נושא העבודה : חלבוניים התלויים בנתיב ה- Signal Recognition Particle...
description
Transcript of נושא העבודה : חלבוניים התלויים בנתיב ה- Signal Recognition Particle...
נושא העבודה :
חלבוניים התלויים בנתיב ה- Signal Recognition Particle
(SRP)בטריפנוזומטידים
תקציר
תפקיד בהובלת חלבונים SRP מחקרים שונים הראו כי ל-•, חלבונים Endoplasmic Reticulum (ER)משני סוגים אל ה-
-Signal Sequenceהנושאים רצף מיוחד הנקרא רצף ההכרה (SS וחלבונים ממברנליים אינטגרליים (חלבונים המשולבים (
בממברנה).
מחקר קודם שנעשה במעבדתנו בטריפנוזומטידים הראה כי •חלבונים נושאי רצף ההכרה אינם תלויים באופן ישיר בחלקיק
. פגיעה בחלקיק לא גרמה לשיבוש המעבר של חלבונים SRPה-לאור תוצאות אלה שאלנו.ER אל ה- SSנושאי
איזה מהחלבוני הטריפנוזומטידים Signalתלויים באופן ישיר ב - Recognition Particle ?
השערתנו היא כי חלבונים ממברנליים אינטגרליים –פוליטופיים, הם אלה
.SRPשתלויים באופן ישיר ב-
כדי לאשש השערה זו בחנו שלושה כיוונים:
חיפשנו שינויים בתבנית החלבונים בין טפילים בהם • ובין טפילים בהם לא הייתה SRPנעשתה פגיעה ב-
פגיעה בו, (החיפוש נעשה בעזרת שימוש באנטיסירה מחיה חולה שהודבקה בטפיל הגורם למחלת השינה).
בחנו את השינוי בחלבון פוליטופי ספציפי – •Nucleoside transporter-במהלך הפגיעה ב SRP.
הפרדנו בין חלבונים ממברנליים וחלבונים •ציטופלסמטיים ואותם חלבונים שעברו שינוי לאחר
אופיינו באמצעות מס-ספקטרומטר.SRPהפגיעה ב-
התוצאות שהתקבלו הראו כי:
אכן יש הבדל בתבנית החלבונים בין • ובין SRPהטפילים בהם הייתה פגיעה ב-
כאלה שלא הייתה פגיעה שכזו.
ירדה nucleoside transporterכמות החלבון •.SRPמשמעותית בעקבות הפגיעה ב-
החלבונים שעלו מאנליזת מס-ספקטרומטר •היו חלבונים השייכים לתהליכים מטבוליים
.Enolase ו-Arginine kinaseבתא,
מבואטריפנוזומטידים -
יצורים חד תאיים שהתפלגו מאוד מוקדם באבולוציה מענף אאוקריוטים ונחשבים ליצורים אאוקריוטים ירודים.
הם כוללים מספר זנים – כולם טפיליים התוקפים בעלי חוליות וגורמים למחלות קשות בחיות בר, משק ובאדם.
בין המחלות שהם גורמים ניתן לציין את "מחלת השינה באדם" , , מחלת Trypanosoma brucei gambienseנגרמת ע"י הטפיל
"Chagas הפוגעת בלב ונגרמת ע"י הטפיל "Trypanosoma cruzi וכן מחלות נוספות.
המחלות הנגרמות מטפילי הטריפנוזומטידים לסוגיהן נפוצות מאוד בעיקר במדינות המתפתחות, הן גורמות
לפגיעה בנפש ולפגיעה כלכלית חמורה אך למרות זאת אין עדין טיפול יעיל כנגדן.
מליון איש חשופים כל שנה לטפיל 60T.brucei וכחצי מיליון נדבקים במחלת
השינה הנגרמת על ידו.
16 וכ-T.cruzi מליון חשופים לטפיל 120" כל שנה.Chagasמליון חולים במחלת “
מליון איש חשופים לטפיל 350 מליון נדבקים במחלות 12הלישמניה וכ-
השונות שנגרמות מטפיל זה.
ישנם שתי קבוצות טפילים עם מחזור חיים שונה:
א. טפילים מונוגנטיים – מתפתחים ומתרבים רק בחרקים כגון: Leptomonas collosoma.
ב. טפילים דיגנטיים – נמצאים בצורת חיים אחת בגופם של חרקים מוצצי דם וצורת חיים אחרת ברקמות או בדם של בעלי חוליות. מחזור
בחרק ושלב procyclicהחיים של טפילים מסוג זה הוא דו-שלבי שלב metacyclic-ב( ביונק T.brucei צורה זו הופכת לצורת bloodstream.)
הטפיל מתרבה ברביה אל מינית במעי הזבוב ועובר לבלוטות הרוק שם הופך
metacyclicלצורת
הזבוב מזריק את החרק למאכסן בזמן metacyclicחולייתני בצורת
מציצת הדם
הטפיל עובר לזבוב בזמן מציצת הדם, במעי
החרק הוא הופך לצורתו procyclicה -
הטפיל מתרבה ברביה אל מינית בזרם הדם של החולייתן
:מנגנונים ייחודיים בטריפנוזומטידים
• Antigenic variation בזרם הדם הטפיל מכוסה במעטה – . Variant Surface Glycoprotein (VSG)חלבוני – הנקרא
• RNA editing .תהליך המתרחש לאחר/בזמן התעתוק – mRNA מטוכונדיראלי עובר עריכה מחדש ע"י הוספה או החסרה
.gRNA. עריכה זו מתבצעת ע"י Uשל בסיס
• Trans splicing תהליך בו -RNA פוליציסטרוני עובר לרצף מונוציסטרוני המקודד לחלבון יחיד.
The Signal Recognition Particle
רוב החלבונים המיועדים להפרשה החוצה מהתא או שמיועדים לממברנה ומשם ליעדם הסופי.ERצריכים להגיע תחילה אל ה-
כדי שחלבונים יוכלו לעבור דרך ממברנה הידרופובית משתמש התא בשתי מערכות:
.post-translational translocationחלבונים צ'פרונים בתהליך הנקרא 1.
.co-translational translocation בתהליך הנקרא SRPקומפלקס ה-2.
משומר בין כל ממלכות החייםSRPקומפלקס ה-
רוב החלבונים המופרשים החוצה כוללים בקצה האמיני שלהם רצף . בשלב ראשון Signal Sequenceייחודי הנקרא רצף ההכרה –
SRPעם יציאת החלבון מהריבוזום נקשר אליו חלקיק ה-והמשך התרגום נעצר. בשלב שני מכוון כל הקומפלקס
. תהליך זה ER) אל ממברנת ה-SRP(ריבוזום-חלבון מתהווה-.ERמצמד בין תהליך התרגום ותהליך ההכוונה ל-
צריכים להתקיים שני SRPכדי שחלבון יוכל להיכנס למסלול ה-תנאים:
רצף ההכרה צריך להכיל רמה מסוימת של שיירים 1.הידרופוביים.
רצף ההכרה צריך לסגל לעצמו מבנה מרחבי של אלפא הליכס.2.
GTP GDP
ריבוזוםSS
SRP
SR
טרנסלוקון
ממברנה
:SRPמרכיבי ה –
, .300nt~ אחת (RNAביונקים החלקיק מורכב ממולקולת ) ושישה פוליפפטידים שמתחברים אליה SRP-RNAנקראת
-SRP9,SRP14,SRP19,SRP54,SRP68,SRP72.
) ושישה scR1 אחת (נקראת RNAבשמרים יש מולקולת הוא ההומולוג של Sec65פוליפפטידים כמו ביונקים.
SRP19, SRP21) פוליפפטיד ייחודי לשמרים - SRP9 לא קיים השמרים).
) 4.5S RNA אחת קטנה (RNAבחיידקים יש מולקולת .SRP54ופוליפפטיד אחד, הומולגי ל-
)Eichler and Moll 2001(
SRPבטריפנוזומות :
SRP:בטריפנוזומטידים הוא חלקיק ייחודי ממספר סיבות
קצר יותר וקטום, אין למולקולה את הצורה Aluאזור ה- .1.tRNAהאופיינית של
, האחת הומולוגית לזו RNA. במשפחה זו יש שתי מולקולות 2 נוקלאוטידים 76של שאר האאוקריוטים והשניה מולקולה קטנה
מולקולה זו L.collosoma נוקלאוטידים ב- 85 ו-T.bruceiבטפיל . 7SL RNAעוברת אינטראקציה עם מולקולת ה -
עוברת בין שתי תצורות שונות בטפיל 7SL RNA. מולקולת ה-3 L.collosoma, 7SL I -7 וSL II.
4בטריפנוזומות נמצאו הומולוגים רק ל-.SRP19,SRP54,SRP68,SRP72פוליפפטידים,
טריפנוזומטידיSRPמבנה
:SRPחיוניותו של ה-
למרות שהחלקיק משומר נמצא כי קיימים הבדלים משמעותיים בין החלבונים שתלויים בו באורגניזמים השונים:
ERיונקים – הובלת רוב החלבונים המיועדים להפרשה דרך ה-.SRPאו חלבונים המיועדים לממברנה עוברים במסלול ה-
משתנה בין הזנים השונים. SRPשמרים – חיוניותו של הייתה קטלנית לתא, SRP פגיעה ב-S.pombeלדוגמא בשמר גרמה לתא SRP פגיעה ב-S.cerevisiaeלעומתו בשמר
להראות "חולה ומסכן" אך בסופו של דבר התא שרד.
קטלנית לתא אך מסלול זה חיוני SRPחיידקים – פגיעה ב-כנראה בעיקר להכוונה של חלבונים ממברנליים, פגיעה
בממברנה סופה מוות לתא.
מטרת עבודה זו הייתה לנסות לאפיין SRPאת החלבונים שתלויים ישירות ב-
בטריפנוזומטידים.
האם בטריפנוזומטידים במצב הטבעי, חלבונים ממברנליים פוליטופיים הם אלה
(כמו בחיידקים) או גם SRPהתלויים ב-חלבונים נושאי רצף הכרה תלויים בחלקיק
(כמו באאוקריוטים אחרים)?
השאלה
-Tet
4-8 days (+Tet)
DF
After 10 days (+Tet)
975315
6
7
8
9
10
Log
(cell
s/m
l)
WT
-TET
+TET
days
על SRP54השתקת השפעת
התאים
מסלול ה – SRP חיוני
לגידול התאים
(Liu et al., 2002)
p67
)Liu et al .,2002(
EP
B
A
כמות וגודל החלבון היו שווים Western blotבאנליזת •בהשוואה בין תאים מושתקים ולא מושתקים
המסקנה מסדרת ניסויים זו היא, כי חלבונים SRPנושאי רצף הכרה אינם תלויים ב-
כנראה במסלול צ'פרוני ERועוברים אל ה – אלטרנטיבי.
נשארה SRPהשאלה אם כן מיהם החלבונים שתלויים ב-פתוחה...
השערה:
חלבונים ממברנליים פוליטופיים הם אלה שתלויים באופן ישיר בחלקיק. פגיעה בו
תגרום לשינוי הרכב הממברנות בתא. שינוי זה פוגם בתנועת חלבונים שונים בתא ולכן
גורם גם לפגיעה במיקומם הסופי של חלבונים נושאי רצף ההכרה ולבסוף למוות.
Nucleoside transporter
טפילי הטריפנוזומה אינם מסוגלים לייצר בעצמם פורין ולכן הם סיגלו לעצמם את היכולת לנצל פורין מהמאכסן. המצאות הפורין
קריטית שכן היא חיונית בבניית חומצות גרעין.
לתוך nucleoside. הכנסת ה - nucleosideמקור הפורין בטפיל הוא הטפיל מתווכת ע"י טרנספורטרים ייחודיים הנמצאים על ממברנת
הטפיל, טרנספורטרים אלה שייכים למשפחת החלבונים הפוליטופיים.
בתאים מושתקים ולא מושתקים GFPכדי להשוות בין רמת ה – ואנליזת FACSהשתמשנו בשלוש גישות: מיקרוסקופ קונפוקלי,
Western blot .
קונפוקלי:
-Tet
+Tet
TbNT-GFP צביעה חיצונית
-Tet
+Tet
GFP-TbNT צביעה פנימית
FACS:
פלורסנציה
גודל
Tet+שחור-
Tet-ירוק -
Tet+שחור-
Tet-ירוק -
Western blot:
Northern blot-ל TbNT-GFP
rRNA Tubulin
Et.Br
GFP ~2.5kb
בטמפרטורות שונות וחלבוני עקהT.bruceiעקומת גידול של
1
10
100
1000
10000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (days)
Log(cells/ml)Wt 27
SL3 27
SL3 34
Wt 34
- + kDa
84
52
hsp83
טובולין
SR - a
84
- + kDa
hsp83
SL-3
kDa
SR-a
77
49
hsp70
טובולין
SL-3
+ - kDa
84
52
- +
hsp70
טובולין
123
77
40
24
19
13
1237740
24
19
13
10
חלבונים המשתנים במהלך ההשתקה של SRP54
וצביעת כסףSR-aפרקציונציה של תאי
Enolase ו- Arginine kinaseהחלבונים שהתקבלו בריצוף הם:
שני חלבונים הפעילים בתהליכים מטבולים בתא
•Arginine kinase חלבון בעל פעילות של - phosphotransferase.
ל - ארגנינין.ATPאנזים זה משפעל מעבר פוספט מ -
Arginine+MgATP Argininephosphate+MgADP+H+
Phosphoarginine-משחק תפקיד חשוב בויסות ריכוז ה ATP בתא ומשמש כמאגר אנרגיה.
Enolase.אנזים המשתתף בתהליך הגליקוליזה ונמצא בציטוזול-
Enolase= 2-phospho-D-glycerate hydrolase המשפעל מעבר דו כיווני של:
D-2-phosphoglycerate (PGA) phosphoenolpyruvate (PEP)
תהליך הגליקוליזה בטריפנוזומטידים -
Ubiquitin
ויסות תהליכים תוך תאיים מושפע במידה רבה מויסות רמות יציבות של חלבוני מפתח בתא, ויסות זה יכול להתרחש ע"י סינטזה
ויצירת חלבונים אך לא פחות מכך ע"י פירוק ועיכול חלבונים.
השאלה אותה בקשנו לבדוק היא האם מערכת ה – ubiquitin/proteasome-פעילה בזמן הפגיעה ב SRP ומזרזת את
פירוק החלבונים.
)Glickman MH.,2000(
ubiquitin
control
Western blot בתאי SR-a – עם נוגדן אנטי ubiquitin ומעכב פרוטאוזום
מסקנות
בעבודה זו הרחבנו את ההבנה לגבי חלבונים שביגורם מושפע ישירות • SRP. מצאנו כי במהלך ההשתקה של ה – SRPמפגיעה במסלול ה -
נפגע ייצורו של חלבון ממברנלי בעוד שייצורם של חלבונים נושאי רצף הכרה לא נפגע.
המסקנה מכך היא כי כנראה לא קיים מסלול אלטרנטיבי ליצירת וביגור חלבונים ממברנליים פוליטופיים בטריפנוזומטידים.
היא בעליה חלקית של חלבונים SRP התמודדות התא עם מחסור ב - •) וירידה בסינטזת חלבונים hsp70 ולא hsp83מסייעים - חלבוני עקה (
חיוניים לתהליכים מטבוליים בתא.
אלא ירידה ביצור חלבונים ubiquitin אין עליה בחלבונים המסומנים ב- •בניסיון למנוע את הצטברותם בתא.