Технические характеристики NanoDrop One:

Измерение нуклеиновых кислот на 260 нм

Джессика Маннион, Шон Лоури, Брайан Метлок, Thermo Fisher Scientific, г. Вилмингтон, штат Делавер, США

Техн

иче

ское

пр

им

еча

ни

е 5

28

10

Ключевые словаNanoDrop One, двухнитевая ДНК, микрообъемный спектрофотометр, нуклеиновая кислота, точность для нуклеиновых кислот, количес-твенное определение нуклеиновых кислот, количественное опреде-ление, УФ и видимый диапазон

Аннотация

Ученые-биологи могут выполнять количественные из-мерения в образцах нуклеиновых кислот на микрообъ-емных спектрофотометрах ультрафиолетового и види-мого диапазона Thermo Scientific™ NanoDrop™ One и OneC, используя готовые приложения для определе-ния двухнитевых ДНК, однонитевых ДНК, РНК, олиго-ДНК и олиго-РНК (Рисунок 1). В настоящем техничес-ком примечании представлены характеристики спек-трофотометра в динамическом диапазоне прибора при использовании двухнитевой ДНК.

Введение

Спектрофотометр NanoDrop One выполняет точные измерения в образцах двухнитевой ДНК в диапазоне концентраций от 2 до 27 500 нг/мкл (0,04-550A) при использовании всего 1 - 2 мкл образца. Патентованная* система удерживания образца и технология автомати-ческого регулирования длины пути в приборах NanoDrop One/OneC позволяет пользователям проводить измерения в образцах, охватывающих широкий диапазон концентраций, что устраняет необходимость в разведениях и расходных материалах.

Рисунок 1: Программное обеспечение NanoDrop One, начальное окно для нуклеиновых кислот

При использовании прибора NanoDrop One для обеспе-чения точности измерения не требуется предваритель-ной информации о концентрации образца, поскольку концентрация образца по существу всегда будет в пределах динамического диапазона прибора. Оценку точности прибора NanoDrop One в динамическом диапазоне выполняли путем сравнения результатов измерения в образце нуклеиновой кислоты с результата-ми, полученными с использованием кюветного настоль-ного спектрофотометра УФ и видимого диапазона Thermo Scientific™ Evolution™ 300. Представленные данные показывают, что приборы NanoDrop One/OneC точно измеряют концентрации двухнитевой ДНК в образцах, разведенных до 3 нг/мкл, и сконцентрирован-ных до 28 000 нг/мкл (а также до 18 150 нг/мкл для однонитевой ДНК, и до 22 000 нг/мкл РНК).

ПРИМЕЧАНИЕ: прибор NanoDrop OneC выполняет измерения как пьедестального, так и кюветного типа. Представленные здесь данные были получены на приборе NanoDrop One и отражают точность измерения на пьедестале в приборе NanoDrop One и в приборе NanoDrop OneC.

Метод

Серию растворов в диапазоне концентраций от 3 до 28 000 нг/мкл получали путем разведения натриевой соли двухнитевой ДНК из молок лосося (Sigma Aldrich®, №D1626) в дважды дистиллированной H O 2

класса «для ВЭЖХ» (Acros Organics™, №268300040). Первоначальную концентрацию приготовленного маточного раствора двухнитевой ДНК проверяли спектрофотометрически на длине волны 260 нм, используя спектрофотометр Evolution 300 в качестве контроля. Образцы, выходящие за пределы определе-ния поглощения контрольного спектрофотометра, разводили так, чтобы концентрация попадала в рабочий диапазон контрольного прибора. Значения концентрации, полученные для разведенных образцов прибором Evolution 300, использовали для ручного вычисления исходной концентрации образцов двухнитевой ДНК; при необходимости применялись соответствующие коэффициенты, чтобы учесть разбавление и разницу длин пути. Далее поглощение в каждом растворе измеряли на приборе NanoDrop One с использованием прикладной программы dsDNA. Размеры образцов, использованные для измерения концентраций на каждом из приборов, составляли: 1.) 1 мкл для прибора NanoDrop One 2.) 3 мл в кварцевой кювете 10 мм для прибора Evolution 300 и 3.) 1 мкл в устройстве кюветного типа Hellma® Analytics TrayCell для прибора Evolution 300.Для вычисления концентрации в каждом образце программное обеспечение NanoDrop One использует измеренное поглощение на 260 нм, весовой коэффи-

-1циент экстинкции для двухнитевой ДНК (50 нг/мкл см ) и закон Бэра. Средние значения концентраций, полученные на спектрофотометрах NanoDrop One и Evolution 300 (таблица 1), отображались на графике (рисунки 2 и 3) и анализировались. Эти результаты показывают высокую степень согласованности измерений между двумя спектрофотометрами.

Спектрофотометр Evolution 300 Спектрофотометр NanoDrop One

днДНК [конц](нг/мкл)

% коэфф. вариации

днДНК [конц](нг/мкл)

Станд. откл. % коэфф. вариации

3.4 0.43 3.9 0.5 н/п

34.3 0.29 35.8 0.3 н/п

100.1 0.29 100.1 0.6 0.1

496.2 0.23 495.5 0.6 0.0

1844.5 0.33 1815.8 7.3 0.0

3606.4 0.25 3389.0 9.5 0.0

12259.8 0.10 11170.1 70.6 0.1

14095.8 6.81 13108.7 57.8 0.0

17289.4 1.97 16789.2 115.1 0.1

21338.6 3.74 20896.0 122.6 0.1

23887.3 3.24 23217.9 199.0 0.1

y = 0.9669x – 66.023 2R = 0.9991

0.00

5000.00

10000.00

15000.00

20000.00

0 5000 10000 15000 20000

NanoD

rop O

ne д

нД

НК

(нг/

мкл

)

Контроль днДНК (нг/мкл)

NanoDrop One в сравнении с Evolution 300. Полный диапазон концентраций

y = 0.9971x + 0.67252R = 1

0.0050.00

100.00150.00200.00250.00300.00350.00400.00450.00500.00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500N

anoD

rop O

ne д

нД

НК

(нг/

мкл

)

Контроль днДНК (нг/мкл)

Рисунок 2: На графике показано сравнение линейности спектрофотомет-ров NanoDrop One и Evolution 300 по всему диапазону измеряемых кон-центраций для приборов. Линия регрессии демонстрирует, что результа-ты измерения концентрации двухнитевой ДНК прибором NanoDrop One хорошо согласуются со значениями, полученными спектрофотометром Evolution 300.

Таблица 1: Средние значения концентраций в различных препаратах двухнитевой ДНК измеряли на спектрофотометрах NanoDrop One и Evolution 300. Десять отдельных повторов каждого раствора измеряли напрямую на пьедестале прибора NanoDrop One без дополнительного разведения. Растворы разводили при необходимости и измеряли в трех повторах на спектрофотометре Evolution 300, оснащенном кварцевой кюветой 10 мм (Starna Cells, Inc., 1-Q-10) и микроячейкой Hellma Analytics TrayCell с крышкой 0,2 мм.

NanoDrop One в сравнении с Evolution 300. Нижний диапазон концентраций

Рисунок 3: В виде графика также представлено более детальное сравне-ние линейности спектрофотометров NanoDrop One и Evolution 300 в нижнем диапазоне концентраций (от 35 до 495 нг/мкл). Линия регрессии показывает тесную корреляцию с результатами Evolution 300 и превосход-ную линейность в нижней части диапазона детекции.

TN52810_E 04/16M

www.thermofisher.com/nanodrop

Опубликованные характеристики воспроизводимости трациями, полученными двумя спектрофотометрами, для нуклеиновых кислот спектрофотометра NanoDrop контрольным прибором кюветного типа и NanoDrop One представляют собой стандартное отклонение One. Прибор NanoDrop One может обеспечить такой ±2 нг/мкл для концентраций в образце от 2,0 до высокий уровень надежности благодаря патентован-100 нг/мкл, и коэфф. вариации ±2% для образцов ной*технологии удержания образца на пьедестале и >100 нг/мкл, при измерении на пьедестале. В таблице автоматическому подбору длины пути, что очень 2 представлены данные по воспроизводимости для важно для выполнения микрообъемных измерений.10 повторов образцов двухнитевой ДНК в диапазоне Наряду с высокой точностью по всему протестирован-концентраций от 3 до 28 000 нг/мкл. Данные стандар- ному диапазону концентраций, спектрофотометр тных отклонений делают совершенно очевидной пре- NanoDrop One позволяет экономить время и затраты восходную воспроизводимость спектрофотометра благодаря удобству работы и необходимому размеру NanoDrop One. Воспроизводимость измерений пре- образца всего 1-2 мкл. Спектрофотометр NanoDrop восходит спецификации по всему диапазону концен- One устраняет необходимость в разведениях образ-траций образцов (таблица 2). цов и в дорогостоящих расходных материалах, таких

как кварцевые кюветы. Благодаря готовым приложе-ниям, специально предназначенным для биологичес-ких лабораторий, и встроенному сенсорному интер-Микрообъемный спектрофотометр NanoDrop One фейсу высокого разрешения, прибор NanoDrop One демонстрирует прекрасную линейность по всему дина-является быстрым и удобным, и одновременно, точ-мическому диапазону прибора (рисунок 2) и превос-ным и надежным.ходную линейность в нижнем диапазоне концентра-

2ций (рисунок 3). Вычисленные значения R в обоих слу- * Патенты US6628382 и US6809826чаях показывают тесную корреляцию между концен-

Заключение

Образец 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Повтор 1 4.4 36.1 101.1 495.2 1799.5 3400.6 11005.2 13132.6 17004.4 21042.0 23155.9

Повтор 2 4.6 35.8 100.0 495.8 1820.5 3394.6 11121.2 13022.4 16873.8 21110.6 23159.4

Повтор 3 3.8 35.4 99.5 496.0 1821.6 3386.3 11159.4 12995.4 16817.8 20925.5 23332.2

Повтор 4 3.3 35.9 99.5 494.4 1818.6 3390.5 11169.7 13111.4 16750.4 20706.0 23276.3

Повтор 5 3.5 35.4 100.3 495.5 1812.8 3372.5 11170.5 13123.3 16765.5 20820.3 23519.3

Повтор 6 3.6 36.3 100.1 495.2 1824.9 3378.8 11126.0 13156.9 16781.7 20896.9 23337.1

Повтор 7 4.4 35.5 100.1 496.5 1814.0 3387.6 11200.5 13167.0 16829.4 20895.1 22991.7

Повтор 8 3.5 35.8 100.7 495.4 1810.1 3391.3 11251.0 13070.1 16557.3 20875.5 23439.8

Повтор 9 4.1 35.9 100.0 495.3 1817.6 3376.3 11217.0 13043.1 16703.5 20790.7 22890.0

Повтор 10 4.5 35.6 99.3 495.7 1810.6 3399.2 11231.8 13106.1 16796.8 21019.0 23077.6

Среднее 4.0 35.8 100.1 495.5 1815.0 3387.8 11165.2 13092.8 16788.0 20908.1 23217.9

Станд. откл. 0.5 0.3 0.6 0.6 7.3 9.5 70.6 57.8 115.1 122.6 199.0

% коэфф. вариации н/п н/п 0.06 0.01 0.04 0.03 0.06 0.04 0.07 0.06 0.09

Техн

иче

ское

пр

им

еча

ни

е 5

28

10

Таблица 2: Воспроизводимость измерений оценивали на приборе NanoDrop One с использованием 10 отдельных аликвот для каждой концентрации натриевой соли двухнитевой ДНК из молок лосося. Для каждого препарата определяли среднюю концентрацию, стандартное отклонение и % коэффициент вариации. Воспроизводимость измерений по всему динамическому диапазону прибора удовлетворяла и превосходила спецификацию.

© 2016 Thermo Fisher Scientific Inc. Все права защищены. Sigma-Aldrich является зарегистрированной торговой маркой компании Sigma-Aldrich, Ко Hellma является зарегистрированной торговой маркой компании Hellma GmbH & Co. Все другие товарные знаки являются собственностью компании Thermo Fisher Scientific и ее дочерних предприятий. Эта информация представлена в качестве примера возможностей продуктов Thermo Fisher Scientific. Она не предназначена для поощрения использования этих продуктов в любой форме, которые могут нарушать права на интеллектуальную собственность других.Технические характеристики, условия и цены могут быть изменены. Не все продукты доступны во всех странах. Пожалуйста, обратитесь к местному торговому представителю для деталей.