研究肝癌中 NET-1 基因与 p27 及其磷酸化降解分子的相关性及对癌预后的影响

陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟

南通大学医学院病理学教研室南通大学附属肿瘤医院病理科

原发性肝细胞肝癌 ( HCC) 是高度恶性的肿瘤， 2000 年全球有 62.6 万人发病，死亡 59.8 万人，其中约55 ％发生在中国，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。南通启东地区是世界卫生组织确定的肝癌高发研究现场。

HCC 的发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此 , 进一步探索研究新的基因功能改变与 HCC 发生、发展及其恶性特征的关系，设计合理的治疗药物及判断预后，在提高我国 HCC 的诊治水平中具有重要意义。

NET-1 与 NET-2 到 NET-7 一起统称为 NET-X ，它们是由 Serru 等于 2000 年在 EST 数据库中发现的 7 个新的含 4 次跨膜蛋白超家族 ( transmembrane 4 superfamily 或 tetraspan family, 简称 TM4SF) 的成员。

NET-1(C4.8 、 P503s 、 Tspan-1)

定位于染色体 1p34.1 上，其mRNA 全长为 1297bp( 基因库登记号码 AF065388) ，为 TM4SF的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。

p27 作为细胞周期重要负性调控因子，受多种因素调控。细胞外信号调节激酶 (ERK) 是丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 中一条主要和经典的并与人类癌症关系最为密切的途径， p27 蛋白是 ERK 信号通路下游的重要分子。 p27 的基因突变非常罕见，对 p27 的功能调控主要发生于转录后阶段，通过蛋白磷酸化修饰来发挥其生物学效应。 p27 分子内存在数十个潜在的磷酸化位点，其中以 N 端第 10 位丝氨酸（ S10 ）及 C 端第 187 位苏氨酸（ T187 ）最为重要，占 p27 蛋白总磷酸化水平70% 以上。 p-p27T187 可启动 S 期激酶相关蛋白 2（ Skp2 ）分子介导的 p27 多聚泛素化及随后降解 。有证据显示 JAB1 与 p27 的出核转运有关。它能够促进p27从胞核向胞浆的移位，加速 p27泛素蛋白酶体途径的降解 。

1 、构建重组表达质粒 NET-1siRNA 、 myc-NET-1 和 pEGFP-myc-p27 (WT) 。2 、细胞培养与转染 3 、 Western blot检测蛋白表达4 、免疫共沉淀分析NET-1 与 p27 的相互作用关系 5 、免疫组化检测 6 、临床病例与预后分析

一、 材料与方法

二、结果1 、 NET-1 对细胞周期相关蛋白 p27 、 p-p27T187 、 Skp2 、 ERK 、 p-ERK 及 PCNA表达的影响

GFP抗体检测结果显示除未处理组外，转染 myc-p27 和 pEGFP-N组中均有显著的 GFP表达，表明在转染后 SMMC-7721 细胞中表达外源性 p27 （ line 1 ）。 p27抗体检测结果显示各组细胞中均表达 p27 ，但在转染 myc-p27 组中显著增加，表明转入外源性 p27可以增强内源性 p27 的表达（ line 2 ）。

免疫共沉淀的结果显示在 SMMC-7721 细胞中 GFP-p27 可以与myc- NET-1 一起，共同被抗myc抗体免疫沉淀下来。提示 p27 与NET-1 存在相互作用。 5% 的全细胞裂解液用于阳性对照。

2 、 p27 与 NET-1 在肝癌 SMMC-7721 细胞中存在相互作用

NET-1阳性率为 97.3%

Ki67阳性率为 94.7%

3 、 HCC 中 NET-1 蛋白表达与 Ki67表达

NET-1 、 p-p27T187 、 p-p27S10 、 PCNA 、及 JAB1均在癌中高表达。

p27均在癌旁核内高表达。

4 、 HCC 组织和癌旁组织中 NET-1/p27 的表达

NET-1 、 p-p27T187 、 p-p27S10 、 PCNA 、及 JAB1均在癌中高表达。

p27均在癌旁核内高表达。

HCC 组织和癌旁组织中

NET-1/p27 的表达

癌中 癌旁

NET-1 在 HCC 、癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达呈递减趋势，不同组间的差异均有显著的统计学意义。 JAB1 、 p-p27T187 、 p-p27S10 和 PCNA 在HCC 中表达显著高于癌旁组织和血管瘤旁肝组织，但后两组间差异无显著统计学意义； p27 在癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达显著高于 HCC 中，但前两组间差异无显著统计学意义。

5 、 NET-1 、 PCNA 、 p27 及其相关分子在 HCC 、癌旁组织和正常肝组织中表达

PCNAPCNAPCNA(1) NET-1 与 p27Kip1 的表达呈负相关 (r = － 0.6078 ， P <0.001)(2) NET-1 与 JAB1 的表达则成正相关（ r =0.6866 ， P <0.001 ）(3) NET-1 与 PCNA 的表达则成正相关（ r =0.5645 ， P <0.001 ）

6 、 HCC 中 NET-1 、 PCNA 、 p27 及其相关分子表达的相关性

（ 1 ） Log-rank单因素分析

影响预后的因素：

癌淋巴结转移与 NET-1 、 p27 、 PCNA 、p-p27T187 p-p27S10 表达。

7 、 NET-1 、 PCNA 、 JAB1 、 p27 、 p-p27T187 、 p-p27S10表达与 HCC 预后的关系

（ 2 ） Kaplan-Meier 生存曲线

NET-1 高表达组五年生存率（ 28.6% ）显著低于低表达组（ 59.4% ）（ P<0.01

NET-1 高表达伴 p27低表达时五年生存率（ 13.6% ）显著低于其他组（ 57.8% ）（ P<0.01 ）。

（ 3 ） Cox比例风险模型多因素生存分析

HCC淋巴结转移、组织学分级，癌中 NET-1 、 JAB1 、 p-p27T187 、 p-p27S10 、 PCNA表达均具有独立的预后意义。风险分析提示这些因素增强时均能增加HCC 病人的死亡风险( 其风险比均＞1)

本研究结果显示上述质粒的构建完全符合设计预期，通过转染针对 Lamin 的 siRNAs 后出现的较显著沉默Lamin 基因的效果，表明本研究进行的 siRNAs递送、转染以及反应条件符合要求。

Western-Blot结果显示干扰NET-1表达后 p27表达增高， Skp2 、 p-ERK 及 PCNA表达降低；相反，增加NET-1表达使 p27表达降低， Skp2 、 p-ERK及 PCNA表达增加。提示NET-1 可能参与 ERK 信号级联通路的激活过程。免疫共沉淀结果也证明了NET-1 与p27 之间可以相互作用，并且外源性 p27 可以增加内源性 p27 的表达。推测NET-1 激活 ERK, 促使其发生磷酸化而活化，使控制细胞进入 S 期的 p27 下调，引起p27 降解相关的磷酸化蛋白增加，从而引发细胞周期调控紊乱是 NET-1 与 p27 之间可能的作用机制。

三、讨 论

免疫共沉淀和免疫组化结果证实 NET-1 与 p27呈负相关。支持NET-1 的表达能抑制 p27 对细胞周期的负性调控。 本文中 NET-1 与 JAB1 的表达呈显著正相关，未见到NET-1 与 p-p27T187 和 p-p27S10 之间存在相关性，提示NET-1 与 p27 的相关性还可以通过与 JAB1 相关通路。

本文在 HCC 预后的分析中显示除了临床上肿瘤脉管转移与预后相关外， NET-1 、 p27 、 JAB1 、 p-p27T187 、 p-p27S10 、PCNA均是显著影响癌患者预后的独立指标，当这些指标高表达或 p27低表达时患者死亡的风险增加。特别在 NET-1 高表达伴有 p27低表达时的 5 年存活率 13.6%显著低于其他组 57.8% 。因此检测HCC 中 NET-1 的表达具有预后评估价值。

致 谢1 、该课题研究历时 9 年先后得到了江苏省教育厅高新技术课题和南通市社会发展课题 的经费资助。 2 、 NET-1抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公司的协助。3 、 课题完成共培养硕士学位毕业研究生 12 位。他们为该课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越的智慧。

Thank you ！