淋球菌耐药机制的初步研究以及多抗原测序分型（ NG-MAST ）在耐药监测工作中的

应用

------ 中国 CDC 性病控制中心

参比实验室 陈绍椿

研究背景耐药机制的初步研究NG-MAST 在淋球菌耐药监测工作中的应

用研究

概 要

高发病率，且在不断增长 诊断、报病的不足导致发病率的低估 严重危害健康：不孕不育，异位妊娠，增加 HIV 感染几率 抗生素耐药！

淋病—全球性公共卫生问题

World Health Organization (WHO). Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections–2008. Geneva, Switzerland; 2012.

PenicillinsTetracyclinesQuinolones (Ciprofloxacin)Macrolides (Azithromycin)SpectinomycinCephalosporins (Ceftriaxone,cefixime)

淋病的治疗药物

头孢菌素敏感性下降和临床治疗失败病例的出现

World Health Organization (WHO). Antimicrobial resistance global report on surveillance. Geneva, Switzerland; 2014.

口服类 Cefixime 治疗失败病例： Japan,1 Norway,2 United Kingdom,3 Austria,4 France,5 Canada,6 and South Africa.7

头孢曲松治疗淋菌性咽炎失败病例： Japan,8,9 Australia,10-

12 Sweden,13 and Slovenia14

治疗失败案例汇总

1. Yokoi S et al. Emerg Infect Dis 2007; 13: 1275-1277. 2. Unemo M et al. Euro Surveill 2010; 15. 3. Ison CA et al. Euro Surveill 2011; 16. 4. Unemo M et al. Euro Surveill 2011; 16: pii= 19998. 5. Unemo M et al. Antimicrobial Agents Chemother 201

2; 56: 1273-1280. 6. Allen VG et al. JAMA 2013; 309: 163-170. 7. Lewis DA et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 12

67-1270. 8. Ohnishi M et al. Emerg Infect Dis 2011; 17: 148-149.

9. Ohnishi M et al. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55: 3538-3545.

10. Tapsall J et al. J Med Microbiol 2009; 58: 683-687. 11. Chen MY et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 14

45-1447. 12. Read PJ et al. Sex Health 2013; 10: 460-462. 13. Unemo M et al. July 2010. Euro Surveill 2011; 16. 14. Unemo M et al. Euro Surveill 2012; 17. 15. Camara J et al. J Antimicrob Chemother 2012; 67: 1

858-1860.

超级淋球菌的出现

第一株高度耐头孢曲松的“超级淋球菌”— H041 ：

XDR, MLST7363, NG-MAST ST4220

咽部感染， 1g 头孢曲松治疗失败 ,MIC 1-2 mg/L

在法国和西班牙也发现了对头孢菌素高度耐药的淋球菌 MLST1901

NG-MAST ST1407

URGENT!!!

应对策略

1. 深入了解耐药机制2. 加强淋球菌耐药监测：（ 1 ）加强已有淋球菌耐药监测网络（ 2 ）分子流行病学方法应用于淋球菌耐药监

测（ 3 ）淋球菌临床治疗失败病例的筛查

中国的应对策略

耐药机制的初步研究

Unemo M, Nicholas RA. Emergence of multidrug-resistant, extensively drug-resistant and untreatable gonorrhea. Future Microbiol 2012; 7: 1401-1422.

淋球菌耐药的可能机制

Isolation year

NG-MAST

ST

MIC of ceftriaxon

e(mg/L)

penA alteration 　 mtrR alteration 　 porB alteration

penA allele

A501 alteratio

n

G542alteratio

n

P551alteration

　MtrR

coding region

Adenine (A)-deletion in

promoter region　 porB1b

G101 alteratio

n

A102 alteratio

n

2007 1612 0.25 new 6 T S WT H105Y Yes Yes K G2007 1691 0.25 V WT S WT H105Y Yes Yes D G2007 1790 0.25 new 1 V S WT H105Y Yes Yes K G2007 1790 0.25 new 6 T S WT H105Y Yes Yes K G2007 1868 0.25 new 6 T S WT H105Y No Yes K D2007 1943 0.25 V WT S WT H105Y Yes Yes D G2007 2279 0.25 new 6 T S WT A39T Yes Yes K D2007 2288 0.50 XVII V S WT G45D Yes Yes K D2007 2416 0.25 XVII V S WT H105Y Yes No D G2007 7085 0.25 new 6 T S WT WT Yes Yes K N2007 8757 0.25 new 8 V S WT H105Y Yes Yes K D2007 8772 0.25 new 6 T S WT H105Y Yes Yes K D2007 8780 0.25 new 6 T S WT H105Y Yes Yes K D2007 8785 0.25 XIII V WT S G45D Yes Yes K D2007 8795 0.25 XIII V WT S 　 H105Y Yes 　 Yes K D

头孢低敏耐药菌株（ MIC≥0.25µg/ml ）的特征

表 1. MIC≥ 0.25 µg/ml 菌株相关基因特征

Resistance determinants

Number (Proportion)

Mean MIC±SD

P-value

CROS isolates

(MIC≤0.06 mg/L) n=191

CROI/R isolates

(MIC≥0.125 mg/L) n=87

2 P-value

penA

WT 107 (38.5%)0.059±0.0

46Ref

85 （ 44.5% ）

22 （ 25.3

% ）Ref

A501T 68 (24.5%)0.103±0.06

4<0.00

131 （ 16.2

% ）37

（ 42.5% ）21.31

9<0.00

1

WT 172 (61.9%)0.060±0.0

45Ref

136 （ 71.2% ）

36 （ 41.4

% ）Ref

G542S 106 (38.1%)0.100±0.07

6<0.00

155 （ 28.8

% ）51

（ 58.6% ）22.538

<0.001

mtrR

WT 92 (33.1%) 0.064±0.069

Ref72

（ 37.7% ）20

（ 23.0% ）

Ref

H105Y 186 (66.9%)0.081±0.05

80.039

119 （ 62.3% ）

67 （ 77.0% ） 5.840 0.016

porB

WT 25 (9.0%)0.051±0.0

27Ref

23 （ 12.0% ）

2 （ 2.3% ） Ref

A102D 153 (55.0%)0.081±0.06

60.001

95 （ 49.7% ）

58 （ 66.7% ） 8.602 0.003

头孢低敏或耐药相关基因突变筛查

CROS, isolates with susceptibility to ceftriaxone; CROI/R, isolates with decreased susceptibility or resistance to ceftriaxone; A, alanine; WT, wild-type; T, threonine; V, valine; G, glycine; S, serine; P, proline; L, leucine; D, aspartic acid; I, isoleucine; H, histidine; Y, tyrosine; K, lysine; N, asparagine;

*P<0.05 for t-test (comparison between two groups) , ANOVA (comparison among three or more groups) or chi-square test.

表 2. 所有菌株根据不同基因突变分组后 MIC 均值比较及低敏耐药与特定基因相关性研究

NG-MAST 在淋球菌耐药监测工作中的应用

1 、追踪特定菌株的传播（如耐药菌株）2 、追踪特定人群中菌株的传播（如 MSM 人群 )3 、监测菌株的爆发流行4 、确定治疗失败病例和重复感染病例

NG-MAST 分型的意义

一、分型表现：1 、区分度2 、结果可比性二、操作的可行性： 1 、耗时 2 、费用 3 、操作难易程度：硬件 + 软件

NG-MAST 分型的优点

NG-MAST 分型过程临床分离株

DNA 提取

porB 基因 PCR

porB 基因测序

根据标准序列选取

490bpNG-MAST 网站

获取等位基因号

tbpB 基因 PCR

tbpB 基因测序

根据标准序列选取

390bpNG-MAST 网站

获取等位基因号

获取 ST 型别

MIC 值与 NG-MAST 型别的对应关系

NG-MAST ST

No. of isolates with MIC (mg/L):Total No. of

isolates<=.008 .015 .030.060 .125

.250 .500

568 2 7 6 1 16270 1 1 8 10421 1 2 2 1 1 7

1866 3 1 1 2 71766 6 62288 3 1 1 52318 1 4 51053 1 3 41731 1 1 1 1 41870 1 3 45990 3 1 48726 4 48770 1 3 4

STs(n=9) represented by three isolates

  1 10 5 8 2 27

STs(n=30) represented by two isolates

0 5 9 20 19 7 60

Unique ST （ n=111 ） 2 6 33 37 28 5 111Total No. of isolates 4 21 79 87 72 14 1 278

19

表 3. 某监测点不同 MIC 值菌株的 NG-MAST 型别分布

STsGuangdon

g Guangxi Tianjin Zhejiang Jiangsu ShanghaiTotal

1866 6 1 1 4 3 6 212318 2 1 1 2 5 7 185061 3 0 2 0 2 2 94846 2 0 0 5 0 2 94539 1 2 5 1 0 0 91768 6 0 0 2 1 0 9568 3 0 0 0 3 1 7

1766 5 0 0 0 2 0 7new28 0 0 7 0 0 0 72083 4 0 1 0 0 1 61053 2 0 0 0 4 0 6

全国不同监测点 2012 年度NG-MAST 型别分布

表 4. 全国不同监测点 NG-MAST 优势型别分布

porB-908, tbpB-110: ST1407 同一监测点两例，都为男性 涂片阳性，培养阳性 具有 Mosaic penA 结构， penA A501-WT,

G542-WT 头孢曲松 MIC-0.016, MIC-0.060 ， PPNG ，环丙沙星耐药，大观霉素敏感

ST1407 菌株的发现

总 结

1. 淋球菌头孢低敏耐药菌株出现，需要进行跟踪监测。 2. 头孢低敏耐药与以下氨基酸替换有关： A102D alteration

in PorB, A501T/G542S alteration in PenA and H105Y alteration in MtrR

3. NG-MAST 分型技术可用于加强淋球菌耐药监测，鉴定特殊菌株的出现，追踪某一区域优势菌株，结合MIC 值建立局部区域的淋球菌耐药数据库。

23Thank You!