การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry)...

การเที�ยบความที�บแสง(Spectrophotometry)

และการใช้�เคร��อง Spectrophotometer


และการใช้�เคร��อง Spectrophotometer

DR. CHATCHAWAN SRISAWAT

BIOCHEMICAL ANALYSIS BIOCHEMICAL ANALYSIS

• Qualitative (ค�ณภาพว�เคราะห์�)

e.g.

to identify the components of a substance or mixture.

Barfoed’s test (test for

monosaccharides)

Commassie blue test

(test for proteins)

xylose glucose fructose lactose sucrose

(disaccharide)(monosaccharide)

Negative Positive

• Quantitative (ปร�มาณว�เคราะห์�)

to determine the amounts or proportions o f the components of a substance.

ระดั�บน้ำ�ตลใน้ำพลสม = 105 mg/dl

Gravimetry(การช้!�ง)

Gravimetry(การช้!�ง)

Accurate

BIOCHEMICAL ANALYSIS BIOCHEMICAL ANALYSIS

but may not be practical!

ระดั�บโปรต�น้ำใน้ำซี�ร� �ม 72= . g/dl

e.g.



เป"นว�ธี�ที��น�ยมใช้�ใน quantitative analysis

กรวิ�เคระห์�ห์ค�ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสรโดัยอศั�ยควิมสมรถใน้ำกรดั%ดักล&น้ำแสงข้องสรที่��ควิมยวิคล&�น้ำห์น้ำ�งๆ

การเที�ยบความที�บแสง (Spectrophotometry) การเที�ยบความที�บแสง (Spectrophotometry)

ส�ห์ร�บสรห์น้ำ*�งๆ จะม�กรดั%ดักล&น้ำแสงไดั�ดั�ที่��ควิมยวิคล&�น้ำ

ห์น้ำ*�งๆ เร�ยกวิ� max

ห์ล!กการห์ล!กการ

h

Io I

ความที�บแสง (absorbance ห์ร�อ optical density [O.D.]) = log Io/I

Absorbance เป-น้ำ 0 เม&�อไม�ม�กรดั%ดักล&น้ำแสง (I = Io)

Absorbance > 0 เม&�อม�กรดั%ดักล&น้ำแสง (I < Io)

Io = light intensity ก�อน้ำผ่�น้ำสรละลย I = light intensity ห์ล�งผ่�น้ำสรละลย



h

Io I

Lambert-Beer’s lawLambert-Beer’s law

0 2 4 8

mg/mlAcc = ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสรละลย

All = ระยะที่งที่��แสงผ่�น้ำสรละลย

l 1

l 2



A = l cA = l c

A= absorbance ห์ร&อ optical density (O.D.)

= ค�คงที่��ข้องกรดั%ดักล&น้ำแสง (extinction coefficient)

l = ระยะที่งที่��แสงผ่�น้ำสรละลยc = ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสรละลย

ดั!งน!&น การว!ดัความที�บแสง สามารถใช้�ว�เคราะห์�ห์าปร�มาณของสารที��ต้�องการต้รวจสอบไดั�

ดั!งน!&น การว!ดัความที�บแสง สามารถใช้�ว�เคราะห์�ห์าปร�มาณของสารที��ต้�องการต้รวจสอบไดั�

O.D. = constant x concentration

เม&�อ ระยะที่งที่��แสงผ่�น้ำคงที่��




ต้!วอย,าง กรห์ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสร A โดัยวิ�ธี�เที่�ยบควิมที่*บแสง

• เตร�ยมสรละลยมตรฐน้ำ (standard solution) ข้องสร A ที่��ร% �ควิมเข้�มข้�น้ำ

• สรละลย unknown ที่��ต�องกรวิ�เคระห์�

• เคร&�องวิ�ดัควิมที่*บแสง (spectrophotometer)

e.g. ไดั�จกกรชั่��งสร A และที่�เป-น้ำสรละลยที่��ม�ควิมเข้�มข้�น้ำที่��ต�องกร เชั่�น้ำ 250 500 1500, , mg/dl


ต้!วอย,าง กรห์ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสร A โดัยวิ�ธี�เที่�ยบควิมที่*บแสง - ว�ธี�ที�� 1

• วิ�ดัค�ควิมที่*บแสง (O.D.) ข้อง standard solutions แล�วิน้ำ�ม plot standard curve.

• วิ�ดัค�ควิมที่*บแสง (O.D.) ข้อง unknown แล�วิอ�น้ำค�ควิมเข้�มข้�น้ำจก standard curve.

ถ�อ�น้ำค� O.D. ข้อง unknown ไดั�0.45

ควิมเข้�น้ำข้�น้ำข้องสร A ~ 1000 mg/dl

011.

018

036

068.


ต้!วอย,าง กรห์ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสร A โดัยวิ�ธี�เที่�ยบควิมที่*บแสง - ว�ธี�ที��2

เน้ำ&�องจกควิมส�มพ�น้ำธี�ระห์วิ�ง O.D. และ ควิมเข้�มข้�น้ำเป-น้ำเส�น้ำตรง


อจวิ�ดัควิมที่*บแสงโดัยใชั่� standard solution เพ�ยงค�เดั�ยวิ แล�วิค�น้ำวิณห์ค�ควิมเข้�มข้�น้ำข้อง unknown ดั�งน้ำ�

Ds = constant x Cs

Du = constant x Cu

Ds, Du = O.D. ข้องน้ำ�ยมตรฐน้ำและ unknown Cs, Cu = concentration ข้องน้ำ�ยมตรฐน้ำและ unknown

1

2

Cu = Du x CsDs


เน้ำ&�องจกควิมส�มพ�น้ำธี�ระห์วิ�ง O.D. และ ควิมเข้�มข้�น้ำเป-น้ำเส�น้ำตรง


อจวิ�ดัควิมที่*บแสงโดัยใชั่� standard solution เพ�ยงค�เดั�ยวิ แล�วิค�น้ำวิณห์ค�ควิมเข้�มข้�น้ำข้อง unknown ดั�งน้ำ�

e.g. Ds ข้อง standard solution 1500 mg/dl = 0.68

Du ข้อง unknown = 0.45

Cu = Du x CsDs

Cu =045. x 1 5 0 0 mg/dl068

Cu = 992 mg/dl

ต้!วอย,าง กรห์ควิมเข้�มข้�น้ำข้องสร A โดัยวิ�ธี�เที่�ยบควิมที่*บแสง - ว�ธี�ที��2


ใน้ำกรณ�ที่��สรที่��ต�องกรวิ�เคระห์�ไม�ม�ส� ( น้ำ��น้ำค&อ ไม�ดั%ดักล&น้ำแสงใน้ำชั่�วิงvisible spectrum ซี*�งใชั่�ใน้ำกรเที่�ยบกรที่*บแสง ) ????

protein (ไม�ม�ส� ) + biuretproduct ส�ม�วิงmax = 550

nm

ใชั่�ปฏิ�ก�ร�ยที่��จ�เพะก�บสรที่��ต�องกรวิ�ดั และให์� product ที่��ม�ส� ซี*�งจะม�ปร�มณแปรผ่�น้ำตมปร�มณสรที่��ต�องกรวิ�เคระห์�และสมรถวิ�ดัไดั�โดัย

วิ�ธี� spectrophotometry

0 2 4 8

g/dl


ใน้ำกรณ�ที่��สรที่��ต�องกรวิ�เคระห์�ไม�ม�ส� ( น้ำ��น้ำค&อ ไม�ดั%ดักล&น้ำแสงใน้ำชั่�วิงvisible spectrum ซี*�งใชั่�ใน้ำกรเที่�ยบกรที่*บแสง ) ????

glucose (ไม�ม�ส�)+ glucose oxidase &

chromogenic substrate p roduct ส�แดัง max = 505

nm

ใชั่�ปฏิ�ก�ร�ยที่��จ�เพะก�บสรที่��ต�องกรวิ�ดั และให์� product ที่��ม�ส� ซี*�งจะม�ปร�มณแปรผ่�น้ำตมปร�มณสรที่��ต�องกรวิ�เคระห์�และสมรถวิ�ดัไดั�โดัย

วิ�ธี� spectrophotometry

ต้!วอย,าง กรวิ�เคระห์� serum protein ( วิ�ธี� biuret) ห์น้ำ� 64

เตร�ยมห์ลอดัที่ดัลอง และเต�มน้ำ�ยตมล�ดั�บ

Standard Unknown

น้ำ�ยโปรต�น้ำมตรฐน้ำ 7 g/dl ( -50l)

serum () - 50 น้ำ�ย biuret (ml) 4 4

ผ่สมต�งที่�งไวิ�อย�งน้ำ�อย 5 น้ำที่� แล�วิเที่�ยบควิมที่*บแสงที่�� 550 nm


Blank

น้ำ�เกล&อน้ำอร�ม�ล ( ) - -50

4

--

ห์ลอดัน-&ายา blank ค�ออะไร?

ห์ลอดัที่��ม�น้ำ�ยห์ร&อสรที่6กอย�งที่��ใชั่�ที่�ปฎิ�ก�ร�ย แต�ไม�ม�สรที่��ต�องกรตรวิจ

h

Io I

เน้ำ&�องจกต�วิน้ำ�ยห์ร&อสรที่��ใชั่�ที่�ปฎิ�ก�ร�ย อจม�กรดั%ดักล&น้ำแสงไดั�บ�ง ดั�งน้ำ�น้ำจ*ง ต�องเตร�ยมน้ำ�ย blank เพ&�อใชั่�ปร�บค� O.D. ให์�เป-น้ำ 0 ก�อน้ำที่��จะใชั่�วิ�ดั O.D. ข้อง

standard ห์ร&อ unknown

blank

น้ำ�ย biuret น้ำ�ย biuret + protein

unknown

h

Io I


ต้!วอย,าง กรวิ�เคระห์� serum protein ( วิ�ธี� biuret) ห์น้ำ� 64

ห์ลอดัน-&ายา blank ค�ออะไร?

ห์ลอดัที่��ม�น้ำ�ยห์ร&อสรที่6กอย�งที่��ใชั่�ที่�ปฎิ�ก�ร�ย แต�ไม�ม�สรที่��ต�องกรตรวิจ


ต้!วอย,าง กรวิ�เคระห์� serum protein ( วิ�ธี� biuret) ห์น้ำ� ???

Standard Unknown



Blank


4

--

Spectronic 20 - analog readingSpectronic 20 - analog reading

การใช้�เคร��อง spectrophotometerการใช้�เคร��อง spectrophotometer


วิ�ธี�กรใชั่�เคร&�องจะม�บอกไวิ�ที่��ต�วิเคร&�อง ให์�น้ำ�กศั*กษที่�ไปตมข้�น้ำตอน้ำดั�งกล�วิ วิ�ธี�กรใชั่�เคร&�องจะม�บอกไวิ�ที่��ต�วิเคร&�อง ให์�น้ำ�กศั*กษที่�ไปตมข้�น้ำตอน้ำดั�งกล�วิ

1. Turn on - warm up 15 min1. Turn on - warm up 15 min


ที่งห์�อง lab จะที่�กรเป9ดัเคร&�องและ warm up ให์�ก�อน้ำกรใชั่�งน้ำ

2. Set zero % transmittance2. Set zero % transmittance


h

Io I Transmittance = IIo

Absorbance (O.D.) = log (Io/I)

3 . Set wavelength lll l lllllllll3

Wavelength adjustment knob


ปกต�น้ำ�กศั*กษไม�ต�องปร�บ wavelength เอง ที่งห์�อง lab จะปร�บให์� แต�ควิร ตรวิจสอบให์�แน้ำ�ใจวิ� เคร&�องที่��ใชั่�วิ�ดั ไดั�ต�งค� wavelength ที่��ถ%กต�อง

4. Insert blank4. Insert blank


ถ�ยน้ำ�ย blank ลงใน้ำ cuvette แล�วิ ใส�ลงใน้ำcuvette holder

cuvettecuvette


Cuvette = ห์ลอดัแก�วิพ�เศัษส�ห์ร�บใชั่�ใน้ำกรเที่�ยบควิมที่*บแสง

•ให์�น้ำ�กศั*กษใชั่�ดั�วิยควิมระม�ดัระวิ�งเน้ำ&�องจกม�รคแพง

• สรละลยที่��ใชั่�จะวิ�ดัควิมที่*บแสงจะถ%กถ�ยลงใน้ำ cuvette ก�อน้ำที่��จะใส�ลงใน้ำเคร&�อง spectrophotometer

• ก�อน้ำใชั่� cuvette ควิร rinse cuvette ดั�วิยน้ำ�ยที่��จะอ�น้ำ 1-2 คร�ง

• ควิรม�น้ำ�ยใน้ำ cuvette ~ 1/2 ข้องห์ลอดั ( อย�งน้ำ�อยส6ดั ~ 1/3)

h

Io I

แต�ไม�ควิรใชั่�น้ำ�ย rinse มก จน้ำที่�ให์�เห์ล&อน้ำ�ยไม�พอส�ห์ร�บอ�น้ำ O.D.

การใช้� cuvette การใช้� cuvette


• จ�บ cuvette ให์�ถ%กวิ�ธี�



• ก�อน้ำที่��จะใส� cuvette ลงใน้ำเคร&�อง spectrophotometer ให์�เชั่:ดัข้�งห์ลอดัดั�วิยกระดัษที่�ชั่ชั่%ให์�สะอดัเสมอ

• sample holder ข้องเคร&�อง spectronic 20 จะม�ข้�ดั (ล%กศัรชั่�) ที่��เป-น้ำ เคร&�องห์มย เพ&�อให์�ใส� cuvette ไดั�ถ%กต�อง โดัยเคร&�องห์มยข้�ดัข้วิบน้ำห์ลอดั

cuvette ต�องตรงก�บข้�ดับน้ำ cuvette holder



4 -5. Insert blank - set 0 absorbance or 100% transmittance (set full scale)

4 -5. Insert blank - set 0 absorbance or 100% transmittance (set full scale)


h

Io Iblank

น้ำ�ย biuret น้ำ�ย biuret + protein

unknown

h

Io I

6-7. Insert unknown - Read absorbance6-7. Insert unknown - Read absorbance


* กรอ�น้ำค�จกเคร&�อง spectronic ที่��เป-น้ำ analog reading ควิรม�ควิม รอบคอบใน้ำกรอ�น้ำ โดัยเฉพะกรอ�น้ำค�จ6ดัที่ศัน้ำ�ยมและกรแบ�ง scale ซี*�งเป-น้ำ

ข้�น้ำตอน้ำที่��ม�กผ่�ดัพลดัไดั�บ�อย

* กรอ�น้ำค�จกเคร&�อง spectronic ที่��เป-น้ำ analog reading ควิรม�ควิม รอบคอบใน้ำกรอ�น้ำ โดัยเฉพะกรอ�น้ำค�จ6ดัที่ศัน้ำ�ยมและกรแบ�ง scale ซี*�งเป-น้ำ

ข้�น้ำตอน้ำที่��ม�กผ่�ดัพลดัไดั�บ�อย


Thermo Spectronic - digital readingThermo Spectronic - digital reading


ป6<มป9ดั/เป9ดัป6<มป9ดั/เป9ดั ป6<ม set zero absorbance (set full scale) ป6<ม set zero absorbance (set full scale)

Wavelength adjustment knob


ถ�ต�องกรอ�น้ำabsorbance ให์�

กดั switch มที่��ต�แห์น้ำ�งดั�งกล�วิ

ถ�ต�องกรอ�น้ำabsorbance ให์�

กดั switch มที่��ต�แห์น้ำ�งดั�งกล�วิ

วิ�ธี�กรใชั่�เคร&�องวิ�ธี�กรใชั่�เคร&�อง


1. Turn on - warm up 15 min1. Turn on - warm up 15 min

2 lll llllllllll.2 lll llllllllll.

* เคร��อง Thermospectronic ไม,ต้�อง set zero transmittance เห์ม�อนเคร��อง Spectronic 20


3 - 4. Insert blank and set zero absorbance (set full scale)

3 - 4. Insert blank and set zero absorbance (set full scale)

5-6. Insert sample and read absorbance

5-6. Insert sample and read absorbance


สร�ปส��งที��ต้�องที-า กรวิ�เคระห์� serum protein ( วิ�ธี� biuret)

เตร�ยมห์ลอดัที่ดัลอง และเต�มน้ำ�ยตมล�ดั�บStandard Unknown



• ผ่สมต�งที่�งไวิ� 5 น้ำที่� แล�วิเที่�ยบควิมที่*บแสงที่�� 550 nm

Blank


4

--

• ค�น้ำวิณควิมเข้�มข้�น้ำข้องโปรต�น้ำใน้ำสรละลย unknown

Cu = Du x CsDs

• ปร*กษอจรย�ผ่%�ดั%แลใน้ำห์�องถ*งวิ�ธี�ใชั่� และ สเห์ต6ที่��อจที่�ให์�ไดั�ค�ไม�แม�น้ำย�• อจจะที่�ซี�ไดั�ถ�ต�องกรแก�ไข้ข้�อบกพร�องห์ร&อเพ��มควิมชั่�น้ำญ

• น้ำ�กศั*กษอจไดั� llllll l ซี�ร� �มที่��ม�ห์มยเลข้แตกต�งก�น้ำ ซี*�งค�ข้อง unknown ค&อ

No. table ห์รดั�วิย 3 เห์ล&อเศัษ 1 = unknown ห์มายเลข 1 = 4.0 (3.4 – 4.5) g/dl

No. table ห์รดั�วิย 3 เห์ล&อเศัษ 2 = unknown ห์มายเลข 2 = 7.7 (7.3 – 8.2) g/dl

No. table ห์รดั�วิย 3 ลงต�วิ = unknown ห์มายเลข 3 = 9.7 (9.4 – 10.0) g/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry)...

Documents

Transcript of การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry)...