ANTI-EBV EA IgM ELISA

96 807015Analisi immunoenzimatica per la determinazione in vitro di anticorpi IgM contro l’antigene precoce (EA) p54/p138 del virus di Epstein-Barr in siero o plasma umano

SOMMARIO

1. USO PREVISTO .............................................................................51

2. PRINCIPI DELLA PROCEDURA ....................................................51

3. REAGENTI .....................................................................................52

4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI ...................................................53

5. CAMPIONE ....................................................................................54

6. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO...........................54

7. ISTRUZIONI PER L’USO ...............................................................54

8. CONTROLLO QUALITÀ .................................................................56

9. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ............................................56

10. LIMITAZIONI DEL TEST ................................................................57

11. RISULTATI PREVISTI ....................................................................58

12. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE .....................................58

13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ...................................................58

14. GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI .............................59

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1. USO PREvISTOAnti-EBV EA IgM ELISA è un sistema per uso diagnostico in vitro per la determinazione di anticorpi IgM contro gli antigeni precoci (EA) p54 e p138 del virus EBV. I risultati ottenuti con questo test, congiuntamente ad altri dati clinici e relativi a pazienti, ottenuti in saggi per la ricerca di altri anticorpi specifici per il virus Epstein-Barr, quali IgG anti-EA, IgG/IgM anti-VCA e IgG anti-EBNA-1, agevolano la diagnosi sierologica dell’infezione da EBV. L’infezione primaria da EBV può avere esito in mononucleosi infettiva (IM = morbo di Pfeiffer) (1,2). La malattia si verifica in modo predominante tra gli adolescenti più prossimi all’età adulta e tra gli adulti giovani. La malattia acuta può essere caratterizzata dalla seguente sintomatologia: febbre, faringite, tonsillite, linfoadenopatia, nausea, mal di testa, mialgia, epato-splenomegalia, leucocitosi (2). Altri agenti infettivi patogeni, quali Citomegalovirus, Toxoplasma gondii, virus della Rosolia, virus dell’epatite, virus dell’immunodeficienza umana (HIV) possono causare sintomi simili. Anti-EBV EA IgM ELISA può essere impiegato per identificare un’infezione da EBV.

2. PRINCIPI DELLA PROCEDURAAnti-EBV EA IgM ELISA è un’analisi immunoenzimatica (enzyme immuno sorbent assay, ELISA) indiretta ad elevata sensibilità per la determinazione di anticorpi specifici per l’EBV nel siero o nel plasma. Durante la prima fase di incubazione gli anticorpi IgM del campione si legano agli antigeni ricombinanti (rec) p54 e p138 (3-5) rivestiti per la micropiastra. Il materiale aspecifico sarà rimosso mediante lavaggio. Il complesso risultante antigene-anticorpo viene rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale specifico marcato con enzimi, diretto contro le IgM umane. Il coniugato legato in modo non selettivo sarà rimosso in un’ulteriore fase di lavaggio. Nella fase di incubazione finale, la soluzione di substrato (TMB, 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina) viene aggiunta nei pozzetti. La reazione enzimatica viene bloccata aggiungendo acido solforico (la colorazione cambia da blu a gialla) e la densità ottica (OD) è misurata con uno spettrofotometro a 450 nm e con un filtro di riferimento di 615-690 nm.

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3. REAGENTILe quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l’esecuzione di 96 testi. Tutti i reagenti sono destinati all’uso esclusivo nella diagnostica in vitro.

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Identificazionesull’etichetta

Descrizione Presentazione

R1 Microplate Micropiastra: 12 singoli strip con 8 pozzetti ciascuno, rivestiti di antigeni ricombinanti p54/138 EA-EBV (concentrazione: ≥ 0,4 μg/ml)

1Pronto per l’uso

R2 EBV Concentrated Washing Solution

(500x)

Soluzione di Lavaggio Concentrata (x 500):Conservante: 2-bromo-2-nitro-1,3-propandiolo 0,01%

1 x 6 ml Da diluire

R3 EBV EA IgM Negative Control

Controllo Negativo IgM EA EBV: Siero umano negativo per anticorpi IgM anti EBV-EA e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV Conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05%

1 x 1,2 ml Pronto per l’uso

R5 EBV EA IgM Positive Control

Controllo Positivo IgM EA EBV: Siero umano reactivo per anticorpi IgM anti EBV-EA e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV Conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05%

1 x 1,2 ml Pronto per l’uso

R6 Conjugate Anti-IgM Umane Coniugato: Anticorpo monoclonale marcato con perossidasi di rafano Conservante: penicillina V 0,025%, solfato di streptomicina 0,025%, ProClin™ 300 < 1,5%

1 x 15 ml Pronto per l’uso

R7 EBV Sample Diluent

Diluente per campioni: Conservante: solfato di neomicina 0,01%, cloramfenicolo 0,03%

1 x 45 ml Pronto per l’uso

R9 EBV Chromogen

TMB

Cromogeno: 3,3´,5,5´ Soluzione di tetramethylbenzidina (TMB) < 0,05 % in H2OVedere Avvertenze e Precauzioni

1 x 13 ml Pronto per l’uso

R10 EBV Stopping Solution

Soluzione Bloccante: Acido solforico < 1 N H2SO4

1 x 15 ml Pronto per l’uso

Conservanti: concentrazione totale < 0,11%

Requisiti per la manipolazione e la conservazioneI reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata su ciascuna singola etichetta, a condizione che gli stessi siano conservati ad una temperatura di 2-8°C. Dopo l’apertura, i reagenti devono essere utilizzati entro 30 giorni. In caso di test ripetuti, avere cura di conservare i reagenti subito dopo l’utilizzo, ad una temperatura di 2-8°C. La micropiastra è sigillata in un involucro di alluminio contenente essiccante e deve essere aperta solo una volta raggiunta la temperatura ambiente. Riporre le strip non utilizzate insieme all’essiccante nella busta con chiusura a zip e conservare come indicato a 2-8°C. Non toccare il bordo superiore o il fondo dei pozzetti con le dita.

4. AvvERTENZE E PRECAUZIONINon ingerire i reagenti. Evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Tutti i campioni e i materiali utilizzati per l’analisi devono essere trattati come potenzialmente infetti, adottando adeguate precauzioni di sicurezza. I controlli sono negativi per anti-HIV 1/2, anti-HCV, HBsAg, anti-sifilide e transaminasi elevate. Non pipettare con la bocca. Adottare idonee pratiche di laboratorio indossando guanti, abbigliamento e occhiali protettivi adeguati. I liquidi e i materiali non combustibili devono essere decontaminati con ipoclorito di sodio (concentrazione finale: 3%, con tempo di attività di almeno 30 minuti). I rifiuti liquidi che contengono acidi devono essere neutralizzati prima di essere eliminati. Le micropiastre e tutti i materiali da riutilizzare devono essere autoclavati per 1 ora a 121°C. Il Cromogeno (R9) è sensibile alla luce ed è quindi necessario proteggerlo dalla luce stessa. Il test deve essere eseguito da tecnici di laboratorio autorizzati ed adeguatamente addestrati. La procedura richiede condizioni asettiche e microbiologicamente controllate. Se il kit originale è danneggiato informare il produttore.

AVVERTENZA: Alcuni reagenti contengono ProClin™ 300 < 1.5%

Per i rischi e le raccomandazioni di sicurezza consultare la tabella alla fine dell’inserto della confezione.

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Identificazionesull’etichetta

Descrizione Presentazione

Storage Bag Sacchetto per Conservazione: Sacchetto in polietilene per conservare le strip per micropiastra residue

1

Self-adhesive transparent

foils

Pellicole Trasparenti Adesive: Pellicole trasparenti adesive per sigillare i pozzetti della micropiastra durante l’incubazione

4

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5. CAMPIONEÈ necessario utilizzare campioni di siero o di plasma freschi, privi di emolisi. Campioni di siero o plasma fortemente lipemici, itterici o microbicamente contaminati e preparati di immunoglobuline concentrati potrebbero compromettere l’affidabilità dei risultati del test. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Se è necessario trasportare i campioni, confezionarli conformemente alle direttive in vigore per il trasporto di materiale infetto. Non inattivare i campioni, per evitare reazioni aspecifiche.

6. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITOMicropipette, spettrofotometro (450 nm, lunghezza d’onda di riferimento 615-690 nm), sistema di lavaggio micropiastra (con lavaggio del fondo), incubatrice (37°C) per micropiastre.

7. ISTRUZIONI PER L’USO

Preparazione dei reagentiDiluire la Soluzione di Lavaggio Concentrada (R2) con acqua demineralizzata o deionizzata (1:501). La Soluzione di Lavaggio così preparata rimane stabile per 1 settimana, a condizione che sia conservata a 2-8°C. Tutti gli altri componenti per il test vengono preparati in modo da essere pronti per l’uso. Tutti i reagenti sono specifici per lotto e non possono essere utilizzati con kit di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri produttori.

Preparazione dei campioniSi raccomanda di attenersi strettamente al protocollo (vedere la procedura di pipettamento).• Diluizionecampione1:21conprediluizioneinprovette: Diluire i Controllo Negativo (R3), Controllo Positivo (R5) e i campioni a 1:21

in una provetta (ossia 25 μl di controllo o campione + 500 μl di Diluente (R7)). Miscelare accuratamente.

• Diluizionedelcampione1:21condiluizionedirettamentenellapiastra: Pipettare 200 μl di Diluente (R7) in ciascun pozzetto. La diluizione effettuata

direttamente nella micropiastra è consigliata soprattutto con l’utilizzo di pipettatrici automatiche. Se la diluizione effettuata nella piastra viene eseguita manualmente, è importante evitare legami aspecifici di proteine, attenendosi alle seguenti fasi: Pipettare prima 200 μl di Diluente (R7) nel pozzetto, quindi aggiungere 10 μl di campione o controlli. Miscelare da 5 a 7 volte, aggiungendo 10 μl di campione o controllo.

Procedura di lavaggioLa procedura di lavaggio ha un’importanza primaria. Un lavaggio insufficiente potrebbe compromettere la precisione e provocare reazioni aspecifiche.

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Lavare 5 volte con soluzione tampone. Per farlo, rimuovere il liquido nel pozzetto ed erogare 300μl di soluzione tampone. Ripetere la procedura di lavaggio 5 volte. A lavaggio terminato, picchiettare sulla piastra. Non lasciare che la piastra diventi secca.

Procedura di pipettamento per la determinazione qualitativa delle IgM (provetta di diluizione)

* Se viene impiegato un sistema ELISA, è responsabilità dell’operatore convalidare il test.

Consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima dell’uso.

I controlli e il bianco devono essere pipettati per ultimi. Dopo avere pipettato i controlli e i campioni, procedere immediatamente all’incubazione della piastra.

Fase 1 Pozzetto [µl]

A1/B1 C1/D1 E1/F1 G1…

Blanco 200 μl R7 - - -

Doppio test Controllo Negativo (R3) - 200 μl R3 - -

Doppio test Controllo Positivo (R5) - - 200 μl R5 -

Campione 1:21 - - - 200 μl Campione

Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*)

Incubazione 60 ± 2 min., 37 ± 1°C Sistema*: 60 ± 2 min., 37 ± 1°C

Lavaggio 5x

Soluzione di Lavaggio Diluata (R2) 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl

Fase 2 Pozzetto [µl]

Coniugato (R6) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*)

Incubazione 30 ± 1 min., 37 ± 1°C Sistema*: 30 ± 1 min., 37 ± 1°C

Lavaggio 5x

Soluzione di Lavaggio Diluata (R2) 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl

Fase 3 Pozzetto [µl]

Cromogeno (R9) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

Incubazione 30 ± 1 min., a temperatura ambiente e al buio

Sistema*: 15 ± 1 min., a temperatura ambiente e al buio

Soluzione Bloccante (R10) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

Misurare l’estinzione immediatamente o entro 15 minuti dopo il bloccaggio a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d’onda di riferimento: 615 - 690 nm).

8. CONTROLLO QUALITÀTutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità, dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad.

9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATII campioni con un valore di estinzione al di sotto dell’area grigia sono da considerarsi negativi. Un campione che presenti un valore di estinzione uguale o maggiore rispetto alla zona grigia, è da considerarsi positivo per anticorpi IgM specifici per EA-EBV. Se il valore OD del campione ritestato è compreso nella zona grigia (risultato non affidabile), si consiglia di richiedere un campione di controllo.

Calcolo del valore di cut-off e dell’area grigiaIl valore di cut-off viene calcolato dal valore medio OD (densità ottica) del Controllo Negativo (R3X) più 0,200:

• Valeurseuil=R3X + 0,200

L’area grigia si estende tra il valore di cut-off e il valore di cut-off meno 10%.

Criteri di convalida della determinazione qualitativaDopo la misurazione dei valori di estinzione a 450 nm in tutti i pozzetti (filtro di riferimento: 615-690 nm), il valore medio dei bianchi viene sottratto dai valori di estinzione dei controlli e dei campioni:

• Estinzionemediadeibianchi≤ 0,100 OD

Dopo la sottrazione del bianco, i valori di controllo devono soddisfare i seguenti criteri di validità:

• ValoreODmediodiR3≤ 0,200• ValoreODmediodiR5≥ 0,400

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Schema intepretativo del test IgM EA

10- LIMITAZIONI DEL TESTUn risultato negativo del test ottenuto con l’analisi Anti-EBV EA IgM ELISA non è sufficiente per escludere completamente un’infezione da EBV. I risultati dell’analisi vanno interpretati congiuntamente alle informazioni disponibili sulla valutazione clinica del paziente e ad altre procedure diagnostiche. I risultati ottenuti testando campioni prelevati da pazienti immunodepressi non sono semplici da interpretare. Il test potrebbe fornire risultati falsamente positivi per individui che abbiano ricevuto trasfusioni di sangue o altri prodotti emoderivati nei mesi immediatamente precedenti. Anti-EBV EA IgM ELISA è stato impiegato con i seguenti campioni con potenziale reattività crociata: campioni con positività per gli anticorpi anti-Varicella stato acuto (6), positività per gli anticorpi anti-Citomegalovirus stato acuto (6), anti-Herpes simplex tipo 1 e 2 (5) e anti-Toxoplasmosi (5). Nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo con Anti-EBV EA IgM ELISA.

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Stato dell’infezione da EBV

Tipologia di reazione Anti-EBV EA + EBNA ELISA

EA IgM

EA IgG

EBNA IgG

IgM EA soglia

(DO=0,5)

EBNA soglia

(DO=0,5)

Infezione acuta

Fase precoce + – – ≥ 0,5 –

Infezione primaria + + – – –

Infezione primaria + + (+) – < 0,5

Fase tardiva – + – – –

Infezione acuta incerto

Sieronegativo – – – – –

Fase precoce incerto (+) – – < 0,5 –

Fase tardiva incerto + – (+) – < 0,5

Riattivazione

Secondaria (debole) + – + ≥ 0,5 ≥ 0,5

Riattivazione + + + – ≥ 0,5

Infezione precedente

Infezione precedente – + + – –

Infezione precedente – – + – –

Infezione precedente (+) – + < 0,5 –

11. RISULTATI PREvISTI99 campioni di siero prelevati da donatori di sangue sani e asintomatici, sono stati analizzati con il Bio-Rad EA IgM ELISA. Dei 99 campioni, 5 sono risultati positivi (5,05%) e 94 sono risultati negativi (94,95%), il che corrisponde alle statistiche riconosciute per la prevalenza di esposizione all’EBV nella popolazione adulta. La prevalenza varia secondo una serie di fattori quali la posizione geografica, lo stato socioeconomico, la razza, il tipo di test impiegato, le procedure di prelievo e manipolazione campioni e la storia clinica e epidemiologica (5,6). Sono stati analizzati i sieri prelevati da pazienti reduci da malattie da CMV (20), Toxoplasma (20) e reumatoide. (20) Impiegando il sistema EA IgM, EA IgG e EBNA IgG ELISA, è stato possibile identificare 7, 17 e 29 campioni con infezione da EBV primaria, riattivata e precedente (4).

12. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE

Sensibilità e specificitàI risultati ottenuti con il test per la determinazione delle IgM EA anti-EBV unitamente ad altre analisi quali la determinazione delle IgG anti-EA e delle IgG anti-EBNA-1 agevolano la diagnosi sierologica dell’infezione da EBV (3). In pazienti affetti da mononucleosi infettiva (IM), la sensibilità del sistema di test ELISA relativa a queste tre analisi è stata definita pari al 99,2%. La specificità era pari al 98,8% (4).

PrecisioneUn testpanel di 10 sieri rappresentanti campioni con reattività scarsa, bassa ed elevata è stato testato in 11 giorni differenti. La variabilità inter-analisi di questi sieri era compresa nel range 10,0%-16,9%.I campioni dello stesso panel sono stati testati 8 volte nell’ambito dello stesso ciclo di test. La variabilità intra-analisi di questi sieri era compresa nel range 2,8%-6,3%.

13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI1. Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51.2. Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118,

45-58.3. Gorgievski-Hrisoho, M., Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J.,

Vornhagen, R., Sonneborn, H.-H., H., Wolf, H. and Siegl, G. (1990). J. Clin. Microbiol. 26, 2305-2311.

4. Färber, I., Wutzler, P., Wohlrabe, P., Wolf, H., Hinderer, W. and Sonneborn, H. -H. (1993). J. Virol. Meth. 42, 301-108.

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5. Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Wenger-Süss, R. and Sonneborn, H. -H. (1993). Biotest Bulletin 5, 33-46.

6. Tamir, D., Benderley, A., Levy, J. et al. (1974). Pediatrics 53, 330.

14. GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI1. Inatteso alto tasso di risultati reattivi:

a. I campioni e i controlli sono stati pipettati prima di pipettare il Diluente (R7).

b. La miscelazione è stata insufficiente.2. Valore di bianco medio maggiore rispetto al criterio di validità, ≥ 0,100 OD:

a. Il Cromogeno (R9) ha assunto colorazione blu a causa di ossidazione o contaminazione.

b. Errore lavaggio: Eseguire la fase di 5 cicli di lavaggio. Se si utilizza un dispositivo di lavaggio manuale, eseguire una fase di 7 cicli di lavaggio. Utilizzare La Soluzione de Lavaggio (R2) Bio-Rad se contenuto nel kit.

c. Errore durante l’incubazione: Temperatura troppo elevata, il tempo di incubazione è stato superato o la piastra non è stata incubata direttamente dopo il pipettamento.

d. Errore di lunghezza d’onda: La misurazione senza un filtro di riferimento determina un aumento dei valori OD di circa + 0,120 OD.

3. Colorazione gialla in tutti i pozzetti (vedere 2a, 2b):a. Contaminazione del Soluzione de Lavaggio (R2); preparare una nuova

soluzione Soluzione de Lavaggio (R2).b. Contaminazione del Diluente (R7) o del Coniugato (R6); ripetere il

test con reagenti provenienti da fiale sigillate. Utilizzare i reagenti in condizioni di ridotta presenza microbica.

4. Valore medio di Controllo Positivo (R5) ≤ 0,400 OD:a. Superamento della data di scadenza.b. Temperatura troppo bassa o scesa durante l’incubazione.c. Errore lavaggio: Lavaggio troppo intensivo o contatto meccanico del

collettore e della fase solida del pozzetto.d. Contaminazione di Controllo Positivo (R5) o 3b.

5. Valore medio di Controllo Negativo (R3) ≥ 0,200 OD (vedere 1 e 2 a-d):a. Controllo Negativo (R3) non è stato pipettato dopo il pipettamento

dei campioni; pipettare tutti i campioni prima di pipettare i bianchi e i controlli.

b. Contaminazione con il coperchio del Controllo Positivo (R5).

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Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 08/2011 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 881073 www.bio-rad.com

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