas, rara vez zonadas concéntricamente overdosas.

Temperatura óptima: 30°.

Hydrogenomonas tntrea Nik1ewski.(Nildewski, Centbl, Bakt., n, 20: 469; 1908.)

Bastoncillos, de 2 fJ. de longitud, adheridos entre sí, no habiéndoseobservado movilidad.

En el medio líquido de Niklewski, antes citado, forma sobre la su­perficie del medio una película que se adhiere a la pared del tubo.

En agar forma colonias superficiales tenues, plegadas, transparen­tes, amarillas en el centro y con ligera fluorescencia. Bajo la superficie .forma con dificultad pequeñas colonias amarillas.

Es microaerofilo, no desarrollándose en atmósferas en las que latensión del oxígeno exceda del 8 por 100.

- 41 -

Hydrogenomonas ¡lava Niklewski.

(Nildewsld, entlbl. Ballt., H, 20: 469; 1908.)

Bastoncillos, de 1.5 1" de longitud, en los que no se observa moví­lidad.

En medio líquido constituye masas gruesas, aplanadas y caseosas,no formando película superficial.

En agar forma colonias pequeñas, lisas, brillantes, amarillas,adherentes al medio. Se desarrolla bien bajo la superficie, pero lascolonias son más pálidas.

Es microaer6filo, no desarrollándose en atmósfera en que la ten­sión del oxígeno exceda del 8 por 100.

Hydrogenomonas pycnoticus Ruhland y Grohmann.[Centbl. Bakt., 11, 61: 261; 1924.)

Bastoncillos, de 1 X 1,5 a 4 IJ., con extremos redondeados, presen­tándose aislados o en cadenas; también se observan formas de invo­lución globosas y ovaladas. gigantes. con paredes gruesas. Móvil conayuda de flagelos perítricos, forma esporas y es Gram negativa.

Las colonias sobre agar son pequeñas, circulares, pardogrisáceas.Temperatura óptima: 200.

Las investigaciones de Ruh1and (84) han probado que la reaccióndel medio ejerce marcada influencia sobre la oxidación del hidrógeno,que tiene lugar entre pH = 5.16 y pH = 9.21, con el máximo, paraun pH, alrededor de 7.

- 42 -

CAPITULO 111

BACTERIAS HETEROTROFAS

1. Fijadoras del nitrógeno atmosférico.

......."... ,

Como ya se ha indicado (primera parte - 29), las bacterias hete­rótrofas, al carecer del poder de síntesis, han de utilizar - para laelaboración de su propio cuerpo y para obtener la energía necesaria almantenimiento de sus funciones vitales - materia orgánica formadapor otros organismos. A estos fines, tales bacterias utilizan compues­tos orgánicos complejos, tales como los proteidos y los productos desu hidrólisis, polipéptidos e incluso aminoácidos, las grasas y ácidosgrasos y los glúcidos, presentando algunas bacterias preferencias pordeterminados grupos, mientras que otras pueden utilizar como fuentede carbono y energía una gran variedad de materias.

El nitrógeno 10 obtienen preferentemente unas bacterias de pro­teínas complejas, albumosas o peptonas, mientras que otras son ca­paces de fijar directamente el nitrógeno atmosférico, Atendiendo aeste modo de adquirir su nitrógeno, pueden clasificarse las bacteriasheterótrofas de la siguiente forma:

l. - BACTF;RIAS FIJADORAS DEL NITRÓGENO ATMOSFÉRICO.

a) B t . tib ,1. - Anaerobias.ac enas f res. ) A bi

( II. - ero las.

b) Bacterias en simbiosis.

2. - BACTF;RIAS AEROBIAS QUE NECESITAN NITRÓGENO COMBINADO.

a) Formando esporas.

b) No formando esporas.

3. - BACTERIAS ANAEROBIAS QUE NECESITAN NITRÓGENO COMBINADO.

- 45-

l. - Bacterias fijadoras del nitrógeno atmosférico.

a) l. - BACTERIAS LIBRES ANAEROBIAS. - (Véase primera parte,páginas 108-113.)

Para el aislamiento de estas bacterias, tuvo Winogradsky la felizidea de utilizar un medio de cultivo desprovisto totalmente de nitró­geno, en el que sólo podrían desarrollarse aquellos organismos capacesde proporcionarse el nitrógeno de la atmósfera. El medio empleadopor Winogradsky (109) fué el siguiente:

Posfato bipotúico lK.HPo.) J ,0 gramos.Sulfato magn~co (MgSO•• ¡HaO) 0,2 •

Cloruro sódico (NaCl) ....• •• .• •• .•... . ..•.. 0,01

Sulfato ferroso (PeSO•. ¡H,O) . . . . . . . 0,01

Sulfato de manganeso (MnSO•••Ha0) .••.•.. O,OJ

Glucosa. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,00

Carbonato cálcico (CaCOs) • . • • . • • . • . . • • . . • • . 30,00

Agua destilada , . .•.. Jooo C. C.

Para evitar la descomposición de la glucosa, conviene esterilizarel carbonato de cal separadamente.

El medio se distribuye en matraces pequeños de 150 c. c. de cabida,llenos hasta el cuello, que se esterilizan a noO durante treinta minu­tos, añadiendo a cada uno de ellos unos 4 gramos de carbonato de cal.

Se prepara un extracto de suelo pasteurizado, para lo cual seponen 50 gramos del suelo en 200 c. c. de agua, calentando lentamentehasta los 80°, temperatura que se mantiene durante quince minutos.Se enfría rápidamente, y mediante pipetas esterilizadas se inoculanlos matraces, poniendo en cada uno de ellos 10 c. c. del extracto desuelo. Se incuban a 25° ó 30°, observándose la formación de abundantesburbujas gaseosas, índice de la fermentación butfrica que se extiendepor todo el líquido, mientras que las partículas de carbonato se recu­bren de un mucílago en el que se encuentran bacterias anaerobiaspertenecientes al género Clostridium, y especie denominada por Wino­gradsky el. pastorianum. El cultivo se enriquece haciendo trasplantessucesivos en el mismo medio, utilizando como inóculo una partículadel carbonato de cal del fondo del cultivo. Las observaciones micros­cópicas hay que efectuarlas en gotas de líquido tomadas del fondo delmatraz con una pipeta esterilizada.

Para obtener cultivos puros se calienta a 750, durante diez minutos,un cultivo enriquecido, con lo que mueren las bacterias que no formanesporas, y este cultivo sirve para inocular trozos de patata, que pre-

1,0 gramoa.1,2 •0,80,21,6

viamente han sido espolvoreados con carbonato de cal y esterilizadosen placas de Petri. Las placas inoculadas se incuban a 300, en condi­ciones anaerobias, en vacío parcial o en atmósfera de hidrógeno, yal cabo de unos seis días pueden observarse sobre la superficie de lapatata colonias amarillentas, redondeadas, llenas de burbujas gaseosas,formadas por Clostridium pastorianum.

Como medio para el aislamiento y cultivo de las bacterias produc­toras de ácido butírico, puede emplearse también el siguiente mediosólido (14):

Glucosa .Peptona Witte.•.•••.•...•.•.............Extracto de carne Liebig .Cloruro sódico (NaCl) ...................•Agar..•..•••.••.••....................•Agua destilada...... .... . .... . .... . ..... 100 C. c.

Reacción Ugeramente alcalina.

Las bacterias del género Clostridium son bastoncillos anaerobioso microaerófilos, que, al esporular, se ensanchan en forma de huso(Clostridium de Fischer) o de palillo de tambor (Plectridium de Fis­cher). Bredeman (14) incluyó en una sola especie, BaciUus amylo­bacter, todas las bacterias que tienen la propiedad de fijar nitrógenoatmosférico y llevar a cabo la fermentación de diversos glúcidos conformación de ácido butírico y alcohol butílico, Aun cuando autorescomo Omeliansky (76) se mostraron disconformes con esta agrupa­ción en una sola especie, de bacterias tales como Clostridium, Granu­lobacter, Plectridium, etc., esta misma norma ha sido seguida porBergey en su Manual, que, como se ve a continuación, incluye en laespecie Clostridium butyricum Prazmowsky una serie de bacteriasdescubiertas por diversos investigadores en diferentes medios y pro­cesos, entre ellas el Clostridium pastorianum, encontrado por Wino­gradsky.

Clostridium butyricum Prazmowsky.(Botan. Zeitung, 37: 409; 1879.)

SINONIMIAS. - Vibl'ion butyrique Pasteur (Compt, Rend., 52: 334; 1861). Bacillusamylobactel' van Tieghem (Bull. Soco Bot, France, 24: 128; 1877). Bacillus butyricusBotkin (Zeit. l. Hyg., II: 421; 1892). Granulobacter sacchal'obutyricum Beijerincky Gl'anulobactel' lactobutyricum Beijerinck (Verhandl. d. K. Ahad. v. Wettmschappen,Tweede Sectie, Deel J, Amsterdam, 1893). Grawulobacter buiylicum Beijerinck(Arch. Neerland., 29, 1896). Clostridium pastorianum Winogradsky (Centbl. Bakt., n,9: 43; 1902). Plectridium plectinovorum Stomer {Centbl, Bakt., H, 13: 171; 1904).Bacillus amylobacter Bredemann [Centbl, Bakt., H, 23: 385; 1909).

- 47-

Bastoncillos, de 0,75 al"" X 3 a 10 "", presentándose aislados,en parejas y en cadenas largas. Pueden producir formas delgadas,de 0,5 "" de ancho. En los cultivos jóvenes se mueven activamentecon flagelos perítricos. Esporas ovales centrales de I X 2 as"". Acu­mula glicógeno en sus células y es Gram positiva.

Picadura profunda en gelatina: No muestra licuación.Colonias en agar-suero (anaerobias): Pequeñas, aplastadas, irregu­

lares, grisáceas, semitransparentes.Colonias en agar simple y glucosado, en bisel (anaerobias): Gri­

sáceas, aplastadas, húmedas, extendidas, con bordes irregulares,laciniados.

Colonias profundas, en cultivos de agar en masa, compactas, de2 a 3 mm. de diámetro, con porción central densa y periferia lanosapoco definida.

I..a picadura profunda en agar muestra un desarrollo filiforme gra­nuloso.

Enturbia el caldo glucosado.Coagulación ácida de la leche tornasolada, con formación abun­

dante de gas y reducción precoz del tornasol.Sobre patata (con carbonato de cal), formación de una película del­

gada, extensa, difícilmente perceptible, en la que posteriormente apa­recen puntos elevados amarillentos. El medio se hace blando y friable,con formación de burbujas gaseosas.

No forma indol.No licüa el suero sanguíneo.Reduce los nitratos a nitritos y amoníaco.Fermenta la glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa y el almidón, con

formación de ácidos, gases y alcoholes, en cantidades dependientesde la temperatura, de la cantidad de hidrato de carbono fermentabley de las substancias nitrogenadas de que disponga. Forma principal­mente ácido butírico, con cantidades menores de ácidos propiónico,acético y fórmico. Los gases formados son COI y H¿ Los alcoholesformados son los butílico, propílico, etílico y trazas de amílico, de­pendiendo de la composición de las substancias fermentadas. De ordi­nario se forman dos partes de alcohol por una de acetona.

Fija el nitrógeno atmosférico.Anaerobia, aun cuando soporte pequeñas cantidades de oxígeno;

con 30 mmgs. de oxígeno por litro las esporas llegan a germinar.Temperatura óptima: 30° a 40°.Reacción mínima: pH = 5. ídem óptima: pH = 6,9 a 7,3.

La presencia del Clostridium en casi todos los suelos del Globo hasido comprobada por diversos investigadores, principalmente porWinogradsky (109), Omeliansky (76), Freudenreich (4I) Hase1hoffy Bredeman (48).

a) n. - BACTERIAS LIBRES AEROBIAS. - En el anterior métodopara el aislamiento de bacterias anaerobias, fijadoras de nitrógeno,la pasteurización o calentamiento del suelo hasta 80° practicada porWinogradsky tenía por finalidad simplificar la flora bacteriana delsuelo eliminando los microorganismos que no eran susceptibles de espo­rular. Beijerinck (6), empleando una tierra de jardín sin pasteurizar,inoculada en un medio sin nitrógeno que contenía manita como fuen­te de carbono, e incubando a 250 ó 30°, encontró una bacteria enforma de bastoncillos bastante anchos y a veces semejantes a levaduras,inmóviles o móviles con ayuda de un solo flagelo polar, aerobia obli­gada, que de ordinario se desarrollaba formando sobre la superficie delmedio de cultivo una película grisácea que más tarde toma color pardo.Beijerinck denominó a esta bacteria Azotobacterchroococcum, compro­bando su presencia en casi todos los suelos ensayados y en el estiércol.

Una porción de la película formada puede trasplantarse a otromatraz con el mismo medio de cultivo:

Manita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20.0 gramos.Fosfato bipotásico (K.HPO,) . . . . . . . . 0.2 t

Agua corriente. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 C. C.

y después de varios trasplantes, se tiene un cultivo suficientementeenriquecido que permite el aislamiento del Azotobacter. Para ello, deun cultivo reciente en que la película formada sea todavía muy del­gada, se toma con el asa de platino una gota, que se diluye en aguaesterilizada, agitando para separar las células bacterianas; a partirde ésta, se hace una segunda dilución, y luego, una tercera, que seutilizan para inocular, en estrías, placas del medio de cultivo, solidi­ficado por la adición de un 2 por 100 de agar. Se incuban las placasa 25°, y a los pocos días aparecen las colonias de Azotobacter, redon­deadas, elevadas, convexas, lisas, pálidas, semiopacas, húmedas yviscosas, a menudo de 4 a 8 mm. de diámetro, que se seleccionan cui­dadosamente con ayuda del microscopio para diferenciarlas de lascolonias transparentes y elevadas del Bacterium radiobacier, que, confrecuencia, acompaña al Azotobacter, y al que a veces cuesta trabajoeliminar en la obtención de cultivos puros.

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En lugar del medio de Beijerinck, puede emplearse cualquiera delos siguientes:

Soluci6n de Lipman (60):Manita. . . .. 15 gramos.K.HPO, 0,2

MgSO, . 7H.O .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . 0,2

CaCl..................................... 0,02

Agua destilada.. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 C. c.PeCI.¡¡: Una gota de solución al 10 por loo.

Una vez disueltas las substancias, se añade la cantidad de soluciónde NaOH, al 10 por 100, necesaria para que la feno1ftaleína tome colo­ración ligeramente rosa.

Soluci6n de Ashby (1):Manita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 gramos.KH.PO, ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 •

MgSO, • 7l1s0 ... . . . . • . . . . . . . . . . . . . • . . . . • . . 0,2

NaCl .............................•....... 0,2

Caso, . 2H.O 0,1

CaCOa • •• •••·· •••• ••••·•••••·•••• ••••••• •• 5,0Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . • . 1000 C, c.

Neutralizar con NaOH como la anterior.

Los cultivos puros de Azotobacter se obtienen fácilmente utilizandoel gel silíceo de Winogradsky, que se prepara partiendo de una solu­ción al 25 por roo, hecha con partes iguales, de silicatos sódico y potá­sico, cuyo peso específico se lleva a 1,06. En una placa de Petri secolocan 5 c. c. de esta solución, agregando una cota de fenolftaleína.Se prepara una solución de ácido clorhídrico al5 por roo, y se va agre­gando al silicato con una pipeta graduada, hasta que desaparezcael color rojo, y se ajusta la solución de HCI de tal modo que 5 c. c. neu­tralicen 5 c. c. de la de silicatos.

Para preparar las placas de gel silíceo se mezclan en un frasco vo­lúmenes iguales de soluciones de silicatos y de HCl, agitando vigoro­samente y vertiendo con rapidez en placas de Petri, que se colocanhorizontalmente hasta que coagule el gel, 10 que tarda de cinco a diezminutos. Luego se llevan a recipientes de poco fondo, donde se dializanen agua corriente hasta la desaparición de los cloruros, lo que requiereunas veinticuatro horas, trasladándolas después a un vaso estéril quecontenga agua destilada hervida, que se renueva varias veces. Des­pués de bien lavadas, se escurren, y se tratan con la solución nutri­tiva que convenga emplear.

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En el caso del Azotobacter, se echa sobre la superficie del gel solu­ción de manita, y se llevan las placas, descubiertas, a una estufa de 60°,para que se evapore el exceso de líquido, cuidando de que el medio nose deseque demasiado (*).

Las placas se inoculan con pequeñas porciones de suelo y se incu­ban a 28°, formándose las colonias de Azotobacter alrededor de laspartículas de suelo, de donde pueden llevarse al medio líquido decultivo.

Las bacterias del género Azotobacter tienen, como hemos indicado,forma de bastoncillos anchos, y a veces redondeada, obteniendo laenergía que necesitan para su desarrollo mediante la oxidación deglúcidos. Son móviles o inmóviles; en el primer caso pueden poseerun solo flagelo polar o un manojo de flagelos también polares.

Varios autores, Beijerinck entre ellos, niegan la formación de espo­ras en este género, mientras que Ashby, Fischer y Krzemieniewskicreen en ella, toda vez que puede resistir la desecación durante pro­longados períodos. Prazmowski (78) demostró que la formación deesporas tiene lugar en condiciones normales, con suficiente aireación,en presencia de humatos. Las principales especies del género Azoto­bacter son las siguientes (9):

Azotobacter chroococcum Beijerinck.

(Centbl. Bahl.• II, 9: 3-43; 1902.)

Bastoncillo, de 2 a 3 '"" X 3 a 6 ,"", presentándose en parejas y paque­tes y rara vez en cadenas. Las células presentan tres o cuatro gránulosrefringentes y están rodeadas de una membrana mucilaginosa de espe­sor variable, que toma color pardusco en los cultivos viejos. La ma­teria colorante es soluble en agua, alcohol, éter y cloroformo. Móvilpor medio de un flagelo polar.

Colonias en gelatina: Pequeñas, circulares, amarillas, granulosas.Con el tiempo toman color pardo amarillento.

Picadura profunda en gelatina: Crecimiento débil. No licúa lagelatina.

Picadura profunda en agar-manita: Gris tendiendo a pardusco.

(.) Los medios silíceos no necesitan esterilizarse, toda vez que los lavados conagua esterilizada, seguidos del empleo de medios muy selectivos, son suficientes paraasegurar la esterilidad en 10 que se refiere a contaminaciones de la atmósfera.

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Caldo: No se desarrolla.Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Patata: Brillante, escasamente perceptible, viscosa y rugosa, pardo

achocolatado.Este organismo fija nitrógeno atmosférico y desprende COI> utili­

zando las siguientes substancias como fuente de energía: glucosa, levu­losa, maltosa, manita, inulina, dextrina, galactosa, arabinosa, lactosa,almidón, glicerol, alcohol etílico, acetatos, butiratos, citratos, lactatos,malatos, propionatos y succinatos.

Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: Se ha comprobado su presencia en casi todos los suelos

con pH superior a 6,0.

Azotobacter agilis Beijerinck.

(Cenlbl. Ballt., 11, 7: 561-582; 1901.)

Bastoncillos, de 4 a 6 ¡.L de longitud, casi esféricos.Muy movible con ayuda de una manojo polar de cuatro a diez

flagelos.Se desarrolla en medios carentes de compuestos orgánicos de ni­

trógeno.Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancoagrísadas, translú­

cidas, con centro blanquecino.Colonias sobre agar lavado: Muestran ligera fluorescencia verde

azulada.Cultivo sobre agar-manita en bisel: Grisáceo, translúcido, fluores­

cente.Cultivo sobre agar lavado, en bisel: Blanco amarillento, liso, bri-

llante, translúcido, con centro opaco.Caldo: Se enturbia, con formación de anillo.Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Cultivo sobre patata: Blanco amarillento, mucilaginoso, tomando

más tarde color pardo amarillento.En presencia de ácidos orgánicos, se forma un pigmento verdoso

o rojizo.Aerobia.Temperatura óptima: 280.

Hábitat: Encontrada en las aguas de los canales de Delft.

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Azotobacter vinelandii Lipman.(New J"5'" Ag«. Ex/!. Sta. RefJ'·, 24: 217-28.5; 1903.)

Bastoncillos, de 2 a 3 !L X 3 a 6 !L. Se presentan aislados, en parejasyen cadenas cortas. Móviles por medio de un flagelo polar.

Colonias sobre agar-manita: Grandes, circulares, blancas, ligera-mente transparentes, con fluorescencia verdosa.

Caldo glucosado: Enturbiamiento con ligero sedimento algodonoso.Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Cultivo sobre patata: Aplastado, amarillento, pasando a pardo

claro.Aerobia,Temperatura óptima: 25°.Habitat: Encontrada en suelos de Nueva Jersey.

Azotobacier Beijerinckii Lipman.(New Jef'sey ACf'. Ex]», Sta. Rep., 24: 217-285. 1903; 25: 237-289, 1904J

Células, de 3 a 4!L X 5 a 6 !L, que se presentan aisladas, en pares o,más raramente, en cadenas. Móviles por medio de un flagelo polar.

Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancas o amarillo deazufre.

Sobre agar-manita, en bisel: Blanco, pasando a amarillo de azufre.Caldo glucosado: No se enturbia. Sobre la superficie flotan peque­

ñas masas circulares blancas.Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Sobre patata: Aplastado, amarillento, brillante, pasando a amarillo

pardusco.Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: Suelo.

Azoiobacter vitreus Lóhnis y Westerman,(Centbl. Bakt., n, 22: 234-254. 1908.)

Células esféricas, de unos 2 !L de diámetro, inmóviles, que se pre­sentan aisladas o en grupos.

Colonias en agar-manita: Pequeñas, circulares, blancas, ligeramentetranslúcidas, brillantes.

Caldo glucosado: Sedimento mucilaginoso.

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Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Patata: Desarrollo ligero, escasamente visible.Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: Suelo.

.. ... *

Además de las bacterias de los géneros Clostridium y Asotobacter,se ha observado en cultivos de otras bacterias existentes en el suelola propiedad de fijar el nitrógeno atmosférico. Entre otras, mencio­naremos el BaciUus asterosporus (Meyer) Migula, que puede fijarde 1 a 3 mgs, de nitrógeno por gramo de glucosa consumido (14);el Bacterium radiobacter (63), y una forma afín al Proteus vulgaris, ca­paz de fijar de 1,8 a 4.7 mgs. de nitrógeno por gramo de azúcar con­sumido (94).

Sin embargo, para Winogradsky, las bacterias fijadoras de nitró­geno, cuya presencia se ha señalado en el suelo, deben agruparse endos categorías:

l." Agentes fijadores neutrales, que comprenden a los dos gruposclásicos del Clostridium pastorianum y Azotobaaer, cuya función nor­mal consiste en la fijación del nitrógeno; y

2." Agentes fijadores artificiales, que comprenden aquellos orga­nismos que pueden fijar pequeñas cantidades de nitrógeno en lascondiciones artificiales del laboratorio. y que no parece tomen parteen el proceso de fijación de nitrógeno del suelo.

b) BACTSRIAS EN SIMBIOSIS. - (Véase primera parte, pagr­nas lI4-II6.) - Poco tiempo después de los trabajos de Hellriegel yWilfarth sobre el origen de las nudosidades de las raíces de las legu­minosas y su intervención en la fijación del nitrógeno atmosférico,consiguió Beijerinck (4) aislar en cultivo puro al microorganismo cau­sante del proceso, que denominó Bacillus radicicola, y que. según él,se encontraba en el suelo en forma de pequeños bastoncillos, capacesde penetrar en los pelos absorbentes de las raíces de las leguminosas,pasando luego al interior de la raíz, evolucionando en bacilos móviles,y posteriormente en bacterioides inmóviles. ahorquillados o ramifica­dos, que funcionan como organismos simbióticos.

A raíz de este descubrimiento se llevaron a cabo numerosas inves­tigaciones. especialmente las de Bewley y Hutchinson (10), y posterior-

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mente las de Thorton y Gangulee (92), que confirmaron la opinión deWinogradsky sobre el ciclo evolutivo que experimentaban las célulasdel Bac. radicicola, tanto en el labotario, en medios de cultivo arti­ficiales, como en su medio habitual de vida, pareciendo existir unarelación entre la alimentación y este ciclo.

A partir de un cultivo joven de Bac. radicicola, se observan las si­guientes fases: Micrococos inmóviles, que al cabo de un cierto tiempocrecen hasta duplicar su diámetro primitivo; células elipsoidales, pro­vistas de un flagelo, que poseen una movilidad extraordinaria, cons­tituyendo 10 que algunos denominaron «fase de enjambres»; bacilosmóviles provistos de flagelos perítricos, que van perdiendo paulati­namente hasta quedar inmóviles, y, finalmente, bacterioides, muchosde ellos ramificados en T o en Y, vacuolados, y presentando el conte­nido protoplásmico concentrado en fajas o bandas transversales.

La multiplicación celular se verifica en dos fases: por biparti­ción de los bacilos móviles o por división múltiple de los bacte­rioides, en la que cada banda protoplasmática da lugar a un nuevoindividuo.

La formación de bacterioides en los medios de cultivo es estimu­lada por la adición de azúcares o pequeñas cantidades de ácidos orgá­nicos de los contenidos en la savia de la planta hospitalaria (89). Laformación de micrococos, que se transforman rápidamente en «enjam­bres», se estimula fuertemente por la adición de fosfatos o de leche.

En el suelo, el Bac. radicicola experimenta las mismas transforma­ciones que en los medios de cultivo, y también aquí viene estimuladala movilidad por la adición de fosfatos. En condiciones favorables dehumedad, temperatura y compacidad del suelo, la forma móvil puededesplazarse con una velocidad de un milímetro por hora.

El modo de penetración del organismo en las rafees ha sido estu­diado por diversos investigadores, y recientemente por Thornton,quien ha podido comprobar que los nódulos no suelen aparecer enla planta recién germinada hasta que se empiezan a formar las hojasverdaderas (91), época en que la planta segrega por sus raíces unasubstancia que estimula la multiplicación de las bacterias a su alrededor.Cerca de la extremidad de los pelos absorbentes se desarrollan pe­queñas colonias de bacterias que segregan una substancia termoesta­b1e susceptible de separarse de las bacterias por filtración (93), queprovoca un crecimiento asimétrico del pelo, a consecuencia del cualéste se riza o encorva, penetrando las bacterias por la región encorva­da mediante un proceso que se ignora. Una vez dentro de la raíz las

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bacterias, se multiplican, formando un filamento o cordón mucilaginosoque se extiende por el parénquima cortical de la raíz, y al llegarjunto a las células de la endodermis excita la multiplicación de lascélulas próximas, iniciándose de este modo la formación de la nudo­sidad, que progresa de modo distinto según la especie de la plantahospitalaria. En los Lupinus y Phaseolus, la infección produce unarápida multiplicación de las células infestadas, dando lugar a la for­mación de la nudosidad, que en estas plantas suele tener su origen enla zona del cambium. En otras muchas plantas, las células infestadasdejan de dividirse, y la nudosidad se origina a expensas de célulasmás externas que no han sido alcanzadas por las bacterias (6<)). Amedida que la nudosidad crece, se forman en ella elementos vascu­lares, unidos a los de la raíz, por los cuales reciben hidratos de carbonolas bacterias.

En todos los tipos de nudosidad, las bacterias se multiplican den­tro del citoplasma de la células hospitalarias, llenándolas por com­pleto y tomando, en su mayor parte, forma de bacterioides, 10 quehace suponer que sean éstos los agentes que llevan a cabo la fijacióndel nitrógeno.

El Bac. radicicol« puede aislarse del suelo o mejor aún de las nudo­sidades, que se esterilizan exteriormente con sublimado corrosivoal 2 por 1.000 durante dos o tres minutos, lavándolas luego variasveces con agua destilada esterilizada, y, finalmente, mediante unavarilla de vidrio esterilizada se machacan en un tubo que contengaun poco de agua esterilizada, utilizando esta agua, que lleva en sus­pensión las bacterias, para hacer las siembras en medio de cultivo,que puede ser el de Ashby (pág. 50) o alguno de los siguientes:

1) Medio a base diJ glucosa (39):

Glucosa ...•.•.......•..•..•.......•....•...•Fosfato monopotásico (KHsP04) ••••••••••••••

Sulfato magnésico (MgS04 • 7H,O) ..•..........Cloruro sódico (NaCl) ' ..•.•.......•....Sulfato ferroso (FeS04) .

Sulfato manganoso (MuSO,) ..............•..•Cloruro cálcico (Caa.) •••••••..• , •.•••..••...•Agua destilada .......•••••.•.•..... , , ...•...

2) Medio a base de manita (IlS):

Manita........••...........................Cloruro sódico (NaCl) •............ " ,Fosfato bipotásico (K,HPO,) .

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ac.oo gramos.1,00 •

0,10 •

Indicios.ídem.ídem.ídem.1000 c. C.

10,0 gramos.0,2 •

0,5 »

Sulfato magnHico (MgSO•• 7Ha0) ...•.•. • . . . . . 0,2 gramos.Sulfato cálcico (caSO•. :lB.O) ..•... . . . . . . • • . . 0,1 •

Carbonato cálcico (CaCOs> . • . . . . . . . . . . . 1,0

Agua de levadura.... . .. . . 100 C. c.Agua destilada , 900 c. c.Agar lavado , . . . . . . . .. . . •. . . . . 15,0 gramos.

Para preparar el agua de levadura se diluye levadura, libre de al­midón, en diez veces su peso de agua corriente; se calienta en baño devapor durante dos o tres horas, agitando de vez en cuando; se esteri­liza durante veinte minutos a r rov, y después de dejarla en reposodurante cuarenta y ocho horas, se decanta el líquido con ayuda deun süón.

3) Medios a base de tI#tl'aetos de leguminosas.

Para su preparación se maceran dos o tres horas 100 gramos desemillas en 1000 c. c. de agua; luego se hierven durante dos horas y sefiltran, añadiendo agua hasta completar los 1000 C. C. y un 1 por 100 desacarosa, 0,5 por 100 de carbonato de cal y 15 gramos de agar,

En lugar del extracto de semillas puede emplearse el de partesverdes y raíces de leguminosas hervidas en agua.

Las bacterias productoras de nudosidades en las leguminosas hanrecibido diversos nombres, según el criterio de clasificación seguido.Beijerinck le dió la denominación de Bacillus radicicola, que Praz­mowski cambió por la de Bacterium radicicola, teniendo en cuenta queno esporulaba, y por tanto, moría a temperaturas entre 600 y 700.

Algunos investigadores las incluyeron en el género Pseudomonas, porel hecho de que varias razas poseen un solo flagelo polar. Finalmente,Smith (88) y Bergey, así como el Comité de la Sociedad de Bacterió­logos Americanos, han concedido prioridad al nombre de Rhizobiumleguminosarum que le dió Frank (38), y que en la actualidad es el másusado.

Las bacterias de las nudosidades presentan particularidades inte­resantes. La primera es que, a diferencia de 10 que ocurre con la ma­yoría de las bacterias del suelo, su presencia en éste es discontinua,encontrándoselas solamente allí donde es, o ha sido, cultivada laplanta hospitalaria; de aquí la necesidad o conveniencia de las inocu­laciones bacterianas en el caso de cultivar por primera vez en unterreno especies leguminosas o en el de cambiar la especie que sevenía cultivando; ya que la segunda particularidad es que no se trata

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de una sola especie bacteriana que pueda producir nudosidades encualquier especie de planta leguminosa, sino que existen razas ovariedades (especies para algunos) cada una de las cuales sólo pro­duce nudosidades en determinados géneros y especies de leguminosas.

Ya en 1888 reconoció Beijerinck que no todas las estirpes de bac­terias de nudosidades eran idénticas, y llegó a distinguir siete varie­dades. Hiltner y Stórmer (49), basándose en estudios culturales ymorfológicos, distinguieron dos grupos de bacterias: Rae. radicicolaque se desarrollaba bien en medios ge1atinados y producía nudosida­des en los géneros Pisum, Vicia, LathyYus, Pbaseolu«, Trijolium, etcé­tera, y Bac. Beijerinckii, que se desarrollaba mal en medios gelatina­dos y formaba nudosidades en los géneros Lupinus, Ornithopus yGlycine; grupos que tuvieron que subdividir posteriormente.

Utilizando la reacción de aglutinación Zipfel (II6), llegó a la con­clusión de que las bacterias productoras de nudosidades en distintosgrupos de plantas leguminosas no eran razas ni variedades de una solaespecie bacteriana, sino especies diferentes; hipótesis que parece con­firmada por diversos investigadores que han utilizado los métodosserológicos para el estudio de las bacterias simbióticas.

Waksman (102) establece los siguientes doce grupos de plantasleguminosas, cada uno de los cuales posee su raza propia de bac­terias incapaz de formar nudosidades en las plantas de los res­tantes grupos:

GRUPO 1. - Trifolium pratense, Tri]. hybridum, Tri]. alexandrinum, Tri]. incarna-tum, T'ri], repens, Tsi]. medium

GRUPO II. - Melilotm alba, Mel. ofjicinalis, Medicago saiioa, Med. hispida, Medica-go lupulina, Tvigonella jCllnum-grt1Jcum.

GRUPO III. - Vigna sinensis, Cassia chamt1Jcrista, Aracbis hipogea, Lespedezastriata, Mucuna milis, Baptisia tinetoria, Desmodium caneseens, Acacia armata,Genista linctoria, Phaseolus lunatus.

GRUPO IV. - Pisum satiuum aruense, Vicia vil/osa, Vico satioa, Vico faba, Lenssculenta, Lathyrus latifolius.

GRUPO V. - G/ycine hispida (Soja máxima).GRUPO VI. - Phaseolus vulgaris y Pbas. muitiflorus.GRUPO VII. - Lupinus perennis y Ornithopws satiua.GRUPO VIII. - Amphicarpa monoica.GRUPO IX. - A mot1>ha canescens.GRUPO X. - Strophostyles keloola.GRUPO XI. - Robinia pseudoacacia.GRUPO XII. - Dale« alopecuroides.

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Bergey, en su M anual, que venimos siguiendo para la descripciónde las especies bacterianas del suelo, incluye las bacterias de las nudo­sidades en el género Rhizobium Frank, con seis especies.

Género Rhizobium Frank, 1889.

Pequeños bastoncillos, móviles cuando jóvenes, que presentanabundantes formas ramificadas características cuando se desarrollanen condiciones adecuadas. Son bacterias aerobias estrictas, capacesde fijar el nitrógeno atmosférico cuando se desarrollan en medioscon hidratos de carbono y carentes de compuestos nitrogenados orgá­nicos. Ocasionan la formación de nudosidades en las raíces de las plan­tas leguminosas. La especie tipo es Rhizobium leguminosarum Frank.

1. - Rhizobium leguminosaTum Frank.

(Landw. ja1J1'b., 19: 523; 1890.)

Bastoncillos aislados, de I,2 a 3 1" de longitud, y ejemplares enforma de Y. Dentro de los bastoncillos se desarrollan formas secunda­rias, bacterioides, que se tiñen de amarillo con el yodo. En las nudosi­dades sobre las raíces de las leguminosas se observan filamentos, de losque proceden los bacterioides. Móvil con flagelos perítricos.

Sobre caldo de guisantes gelatinado que contenga asparagina sedesarrolla en forma de colonias blanquecinas de superficie brillantey mucilaginosa. La substancia mucilaginosa se tiñe de amarillo con elyodo y no presenta las reacciones de la celulosa. La gelatina se licúaa veces.

El desarrollo sobre agar-manita es rápido, con tendencia a exten­derse. Los cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semi­translúcidos, blancos, mucilaginosos y a veces viscosos, formándoseabundante goma.

En caldo: Sedimento mucilaginoso.Ligera producción de ácidos en medios con glucosa, galactosa,

manosa, lactosa y maltosa.Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: En las nudosidades de LathYTUS, Pisum, Vicia y Lens.

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2. - Rhizobium trifolii Dangeard.(1.1 BottZf'isú, Ser. 16: 1-27°; 1936.)

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. Los bacterioides delos nódulos son en forma de pera, hinchados y vacuolados.

El desarrollo sobre agar-maníta es rápido.Las colonias son blancas, enturbiándose con la edad, Mucilaginosas.

Produce grandes cantidades de goma.Ligera producción ácida en medios con glucosa, galactosa, manosa,

lactosa y maltosa.Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: En las nudosidades de las raíces de plantas del género

Trifolium.

3. - Rhizobium phaseoli Dangeard.(Le Botaniste, Ser. 16: 1-27°; 1926.)

SINONIMIAs. - Rhi:obíu," F"a"lJii varo ,"a;M Schneíder: Rhízobium Fran1Jii variedadmillM Schneíder (Bull. Torr. Bot. Club, 19: 203; 1892).

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. Los bacterioides tie­nen ordinariamente forma de bastoncillos, a menudo vacuolados.

El crecimiento sobre agar-manita es rápido, con tendencia a exten­derse. Los cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semi­translúcidos, blancos, mucilaginosos.

Formación ácida muy ligera en medios con glucosa, galactosa,manosa, sacarosa y lactosa.

Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: En las nudosidades de las raíces de Phaseolus vulgaris,

Phaseolus angustifolia y Phaseolus multillorus.

4. - Rhizobium meliZote Dangeard.(Le Botanist», Ser. 16: 1'270; 1926.)

SINONIMIA. - Rhilobiu," ,"utahíl/! Schneíder (Bull. Torr, Bot, Club, 19: 203; 1892).

Bastoncillos móviles con flagelos perítrícos. Bacterioides mazudosy ramificados.

El crecimiento sobre agar-manita es claramente rápido. Cultivos

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en estrías, elevados, brillantes, opacos, blanco perlino, mantecosos.Forma mucha goma.

Formación ácida en medios con glucosa, galactosa, rnanosa ysacarosa.

Aerobia.Temperatura óptima: 25°,Habitat: En las nudosidades de las raíces de plantas de los géneros

Melilotus, Medicago y Trigonella.

5. - Rh~'zobium radicicola (Beijerinck) Bergey y col.(Bacillus radicicola Beijerinck, Bot. Zeit., 46: 726; 1888).

SINONIMIAS. - Bacterium radicícola Prazmowsld (Landw. Vers-siat., 37; 1890). Phyto­mixa leguminosarum J. Scbróter (Krytogamen Flora, v . Schlesien de Cohn, 3; 1889).Pseudomonas radicicola G. T. Moore (Bull., 71, U. S. Dept. Agric. Bur. PlantIndustry, 1905).

Bastoncillos aislados o en parejas, frecuentemente hinchados en unextremo o en la parte central, que se tiñen desigualmente. Muy movi­bles con ayuda de un solo flagelo polar. Segregan una substancia rnuci­lagínosa.

Sobre agar-glucosa, cenizas: Colonias circulares elevadas, húmedas,blancas, brillantes y enteras.

Sobre agar-maltosa, cenizas: Colonias húmedas, brillantes, trans­parentes, pasando con el tiempo a translúcidas, blancas, mucilaginosas,con tendencia a extenderse,

En agua con maltosa y cenízas produce enturbiamiento con sedi-mento mucilaginoso.

Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: Forma nudosidades en las raíces de especie de Lupus, Soja

y Ornithopus.

6. - Rhizobium iaponicum (Kirchner) Baldwin y Fred.

(Kirchner, Beitrage sur Biol, d. P/lanzen de Cohn, 7: 213; 1895.

Baldwin y Freed., [our. Bact., 17: 141; 1929.)

Bastoncillos móviles con flagelos monótricos,El desarrollo sobre agar-manita es lento y escaso. El cultivo en

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estría es ligeramente elevado, brillante, opaco, blanco, mantecoso,con ligera formación de goma.

El crecimiento es mayor sobre pentosas que sobre hexosas.Hay lenta producción ácida en medios con xilosa y arabinosa.Aerobia.Temperatura óptima: 25°.Habitat: Produce nudosidades en las raíces de Soja máxima.

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CAPITULO IV

BACTERIAS HETEROTROFAS (Continuación)

2. Que necesitan nitrógeno combinado.

Aerobias: a) Esporógenas.b) No esporógenas.e] Termófilas.

d) Desnitrificantes.

l. - Bacterias heterótrofas aerobias, - Estas bacterias intervienenen numerosos procesos del suelo, sobre todo en los de demolición de lamateria orgánica, en sus tres familias de prótidos, glúcidos y lípidos.La extremada complejidad de estos procesos, algunos poco o nadaestudiados, y el extraordinario número de tales bacterias, las másabundantes del suelo, han tenido como consecuencia que los conoci­mientos que se poseen sobre ellas y sobre sus actividades fisiológicassean muy incompletos y desordenados.

De acuerdo con el sistema de clasificación enunciado (pág. 45),las dividiremos en dos grupos, según que formen o no esporas. Te­niendo en cuenta que entre las bacterias heterótrofas se conocenalgunos grupos que, como las termófilas y las desnitrificantes, poseencaracterísticas definidas, los estudiaremos separadamente al finaldel capítulo.

a) Qu Jo: FORMAN ESPORAS. - Las bacterias esporógenas se des­arrollan con extraordinaria actividad cuando el suelo recibe materiaorgánica rica en proteidos; pero a medida que ésta va siendo consu­mida, decrece su actividad, terminando por formar nuevamente es­poras, en cuyo estado permanecen hasta que vuelven a presentarsecircunstancias favorables para su desarrollo. Debido a que se desarro­Han fácilmente sobre los medios habituales de agar y gelatina, sobrelos que forman grandes colonias características, son, probablemente.las bacterias heterótrofas mejor estudiadas.

Algunas especies, como el Bacillus myeoides, el Bae. cereus y elBae. megatherium, se encuentran en casi todos los suelos examina­dos (36 y 50); Ford y sus colaboradores (37) aislaron 520 cultivos debacterias esporógenas de ocho muestras de suelo, de las que cinco

- 65-

fueron tomadas cerca de Baltimore (Maryland) y tres en Nazareth.Las muestras de suelo fueron hervidas en agua durante veinte minu­tos, antes de las siembras en placas de Petri, con el fin de matarlas células vegetativas de las bacterias y otros organismos del sueloy conservar solamente las esporas. El resultado de las determinacionespracticadas en los cultivos fué el siguiente:

z _

NUMERO DE COLONIAS

ESPECIE BACTERIANA EN sum.o EN SUEI,O

DE BAI:l'IMORE DE NAZARE'l'B

TO'tAL. o. o' o, •••••••••• o......... 306

Badllus cereus. o •••• o ••••••••••••••••• o •••••••••

Bae. petasites o •• o •••• o •• o •

Bac, ~gatJaerium o ••••••••••••••••

Bac, subtilis o ••••••• o •••••••••••••••••••••

Bae. mesefltericus o o o o ••

Bae. vulgatus. o o" o' o ••• o •• o • o ••••••••• o o' •• o • o •

Bae. m"coideso. o •••••• o o o o o o o o • o • o o ••• o •••• o •• o •

Bae. ~sC1ltericus. varo flavus o' o ••••••••••••• 1

Bac. cereus, varo flUOl'escefls .Bae. fusif01'mis o • o ••••••••••••••••••••••••••••••

Bae. brevis o •••••• o ••••••••••••••••• o o •

Bac. simple:ro o ••••• o •••••••••••••••••••

Bac. cohaet'efls........ . . . . . . • . . . . . . . . . . • . . . . . . • .

Bac. agrio ..•.............. o •••••••••••••••••••

134

732924

912

15t

33

•1

1

2

41116

139

11

62

9

t

2

3t

2

•214

Waksman (102), tomando como base los trabajos de Ford y suscolaboradores, establece la siguiente clasificación de las bacteriasesporógenas:

1. - GRUPO subtilis.

Organismos pequeños, homogéneos, móviles con lentitud, midien­do 0,4 !J. X 1,5 a 2,5 !J.. No forman filamentos en agar-glucosa. Espo­ras ovales, centrales o excéntricas, midiendo 0,5 !J. X 0,75 a 0,88 !J.,

conservando a menudo restos de protoplasma. En medios sólidospresentan colonias duras y penetrantes; en medios líquidos formannata pegajosa. Gram positivos.

- 66-

Bacillus subtilis Cohn. (Bergey, 385.) (*)

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.., .":.1.' . .. '

Bacillus subtilis viscosus Chester.

Caracterizado por la viscosidad.

Colonias sobre agar: Extendidas, grisáceas, amiboideas con bor,Q.es. -.festoneados. , . ~~,1~

Picadura en gelatina: Crecimiento superficial blanquecino. I..icua-ción estratiforme o saculiforme. .... ~

n. - GRUPO mesentericus.

Organismos pequeños, homogéneos, móviles con rapidez, midien­do 0,5 f.L X 2 a 4 f.L. Sobre agar-glucosa forman con frecuencia largosfilamentos. Las esporas son centrales, ovales; miden 0,5 f.L X 1 a 1,2 f.L,

Y conservan residuos de protoplasma. En medios de cultivos sólidosforman masas pultáceas con tendencia a arrugarse; en medios líquidosforman una nata friable que se rompe fácilmente. Gram positivos.

Bacillus vulgatus (Flügge) Trevisan. (Berg., 404.)[Bac, mesentericus vulgaJus Flügge.)

Colonias sobre agar: Circulares, homogéneas, refringentes.Picadura en gelatina: Licuación crateriforme.

BaciUus mesentericus (Flügge) Migula. (Berg., 405.)(Bac. mesenterieus fuscus Flügge.)

Colonias sobre agar: Circulares, refringentes, extendidas, enteras.Picadura en gelatina: Licuación crateriforme, pasando a estrati­

forme.

BaciUus aterrimus Lehmann y Neumann. (Berg., 411.)(Bac. mesente,.icus nige,. Lunt.)

Colonias sobre agar: Circulares, planas, amorfas, mantecosas. Elmedio de cultivo se obscurece.

Picadura en gelatina: Licuación rápida, crateriforme.

(*) Las citas entre paréntesis se refieren a la página del M anual de dete,.minaciónbacteriolágica, de BltRGEV (tercera edición), en que aparece descrita la especie.

- 67-

Baciüus globigii Migula. (Berg., 409.)(Bae. mesentericus ruber Globig.)

Colonias sobre agar: Blancas, blandas, amiboideas, extendidas.Picadura en gelatina: Ligero desarrollo superficial. I ..icuación es­

tratiforme.

Bacillus niger Migula. (Berg., 4II.)(BM. lactis niger GorinL)

Colonias sobre agar: Circulares, elevadas, amorfas, con margen on­dulado.

Picadura en gelatina: Licuación.

Baeillus panis Migula. (Berg., 419.){Bac, mesentericus panis viscosus Vogel.)

Carece de movilidad.Colonias sobre agar: Pequeñas, grises, ligeramente irregulares,

translúcidas, elevadas, viscosas.Picadura en gelatina: I ..icuación infundibuliforme, pasando a estra­

tiforme.

lII. - GRUPO cohaerens-simplex.

Organismos móviles, algo mayores que Bae. meseniericus o Bae. sub­tilis, midiendo 0,37 a 0,75 fL X 0,75 a 3 fL. Sobre agar-glucosa se pro­ducen formas más gruesas y largas. Son frecuentes formas de involu­ción que aparecen precozmente. Las esporas son cilíndricas, y mi­den de 0,56 a 0,75 fL X 1 a 1,5 fL. En medios sólidos crecen formandomasas blandas; en medios líquidos, enturbiamiento con nata ligera() nula. Gram positivos.

Baeillus cohaerens Gottheil. (Berg., 393.)

Colonias sobre agar: Circulares, blanco amarillentas, plegadas.Picadura en gelatina: Crecimiento superficial irregular blanqueci­

no. I ..icuación crateriforme lenta.

Bacillus simplex Gottheil. (Berg., 392.)

Colonias sobre agar: Delgadas, arniboideas, translúcidas.Picadura en gelatina: Crecimiento superficial blanquecino. Licua­

ción estratiforme.

- 68-

Bacillus agri Ford y col. (Berg., 408.)

Colonias sobre agar: Pequeñas, grises, húmedas, elevadas, brillan­tes, pestañosas.

Picadura en gelatina: Licuación infundibuliforme.

Bacillus asterosporus (Meyer) Migula. (Berg., 413.)

Colonias sobre agar: Circulares o irregulares, ligeramente elevadas,amarillas, concéntricas.

Picadura en gelatina: Licuación infundibuliforme.

Bacillus teres Neide. (Berg., 407.)

Colonias sobre agar: Gris azuladas, finamente granulares.Picadura en gelatina: Crecimiento superficial blanco agrisado. I.í­

cuación estratiforme.

IV. - GRUPO mycoides.

Organismos grandes, con extremos rectangulares, que crecen for­mando cadenas largas. Las células miden 0,5 (J. X por 3 a 6 (.'. Sobreagar-glucosa tienden a ser de mayor tamaño y presentan estructuraglobular. Presentan tendencia a crecer formando curvas o espirales.Las esporas son centrales o excéntricas, redondas, ovales o cilíndricas,de 0,75 a 1 (.' X 1 a 2 f.l.. En medios sólidos presentan colonias secas ypenetrantes; en medios líquidos, nata gruesa y consistente. Grampositivos.

Bacillus mycoide Flügge. (Berg., 386.)

Acumula grasas en sus células como substancias de reserva.Colonias sobre agar: Grisáceas, extendidas, rizoideas.Picadura en gelatina: Desarrollo arborescente en la picadura. Li­

cuación saculiforme.

Bacillus pransnitzii Trevisan. (Berg., 488.)(Bac. ramosus liquejaciens Pransnitz.)

Colonias sobre agar: Grises, filamentosas, extendidas.Picadura en gelatina: Desarrollo arborescente en la picadura. Li­

cuación infundibuliforme.

- 69-

Bacillus adhaerens Ford y col. (Berg., 420.)Inmóvil.Colonias sobre agar: Grisáceas. extendidas, filamentosas, con por­

ción central elevada pardoamarillenta.Picadura en gelatina: Licuación lenta infundibuliforme.

V. - GRlJPO cereus.

Organismos móviles grandes, con extremos redondeados, de0,75 IJ. X 2,25 a 4 IJ.. Tienden a crecer en cadenas cortas. Sobre agar­glucosa, las células son más gruesas y largas, transformando el pro­toplasma en cuerpos globulares. Esporas cilíndricas, centrales o ex­céntricas, de 0,5 a 0,75 IJ. X 1,12 a 1,5 !L. Las esporas conservan proto­plasma en uno o en los dos extremos, pareciendo a menudo esporasampliadas de subtilis o mesentericus. En medios sólidos forman unamasa pultácea blanda, con tendencia a replegarse o a arrugarse; enmedios líquidos, nata gruesa friable. Gram positivos.

Bacillus cereus Frank1and. (Berg., 386.)

Colonias sobre agar: Circulares, enteras, elevadas, densas y refrin­gentes.

Picadura en gelatina: Licuación crateriforme o saculiforme, pasan­do a estratiforme.

Bacillus ellenbachensis Stutzer. (Berg., 387.)

Colonias sobre agar: Blancogrisáceas, grasientas, brillantes, circu­lares, con bordes indefinidos.

Picadura en gelatina: Licuación napiforme, pasando a saculiforme.

Bacillus albolactis Migula. (Berg., 398.)

Colonias sobre agar: Circulares o irregulares, blancas, elevadas yalabeadas.

Picadura en gelatina: Licuación crateriforme.

Bacillus cereus varo fluorescens Ford. y col. (Berg., 396.)

Colonias sobre agar: Irregulares, extendidas o amiboideas, trans­lúcidas, levemente elevadas, verdeamarillentas.

Picadura en gelatina: Licuación saculiforme, El medio líquido tomacoloración pardoamarillenta.

-70 -

VI. - GRUPO megatherium:

Organismos muy móviles y de tamaño grande: 0,75 a 1,25 (..1. X 3a 9 (..l.. Frecuentemente se producen formas largas, que se extienden,pierden su citoplasma y presentan en la periferia masas de proto­plasma. El protoplasma se convierte rápidamente en cuerpos globu­lares muy refringentes, sobre todo en cultivos en agar-glucosa. Apa­recen precozmente formas opacas y transparentes. Las esporas pue­den ser centrales, excéntricas o subterminales, ovales o cilíndricas,de 0,75 a 1,12 J.L X 1,5 a 2 J.L. Las esporas presentan formas muy varia­bles: unas veces, redondas; otras, rectangulares, y a veces, arriñona­das. En medios sólidos crecen formando gruesas masas pultáceas; en me­dios líquidos, enturbiamiento con nata escasa o nula. Gram positivos.

Bacillus megatherium De Bary. (Berg., 396.)

Colonias sobre agar: Circulares, enteras, gruesas, de color blanco ocrema.

Picaduras en gelatina: Crecimiento superficial blanco agrisado.Pequeñas colonias blancas en la picadura. Licuación crateriforme osaculiforme.

Bacillus petasites Gottheil. (Berg., 393.)

Colonias sobre agar: Circulares, gruesas, color blanco o crema, pa­sando a pardoamarillento.

Picadura en gelatina: Crecimiento superficial amarillento. Licua­ción crateriforme lenta.

Bacillus ruminatus Gottheil. (Berg., 402.)

Colonias sobre agar: Circulares o extendidas, blancas, opacas, hú­medas, brillantes y elevadas.

Picadura en gelatina: Licuación infundibuliforme.

VII. - GRUPO DE ESPORAS TERMINALES REDONDAS.

Organismos pequeños muy móviles, de 0,5 a 0,75 (Jo X 1,5 a 3 J.L,

que en los cultivos viejos suelen formar largos filamentos. Protoplas­ma homogéneo. Esporas terminales o subterminales, redondas, másgruesas que el organismo en que se forman, midiendo de 1 a 1,5 J.L dediámetro. Gram positivos.

-71 -

Bacillus pseudotetanicus (Kruse) Migula, (Berg., 416.)

Colonias sobre agar: Circulares o amiboideas, densas, con tenden­cia a engrosar, blancoamarillentas.

Picadura en gelatina: Ligero crecimiento superficial, a veces des­arrollo arborescente en la picadura. Licuación lenta (doce días).

Bacillus fusiformis Gottheil. (Berg., 409.)

Colonias sobre agar: Circulares, gruesas, blancas, opacas, extendi­das, filamentosas.

Picadura en gelatina: Licuación infundibuliforme.

VIII. - GR{;PO DE ESPORAS TERMINALES CILíNDRICAS.

Organismos pequeños y delgados, muy móviles, de 0,37 a 0,5 [L X 2,5a 4 (L. Ligeramente mayores en agar-glucosa, pero sin variar el carácterdel protoplasma. Esporas terminales, cilíndricas, de 0,75 11. X 1,12a 1,5 (L. Gram positivos.

Bacillus circulans ]ordan. (Berg., 417.)

Colonias sobre agar: Circulares, enteras o aserradas, blancas o ama­rillo pálido.

Picadura en gelatina: Sin licuación. Crecimiento superficial, escasoo nulo.

Bacillus breois Migula. (Berg., 406.)

Colonias sobre agar: Circulares, enteras, extendidas, delgadas,translúcidas.

Picadura en gelatina: Licuación crateriforme a infundibuliforme.

Bacillus terminalis Migula. (Berg., 412.)

Colonias sobre agar: Pequeñas, circulares, enteras, agrisadas.Picadura en gelatina: Licuación crateriforme.

IX. - GRUPO DE ESPORAS CENTRALES.

Organismos muy móviles, largos, puntiagudos, de 0,37 a 0,5 [L X 1,12a 4 [L. Ligeramente mayores en agar-glucosa, pero sin cambiar el ca­rácter del protoplasma. Las esporas se desarrollan en el centro de losbastoncillos, que toman forma de husos. Esporas grandes, cilíndricas,de 0,6 a 0,8 !l. X 1,12 a 1,5 [L.

- 72 -

Bacillus centrosporus Ford y col. (Berg.• 395.)

Colonias sobre agar: Circulares, enteras, translúcidas.Picadura en gelatina: Licuación napiforme.

Bacillus laterosporus Ford y col. (Berg., 399.)

Esporas centrales en un costado.Colonias sobre agar: Irregulares, planas, transparentes, húmedas,

con brillo metálico.Picadura en gelatina: Licuación crateriforme lenta.

b) QUE NO FORMAN F..5PORAS. - Las bacterias heterótrofas aero­bias no esporógenas viven por lo general en la película de agua querodea las partículas del suelo, y la mayor parte de ellas se desarrollanmal y muy lentamente en los medios de cultivo usados en los labo­ratorios. De aquí que, a pesar de ser las más numerosas de las bacte­rias del suelo, sean las peor estudiadas y conocidas de todas, sabiéndosemuy poco respecto a sus actividades fisiológicas y a su papel en losprocesos del suelo. La escasa información que se posee sobre estasbacterias parece indicar que intervienen en la descomposición lenta,pero continua, de la materia orgánica del suelo que ha sufrido ante­riormente el ataque de las bacterias esporógenas y hongos del suelo,liberando el nitrógeno y los otros elementos minerales bajo forma asi­milable para los vegetales superiores.

La mayor parte de estas bacterias forman colonias minúsculasen los cultivos en agar y en gelatina, que algunas licúan rápidamente,como Pseudomonas [luorescens (Flügge) Migula, cuya presencia hasido señalada en casi todos los suelos del Globo.

Otras licúan muy lentamente la gelatina o son incapaces de ello,formando colonias puntiformes en agar y desarrollándose pobrementeen todos los medios líquidos de cultivo, lo que dificulta los estudiosfisiológicos. Cohn (20), fundándose en su modo de desarrollarse en elsiguiente medio sintético:

NH4H2POt . . . . • • • . . • . . • . . . . . . . . . . . 1,0 gramos.KC\ . 0,2

:MgS04 ........................•.. . 0,2

Sacarosa.. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0

Agua....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. 100 C. c. pH = 7,0,

divide estos microorganismos en los cinco grupos siguientes:

- 73-

I. - Organismos que forman bastoncillos cortos, de menos de0.5 !1. de diámetro, inmóviles o con uno o dos flagelos polares, que nomuestran tendencia a variar morfológicamente, pero son muy irre­gulares en su comportamiento fisiológico (licuación de la gelatinay desprendimiento gaseoso con los nitratos).

n. - Organismos que un día ° dos después de sembrarlos en unmedio nuevo se presentan como bastoncillos cortos, de menos de0,5 fL de diámetro, pero al poco tiempo se acortan y toman aparienciade micrococos. Licuan la gelatina lentamente. El Bae. globilorme Cohnpuede considerarse como tipo de este grupo.

IIl. - Bastoncillos cortos, con tendencia a formar filamentos lar­gos, a veces ramificados.

IV. - Organismos que en cultivos jóvenes presentan principal­mente formas ramificadas, en apariencia producidas por la germina­ción de pequeñas artrósporas esféricas. A los pocos días desaparecenlas formas ramificadas, presentándose las cocoideas.

V. - Organismos que se presentan normalmente como cocos, perocon tendencia a producir bastoncillos y filamentos, después de algu­nos días de desarrollo, en los medios corrientes de cultivo.

Las bacterias de los dos primeros grupos son las más abundantesen el suelo, sobre todo las del segundo, que predominan en los suelosfértiles, y que pueden considerarse como indicio de la existencia denitrógeno en forma asimilable. Las del quinto grupo son más abun­dantes en el estiércol que en el suelo.

Den Dooren de Jong (25) encontró como bacterias del suelo másactivas en la descomposición de material orgánico las siguientes, men­cionadas en orden de actividad decreciente: Pseudomonas jlaoree­cens (Flügge) Migula, Pseudomonas putida Migula, Mycobacteriumphlei (Moeller) Bergey y col., Bacterium prodigiosum Lehmann yNeumann, Sarcina lutea Schroter, Proteus vulgaris Hauser y Aero­bacter aerogenes (Kruse) Beijerinck, y las bacterias del género Proto­aminobacter, que atacan preferentemente a las substancias que con-

Ctienen el grupo HN <C .

e) BACTERIAS TERMÓFILAS. - Se denominan así aquellas bacte­rias capaces de desarrollarse a temperaturas de 70°. Estas bacteriasse encuentran en el cieno de los ríos, en las aguas residuales del al­cantarillado, en el polvo, en el suelo y en el estiércol, siendo las cau­santes de la combustión espontánea del algodón y del heno. Ne­gre (71) ha encontrado bacterias termófilas en las arenas del Sáhara,

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no habiéndose encontrado en los suelos forestales. Su presencia en elsuelo debe ser debida, en gran parte, al estiércol usado como abono.En los cultivos en placa de suelos de jardín muy estercolados, del5 al 10 por 100 de las colonias formadas son de bacterias termófilas,mientras que en suelos de campo a 10 sumo llegan al 0,25 por 100,

y los suelos incultos, por 10 general, carecen de ellas. Pringsheim (79)señaló la existencia de bacterias termófilas, desarrollándose a 610 encultivos mezclados, que eran capaces de fijar cantidades apreciablesde nitrógeno.

Bergey (8) reseñó como desnitrificantes las siguientes bacteriastermófilas aerobias aisladas del suelo: Bac. thermodiastaticus, Bac. ther­mononliquefaciens, Bac. nondiastaticus y Bac. lobaius. Las dos pri­meras reducen activamente los nitratos a nitritos, mientras que lasdos últimas 10 hacen ligeramente. En el estiércol encontró una bacte­ria termófila desnitrificante: Bac. thermoliquejacien«.

Coolhass (21) encontró en el suelo otra bacteria termófila, Bacte­rium thermoamylolyticus, reductora de los nitratos a nitritos, capaz dehidrolizar el almidón y que descompone los azúcares y el glicerol, condesprendimiento de COI y H•.

Entre las bacterias termófilas del suelo citadas por Blau (12) seencuentran: Bac. cilindricus y Bac. tostus, que hidrolizan el almidón,y Bac, robustus y Bac. calidus, que carecen de esta propiedad, noejerciendo ninguna de las cuatro acción reductora sobre los nitratos.

En el estiércol encontraron Damon y Feirer (24) las siguientesbacterias esporógenas anaerobias: Clostridium thermoaerogenes y Clos­tridium thermoacidojilus, reductoras de nitratos, y Clostridium thermo­putrijicum, sin propiedades reductoras.

La naturaleza del medio parece ejercer influencia sobre la tempe­ratura óptima para el desarrollo de las bacterias termófilas, pudiendoprosperar en el suelo a temperaturas más bajas que en los medios decultivo artificiales.

d) BACTERIAS DESNITRIFlCANTES. (Véase primera parte, pági­nas lI8-I20.) - Se desconocen numerosas bacterias capaces de llevara cabo la reducción de los nitratos a nitritos; pero son en número re­ducido las que en condiciones de anaerobiosis pueden utilizar los ni­tratos y nitritos como fuente de oxígeno para sus necesidades vitales,llevando a cabo su reducción a óxidos de nitrógeno o nitrógeno libre.

Maassen (65) realizó ensayos inoculando diversas especies de bacte­rias en un medio de cultivo líquido que contenía un 5 por 100 de pep-

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tona y Un 0,5 por 100 de nitrato sódico. De las 109 especies ensayadas,85 redujeron el nitrato a nitrito; 46 llevaron la reducción hasta laformación de amoníaco, y solamente 4 se mostraron como desnitrifi­cantes verdaderas, continuando la reducción hasta el desprendimientode nitrógeno libre.

De las experiencias realizadas se deduce que la reacción del medioejerce influencia sobre el proceso de reducción de los nitratos, que enmedios alcalinos se detiene en la formación de nitritos y en mediosácidos llega hasta la formación de amoníaco. En todos los casos, lapresencia de oxígeno libre en cantidad suficiente inhibe la reducciónde los nitratos.

Bacterias reductoras de nitratos a nitritos se han aislado enhabitats muy variados. Por ejemplo: Eberthellatyphi (Schróter) Bucha­nan, Eberth, tarda Assis, Eberth, enterica (Ford) Bergey y col., Esche­richia coli (Escherich) Castellani y Chalmers = Bae. eoli Migula yVibrio eomma Schroter = Spirillum eholerae asiatiehae Flügge, en elcanal intestinal del hombre; Hemophilus influenzae (Pfeiffer) Comitéde la Sociedad Americana de Biólogos, Klebsiella pneumoniae Tre­visan = Bacterium pneumoniae Migula y otras, en el aparato respi­ratorio; Stapbylococcus aureus Rosenbach y Staph. epidermidis Ber­gey y col., en la piel y membranas mucosas. En el agua se han encon­trado, entre otras: Achromobacter liquidum (Frankland) Bergey y col. yFlauobacterium caudatum (Wright) Bergey y col.; y en el aire: Mi­eroeoccus conglomeratus Migula y Mieroe. percitreus Bergey y col.

En el suelo se han señalado un número muy elevado de especiesbacterianas capaces de reducir los nitratos a nitritos. Entre ellas pue­den mencionarse las siguientes: Sarcina tutea Schroter; especies delgénero Serratia Bizio propiamente tales; Flauobacterium diffttsum(Frankland) Bergey y col. y Flavobae. rigensis Bergey col.; Pseudo­monas [luorescens (Flügge) Migula, Pseudo boreopolis Gray y Thorntony Pseudo striata (Ravenel) Chester; Achromobacter iophagum. (Grayy Thorton) Bergey y col., Achrom. geminum (Ravenel) Bergey y cola­boradores, Achrom, eycloelastes (Gray y Thorton) Bergey y colabora­dores, Achrom, rathonis íd. íd, Achrom. pietorum íd. íd., Achrom. des­molyticum íd. íd., Y Aehrom. globijormi« (Cohn) Bergey y col.; Esehe­riehia [ormica (Omeliansky) Bergey y col.; y numerosas especies delgénero Bacillus, entre las que se encuentran: Rae. subtilis (Ehren­berg) Cohn, Bae. cereus Frankland, Bae. myeoides Flügge, Bae. ellen­bachensis Stutzer, Bae. clostroides Gray y Thorton, Bac. albus (Sack)Bergey y col., Bae. albolaetis (Lóffler) Migula, Bae. ruminaius Gottheil,

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Bac, hesmogenes (Rubentschick) Bergey y col., Bae. panís (Vogel)Migula, Bae. aurantius (Sack) Bergey y col., etc.

Entre las bacterias desnitrificantes verdaderas, capaces de libe­rar nitrógeno libre, se encuentran las siguientes:

Flavobaeterium denitrijicans (Lehrnann y Neumann) Bergey y co­laboradores = Bacillus denitrifieans 1 Burri y Stutzer (Centbl. Bakt.,JI, 1: 356, 1895; Bergey, Manual, 141.)

Achromobacter stutzeri (Lehmann y Neumann) Bergey y colabora­dores = Bacillus denitrificans II Burri y Stutzer (Centbl. Bakt., H,1: 362, 1895; Bergey, Manual, 207.)

Achromobacter agile (H. Jensen) Bergey y col. = Bacillus dem­trijicans agilis Ampola y Garino. (Centbl. Bakt., H, 2: 670-676, 1896;Bergey, Manual, 205.) = Bae. denitrijicans Migula. (System derBakteriem, 796, 1900.)

Achromobacter hartlebii (H. Jensen) Bergey y col. = Baeillushartlebii H. Tensen. (Centbl. Bakt., I'I, 4: 449, 1898; Bergey, Ma­nual, 206.)

Pseudomonas denitrifieans Bergey y col. = Bae. denitrijicansfluoreseens Christensen, (Centbl. Bakt., H, II: 190, 1903; Bergey,Manual, 174.)

Flavobacterium schirokikhi (H. Jensen) Bergey y col. = BacteriumsehirokikM H. Jensen. (Schirokikh, Centbl. Bakt., H, 2: 205, 1896;H. Jensen, Centbl. Bakt., H, 4: 4°9,1898; Bergey, Manuai, 131.)

Achromobacter filifaeiens (H. Jensen) Bergey y col. = Bacteriumfilifaciens H. Jensen. (Centbl. Bakt., JI, 4: 4°1, 1898; Bergey, Ma­nual, 233.)

Se encuentran en el suelo bacterias que, como las del grupo Thioba­eillus denitrifieans Beijerinck, en anaerobiosis, son capaces de oxidarsubstancias inorgánicas (azufre, sulfuros, tiosulfatos) con el oxígenode los nitratos que reducen a nitrógeno libre.

Según Gerretsen (42), en el suelo puede llevarse a cabo la descom­posición de la celulosa por la acción de dos especies bacterianas ensimbiosis, una de las cuales reduce los nitratos a nitrógeno libre, mien­tras la otra efectúa la descomposición de la celulosa. Los productosde esta descomposición son utilizados como fuente de energía por lasbacterias reductoras de los nitratos, a la vez que el oxígeno procedentede esta reducción es utilizado por las bacterias demoledoras de lacelulosa, que de este modo pueden soportar la anaerobiosis,

-77-

CAPITULO V

BACTERIAS HETEROTROFAS (Continuación)

3. Bacterias anaerobias que necesitan hidrógeno combinado.

BACTERIAS DESTRUCTORAS DE LA CELULOSA:

a) Anaerobias.b) Aerobias.c) Termófilas.d) Desnitrificantes.

3. Bacterias anaerobias. - No se conoce ninguna bacteria abso­lutamente anaerobia, es decir, que sólo pueda vivir y desarrollarse entotal ausencia de oxígeno (pág. 13). Las anaerobias estrictas parecenestimuladas por la presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre,aun cuando pueden vivir en total ausencia de este gas.

La primera generación de una bacteria anaerobia, en cultivo, esmás sensible a la presencia de oxígeno que las generaciones siguientes,y dentro de una generación, toleran peor el oxígeno en las primerasedades del cultivo.

McLeod y Gordon (68) han destacado la incapacidad de producircatalasa de las bacterias anaerobias. En el desarrollo aerobio de lasbacterias se forma peróxido de hidrógeno, que sería perjudicial paraellas de no existir la catalasa, que desdobla el peróxido en agua y oxí­geno inactivo. Al carecer las bacterias anaerobias de la capacidad deformar catalasa, cuando se desarrollan en condiciones aerobias estánsometidas a la acción perjudicial del agua oxigenada. El efecto nocivodel aire sobre las bacterias anaerobias en estado vegetativo se hacepatente con una exposición de sólo cuarenta minutos, mientras queen las esporas no se manifiesta al cabo de tres horas (2 y 27).

Las bacterias anaerobias intervienen en el suelo en un número con­siderable de importantes procesos, algunos de los que hemos mencio­nado ya, y entre los que merecen destacarse: formación de amoníacoa partir de los proteidos; fijación del nitrógeno atmosférico por bac­terias libres, más intensa, probablemente (77), que la llevada a cabopor bacterias aerobias, y descomposición de celulosa, peptinas yproteidos.

El solo carácter de anaerobias no sirve para caracterizar bacteriasque difieren tan fundamentalmente en su metabolismo, como lasque obtienen su energía de la celulosa, las que toman su nitrógeno delnitrógeno atmosférico, las que pueden obtener oxígeno de los nitratos

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y sulfatos o las que ocasionan el desprendimiento de olores pesti­lentes de las proteínas complejas. Mientras que el anhídrido carbó­nico es el gas principal producido por las bacterias aerobias, las anaero­bias se caracterizan por originar diversos gases, tales como el metanoy el hidrógeno en la descomposición de los glúcidos; el ácido sulfhí­drico en la reducción de los sulfatos; óxidos de nitrógeno y nitrógenolibre en la reducción de los nitratos; determinadas aminas, hidrógenosulfurado, nitrógeno y sus óxidos y mercaptanes, como resultantesde la descomposición de los proteidos. Además, las bacterias anaerobiasforman ácidos acético, butfrico, propiónico, fórmico y láctico, alco­holes etílico y butílico, y en algunos casos, acetona.

De entre los varios sistemas de clasificación de las bacteriasanaerobias del suelo, reproducimos el siguiente, propuesto por Waks­man (102):

l.-Bacterias que actúan principalmente sobre hidratos de carbono:

l. - Bacterias que utilizan ampliamente hidratos de carbono sencillos yalmidones como fuentes de energía, denominadas por varios auto­res sacarolíticas, A este grupo pertenecen las bacterias butíricasclasificadas de ordinario como una sola especie: Bacillus amy1o­bacter A. Meyer y Bredemann. Estas bacterias descomponen losazúcares, con formación de ácldo butírico y gases.

a) Bacterias. fijadoras de nitrógeno: C10stridium pastorianum \Vlno­gradsky (Bae. amylobaeter van Thieghem, Bae. amyloeymePerdrix, Bae. butyrieus Botkln, Granulobaeter saccarobuty­rieum Beljerinck, Bac, orthobutilieus Grimbert, Ctostridiumamerieanum Prlngshelm, Bae. amylobaeter A. M. Y Bred.), yformas afines encontradas prácticamente como abundantesen casi todos los suelos. Este organismo o grupo ha sido clasi­ficado por Bergey como Clostridium butyricum Prazmowsky­y por Lehmann y Newmann, como Bac, pastorianum Wino,gradsky.

b) Bac. welchii Migula (Bae. aerogenes capsulatus Welch y Nutall,Bae. perfringens Veillon y Zuber, Bac, enteritidis sporogenesKleín). Bastoncll1os cortos, de 4 a 8 fL X 1 a 1,5 fL, aislados oen parejas, inmóviles, que forman esporas ovales, centraleso excéntricas, encapsulados. Encontrada repetidas veces enel suelo y en las aguas residuales.

2. - Bacterias que descomponen los compuestos péctícos,

a) Grupo del Bac, amylobaeter. que Incluye al Clostridit4m pastorianum(igual que 1, a)). Las formas que ocasionan el enriado del linohan sido descritas con nombres diversos, entre ellos el Plec­tridium de Pribes y Wlnogradsky, el Clostridium de Behrens­el Plectridium peetinOlJorum de Beijerinck y van Delden,

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b) Bae. 'elsi"eus Carbone. Bastonclllos. de 0,3 a 0.4 ¡Jo X 3 a 5 ¡Jo,

que se presentan aislados. en pares y en cadenas, móviles conflagelos perítrícos, Esporas ovales. terminales. Gram positivos.No producen ácido butirlco en el enriado del lino.

3. - Bacterias que descomponen la celulosa.

a) Bacterias anaerobias que descomponen la celulosa a la temperatu­ra ordinaria. Entre ellas se encuentran las productoras dehidrógeno y de metano, de Omeliansky; el Bac. celluloslBdissolvem Khouvíne, y otras.

b) Bacterias termófilas: Clostridium tllMmocellum Víljoen, Fred yPeterson.

H.-Bacterias que actdan principalmente sobre los prótidos.

l. - Formas fuertemente proteolítícas.

a) Bac. sporegmes Metchnikoff (Clostridium sporogenes (Metchni­koff) Bergey y col). Bacilo móvil, con flagelos perítricos, Grampositivo. con extremos redondeados, de 3 a 7 ¡¡. X 0.6 a 0,8 v..Una de las bacterias más fuertemente proteolíticas que se co­nocen. Descompone los prótidos con formación de gas, enne­grecimiento del medio y producción de un olor marcado. Lasesporas. subtermínales, se forman pronto. Se encuentra abun­dantemente en el suelo. estiércol. polvo yaguas residuales.

b) Bac. oedemaJis maligni Koch (Vibrion septique Pasteur, Clostri­diu", oedematis maligni (Koch) Bergey y col.]. Encontradoen el intestino del hombre y en el suelo. Descompone los pro­tidos con formación abundante de gas. sin ennegrecer elmedio.

c) Bao, putrilieus Bienstock (Clostridium putrificus Bergey y col.).Bacilo con flagelos perítricos, móvil. Forma esporas ovales,grandes, terminales. Posee propiedades sacarolítícas débilesy descompone fuertemente los prótidos, con ennegrecimientodel medio y desprendimiento de olor fétido. La leche es dige­rida gradualmente. sin coagulación rápida.

d) Bac, lIistolyticus Weimberg y Seguin {Clostridium !IistolyticumBergey y col.), Baci~o de 3 a 5 V. X 0.5 a 0.7 JJ.. móvil con fla­gelos perítrícos, que se presentan aislados o en parejas, Des­compone los prótidos sin desprendinrlento de gases. ennegre­ce el medio y posee olor nauseabundo. Este organismo ha sidoaislado del suelo por Peterson y Hall.

e) Bao, botulinus van Ermengen (Clostridium botulinum Bergeyy col.). Bacilos gruesos. con extremos redondeados y esporasovales subterminales. Descompone los prótidos con forma­ción de gases y ennegrecimiento del medio. El habitat naturalde esta especie está extendido por todo el mundo. tanto en lossuelos vírgenes y forestales como en los cultivados.

2. - OrganialDOll d~bilmalte proteoItticoe.

a) BtU. bi/~ Tialder Y Harte11y (Clostridi"m bi/lnflftlafls(Tissier y Harte11y) Bergey Y col.). Bacilos de 5 a 6 J.L X 0.8

a 1 ¡.t. inmóviles. presentlindoee aislados o en cadenas cortas.Esporas ovales. centrales. Los bastond1los no engruesan alesporular. Produce 'cldo y gas con los hidratos de carbono.Descompone los prótidos con desprendimiento gaseoso y en­negrecimiento del medio. Puede desarrollarse hasta los 50".

b) BtU. teIMIi NiClO1aier (ClosIridiNm úta.i (Nieolafer) Holland).Bacl10s móviles. con flagelos perítrícos, de 4 a 8 J.L x 0.4 a 0,6 ¡.t,

iDcapaces de utilizar los hidratos de carbono. Ennegrecen elmedio de cultivo. Puan al suelo con el estiércol. habiendo sidocomprobada su existencia en muchas muestras de suelo.

Se han alslado del suelo o de otras fuentes, que pueden iD·díear un habitat en él, bacterias anaerobias de escaso poder pro­teolítíeo, pero capaces de atacar a diversos hidratos de carbonocon formación de gas, y tales como B(I.C. cJiauvei Arloing, Come­vin y Thomas (Clostridium cJiauvei (Arloing, Comevin y Thomas)Holland).

I1I.-Bacterias que obtienen su oxígeno de sales minerales.

l. - Bacterias reductoras de nitratos.

2. - Bacterias reductoras de sulfatos.

Las bacterias anaerobias pueden llegar a alcanzar en el suelocifras muy elevadas. del orden de los 10 millones por gramo de tierrade jardín. El gran número de bacterias anaerobias que se encuentranen los suelos forestales (de 500.000 a 5 millones por gramo de suelo)merece particular atención, así como la de las fijadoras de nitrógenoanaerobias (de 100 a 10.000 por gramo de suelo). Las bacterias fija­doras de nitrógeno aerobias, o faltan totalmente en los suelos fores­tales, o están en número muy reducido, 10 que prueba (30 y 32) elpapel de las bacterias anaerobias para la fijación del nitrógeno atmos­férico en estos suelos.

Bacterias destructoras de la celulosa. - Estas bacterias han sidoobjeto de particular atención a causa de que la celulosa es el materialorgánico más abundante entre los que recibe el suelo y a que existenbastantes bacterias que pueden desarrollarse utilizando la celulosacomo material energético, y algunas son incapaces de emplear otrafuente de energía.

Las bacterias destructoras de celulosa pueden dividirse en lossiguientes cuatro grupos: anaerobias, aerobias, termófilas y desni-

trificantes, de los que el primero parece ser el de mayor importan­cia (80 y 1I3) en los procesos que se llevan a cabo en el suelo.

a) BACTERIAS ANAEROBIAS DESTRUCTORAS DE LA CELULOSA. - Alfrente de este grupo deben figurar las bacterias, ya clásicas, aisladaspor Omeliansky (75) a fines del siglo pasado: Bac. methanigenes Lehmanny Neumann y Bac. lossicularum Lehmann y Neumann, que fueronlas primeras bacterias que se demostraron definitivamente capacesde descomponer la celulosa en forma de papel de filtro o de algodón.

Ambos organismos se encuentran en aquellos sitios donde. encondiciones anaerobias, se destruyen tejidos vegetales, por ejemplo,en el estiércol o en el cieno de los pantanos y ríos.

Para su aislamiento, Omeliansky empleaba estiércol de caballo ocieno del río Neva, inoculados en frascos completamente llenos deun medio que contenía, además de papel de filtro. los siguientes ele­mentos:

Fosfato bipotásico (K.HPO&) . . . . . . . . . . . r ,0 gramos.Sulfato magnésico (MgSO& . 7H.0) 0,5 •Sulfato amónico (NHa). SO& , . . . . r.oCarbonato cálcico (CaCO,) ...•....... " . . . .. . .. 10,0

Cloruro sódico (NaCl) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Indicios.Agua destilada , , . . .. . . . . . . . . . . . . .. 1000 C. C.

El sulfato amónico puede ser reemplazado por una cantidad igualde fosfato amónico, de peptona o de asparagina.

Los frascos inoculados se incuban a una temperatura de 34° a 35°.Al cabo de unos ocho días empieza el desprendimiento de gases de lafermentación, que, al principio, consisten en una mezcla de hidrógeno,metano y anhídrido carbónico; pero que después de varios resiembrosen medio nuevo, terminan por contener una mezcla de metano yanhídrido carbónico, en la proporción de 3 a 1 cuando los cultivos sonjóvenes.

En esta fase, cuando el gas desprendido no contiene hidrógeno, elcultivo es casi puro, pudiendo ser aumentada su pureza mediante pas­teurizaciones realizadas antes de los resiembros, siempre que las espo­ras del fermento metánico estén formadas. Por este medio se destru­yen los organismos contaminadores que no formen esporas.

Examinando al microscopio un cultivo obtenido de este modo, seobserva que contiene unos bacilos delgados, de 0,4 !J. X 5 \L, que secolorean fácilmente y se encuentran en gran número depositadossobre las fibras de celulosa, por 10que muchos de ellos están curvados

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y conservan la forma de la sección de la fibra aun después de separa­dos de ésta mediante lavados. A medida que el cultivo envejece yavanza la destrucción de la celulosa, los bacilos se alargan hastaalcanzar una longitud triple de la primitiva, empezando apercibirseun engrosamiento en uno de los extremos, que se tiñe más intensa­mente, constituyendo finalmente una espora esférica de 1 ¡Jo de diá­metro, en cuyo momento el Bae. methanigenes presenta su aspectomás característico.

La destrucción de la celulosa puede seguirse microscópicamente.Al iniciarse el ataque, el papel de filtro toma una coloración anaran­jada o amarilloanaranjada, apareciendo con numerosos agujeros ylos bordes corroídos. Finalmente pierde su estructura fibrosa y seacumula en el fondo del frasco en forma de un sedimento negruscoo anaranjado. El proceso de la destrucción es lento y puede durarvarios meses. Durante el período de fermentación vigorosa, el des­prendimiento de gases varía de 3,5 c. c. a 15 c. c. por gramo de celu­losa. Además de los gases indicados, durante la fermentación se for­man ácidos grasos volátiles.

Con el Bac,methanigenes aparece asociado el Rae. tossicularum, quedesprende hidrógeno durante la fermentación de la celulosa. Sus es­poras germinan mucho más lentamente que las del primero, hecho quefué aprovechado por Omeliansky para su separación. Como hemosindicado, en el primer cultivo preparado para el aislamiento del Ba­eillus methanigenes, el gas desprendido contenía hidrógeno y metano.Si dicho cultivo, poco tiempo después de iniciado el desprendimientogaseoso, se calienta durante quince minutos a una temperaturade 75°, las células del bacilo metánico procedentes de la germinaciónde las esporas quedan destruidas, mientras que las esporas del pro­ductor de hidrógeno, que no han germinado todavía, permanecen vi­vas. Repitiendo esta operación en tres o cuatro generaciones sucesi­vas se llega a obtener un cultivo que sólo desprende hidrógeno yanhídrido carbónico, en el que se encuentran bacilos de 0,5 !.lo X 4 a 8 ¡Jo

de longitud en los cultivos jóvenes, y en los viejos pueden alcanzarde 10 a 15 ¡Jo de longitud. Las esporas, esféricas y terminales, son demayor diámetro que en el Bac. methanigenes, midiendo 1,5 ¡Jo de diá­metro. Al igual que este último, las células vegetativas no toman conel yodo la coloración azul o púrpura característica del Rae. amylobacter.

La fermentación hidrogenada de la celulosa progresa más lenta­mente que la metánica, y a la temperatura óptima (35°) puede con­tinuar ininterrumpidamente durante más de un año. El gas, hidr6-

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geno y anhídrido carbónico, se forma con más lentitud; aproximada­mente, 8 c. c. por gramo de celulosa en las veinticuatro horas. Ade­más de los gases mencionados, durante la fermentación se formanácidos acético y butírico, trazas de ácido valérico y alcoholes superio­res, así como pigmentos y substancias aromáticas, que dan al cultivoun aroma parecido al del queso.

Ni el Bac. methamgenes ni el Bac. fossicularum han podido obte­nerse en cultivos puros en la forma habitual, ya que ninguno de losdos se desarrollan en los medios sólidos ordinarios a base de agar ogelatina, habiendo fracasado todos los intentos en este sentido.

En 1923, Khouvine (56) describió otro organismo anaerobio des­tructor de la celulosa aislado del intestino del hombre: el Bac, cellulosaedissolvens Khouvine (Clostridium dissolvens (Khouvine) Bergey y cola­boradores), interesante porque, además de otros productos, suministraalcohol etílico en proporción de un 8 por 100 de la celulosa fermen­tada. Morfológicamente, el Bac. cellulosae dissolvens se parece mucho alBac. [ossicularum, del que se diferencia por sus esporas, ovales enlugar de esféricas y de mayor tamaño: 2 ¡L X 2,5 ¡L. Este organismose desarrolla bien hasta en temperaturas de 57°, y a este respecto,representa una fase de transición hacia las bacterias termófílas. Fuécultivado en un medio líquido conteniendo substancias fecales comofuente de nitrógeno: las bacterias se adhieren fuertemente a las fibrascelulósicas del papel, 10que permite separarlas de las contaminacionesque son arrastradas al lavar el papel con la solución de sales esteri­lizada.

En la fermentación de la celulosa, único hidrato de carbono al queataca, además de hidrógeno y anhídrido carbónico, se forma ácidoacético y butírico, alcohol etílico y un pigmento pardoamarillento.Únicamente se recupera, en los productos de la fermentación aislados,el 55,15 por 100 del carbono fermentado. Madame Khouvine cree que elresto se encuentra en el líquido de fermentación en forma de hidratosde carbono solubles, que son capaces de ser absorbidos por elintestino.

Este organismo se ha encontrado también distribuido abundante­mente en toda clase de suelos.

En el conducto intestinal de las larvas de Potosea cuprea Fabr., aislóWerner (106) un organismo anaerobio, Bac. cellulosam [ermentans(Clostridium werneri Bergey y col.), capaz de atacar rápidamente ala celulosa, ayudando así al insecto en su proceso digestivo. Otrosinvestigadores han señalado también la naturaleza anaerobia de las

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bacterias que descomponen la celulosa en el aparato digestivo de loscaballos, ganado, termites y larvas de insectos.

b) BACTERIAS AEROBIAS DESTRUCTORAS DE CELULOSA. - El pri­mer microorganismo de este tipo fué descrito por van Iterson (95),bajo el nombre de Bac. lerrugineus (CeUulomonas [errugínea Bergeyy col.), como un delgado bacilo, muy movible, no esporógeno, que seencuentra en el suelo de jardín, en el humus, en las hojas secas, etc.

Puede obtenerse colocando en un plato un trozo de papel de filtro.que se espolvorea con fosfato amónico magnésico, se cubre con otrotrozo de papel, se humedece con una solución al 0,05 por 100 de fos­fato bipotásico, se inocula con tierra de la indicada anteriormente yse incuba a 28°.

A los cuatro o cinco días aparecen sobre el papel unas manchaspardoamarillentas; en ellas, el papel va siendo descompuesto en unasubstancia mucilaginosa, en la que, observada al microscopio, seadvierten diversos microorganismos, entre los que predominan dostipos: el ya mencionado Bac. lerrugineus y una forma cocoide grande.En una fase más avanzada de la descomposición, los restos de lasfibras aparecen envueltos en una masa mucilaginosa de micrococos.Van !terson atribuyó la descomposición de la celulosa al Bac. lerrugi­mus, y consideró la forma cocoide como un organismo en simbiosiscon aquél, que aun cuando por sí solo es incapaz de atacar a la celu­losa, ayuda al primero a destruirla.

Durante una investigación sobre la descomposición aerobia de lacelulosa en los suelos de Rotbamsted, Hutchinson y Clayton (SI). ais­laron un microorganismo aerobio Spirochaeta cytophaga Hutchinsony Clayton, muy semejante al Bac. lerrugineus. utilizando una solu­ción de sales minerales inoculada con suelo, en la que estaba introdu­cido parcialmente un trozo de papel de filtro. Al cabo de cuatro o seisdías de incubación a 25°, aparecían en el papel, en la parte no sumer­gida, pero próxima al líquido, unas manchas pardoamarillentas, en lasque el papel iba perdiendo consistencia. y donde se podía observar,con ayuda del microscopio, que contenía bacilos delgados y cocos detamaño grande. Tras de muchas tentativas consiguieron un cultivolíquido en el que sólo se encontraban bacilos; pero los resiembros enmedio nuevo, al cabo de algunos días, presentaron nuevamente laasociación de cocos y bacilos, 10 que hizo que Hutchinson y Claytonconsiderasen a los primeros como una fase del ciclo evolutivo del or­ganismo.

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En los cultivos jóvenes de Spirochaeta cytophaga predomina laforma de bacilos de 0,3 a 0,4 lA. por 3 lA. de longitud, afilados en losextremos y frecuentemente encorvados. Aun cuando no se han podidoobservar flagelos, los bacilos presentan un movimiento de rotaciónlento, pero marcado. Son muy flexibles, tomando a menudo formasde S,de O ó de U; a medida que el cultivo envejece va siendo más fre­cuente la forma de cocos, o dase esporoide•. Los esporoides miden 1,5 lA.

de diámetro, y se tiñen mucho más intensamente que los bacilos. Losesporoides no pueden considerarse como esporas, ya que basta paradestruirlos el calentamiento a 600 durante diez minutos.

Winogradsky (n3), posteriormente, en un estudio sistemático dealgunas bacterias aerobias del suelo destructoras de celulosa, estable­ció los siguientes géneros:

Género Cytophaga Winogradsky, 1929.

Bastoncillos largos, flexuosos, con extremos afilados, conteniendogránulos metacromáticos, Incapaz de usar como alimento substan­cias carbonadas, con excepción de la celulosa que hidroliza. Su des­arrollo sobre los medios de cultivo habituales es lento.

La especie típica es Cytophaga hutchinsoni Winogradsky, que fuéel organismo descrito por Hutchinson y Clayton como Spirochaetacitophaga.

l. - Cytophaga hutchinsoni Winogradsky.

Bastoncillos de 0,3 a 0,4 lA. X 3 a 8 IA., aislados o en cadena, que setiñen con dificultad, pero presentan gránulos fuertemente teñidos.Gram, negativa. Reproducción probable por los gránulos teñidos( ¿artrósporas ?). 1,0s cultivos viejos presentan formas cocoidesgrandes.

Se desarrolla en gel silíceo y ataca la celulosa en este medio, for-mando grandes colonias mucilaginosas de color naranja.

Aerobia facultativa.Temperatura óptima: 20°.

Habitat: Suelo. Desintegra las fibras vegetales.

2. - Cytophaga aurantiaca Winogradsky.

Bastoncillos largos, de 1 lA. X 6 a 8 IA., puntiagudos, inmóviles. Gramnegativos.

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Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias de color rosa na­ranja.

3. - Cytophaga rubra Winogradsky.

Bastoncillos largos, de 0,4 !L x 3 ¡.t, ligeramente curvados, con unpequeño gránulo cerca de cada extremo. Movilidad no demostrada.Gram negativo.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas rojas.

4. - Cytophaga lutea Winogradsky.

Bastoncillos de 0,4 !L por 3 !L. Gram negativos. No se ha aislado encultivo puro.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas, ama­rillo brillante.

5. - Cytophaga tenuissima Winogradsky.

Más tenue que las otras especies.Forma colonias mucilaginosas color verde oliva sobre el gel silíceo

con celulosa.

Género Cellvilwio Winogradsky, 1929.

Bastoncillos largos, ligeramente curvos, con extremos redondeados.Muestran gránulos, que se tiñen fuertemente (¿artrósporas?), que pa­recen relacionados con la reproducción. Móviles con flagelos polares.Oxida la celulosa formando oxicelulosa. Sobre medios ordinarios decultivo muestra crecimiento débil.

La especie tipo es Cellvibrio ochracea Winogradsky.

1. - Celloibrio ochracea Winogradsky.

Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, de0,5 !L X 2,5 a 5 !L, raramente en espiral. Móviles. Oram negativos.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilagino­sas, color ocre claro.

2. - Cellvibrio flavescens Winogradsky.

Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, congránulos metacromáticos, Oram negativos.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilaginosas,color amarillo claro.

Género Cell/alcicula Winogradsky, 1929.

Bastoncillos cortos, que no exceden de 2 IL, puntiagudos, con grá­nulos metacromáticos. Los cultivos viejos presentan formas cocoideas.Móviles con un flagelo polar. Oxida la celulosa y la transforma enoxicelulosa.

La especie tipo es Cellfalcic'ula viridis Winogradsky.

1. - Cellfalcicula viridis Winogradsky.

Bastoncillos curvos, rollizos, de 0,7 IL X 2 IL, con extremos ligera-mente puntiagudos. Móviles. Gram negativos. .

Forma colonias difusas, mucilaginosas, de color verde, sobre gelsilíceo con celulosa.

2. - Cellfalcicula mucosa Winogradsky.

Bastoncillos curvos, rollizos, de 0,7 IL X 2 IL, con extremos ligera­mente aguzados. Móviles. Gram negativos.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilaginosas,color crema.

3. - Cellfalcicula fusca Winogradsky.

Muy parecida a la anterior, presentando autolisis en los cultivosviejos.

El gel silíceo con celulosa empleado por Winogradsky puede pre­pararse del modo siguiente: Se pone en placas de Petri, en la forma in­dicada anteriormente, una mezcla de una solución normal de HCI ysu equivalente de una solución de silicato potásico. Después que se

,ha formado el gel, se colocan las placas durante veinticuatro horas enagua corriente, y luego, varias veces, en agua destilada hervida, hastaque queden libres de cloruros. Cinco gramos de papel de filtro, fina­mente desmenuzado, se mezclan con 100 c. c. de una solución quecontenga:

(NHa). HPOa. .•. . . . •. . . . .• .. . . .. . 5.00 gramos.Mg SOa. . . • . . . • . • . . . . . • . . . . . . . • . . . . . . . . . . . 1,00.

KC1 ...............•. •...... •...•......... 1,00

PeSOa 0.02

Agua destilada. •.... . . . . . . . .. . . 1.000 C. C.

De la anterior solución se extienden porciones de unos 2 c. c. sobreel gel de cada placa, espolvoreando con una pequeña cantidad deCaCOs. Las placas se colocan en una estufa a 60°, hasta que la super-

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ficie del gel quede libre de exceso de liquido. Se colocan entonces pe­queñas partículas de suelo sobre la placa, que se cubre y se pone aincubar. A los tres o cuatro días se desarrollan colonias de color anaran­jado, amarillo, etc., que se extienden sobre el medio de cultivo. De es­tas colonias se pueden hacer trasplantes a matraces que conten­gan un gramo de papel de filtro y 25 c. c. de la solución anterior. Losorganismos empiezan a desarrollarse como pequeños lunares colorea­dos, sobre el papel, que posteriormente forman una masa mucilagi­nosa extendida por todo éste. Mediante repetidos trasplantes puedellegar a obtenerse la bacteria en eu1tivo puro.

Además de los organismos mencionados anteriormente, Kellennan,McBeth y otros (54 y 55), así como McBeth y Scales (66), han descritonumerosas bacterias aerobias que consideran como destructoras decelulosa. Para el aislamiento de estos organismos, los autores ameri­canos emplearon la siguiente solución:

Fosfato bfpotásico (K,HPO,l . . . . . . . . . 1.0 gramos.Sulfato magnésico (MgSO, . ¡H,O) .. . . . . . . . . . 1,0

Cloruro sódico (NaCl) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0

Sulfato amónico (NH,l. SO, . .. . .. 2,0

Carbonato cálcico (CaCO,) . . . . . . . . . . . . . . 20,0

Agua corriente , .. . .. 1000 c. c.

El sulfato amónico puede reemplazarse por peptona.En matraces de Erlenmeyer de 200 c. c. se colocan papeles de

filtro de 10 cm. de diámetro y se añaden roo c. c. de solución hastaque quede cubierto el papel.

Los matraces preparados se esterilizan y se inoculan con una pe­queña cantidad de la substancia a examinar, incubándolos a 300. Losprimeros síntomas de fermentación son un enturbiamiento de la solu­ción seguida por una apariencia corroída del papel, 10 que tiene lugarde los cinco a los diez días de incubación. Entonces se toma un trozodel papel atacado y se introduce en un matraz de control que conten­ga un trozo de papel estéril suspendido en la solución de sales. Si, poragitación del frasco, se rompe antes el papel atacado que el de control,ha llegado el momento de la inoculación de otro matraz que contengapapel de filtro y solución, con un trozo de papel atacado. Después detres o cuatro trasplantes en el período más corto posible, el papel ata­cado se coloca en un matraz con agua esterilizada y se agita vigorosa­mente hasta que el papel quede desmenuzado. De esta suspensión sepreparan diluciones en la forma acostumbrada para el aislamiento decultivos puros en uno de los medios que se indican a continuación:

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Agar-celulosa. - A un litro de amoníaco diluido que contenga diezpartes de amoníaco (de 0.900 de p. e.) por tres de agua, se añade unligero exceso de carbonato cúprico. La mezcla se agita vigorosamentey se deja reposar hasta el día siguiente. Luego se decanta la soluciónde óxido de cobre amoniacal. y se disuelven en ella 15 gramos de pa­pel de filtro sin lavar. F..sta solución se diluye hasta 10 litros y se pre­cipita la celulosa, acidificando lentamente con ácido clorhídrico di­luido (20 por lOO). El líquido se diluye nuevamente hasta 20 litros,se deja sedimentar la celulosa y se decanta el líquido. La celulosa pre­cipitada se lava varias veces con agua acidulada con clorhídrico hastaque el agua de los lavados no contenga cobre. y luego. con agua des­tilada hasta arrastrar todo el clorhídrico. La celulosa se deja reposarvarios días. y finalmente se hace una suspensión al I por 100. A500 c. c. de esta suspensión se agregan 10 gramos de agar y 500 c. c. dela solución de sales antes indicada.

Agar-almidón. - Diez gramos de almidón de patata se suspendenen 800 c. c. de agua fría. La suspensión se hierve, agitando, hasta quese reduzca su volumen a 500 c. c. A esta solución se añaden ro gramosde agar y 500 c. c. de solución de sales.

A gar-patata. - A lOO gramos de patatas machacadas se añaden800 c. c. de agua corriente. La mezcla se lleva al baño de vapor durantetreinta minutos y se filtra a través de algodón. A 500 c. c. del filtradose agregan 10 gramos de agar y 500 c. c. de solución de sales.

Agar-dextrosa. - Diez gramos de glucosa y 15 gramos de agar sedisuelven en 500 c. c. de agua corriente, y esta solución se mezcla con500 c. c. de solución de sales.

Es característico de los cultivos de estas bacterias que produzcanunas zonas transparentes alrededor de las colonias. que no son debidasa la neutralización del carbonato cálcico ni a una acción enzimáticade las bacterias. sino a la invasión del medio por un gran número debacterias (98). 140s resiembras de las colonias tienen menos marcado elcerco claro. que desaparece al tercero o cuarto trasplante.

Estas bacterias de Kellerman y sus colaboradores, así como otrasaisladas por Sack (87). fueron incluidas por Bergey en el género Cellulo­monas. caracterizado por bacterias en forma de pequeños bastoncilloscon extremos redondeados. no esporógenos, móviles o inmóviles. quese encuentran en el suelo y tienen la propiedad de digerir la celulosa.14 a especie tipo es Cellulomonas biazoiea (Kellerman) Bergey y col., ci­tando Bergey 33 especies, de las que 18 son móviles con flagelos perí­tricos, 7 móviles con flagelos polares y 8 inmóviles.

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c) BACTERIAS TERlI6FILAS DESTRUCTORAS DE CELULOSA. - Estegrupo de bacterias no está bien estudiado. McFayden y Blaxall (67)fueron los primeros en observar que las bacterias termófilas que ha­bían encontrado en el suelo eran capaces de fermentar la celulosa.necesitando veintiún días para descomponer el papel de filtro, o laviscosa, a la temperatura de 60°. Como productos de esta descomposi­ción, se formaban ácidos acético y butírico, anhídrido carbónico ymetano. Los organismos productores de esta fermentación no pudieronaislarse en cultivo puro.

Posteriormente, Kroulik (57) realizó investigaciones con ciertosorganismos termófilos, y aun cuando no pudo aislarlos en cultivopuro, mediante el estudio microscópico llegó a la conclusión de que ladestrucción de la celulosa era ocasionada por dos formas distintas: elBacillus n, 1, y el Bacillus n, 2, produciéndose en ellas ácidos fórmico,acético y butírico, anhídrido carbónico e hidrógeno, este último encantidades pequeñas. El hidrógeno sulfurado, que se formaba ocasio­nalmente en cantidades apreciables, fué considerado como productode la reacción del hidrógeno formado con los sulfatos del medio. Ladestrucción de celulosa era más intensa cuando actuaba el Baci­llus n, 2, alcanzando al 90 por 100, y aun más, de la celulosa empleada.

En 1923, Langwell y Hind (58) dieron noticias de una bacteriatermófila destructora de celulosa que producía ácidos orgánicos volá­tiles: alcohol etílico, metano, hidrógeno y anhídrido carbónico. Auncuando dieron una descripción del organismo y un balance de lasreacciones, las investigaciones posteriores no han confirmado estoshechos ni han permitido aislarla.

Finalmente, Viljoen, Fred y Peterson (97), estudiaron la descom­posición de la celulosa por una bacteria termófila, cuya descripciónmorfológica dieron, ya la que denominaron Clostridium thermocellum,dudándose de que consiguieran aislarla en cultivo puro, tanto por latécnica empleada (90) como por el hecho de que al cultivarla sobreagar perdía la facultad de descomponer la celulosa. Por ello debenacogerse con reserva las propiedades que se le asignaron.

En su escrito de 1924 afirmaron que cuando se desarrolla entre60° y 650, el el. thermocellum descompone la celulosa rápidamente,formando un 56,8 por 100 de ácido acético y un 10 por 100 de alcoholetílico a los once días de incubación; en este período desaparece del60 al 80 por 100 de la celulosa, quedando el resto formando un sedi­mento amarillento amorfo. En su publicación de 1926 se hace constarque el rendimiento en alcohol varía considerablemente.

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d) BACTERIAS DESNITRIFICANTES QUE ATACAN A LA CELULOSA.­

Algunas bacterias reductoras de nitratos pueden usar la celulosa comofuente de energía. Un medio que contenga 0,25 gramos de KNO.,0,05 gramos de K.HPO. y 2 gramos de celulosa en forma de papel defiltro, en 100 c. c. de agua corriente, se coloca llenando completamenteun matraz tapado, que se inocula con cieno y se incuba anaerobia­mente a 35°. El ataque de la celulosa empieza en una semana, yviene acompañado de la reducción del nitrato a nitrito, que a su vezdesaparece en quince días. Renovado el medio, el proceso de reducciónde nitratos se acelera considerablemente. La celulosa toma color ana­ranjado amarillo y consistencia mucilaginosa, descomponiéndose enfibras, que terminan por desaparecer. Los gases que se desprenden'son una mezcla de nitrógeno con anhídrido carbónico.

Groenewege (45) considera que el proceso de descomposición dela celulosa en presencia de nitratos es llevado a cabo por la acciónsimbiótica de dos grupos de organismos: uno descompone la celulosa,mientras que el otro reduce los nitratos usando como fuente de energíalos productos formados en la descomposición de la celulosa. Por laacción simbiótica de los dos organismos desaparece la celulosa másrápidamente que por la acción aislada del organismo especifico de lacelulosa. La formación de gas se inicia al segundo día, acompañada dela reducción del nitrato a nitrito y óxido de nitrógeno, con una disolu­ción gradual del papel. El proceso es sumamente activo cuando la solu­ción de cultivo se renueva por decantación.

Groenewege aisló las bacterias que intervienen en el proceso, en­contrando varias estirpes de una bacteria aerobia, Bacterium cella­resoloens, que actúa sobre la celulosa, y los productos de la descompo­sición de ésta (ácidos acético, butírico y láctico) sirven de alimentoa los organismos desnitrificantes Bacterium opalescens y Bacteriumtnscosum,

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CAPITULO VI

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METonos PARA EL ESTUDIO CUANTITATIVO

DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO

a) TOllA DE MUESTRAS DEL SUELO. - Cualquiera que sea el mé­todo que haya de emplearse para el estudio microbiano de un suelo,el primer problema que se presenta es el de la toma de muestras delmismo, que ha de ser ejecutada con arreglo a ciertas normas, ya queuna muestra mal tomada puede conducir a conclusiones erróneas.

El suelo presenta una gran variación, tanto en sus característi­cas físicoquímicas como en las biológicas, aun en superficies peque­ñas. Waksman (100), en 51 muestras de suelo, tomadas a distanciasde 2 metros en una superficie de 2,5 áreas, encontró que el número debacterias por gramo de tierra oscilaba entre 8 millones y 25 millones.Esta gran variabilidad aconseja que para los análisis microbiológicosse utilicen las denominadas muestras medias, procedentes de la mezclade varias muestras tomadas a igual profundidad en distintos puntosdel terreno a estudiar, no pudiéndose otorgar valor eficaz a las deter­minaciones basadas en una sola muestra del terreno.

Para el estudio de los suelos forestales aconseja Fehér (33) reali­zar las investigaciones en parcelas de experiencias grandes y biendelimitadas, las cuales, para eliminar las influencias perturbadoras delas zonas colindantes, deben elegirse, dentro de la masa de arbolado,de tal manera que la naturaleza de la parcela corresponda al caráctermedio del conjunto forestal.

Cada parcela de experiencias consta de una parte exterior y de otrainterior. La magnitud de la parte interior oscila entre 200 y 500 me­tros cuadrados. En esta «parte principal» de la parcela de experien­cias, Fehér numera los árboles, para poder también investigar su cre­cimiento y obtener una imagen exacta de la realidad. La parte exteriorsirve de zona o cortina de protección. La superficie total de la parcelade experiencias oscila, según las condiciones locales, entre 0,5 y unahectárea.

Para tomar las muestras se quita con una espátula la capa de hoja-

rasca sin descomponer que cubra el suelo, sacando la muestra hastade una profundidad de unos 15 cm., mediante un tubo metálico de3 a 5 cm. de diámetro provisto de bordes cortantes. Cuando quieraestudiarse la variación del número y clase de microorganismos con laprofundidad, debe abrirse una zanja de un metro de larga por 0,50 me­tros de ancha y la profundidad deseada, tomando las muestras de unade las caras laterales, cuya superficie se limpiará con la espátula en lospuntos destinados a la toma de muestras.

Para preparar la muestra media, Fehér recomienda reunir paracada parcela las muestras de quince o veinte sitios, y después de bienmezcladas, tomar una muestra en un frasco de vidrio esterilizado, quese envía inmediatamente al laboratorio para su análisis.

Wasksman aconseja tomar cinco muestras medias, procedentescada una de ellas de la mezcla de tres o cuatro muestras tomadas endistintos lugares del terreno.

Tanto los instrumentos como el material de vidrio, etc.• utilizadosen la toma de muestras debe estar cuidadosamente limpio, y a serposible, esterilizado, para evitar contaminaciones, aun cuando enesta fase del análisis, las posibles contaminaciones por exposición alaire y otras causas serían muy pequeñas con relación al elevado náme­ro de microorganismos contenidos en el suelo.

Es de gran importancia que las muestras de suelo se utilken 10más rápidamente posible después de su extracción, ya que un largoperiodo de almacenamiento puede ocasionar variaciones considera­bles, tanto en lo que se refiere al número y relación cuantitativa debacterias como a otras condiciones de las muestras, tales como pH,nitrificación, etc.

Fehér ha realizado estudios comparativos para apreciar la influen­cia del almacenamiento y transporte, sobre todo en los meses de in­vierno, en que existe gran diferencia de temperatura entre el suelo yel recipiente en que se transportan las muestras. El resultado de estasinvestigaciones se refleja en la figura 4. que demuestra claramente quela elevación de temperatura y el almacenamiento, tanto en recipien­tes abiertos como en cerrados, influye grandemente en el estado bioló­gico de las muestras de suelo.

Los valores del pH sufren grandes variaciones, que también seobservan en el número de bacterias. Si los recipientes se mantienenabiertos, aumenta el número de bacterias aerobias, descendiendo, aun­que menos rápidamente, el de las anaerobias; por el contrario, si losrecipientes se conservan cerrados, el número de las bacterias anaero-

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Aerobios

Anaerobias

To101

-----Wl::.__ _--.... ----1.000.000!-----+----+---.;;===-=p------j

p~

lII.19.m.13.m,5.m2.

O~-------+-----+----t----___;j

6.51----­

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5.0 t=====±:====:±:=====±====:::::jD20.

Cerrado.Abierto.

FIC. 4.-Variación del número de bacterias y del valor del pH durante el transportede las muestras de suelo en recipientes abiertos y cerrados. (Según Fehér.)

bias aumenta considerablemente (del 60 al 70 por 100 en nueve días),mientras disminuye el de las aerobias.

Como el valor del pH está influido en gran medida por la activi­dad de las bacterias, reacciona inmediatamente, y en los recipientesabiertos, después de elevarse permanece casi constante; en los reci­pientes cerrados, en un principio aumenta también, a consecuenciadel gran trabajo de demolición, y posteriormente desciende a valoresmás ácidos, como resultado de los procesos de anaerobiosis.

Estas experiencias demuestran que en bacteriología del suelo, lasinvestigaciones exactas sólo son posibles, especialmente en invierno,cuando se analizan las muestras de veinticuatro a cuarenta y ochohoras después de tomadas y se conservan en locales frescos.

Una vez en el laboratorio, y antes de proceder a su análisis, semezcla cuidadosamente la tierra de cada una de las muestras mediascon ayuda de una espátula, para hacerla 10 más homogénea posible,y caso de contener piedrecillas, se pasa a través de un tamiz limpio,esterilizado a ser posible, de 2 mm. de malla.

Para el estudio analítico del suelo pueden emplearse métodosculturales, basados en el desarrollo de los microorganismos del sueloen medios de cultivo adecuados, y métodos llamados directos, consis­tentes en la observación microscópica de una porción del suelo encuestión.

b) MÉTODOS CULTURALES. - Los métodos culturales para el es­tudio de los microorganismos del suelo, derivados en un principio delos métodos usados en medicina, adquirieron gran desarrollo des­de IB8I, en que Koch introdujo la técnica de los medios gelatinizadosen placa de Petri para el cultivo de las bacterias, aunque pronto sevió que los medios más usados en bacteriología patógena no eran losmás adecuados para el estudio de los microorganismos del suelo, porno ser medios de composición constante y definida y porque permitenun desarrollo exuberante de unos cuantos organismos que invadentoda la placa, dificultando con ello el desarrollo de los restantes.

Los medios de cultivo usados en estos métodos han de permitirel desarrollo del mayor número posible de organismos, y deben serde una composición tal que puedan repetirse idénticos en cualquiermomento o laboratorio; de aquí que hayan de estar constituídos prin­cipalmente a base de sales inorgánicas, y que aquellas substanciasorgánicas indispensables para suministrar carbono y nitrógeno debenser puras y de composición definida y estable. Con el fin de reducir el

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desarrollo de los organismos de crecimiento exuberante, que impedi­rían el desarrollo de numerosas bacterias de crecimiento lento, la can­tidad de materia orgánica del medio debe ser lo más pequeña posible.

Entre el gran número de medios de cultivo propuestos para ladeterminación cuantitativa de microorganismos mediante el métodode la placa, nosotros entresacamos los siguientes:

l. - Aga".est"/ICI() de s1l41o, de Fischer (J4):

Extracto de suelo '" . . 1000 C. C.

Agu. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 gramos.KtJIPO. 2

El extracto de suelo se prepara calentando en un autoclave du­rante media hora. a una atmósfera de presión, una determinada can­tidad de suelo con un peso igual de una solución al 0,1 por 100 deNa,CO•.

2. - Aga"-e~t"lICto de suelo, de Fehér (33):

Extracto de suelo , . . • .. . . .. . .. 1000 C, c.Agar , '" .. . 15 gramos.

El extracto de suelo puede prepararse:a) Hirviendo a fuego directo durante dos horas un kilogramo de

tierra con dos litros de agua corriente; ob} Calentando en el autoclave durante una hora, a una presión

de una o 1,5 atmósferas, un kilogramo de tierra con 1.000 c. c. deagua corriente.

En los dos casos, se filtra, se completa el volumen con agua hasta2.000 c. c., se le añade un gramo de K1HPO., se hierve y se filtra denuevo.

3. - Agar-albuminato de sosa, de Waksman (101):

Agua destilada .Agar .Glucosa .Fosfato bípotásíco (K,HPO.) .Sulfato magnésico (MgSO 7H10) .Sulfato férrico (Fe,(SO..)s . 9H,0) .Albúmina de huevo en polvo .

1000 C. c.15.00 gramos.

1,00 •

0.50

0,20

Indicios.0,25 gramos.

Se hace una suspensión de la albúmina en 5 a 10 c. c. de agua, seagrega I c. c. de una solución o,IN de NaOH, para formar el albumi­nato de sosa, que se añade al medio ya filtrado. La reacción del medioes, aproximadamente, pH : 7,2.

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4. - AgaJ'.peptona, de Lípman y Brown (61):

Agua oo.... 1000 C. c.Agar o ••••••••• o ••••••••••• o ••••• o • • • • • • • • 15,00 gramos.Peptona o • • • • • • • • • • • • • • 0,05 •

5. - Agar-caselwa sódica, de Waksman (101):

Agar , .•.........•.•.•..••••.....•••.•.......Caseína s6dica (lIwtmza) ...........•..........

Glucosa ' . o ••• o' •••••••••••••••• o •••••

Fosfato bipotásico (Ksl!PO.) ..Sulfato magn6Iico (MgSO.· 7Hs0) .Sulfato ferroso (FeSO•. 7Hs0) . o •••••••••••••••

Agua corriente o •••••

12,5 gramos.2,0 •

1,0

0,2

O,Z •

Indicios.1000 C. c.

No es necesario ajustar la reacción del medio, que tiene, aproxi­madamente, un pH = 6,8.

Ü. - Gelatilla-extJ'acto de suelo, de Fehér (33):

Extracto de suelo ·... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 C. Co

Gelatina o o • •• • • ••• • •• 100 gramos.

El extracto de suelo preparado según Fehér (fórmula 2) se calientadurante una hora u hora y media al baño de vapor. Se deja enfriarhasta una temperatura de 450 , y se añade albúmina de huevo paraclarificarlo, calentándolo nuevamente de media hora a tres cuartosde hora. Cuando se ha coagulado la albúmina, se filtra, en caliente,sobre papel.

En la preparación de los medios de cultivo deben disolverse loscomponentes, incluso el agar o la gelatina, en agua hirviendo. Des­pués de filtrar en caliente, a través de algodón o lana de vidrio - elfiltrado de medios con agar, a través de papel, es lento. y sólo puedehacerse con embudos especiales provistos de calefacción -, se agre­gan aquellos componentes que puedan alterarse por un calentamientoexcesivo (sales amoniacales, albuminato sódico, glucosa, etc.). Se re­parte en tubos de ensayo, en cada uno de los cuales se ponen unos10 c. c.; se tapan con algodón, y se esterilizan de dos a tres veces,con intervalos de veinticuatro horas, procurando que la temperaturade esterilización no exceda mucho de los IOOO, sobre todo en mediosque contengan glucosa.

Todo el material de vidrio (pipetas, matraces, placas de Petri, etcé­tera) que haya de utilizarse para la obtención de cultivos deberá

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esterilizarse previamente, en seco, a una temperatura de 1200 a 1400,

durante varias horas. Es conveniente regar las paredes y el suelodel laboratorio con una disolución acuosa de bicloruro mercúrico al1 por lOO, inmediatamente antes de empezar a trabajar.

La muestra media del suelo que queremos analizar se remueveperfectamente sobre una placa de vidrio con ayuda de una espátulaesterilizada, y se pesan 50 gramos, que se mezclan con 500 c. c. deagua esterilizada, agitando para provocar la dispersión del suelo. FJperíodo de agitación varía según los operadores. Waksman recomiendauna duración de cinco minutos: .Períodos más cortos no permitenla separación de las bacterias unidas a las partículas del suelo; y pe­ríodos más largos - dice - pueden disminuir el número de bacte­rias en forma vegetativa a causa de fenómenos de plasmólisis.• Fehérrecomienda la agitación durante una hora en un aparato de agita­ción horizontal alternativa. Nosotros, en las experiencias realizadas,no hemos encontrado aumento apreciable en el número de micro­organismos para períodos de agitación comprendidos entre los cincoy los sesenta minutos, por 10 que habitualmente agitamos la mezclade agua y suelo durante cinco o seis minutos.

Cada centímetro cúbico de esta mezcla encierra 0,1 gramos de suelo.De esta primera dilución de suelo, sin dejarla reposar, tomamos la cen­tímetros cúbicos con una pipeta esterilizada, yen matraz estéril, losmezclamos con 90 c. c. de agua destilada, agitando cuidadosamente,con 10 que obtenemos la segunda dilución, que tendrá 0,01 gramosde suelo por centímetro cúbico.

y así sucesivamente, como se indica en el siguiente cuadro, en elque el número de orden de la dilución nos indica el número de cerosen el denominador de la fracción de suelo que contiene:

ss

NÚIBRO

DEDII,UCIÓN

MÉTODO DE OBTENCIÓN 1 cmS CORRESPONDE A

2

3

456

50 gramos de suelo en 500 cms de agua

loe:::~:~a¡ ···110 cm' de 2

ro cm' de 3 en 90 cms de agua ...10 cm' de 410 cms de 5

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l/lO

l/lOO

1/1.000.000

1/10.0001/100.0001/1.000.000

( gramos de suelo.

\

Para cada dilución debe emplearse una pipeta esterilizada dis­tinta, Y agitar bien antes y cuando se procede a una nueva di­bidón.

El número de diluciones a practicar depende de la clase de suelo,sobre todo de su contenido en materia orgánica: en suelos pobres yarenosos suele bastar con cuatro diluciones; los suelos ricos en materiaorgánica requieren cinco o seis diluciones.

A! trabajar con un suelo desconocido deben practicarse seis dilu­ciones, haciendo siembras con las números 4, 5 Y 6. La dilución másconveniente es aquella que da en el cultivo sobre placa de Petri unn6Jnero de colonias comprendido entre 40 y 200. Un número de colo­nias por placa muy bajo expone a errores de consideración, y superiora 200 es pesado de contar.

A! mismo tiempo que se toma la tierra para hacer las diluciones,se pesan 10 gramos de tierra, que se tienen en estufa a 100° hasta supeso constante, con el fin de determinar el contenido de humedad delsuelo, expresado en tanto por ciento.

El cultivo se hará colocando 1 c. c. de dilución en una placa dePetri esterilizada (teniendo la precaución habitual de no destapar porcompleto la placa, sino levantar la tapa por el borde justamentelo indispensable para introducir la pipeta), al que se agregan unos!O c. c. del medio del cultivo elegido, fundido previamente y enfriadohasta unos 420 (*). Después se imprime a la placa un suave movi­miento de rotación para la mejor distribución de los gérmenes, y secoloca sobre una superficie horizontal hasta que el medio se solidifica.

El número de cultivos en placa para cada muestra media de suelono debe ser menor de cuatro, con el fin de aminorar posibles errores.En trabajos delicados debe aumentarse este número.

Las placas sembradas se incuban en la estufa de cultivos a tem­peratura constante: de 250 a 270 para medios con agar, y de 18° si setrata de medios gelatinizados. Para la determinación de los hongosse cuentan las colonias a las cuarenta y ocho y setenta y dos horas deincubación. Las placas para determinaciones bacterianas deben in­cubarse de siete a doce días. A menor temperatura, el período de in­cubación ha de ser mayor, no siendo conveniente el empleo de tem­peraturas superiores a 300, porque pueden ejercer acción perjudicialsobre algunos organismos del suelo.

(*) Los medios a base de agar se funden a temperatura próxima a los 100°; peropermanecen líquidos hasta una temperatura alrededor de los 40°,

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100 -/J.

Al final del período de incubación se cuentan todas las coloniasexistentes en la placa, ayudándose, si es preciso, de una lupa o micros­copio binocular. Para evitar errores en el conteo, se puede ir colocandoun punto de tinta en el fondo de la placa por su cara exterior, en co­rrespondencia con cada colonia contada.

El número de colonias por placa nos dará el número de micro­organismos contenido en un centímetro cúbico de dilución, en la hipó­tesis de que cada uno de ellos se haya desarrollado en colonia. Ese nú­mero, multiplicado por el grado de la dilución, nos dará el número demicroorganismos por gramo de suelo húmedo de la placa en cuestión.Después se tomará la media aritmética de los números correspon­dientes a cada muestra media; y si designamos este media por 11,

por h el tanto por ciento de humedad de la tierra determinada ante­riormente y por d el grado de la dilución empleada, el número N demicroorganismos por gramo de tierra seca vendrá dado por la fórmula

a X d X 100N=----:~

e) MÉTODOS MICROSCÓPICOS DIRECTOS. - Este método fué suge­rido por Cohn, y desarrollado posteriormente por Winogradski, Cho­lodny y otros investigadores. Busca la determinación de la totalidadde los organismos existentes en el suelo para complementar los mé­todos culturales, que son selectivos. Tiene la ventaja de permitir obser­var la abundancia relativa de los diversos grupos morfológicos deorganismos del suelo, independientemente de sus peculiaridades denutrición, así como las relaciones físicas entre el suelo y su poblaciónmicrobiana.

1) El método de Cohn (19) consiste en preparar una suspensiónde suelo en una solución fijadora diluída: extender una o dos gotas dela suspensión sobre un portaobjetos, y después de seca, teñirla conun colorante ácido.

La solución fijadora se prepara disolviendo a calor suave, en unlitro de agua destilada, 0,15 gramos de gelatina. La solución se dis­tribuye en tubos de ensayo (5 c. c. en cada uno), que se tapan con algo­dón y se esterilizan.

La solución colorante se prepara disolviendo un gramo de eri­trosina o de rosa de bengala en 100 c. c. de una solución acuosa deácido fénico al 5 por lOO que contenga del 0,001 al 0,1 por lOO deClzCa, hasta ligera precipitación de la sal cálcica del colorante.

La técnica a seguir es la siguiente: Medio gramo de suelo se coloca

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en uno de los tubos de ensayo que contienen la solución fijadora, conla que se mezcla cuidadosamente, colocando una gota de la suspen­sión sobre un portaobjetos muy limpio, extendiéndola con una agujahasta que cubra una superficie de un centímetro cuadrado. Este frotisse deja secar, de preferencia sobre un baño de María; luego, siempresobre el baño de María caliente, se coloca una gota del colorante,que se deja actuar durante un minuto. Finalmente se lava en se­guida con agua y se observa al microscopio. Conociendo el volumende la suspensión de suelo utilizado en la preparación, mediante unsencillo cálculo se obtiene el número aproximado de microorganismospor gramo de suelo.

2) Modijicaci6n de Winogradsky (HZ). - La presencia de gran­des corpúsculos amarillentos, de materia mineral del suelo, perturbala observación de los microorganismos, y para evitarla, Winogradskyideó la siguiente modificación del método directo.

Las muestras de suelo se mezclan bien y pulverizan. Un gramo deeste suelo, desecado al aire, se añade a 4 c. c. de agua destilada y se

. agita vigorosamente durante cinco minutos; después se deja reposardurante treinta segundos, y la suspensión que cubre las grandes par­tículas inorgánicas se decanta en un tubo pequeño de centrifugadorade mano. Por dos veces se añade al residuo 3 c. c. de agua destilada,agitando cada vez durante un minuto, dejando reposar treinta se­gundos y decantando en el mismo tubo de centrifugadora que la pri­mera vez. Se han usado, por tanto, 10 unidades de agua por unidadde suelo. Después de estos tres lavados, el primer sedimento suspen­dido en agua destilada debe depositarse inmediatamente. Duranteestas manipulaciones, que requieren unos diez minutos, se ha formadoun segundo sedimento en el tubo de la centrifugadora. La mitad dela suspensión que 10 cubre se decanta en un segundo tubo de cen­trifugadora, en el que, centrifugando, se forma un tercer sedi­mento.

Se hacen entonces preparaciones de los tres sedimentos y de lassuspensiones no centrifugada y centrifugada, para 10 cual, una gotade cada una de las preparaciones se coloca sobre su correspondienteporta, extendiéndolas, para que cubran 1 cm', poniéndolas a secaren una estufa y cubriéndolas rápidamente con una solución fijadorade agar muy diluído. Para los dos primeros sedimentos conviene usaruna solución de agar al 1 por 100 en caliente, y para el tercero, al0,1 por 100 en frío. Las suspensiones no es necesario fijarlas.

Cuando se ha secado el agar se echan varias gotas de alcohol abso-

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luto, y la preparación se tiñe por medio de un colorante ácido (eritro­sina) disuelto en una solución acuosa de fenol al 5 por 100. Las célu­las de las bacterias se colorean. no haciéndolo las cápsulas ni el mucns.Esto se verifica sobre todo para las colonias compactas, como las denitrosomonas y otras formas del suelo, las cuales se supercoloreanfácilmente con los colorantes básicos. Los coloides se tiñen muy lige­ramente y el agar se decolora rápidamente durante los lavados conagua fría. El colorante se deja actuar de cinco a quince minutos enfrío o con calor ligero. y luego se lava unos segundos en agua.

Las preparaciones del primer sedimento están, ordinariamente,libres de bacterias, excepto en suelos extraordinariamente ricos enmateria orgánica, en los que algunas de las partículas no son arras­tradas por los tres lavados.

La segunda preparación muestra. cualitativa y cuantitativamente,los mismos microbios que el tercer sedimento, que es el que mejorse presta para la observación.

La cuarta preparación procedente de la suspensión es, por 10 ge­neral. la más instructiva. Se colorean únicamente las células vivas; lasesporas no se colorean, o lo hacen ligeramente, por 10 que sólo se vencuando son muy numerosas. Los quistes de protozoos se distin­guen claramente por su fuerte coloración y pueden contarse fácil­mente.

3) Cholodny (17) objetó a la técnica empleada por Cohn y Wino­gradsky el que. a consecuencia de la agitación de las partículas delsuelo en el agua, no daba una completa imagen de la población delsuelo en su habitat natural, cosa especialmente cierta en el caso de losactinomicetos, que son muy frágiles. Para obviar este inconvenientepropuso la siguiente técnica:

En el suelo a examinar se hace con un cuchillo una hendidurahorizontal, en la que se introduce un portaobjetos, que quedará consu superficie paralela a la del terreno. El suelo se comprime suave­mente para que quede en contacto con el porta. indicando medianteseñales la situación de éste, que se deja en el terreno de una a tres se­manas.

El porta es cubierto por la solución del suelo y las partículas or­gánicas, sobre las que empiezan a desarrollarse los microorganismos.Después de una a tres semanas se extrae cuidadosamente el porta delterreno, y limpiando con un paño una de las caras, se deja secar alaire y se guarda en un recipiente adecuado. En el laboratorio, se fijaprimero la preparación, pasándola sobre una llama; se lava suavemente

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en agua, para arrastrar las partículas gruesas de tierra, y luego selava con agua destilada; se tiñe durante treinta minutos, a la tem­peratura ambiente, con eritrosina fenolada, según la técnica de Wino­gradsky; se lava cuidadosamente y se seca.

Este método de Cholodny, a causa de la desigual distribución demicroorganismos en el suelo; de la dificultad de distinguir en ~os ¡"'. _¿;casos las bac~erias de las partículas de suelo: especialmente en~ caso ~ ~de suelos arcillosos, y de separar las bactenas muertas de las~,'" '"no se presta a estudios cuantitativos, siendo sólo adecuado a fines~.;'. n

litativos, mostrando los tipos de microorganismos que existen e~. e:suelo en forma activa, por 10 que constituye un eficaz complemento delos métodos culturales.

4) F ehér (33) utiliza la siguiente modificación del método deCohn: Con un agitador eléctrico se agita enérgicamente un gramo desuelo con 8 gramos de agua destilada. Después de ese tratamientose añade a la suspensión 1,5 c. c. de alcohol absoluto, y se agita nue­vamente, con 10 cual las bacterias que contenga quedan fijadas, evi­tándose con ello cualquiera variación en su proporción cuantitativa.De este modo las muestras de suelo pueden conservarse largotiempo.

Para el teñido de las bacterias se añaden 0,5 c. c. de una soluciónde eosina-eritrosina al 1 por 100 en agua fenicada al 5 por 100. Lasuspensión se agita con la mano durante corto tiempo, y rápidamente,para evitar la sedimentación, se lleva al portaobjetos. Se utilizanportaobjetos en los cuales se ha grabado un cuadrado de 2 cm. delado. Sobre este cuadrado se echan, exactamente, 0,05 c. c. de la sus­pensión. La altura de la capa de suspensión así preparada asciende a0,05 : 4 = 0,0125 cm. La preparación hecha de este modo se desecasobre el baño de Mana, y finalmente se fija. Si la fijación se hace conesmero, no es necesario el empleo del agar o de la gelatina.

d) DETERMINACIÓN NUMÉRICA DE I.AS BACTER.IAS ANAEROBIAS. ­

Para la determinación del número de bacterias anaerobias susceptiblesde desarrollarse en los medios de cultivo habituales, pueden utilizarse lostubos de Burry, que son tubos de cultivo abiertos por las dos extre­midades, a las que pueden adaptarse tapones de goma. Para prepararel cultivo se sigue la siguiente marcha: El tubo, esterilizado, se tapapor una de sus extremidades con un tapón de goma esterilizado; enel interior se vierte rápidamente, a la llama, la mitad del medio decultivo al agar, refrigerado a unos 42°; se añade con rapidez 1 c. c. de

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la dilución de suelo elegida. y también, rápidamente, la otra mitaddel medio de cultivo, que debe estar en cantidad tal que el agar friosólo llene de un tercio a la mitad del tubo. Entonces se coloca en lamitad libre del tubo de Burry un tapón de algodón flameado, que seroda con ácido pirogálico, que se neutraliza con lejía de sosa o depotasa, tapando en seguida con otro tapón de goma esterilizado. Elpirogalato de sosao potasa absorbe el oxígeno, creándose de este modola atmósfera adecuada a la anaerobiosis.

Los tubos se ponen a incubar a 37° porque hay muchas bacteriasanaerobias termófilas que sólo se desarrollan a esta temperatura. Du­rante la incubación se debe cuidar que los tapones de goma de lostubos de Burry no sean lanzados hacia fuera por el desarrollo de gasesde la fermentación.

El recuento en los tubos de Burry se hace del modo siguiente: Sesaca la masa sólida fuera del tubo, se divide en trozos pequeños y secuenta el número de colonias. Como sabemos el grado de dilucióndel suelo, podemos calcular fácilmente el número de gérmenes porgramo de tierra, en la hipótesis de que cada bacteria anaerobia sehaya desarrollado en una colonia.

Además del método de Burry, que hemos recomendado por lasencillez de su técnica, factor digno de tenerse en cuenta cuando hayque realizar determinaciones en serie, puede emplearse cualquiera delos métodos para cultivo de organismos anaerobios que se encuentranen los tratados de Bacteriología, y de los que Waksman hace un resu­men en su Microbiología del suelo, tantas veces citada.

e) DETERMINACIÓN DE 1,OS GRUPOS FISIOI,ÓGICOS DÉ BACTERIAS.­

Con los métodos descritos se determina únicamente el número totalde bacterias, 10 que es una solución incompleta del problema, todave? que con ello no podemos formamos idea de la diferente partici­pación que tienen en el suelo los distintos grupos que integran la florabacteriana del mismo.

La determinación de los grupos fisiológicos de bacterias se con­sigue con el método llamado de las diluciones, que, en combina­ción con el procedimiento selectivo, fué empleado por primeravez por Hiltner y Stormer (49), y más tarde por Diiggeli (29) yotros.

En esencia, el procedimiento es el siguiente: Se hacen dilucionesde suelo en agua esterilizada en la forma descrita anteriormente.llevando 1 C. c. de cada una de las diluciones elegidas a una serie de

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medios de cultivo selectivos, de los que cada uno es adecuado sola­mente para el desarrollo de un grupo particular de microorganismos.Las bacterias de la suspensión originan en los medios de cultivoadecuados a cada una alteraciones químicas, las cuales se puedenobservar frecuentemente a simple vista o mejor por medio delanálisis.

El principio de los cultivos selectivos consiste en crear las condi­ciones de vida más favorables para una determinada especie de bac­terias, tanto por la composición especial del medio de cultivo comopor una determinada temperatura. A consecuencia de ello, esta espe­cie bacteriana obtiene el predominio, y las bacterias acompañantes,o desaparecen a consecuencia de la falta de nutrición, o quedan muyen segundo término, sobre todo después de algunos trasplantes suce­sivos.

Estos medios de cultivo diferenciales se colocan de ordinario enmatraces de Erlenmeyer de 250 a 300 c. c., o en tubos de cultivo. Losmatraces de Erlenmeyer tienen un fondo relativamente ancho,~ locual permite un acceso suficiente de aire. La siembra se hace, a partirde las diluciones originales, desde 1/10 hasta 1/1.000.000. Sin embargo,en determinadas especies de bacterias se pueden emplear escalonesintermedios de dilución 1/5.000, 1/50.000, 1/500.000, 1/2.500.000,

1/5.000.000. Con cada dilución se siembran dos matraces de Erlen­meyer. Los cultivos aerobios se llevan a la estufa de cultivo y se in­cuban entre 25° y 30°.

Los cultivos anaerobios se ejecutan en recipientes grandes de vi­drio que cierren herméticamente, de los que se extrae el aire con unabuena bomba de vado hasta 0,001 atmósferas de presión, y se absorbeel resto de oxígeno que pudiera quedar presente, con la mezcla de lejíade sosa y ácido pirogálico. Los cultivos anaerobios se llevan general­mente a la estufa a 37°. Después de un cierto tiempo, que es muy dife­rente según las distintas especies de bacterias, determinamos, con elmétodo correspondiente, la dilución en la cual ha aparecido ya laesperada reacción química, o bien la presencia de una determinadaespecie de bacterias. De este hecho deducimos que en esa especialdilución hay, por lo menos, un germen de aquellas bacterias, el cualestá en condiciones de realizar la reacción.

Por medio de un ejemplo aclararemos 10 anterior. Cuando, porejemplo, se dice que el número de bacterias nitrificantes es de r.ooo porgramo de tierra, esto significa que las bacterias fueron halladas toda­vía en la dilución 1/1.000, pero que ya no aparecieron en la dilución

- III -

inmediata 1/10.000. Más correcto sería escribir que en un gramo detierra, el número de bacterias nitrificantes es mayor que 1.000, peromenor que 10.000. Sin embargo, en general, se fija el dato del valorlimite inferior. Después de ello se pueden obtener números más exac­tos por la interpolación entre las diluciones; pero esto exige muchotrabajo, que es incompatible con el trabajo en serie.

Aun cuando en los capítulos que anteceden hemos indicado mediosde cultivo adecuados para los distintos grupos fisiológicos de bacte­rias. para completar este trabajo queremos indicar los medios de cul­tivo que. para algunos de ellos, recomienda Fehér en su obra sobreMt«obiología de los suelos foyesúdes, no sólo por el hecho de habersido seleccionados por quien lleva muchos años dedicado a esta clasede investigaciones, sino porque para que los resultados que se obten­gan puedan ser comparables a los muy numerosos e interesantes quefiguran en dicha obra, deben haberse logrado mediante el empleode técnicas iguales.

a) Ctdtivo de las bacterias aerobiasque lijan al nitrógeno

libre del aire.

Se emplean las diluciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6.(En todos los medios de cultivo se debe fijar el pH entre 6 y 7.)

1000 cm' de agua destilada.15,00 gramos de manita.

1,00 K,HPO•.0.20 MgCls.

Medio de cultivo.. - _. _. ... 0.50 CaCO•.0,20 NaCl.0,10 FeSO._

0,10 Al,(SO.l,-0.01 MuCI"

El líquido nutritivo así obtenido se reparte en matraces de Erlen­meyer de 300 c. c. de capacidad y se esteriliza en corriente de vapor.El cultivo se incuba durante dos o tres semanas en estufa de 200 a 25°.

Después se hace la determinación microscópica de las especies deAzotobacter, de las cuales existen principalmente, en los suelos ana­lizados, el Azotobacter chroococcum y el agilis.

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b) Cultivo de las bacterias anaerobias que fiian el nitrógeno

del aire.

La preparación se hace a partir de las diluciones 1-6:

100 cm' de agua destilada.2,00 gramos de glucosa.0,10 • ~HPO,.

0,02 a 0,05 gramos de MgSO,.Medio de cultivo. . . . . . . . . . 0,01 gramos de NaCl.

0,01 FeSO,.0,01 Hn80,.0.50 CaCO,.

Indidos de ZnSO,.

El medio nutritivo líquido así obtenido se reparte en matracesErJenmeyer de 50 c. c. de capacidad. El cultivo se incuba, en atmós­fera de nitrógeno, a 370 durante dos o tres semanas. Para la determi­nación del número se estudia microscópicamente la presencia delClostridium pastorianum.

Puesto que ambos grupos de bacterias dan, aproximadamente, lamagnitud de los organismos que fijan el nitrógeno, y su número estásometido, relativamente, a grandes oscilaciones, debemos emplearen ambas investigaciones todas las diluciones desde 1 hasta 6.

Para las restantes determinaciones, si ya se tiene la deseada impre­sión de conjunto, se deben emplear únicamente aquellas dilucionesque correspondan, al parecer, con la presencia de la bacteria corres­pondiente.

c) Cultivo de las bacterias nitrificantes.

Se emplean las diluciones 3 a 6. Se recomienda, además, estable­cer escalones intermedios entre las diluciones 4 y 5. por una parte. ylas 5 y 6, por otra, si se quieren hacer investigaciones precisas y seguirdetalladamente la dinámica de la nitrificación.

900 cm· de agua destilada.r,o gramos de.~HPO,.0,5 • MgSO,.

Medio de cultivo...... .. . . 0,2 NaCl.

0,4 FeSO,.5.0 MgCOs-

Indicios de ZnSOj'

La disolución se reparte en matraces de Erlenmeyer de 100 c. c. decapacidad y se esteriliza por tres veces. Por separado se prepara una

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disolución que contenga 2 gramos de sulfato amónico en 100 c. c. deagua destilada, se esteriliza, y después se lleva a los matraces de Erlen­meyer, con una pipeta estéril, la cantidad precisa para que el contenidode sulfato amónico llegue al 2 por 100.

El cultivo tiene lugar durante dos o seis semanas entre 200 y 25°.Después de transcurrido este tiempo, se toman muestras del cultivo,y se analizan en ellas los nitritos o los nitratos según la técnica indi­cada (págs. 27 Y 31).

d) Cultivo de las bacterias desnitrijicantes.

Se emplean las diluciones 3-6.

l 1000 gramos de agua destilada.Medio de cultivo: 1.z KNO, disuelto en 2,50 cm3 de agua.

Medio de cultivo: n.

1,00 gramos de asparagina .,5,00 ácido cítrico .2,00 K,HPO•......2,00 MgSO•........0,20 CaC! .

Indicios de FeCl" .Indicios de ZnSO•............

Disuelto en ,500 cm' de aguay neutralizado con hidró­xido potásico.

Las dos diluciones se juntan y se completan con agua hasta for;mar 2.000 c. c. La distribución se hace en tubos de cultivo, los cualesse llenan hasta su mitad. Los cultivos se mantienen de dos a tres se~

manas en la estufa de 20° a 25°. Después de transcurrido este tiempo,se investigan nitritos y amoníaco. (Pág. 27.)

e) Bacterias anaerobias que destruyen la celulosa.

Se emplean las diluciones 3. 4 y 5.

1000 gramos de agua destilada.

1.00. (NH,laSo•.1,00 K,HPOc.

0.,50 MgSO•.0.02 NaC!.

25.00 CaCO,.

Indicios de ZnSO•.

El medio de cultivo líquido así obtenido se reparte, o bien en pro­betas, o bien en matraces de 100 c. c. En los recipientes se echa papel

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de filtro corriente, en tiras o en pedazos mayores, y el conjunto seesteriliza una o dos veces a una presión de una y media a dos atmós­feras. El desarrollo del cultivo tiene lugar en recipientes anaerobiosdurante tres o cuatro semanas a 370. Se observa, en general, la des­trucción de la celulosa.

f) Bacterias aerobios que destruyen la celulosa,

Se emplean las diluciones 3, 4 Y 5·El medio de cultivo es el mismo que para las bacterias anaerobias

destructoras de la celulosa. Sin embargo, la repartición es algo dife­rente. En matraces de Erlenmeyer de 200 a 300 c. c. echamos perlasde vidrio. Sobre estas perlas se coloca un trozo redondo de papel defiltro, el cual se rocía con solución nutritiva. Podemos también ejecu­tar toda la investigación en placas de Petri, con cuyo objeto, entredos trocitos redondos de papel filtro, esparcimos algo de fosfatoamónico-magnésico Mg(NH.)PO.. Después de esta manipulación seesterilizan las placas de Petri a 1200. Aproximadamente, una horaantes de la siembra se rocía el papel de filtro con disolución esterilizadaal 0,05 por 100 de fosfato bipotásico. El cultivo tiene lugar durantetres o cuatro semanas entre 200 y 250. El empleo de perlas de vidrioes decididamente el mejor, pues con ello los cultivos se mantienenbien y fácilmente aerobios.

La observación consiste en apreciar, análogamente al caso de ladestrucción anaerobia de la celulosa, el comienzo de destrucción delpapel de filtro.

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CAPITULO VII

NUMERO DE BACTERIAS DEL SUELO

SUS VARIACIONES

La existencia de un cierto número y clases de bacterias en undeterminado suelo y momento está íntimamente ligada a las condi­ciones del medio y a las cantidades de energía y elementos nutritivospuestos a su alcance para su desarrollo y reproducción. Todo cambioen las condiciones del medio o en el suministro de energía o de subs­tancias nutritivas lleva consigo no sólo una variación en el número debacterias de un suelo, sino también en la naturaleza de la flora bacte­riana del mismo.

Los resultados obtenidos en la determinación del número de bac­terias en un suelo dependen, en gran parte, del método empleado, yaque, como hemos dicho, hasta la fecha no se conoce ningún métodode cultivo que pueda darnos exactamente el número total de bacteriascontenidas en él, a causa de la dificultad de conseguir la total sepa­ración, en las diluciones, de los individuos que forman las agrupacio­nes bacterianas, y de no existir un medio de cultivo que permita eldesarrollo en colonias de todos los grupos fisiológicos de bacterias.

Así, por ejemplo, Cohn (18) encontró las siguientes diferencias endiversos suelos según el medio de cultivo empleado:

IMILJ,AllJtS DK BAC'1'KJUAS POli. GJLU(O DK SUJU,O saco

DK'rKIUONADOS CON

TIPO DE SUELO GKI"ATINA A'I'UAIIIA PKPTONA FISCHItIil AI,BÚMINA

- - - - -btnctI".1e Aga" Age« Aga" Agar

Tierra limosa de Volusia ( Volu-~ia siU loam). . ............ 9·500 8.000 5.500 6.70 0 8.000

Tierra limosa de Volusia....... n·500 7.500 5.300 5·000 7.000

Tierra limosa de Volusia....... 10.000 12.000 8.800 r a.ooo IJ.OOO

Tierra franca de Ontarlo (Onta-no loa".). .. .............. 21.000 9.000 13.0 00 15.0 00 14.000

Tierra franca de Ontarlo (Onta-no loa".). ................ 25.000 16.000 16.000 21.000 17.0 00

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Sin embargo, los métodos culturales, aunque no nos den el valorabsoluto del número de bacterias, pueden servir para efectos de com­paración entre diversas muestras de suelo, ya que es lógico suponerque exista una cierta proporcionalidad, dentro de cada grupo de bac­terias estudiado, entre el número de bacterias desarrolladas en el me­dio de cultivo y el existente en el suelo, y por tanto, pueden ser deverdadera utilidad para determinar si el número de bacterias aumentao disminuye durante un cierto período o a consecuencia del tratamientodado a un suelo.

Los métodos microscópicos directos, anteriormente expuestos,arrojan siempre números de bacterias por gramo de suelo mucho máselevados que los medios de cultivo, ya que en éstos sólo pueden des­arrollarse en colonias una parte de las bacterias contenidas en el suelo.Así, según Rippel (82), mientras que en un suelo agrícola de pH 5,7se encuentran por el método de placa 31 millones de gérmenes porgramo de suelo, por el método de Cohn se cuentan 133 millones, y porel de Winogradsky, 422 millones, habiéndose llegado a determina­ciones por el método directo que arrojan cifras oscilando entre 1.280 mi­llones a 21.600 millones de gérmenes por gramo de tierra (96), congrandes variaciones entre muestras tomadas en diferentes partes deuna misma porción de suelo.

No es excepcional encontrar centenares de millones de bacteriaspor gramo de suelo, sobre todo si éste ha recibido substancias orgánicas.Suponiendo que en un centímetro cúbico de suelo existan 100 millonesde bacterias, y que el volumen medio de cada una de éstas sea de unamicra (0,001 mm.) cúbica, los cien millones ocuparían un volumen de100.000.000 1&8, Ycomo el centímetro cúbico tiene 1.000.000.000.000 1&8,

el volumen ocupado por las bacterias seria sólo de una diezmilésima(1/10.000) del volumen total del suelo.

Sobre el número de bacterias por gramo de suelo influyen muy di­versos factores, tales como clase del suelo y contenido en materiaorgánica, humedad, reacción, profundidad, clase de cultivo, estacióndel año y otras varias condiciones del medio.

Por 10general, los suelos ligeros, arenosos, pobres, y los suelos anor­malmente muy ácidos o básicos, presentan un número de bacteriaspequeño. Los suelos arenosos de los eriales de Nueva Jersey (EstadosUnidos) (102), por ejemplo, contienen solamente de 25.000 a 100.000

bacterias por gramo, mientras que algunos suelos turbosos ácidos pue­den casi carecer de bacterias capaces de desarrollarse sobre los medioshabituales de cultivo en placa.

- 120-

l-os suelos arcillosos y las tierras fértiles, ricas en materia orgá­nica, ofrecen una mayor cantidad de bacterias; los suelos muy ester­colados, como los de jardín, pueden arrojar, mediante el cultivo enplaca, números de bacterias por gramo del orden de 200 millones. Laadición de materia orgánica al suelo es, probablemente, el tratamientoque ejerce un efecto más pronunciado sobre su población bacteriana,sobre todo cuando las condiciones de humedad son adecuadas. Laadición de materia orgánica, tanto vegetal como animal, modificaademás las condiciones físicas del suelo, dando mayor soltura y poro­sidad a los suelos fuertes y arcillosos y mayor compacidad a los sueltosy arenosos, cualidades que favorecen el desarrollo de bacterias. Lossuelos que no reciban ninguna adición de materia orgánica sufren unaconstante disminución de su población bacteriana.

La influencia de la humedad sobre el número y la actividad de lasbacterias del suelo, principalmente de las aerobias, depende en granmedida de la naturaleza del suelo: un contenido de humedad que resultesuficiente en suelos ligeros, arenosos, puede ser insuficiente para suelosfuertes y arcillosos. El desarrollo máximo de bacterias aerobias tienelugar cuando el contenido de humedad del suelo oscila entre el 50y 70 por lOO de su capacidad máxima de humedad. Engberding (31)obtuvo los siguientes resultados:

INFLUENCIA DEL CONTENIDO DE HUMEDAD DEL SUELOSOBRE EL NÚMERO DE BACTERIAS (ENGBERDING)

Contenido Porcentaje en rela- Número de bacterias Porcentaje relativode humedad ción con su capací- por del

Por roo dad de humedad gramo de suelo seco número de bacterias

------- .. _-...__..- --6.5 1 30 9.980.000 33.3

10,85 50 11.890.000 39,714,10 65 16,410.000 .54,8

17.35 80 29.960.000 100.0

21,69 100 25.280.000 84,0

Aunque la actividad bacteriana en suelo desecado al aire, con un2 al 5 por 100 de humedad, es casi nula, la desecación del sueloejerce un notable efecto sobre el desarrollo de los microorganismosdel suelo al humedecerse éste de nuevo, de tal modo, que las intermi­tencias de sequía y humedad de la superficie del suelo es beneficiosapara el suministro a las plantas de elementos asimilables, como puedecomprobarse en el gráfico de Waksman y Starkey (roS) (fig. 5). que

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indica el curso del desarrollo microbiano consecutivo al humedeci­miento de un suelo desecado, anotándose también la variación de laproducción de COI como índice representativo de la actividad bacte­riana. Durante el mismo período de tiempo, un suelo testigo no dese­cado no mostró variaciones pronunciadas en el número de bacteriasy hongos ni en la producción de COI'

La reacción del suelo, esto es, su grado de acidez o alcalinidad,indicado por la concentración de iones hidrógeno, ejerce una señaladainfluencia sobre el número de bacterias del mismo. Los suelos ácidoscontienen una población bacteriana muy baja y, en su mayor parte,en forma de esporas inactivas. A este respecto, es instructivo el si­guiente cuadro de valores, determinados por Drewes (28) en diversoslugares de un terreno turboso ácido:

pHPorcentaje

Bacterias por gramo de bacterias en formade suelo de esporas

14.000

36.000

95. 000

2°5·000360.000

74°·000

100

91

3°15II

J6

El grado en que la acidez del suelo llega a ser perjudicial para eldesarrollo de las bacterias varía con la clase de éstas; algunas, comoAzotobacter, no pueden tolerar un pH inferior a 6. Según Olsen (74).el proceso de amonización tiene lugar en suelos cuyo pH oscile entre3.7 y 9, pero alcanza el máximo de actividad para un pH entre 7 y 8.5.La nitrificación puede verificarse en suelos cuyo pH oscile entre 3,7y 8.8. estando únicamente limitada, entre pH 4 y pH 8, por la rapidezde la formación de amoníaco en el suelo.

Con la profundidad disminuye el número de bacterias por gramode suelo. Waksman (99) encontró para diferentes profundidades y endiversas clases de suelos los siguientes resultados:

CLASE DE SUELO I PROFUNDIDAD EN CENTíMETROS

2.5 10 20 30 So 75

Jardin............. 7.202.000 7.737.000 3.99 8.000 1.312.000 624.000 381.000

HUerta ··

I

8.257.000 5.577.000 2.863.000 1.527.000 574. 000 347. 000Pradera............ 10·J33·000 5.75 8.000 2.85°·000 1.007·000 37°·000 236.000ForestaL .......... 2.088.000 1.17 2.000 482.000 3II .000 169.000 14°·000

- 122-

DE ~ONGOS - "'ILLAQ~S.

~ &DE BACTERIAS - MILLONES_

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FIG. 5·-Variaciones del desarrollo microbiano a continuación del hUllle(!<-cillliento deun suelo seco. (Segun Waksman y Starkey.)

De numerosos estudios (15 y 81) sobre la distribución de las bac­terias en los diversos horizontes del suelo se desprende que el númerode bacterias no decrece gradualmente, sino por saltos, al pasar deuno a otro de los subhorizontes. En los suelos podsólicos suele encon-trarse el mayor número de bacterias en los subhorizontes Ao-Ai . ~.N'

Otro factor de preponderante influencia sobre el número y .~~./Ib ••~'"

de ~acterias del ~uelo es.el uso o aplicación que ~ haga de él. ,L,9sarie: ...... CJ'los incultos contienen siempre una menor cantidad de bactérjas qut ·.t~,

los suelos cultivados, sobre todo cuando éstos son abonados con'ft1ateri~ ~}orgánica. En algunos casos, la inadecuada aplicación de abonos mine-"rales puede ser perjudicial, como en el caso de repetidas ad~esde sulfato amónico en suelos escasos en carbonato de cal, lo que pneV.!e'elevar la acidez del suelo hasta un grado tal, que aminore grandementeel número de bacterias.

El número de organismos en suelos cultivados puede llegar a du­plicar al de los suelos vírgenes correspondientes, y es mayor en loscultivos de trigo, por ejemplo, que en los de alfalfa (44). La nitrifica­ción y la fijación del nitrógeno son también dos veces más activasen las tierras sometidas a cultivo.

En el cuadro de Waksman, anteriormente reproducido, puedeverse que el número de bacterias en los suelos forestales es inferioral de los cultivos agrícolas, indudablemente a causa de la mayor acidezde los primeros, siendo de destacar que las bacterias fijadoras denitrógeno soportan mayor grado de acidez en los suelos forestales queen los agrícolas, y que las bacterias destructoras de celulosa, tantoaerobias como anaerobias, se encuentran en suelos forestales aun conun pH hasta de 4,3 (102).

Según Bokor (13), el contenido bacteriano, en los suelos forestales,crece al pasar de masas puras de resinosas a masas puras de frondosas,y de éstas a masas mezcladas de resinosas y frondosas, siguiendo lamisma variación que el contenido en hum1lS y capacidad de aire delsuelo.

El número de bacterias del suelo, en un mismo lugar, puede pre­sentar variaciones considerables de un día a otro (23). que se han rela­cionado con las actividades de algunos protozoos del suelo, ya quese han observado cambios diarios en el número de amibas activas delsuelo en sentido inverso al del número de bacterias. Por tanto, parecetratarse de un equilibrio entre los diversos miembros de la poblacióndel suelo, cuyo punto de equilibrio cambia a intervalos frecuentes.

Además de estos cambios frecuentes, el número de bacterias del

- 123 -

ESTACION DE

B A CTERIA S

FECHA pH

I AlUlOBIAS ANAIlROBIAS

ITOTAL

l .... , 3.600. 000 3.700.000 7.300. 000 5. 14

I1 ..... 1·710.000 13°·000 1.84°.000 6.94_

111..... 2.500. 000 60.000 2·560.000 6•.52

IV..... 3. 100.000 55°·000

I

3.65°.000 6.72

V..... 9·000.000 35°·000 9.350•000 6.80

Año 1929 ... , .. ,VI. .... 20.000.000 1.300. 000 21.300. 000 7.25

VII. .... 4°·000.000 2.500.000

I42.5 00. 000 7.4°

VIII. .... • • • 7.86

IX..... 9·000.000 200.000 I 9.200.000 7.61I

X ..... 3.400.000 1.800.000 I 5·200.000 5.62XL .... ,! 1.000.000 100.000 1.100.000 5.42

XII .... '11 1.200.000 3°·000 I 1.23°·000 5. 10

Il'

l. .... 11 600.000 3°·000 63°·000 4.84

11.. "'Ii 200.000 4°·000 I 24°.000 5.24

AO"93" I111..... • • • 5.31IV ..... , 4.3 00. 000

I20.000 4.3 20.000 5.54

V..... • • • 5.8 1

VI. .... • • • 6.02 I

VIl ..... 25.400. 000 1.35°·000 26·75°·000 6.23VIII. .... • • • 6•.57

IX..... 4. 600. 000 100.000 4.7 00. 000 6.18

\X ..... • • t 5.82

XI. .... 2.5 00.000 55°·000 3·°5°·000 5.44\ XII..... 7·Soo.000 2S0.ooo 7·7.5°·000 4.5 1

I l. .... 2·300.000 500.000 2.800.000 5.n, II..... 2.000.000 700.000 2.700. 000 S.25

III. .... 3.300. 000 300. 000 3.600.000 S.93IV ..... 4. 100. 000 200.000 4·300.000 4.91

V..... 4.800.000 soo.ooo 5·300.000 4.82

Año 1931 ... , ...VI. .... 16.800.000 1.300.000 18.100.000 5.00

VIl ..... 10.100.000 500. 000 10.600.000 4.90VIII..... 3·45°·000 500.000 3·95°·000 4.95

IX..... 2.900.000 900.000 3.800. 000 5.06

X·····

1

3·900.000 25°·000 4.15°.000 5.57XL .... 5. 200.000 65°·000 5.85°.000 6.16

\ XII..... , 1.800.000 400.000 2.200.000 5.0S

=

- 124 -

ENSAYO NUM. 11

'1'JQIPOATUJtA TIUO'BllA'l'UJU. 'lJUlPJUtATUIlA 'lICNPEIlATUIlA

BUlIIUS HUIOUlAD SUPEJl.FICIAJ, DEI, LI.UVIAS DEI, SUEI,O DEI. AIRE

DEI, SUEJ,O A I JI. E POJl.HUJmDAD POR LI.UVIAS- - -- - - -

Por 100 Por lOO Centígrados Centígrados Milbnetros RI R.s

1.60 13.9 - 0.3 - 5. 2 7°.3 138.5 338

1,46 14.8 - 1.5 - 11,2 11.0 126.0 - 13

1.21 15,9 0.45 3,6 1.°.7 166.2 146

1.05 13,1 3.85 8.6 47.9 180.9 891

0,73 u.8 9.9 16,5 63.3 234.5 16770.91 13.9 10.0 I 17.6 68.5 278•0 IBg2

0.99 19.1 15.5

I20.9 83.0 487.0 2569

I 6.9 15.5 20.6 48.8 176•0 1495

3,25 5.8 14.1 I 16.9 12.8 139.5 344

2.50 8,1 9.7 9.2 63.9 159.6 1228

J.# 8.9 5.5 5. J 82.7 138•0 uSo

1,54 11.7 4.3 3.3 22.8 J67.2 320

J.55 14.5 1.4 0.6 4.6 165.4 49

1.55 16.8 - 0.14 - 2.7 6 63.5 165.6 459I 16.6 2.4 3.9 72.5 206.0 1009

3.02 18.8 5.7 7.9 54.7 295.1 981

I 17.6 8.7 10.4 65. 2 329.0 1329

I 16.8 10.7 15.9 39.0 353.0 1010

J.3 1 16.6 14,5 17,1 59.6 418•0 1612

I 10,8 14.3 16,3 19.7 262.4 518

0,36 12.0 12.7 , 13,4 48.5 7.72•2 II36:

I 14.6 8.2 9,2 62.8 266,0 1208

1,34 16.9 5,9 5.9 71.5 268,0 II39],02 23.3 0,6 - 0,46 69,6 247,0 695

I

1.16 20,2 - 0,9 - 0,96 13.7 183.7 136

1,12 18.0 - 0.7 - 0.68 56.7 167.8 564

1,09 19.7 - 0.47 °.35 30•8 188.2 318

1,43 20.3 2,8

15.79 32,1 259.9 507

1,69 18.0 10.4 14.4 18.0I

367. 0 4391.10 16.5 13.9 17.6 59.5 394.0 16430.63 9.0 15,0 18.5 8 47.5 225,0 1356

2.08 13.0 14.3 1 16,12 58,2 116.0 1520

2,19 12,1 8.7 15,8 60,4 226,2 1560

1.53 13,2 7.6 11,3 45,0 224. 2 959

0·94 18,6 3.8 5.7 10,3 256.7 1640,93 18.0 - 0.6 - 1,2 17,6 169 .8 174

_•... - p.- -,- ..

- 125-

suelo presenta variaciones durante el transcurso del año. De las va­liosas experiencias de Fehér (33), realizadas durante varios años engran número de suelos forestales (algunas de las cuales figuran en elcuadro anteriormente inserto), se deduce claramente que el númerode bacterias aerobias del suelo presenta siempre, en el transcurso delaño, un máximo muy marcado en el centro del verano, que coincidecon la máxima temperatura del aire y del suelo, especialmente en suscapas superficiales, y un mínimo invernal coincidente con las tempe­raturas más bajas. En algunos casos pueden presentarse máximos se­cundarios de ordenada mucho más pequeña en primavera yen otoño.

Aunque el número de bacterias anaerobias experimenta variacio­nes más pequeñas, también señala un máximo estival y un mínimoinvernal.

El principal agente de estas variaciones reside en la energía solar.productora de las variaciones de temperatura del aire y del suelo.

También se deduce de estas experiencias la influencia del conte­nido de humedad del suelo, cuyo influjo es correlativo con la tempe­ratura, aunque menor que el de ésta. En el máximo estival, el con­tenido en humedad del suelo ejerce el papel de factor limitante, mien­tras que en el mínimo invernal, en que las condiciones de humedadson óptimas, corresponde este papel a la temperatura.

La influencia conjunta de la temperatura y de la humedad puedeapreciarse mediante el factor R¡ = temperatura del suelo x conte­nido de humedad.

El pH del suelo varía paralelamente a la actividad bacteriana,coincidiendo, aproximadamente, sus máximos y mínimos con los delnúmero de bacterias.

FIN DE LA SEGUNDA PARTE

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Trabaios d6 las Secciones tU Flora y .'Mapa Forestal, Repoblaciones.Mad81'as. Resinas, Celulosas y Combustibles. 1928. 206 páginas.

Trabajos de las Secciones de Hidráulica Torrencial, Flora y MapaForestal y Resinas. 1928. 164 páginas.

Trabajos de las Secciones de Hidl'áulica Torrencial, Combustibl//s,Vegetalcs, Flora y Mapa Forestal, Resinas. 1929. 143 páginas.

TI'abajos de las Secciones de Suelos, Hidráulica TOrI'mdal, M ad81'as.Celulosas, Resina. Química y Repoblaciones. 1929. 296 páginas.

La Semana Forestal tU Barcelona. Trabajos de las Secciones de Ce­lulosas, Resi1ltlS y Combustibles Vegetales. 1929. 126 páginas.

TI'abajos de las Secciones de Flora, Mapa y Suelos Forestales, Re­sinas y otros fugos e Hidl'áulica Torrencial. 193°.200 páginas.

J. I'l'URRAJ,DIt Y M. SEVILLA: Establecimiento de sitios de ensayo deresinas y resultados obtenidos.-M. To:lo!lEo y J. GARcf.A VIANA:

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ginas.E. MORALES: AndUsis mecánico, físicoqulmico y químico de los sue­

los forestales. 1936. 57 páginas .

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17 J. BENITO MA.RTíNItZ: Valor eficau].e U" antiséptico. 1939.50 pá-ginas. . . . . . 7·-

18 A. CID Y RUIZ-ZOllRlJ.I,A: La resinaci6n del Pinus pinaster en losmontes tU las llanuras de Castilla. 1941. I.4I páginas. 7,-

19 O. EI,oRRIltTA.: Ordenaci6n econ6mica de la producci6n agraria.

Afio 1941. 166 páginas. . . . . 15,-20 J. GARetANJ,¡JJ;RA: Teorla male1n41ica de la co"ecci6rJ de tom",us.

Afio 1941. 41 páginu . . • . . . • . . . . . 7,-21 G. RIco AVEI,I,O: Fdmlulas aplicables a la inspecci61J de corflbusti-

b~s. 19<41. 47 página.'. . . . . . • . . . . • 7.-22 1. EeJmVJnJúA: E"sa"o de tablas de producci61J e" el Pinus insignia

en el Noru tU Espalla. 1941. 67 páginas. . . 10,-23 J. BJtNIToM.uTiNltZ: Las micosis del Pinus insignia en Guiptúcoa.

Afio 1942. 72 páginas . . . . . . 15,-24 L. PARDO. La Albufera de Valencia. Estudio limnográfico, bioldgi-

ca, econd".ico y antropoldgico. 1942. 268 páginas y 42 lá-minas . . . .. Agotado.

25 F. NÁJRRA: Estudio sobre los perfeccionamientos de que es suscepti-ble el sisuma de resinacidn Hugues. 1942. 44 páginas. . 7,-

26 r. EcHltVEJlJl.iA: Tratamiento del Pinus insignia. Espesuras, claras

" podas. 1943. 153 páginas. . . . . . . . 18,-27 M. MARTÍN BOI,AÑOS: Considllraciones sobre los Ilncinares de Es-

palla. 1943. 106 páginas. • . . . . . 10,-28 J. UGARTR: Estudio analítico de los carbones vegeta/es. 1943. 46 pá-

ginas. . . . . . . . . 7,-29 F. GAI,I,OOO: Compendio de microbiología del suelo. Primera parte:

Procesos biolágicos del suelo. 1943. 129 páginas. . . ., J8,-30 L. VÉI,AZ DR MEDRANO: Contribucidn a la fauna ictioldgica Ilspa-

1I01a. J944. 66 páginas y 15 láminas . 25,-31 l. EcBltV1UUÚA y S. DE PRDRO: El Pinus insignia en el Nort« de

Espaila. Segunda edición. 1944. 54 páginas. . . . . 20,-32 M. MARTíN BOI,AÑos: Impresiones comentadas sobre los eucaliptos

de Sie"a Cabello. 1946.92 páginas. . . . . 20,-33 L. CIeB.u.:r..OS y F ORTUÑO: Notas sobre llora canariense. J947.

31 páginas y JO láminas . . . . 14,-34 M. MARTÍN BOI,AÑos: Ensayo de investigaci6rJ indirecta sobre ori-

gen, desarrollo y producciones del monte alto. J947. J43 páginas. 20,-35 J. AGUADO SMOI,INSKJ: Un caso dll aplicacidn de la Ilstadística ma-

temática a la produccidn forestal. 1947.56 páginas. . . 20,-36 L. VJtI,AZ DIe MEDRANO SANZ: Dos notas sobre ictiología espaftola.

Localidades de B. barbus bacagei Steind., y B. comiza Steind.Formula dentario-faríngea de los barbos. 1947 46 páginas y4 láminas . . . 15,-

37 JESÚS UGARTE LAJSECA: Fitoqulmica forestal. Primera parte. 1947.88 páginas. . . • . . . . . • . . , . . . 15,-

38 J. ECHltVERR1A y S. DE PRDRO: El Pinus pinaster en Ponteoedra.Su productibilidad normal" aplicacidn a la celulosa industrial.Año 1948. 148 páginas y numerosos gráñcos en color. . 40,-

39

43

N. DE BENITO CEBRl!N: Brezales" bresos. 1948. 72 páginas. 1.f di­bujos y 5 mapas .

C. VICIOSO: Estudio sobre el ginero Rosa en Espaila. 1948. II2 pá­ginas. .

L. PARDo: Catálogo de los lagos tU Espda. 1948.522 páginas.E. Zuco: El g/fino Pissodes Germ. en Espaila. 1948. 40 pá­

ginas.P. R1P1t: Invesliga&ione~ sobre nuevos derivados de la colofonia.

1949. IZO páginas .J. UCARTE: Fitoqulmica forestal. Segunda parle. 1949. II 6 pági­

nas y una lámina. .P. GAU'.ltGO: Compefldio de microbiologla del suelo. Segunda parle;

Bacterias del suelo. 1949. 132 páginas.

OTRAS PUBLICACIONES

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l. ECUaVItRR:fA: Celtúosa lellosa. 1928. IIO páginas.P. NÁJBRA: La GuifUla espaflola" su riqueza forestal. 1930. 63 páginas y

52 láminas. • ,L. CEBAI,I,OS y M. MARTÍN BOI,A&OS: Mapa forestal de la provincia de

Ctldiz en escala I : IOO.OOO. 1930.

L. CnAI,I,OS y M. MARTÍN BOI,A:&os: Estudio sobre la vegetaci6n forestalde la provincia de Cádiz. 1930. 353 páginas . .

L. CKlIAI,I,OS y C. VICIOSO: Mapa forestal de la provincia de Mdlaga eft es­Cilla I : IDO.OOO. 1930 .

L. CItBAI,I,OS y C. VICIOSO: Estudio sobre la vegetación y la flora forestal dela provincia de Málaga. 1933.285 páginas . .

G. MARINA: Aves anilladas. 1935. 10 páginas.J. GARc:fA NÁ]ERA: Principios de hidráulica to"rmcial. Su aplicación a la

cOl'1'ección de torrentes. 1943. 294 páginas .M. PRATS ZAPlRAÍN: Orientaciones modernas en el ensayo de semillas fores­

tales. 1944. 84 páginas .P. NÁJERA: La evolución de la téonica en el empleo y aplicaciones de la ma­

dera de construcción. 1944, 132 páginas. .E. GUlNltA: Aspecto forestal del desierto. La vegetación leñosa y los pastos del

54ha"a espaflol. 1945. 150 páginas. •L. PARDO: Diccionario de ictiologla. piscicultura y pesca fluvial. 1945.

340 páginas.W. SCHMIDT: Influencia de la radiactividad en el t"opismo y crecimiento de

las plantas. (Conferencia.) 1943 •W. SCIDaDT: Aspectos actuales de la gent!tica forestal en Europa. (Confe­

rencía.] 1944 • .L. VtI,AZ DE M!U>RANO: La hidrobiolocla en Galicia. (Conferencia.) 1944 •M. PRATS ZAPlRAfN: Producción" consumo de semillas en el año forestal

I943-44. 63 páginas. .

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