嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养MIMVECsLPS模型信号通路调控作用的研究

北京农学院 任晓明 13910224882@163.com

乳酸对 LPS 诱导的 RIMMVECs 细胞信号通路 NF-κB 的调控作用

研究背景和目的

乳酸菌 乳酸菌是目前应用最广且效果最好的一类益生菌，但其保健抗病的作用机制还不十分明了。

乳酸菌代谢产物乳酸的抗病作用 我实验室前期研究表明，乳酸对大肠杆菌和沙门氏杆菌的腹泻模型具有很好的抗病作用，对大肠杆菌内毒素（ LPS）所致的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（ RIMMVECs ）损伤有明显的修复和抗损伤作用。

研究背景和目的

微血管内皮细胞（MVECs）在炎症反应中的作用

很多研究已经证明，在未受到损伤因子攻击情况下，MVECs分泌少量的白细胞介素（ IL-1和 IL-6）。当受到内毒素（ LPS）、肿瘤坏死因子（ TNF）等细胞因子攻击的时候 IL-1、 IL-6的表达量大幅上调，参与炎症反应和炎性损伤过程。

研究背景和目的 LPS对 MVECs的损伤作用 致病性大肠杆菌（ EPEC）能引起仔猪腹泻等多种疾病，主要是通过其产生的毒素（ LPS）发挥致病作用。近年来国内外对LPS的研究较多，很多集中在 LPS所介导的

细胞信号转导通路的调控上。 LPS能激活靶细胞信号转导通路表达炎性因子，导致一系列炎性反应，是 EPEC致病性的的重要机制。

研究背景和目的

LPS对 MVECs细胞信号转导通路 NK-κB的激活及其作用

LPS攻击MVECs后，激活 NK-κB信号通路产生 IL-6、 TNF-α、 NO和表达黏附因子，这些变化在局部组织损伤和修复、弥散性血管内凝血（ DIC）、脓毒血症和多器官功能衰竭的发生过程中发挥重要作用。

研究背景和目的

LPS诱导MVECs产生 IL-6和 TNF-α。如果能抑制这些因子的合成，便可下调 NF-κB细胞信号转导通路的激活程度，进而抑制炎性反应。为深入探讨益生菌代谢产物抑制LPS激活 NF-κB细胞信号转导通路的调控作用，本实验测定了不同条件下 NF-κB p65亚基的mRNA和蛋白的表达情况。从基因和蛋白表达两个层面，探讨乳酸菌代谢产物调控靶细胞抗损伤的细胞信号转导通路的某些机制。

材料与方法

细胞分组 试验

ELISA ELISA

RealTime-PCRRealTime-PCR

空白对照组

LPS （阳性）对照组

乳酸高浓度预处理组

乳酸中浓度预处理组

乳酸低浓度预处理组 WesternBlotWesternBlot

RIMMVECs的分离、培养与鉴定

RIMMVECs分离自 10日龄内乳鼠肠粘膜，至细胞生长到 80%呈融合状态时进行传代培养，对传至第 6代的细胞进行鉴定。方法是采取 SP免疫细胞化学法进

Ⅷ行内皮细胞第 因子相关抗原（ F-RagⅧ ）的鉴定。

荧光定量 PCR

将RNA反转录为 cDNA，按照以下反应体系进行：模板（ RNA） 3μg；引物（ 50μM） T18,4.0μl；DEPC处理水至 25μl，混匀， 70 5min℃ ，立即冰浴； 5×buffer， 8.0μl；dNTP（ 10mM） ,4.0μl;RNase Inhibitor,1.0μl,混匀， 37 5min℃ ；M-MuLV， 2.0μl， 42 60min℃ ， 70 10min℃ 。

定量 PCR检测按照以下反应体系进行：模板（ cDNA） /ddH2O,1.0μl;10μM引物 F/R， 0.5μl;2×PCR Mix， 12.5μl； Eva green； 1μl；ddH2O,10μl，混匀，置于荧光定量 PCR仪中。

制备 RNA

RNA电泳结果如下图所示。可见 28S和 18S两条明亮条带，无 DNA 条带污染。

荧光定量 PCR

通过 PCR验证筛选出各基因的引物 PCR 如下图

M： DL2000 DNA ladder 1： β-actin 2： NF-kB 3： β-actin 空白对照 4： NF-kB 空白对照

M 1 2 3 4 M

引物名称及序列

检测基因表达水平

用 RT-PCR方法检测 IκB的基因表达水平。设计引物，提取细胞总 RNA加入反应体系中，进行逆转录以及 PCR扩增cDNA。然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射灯下观察，最后对凝胶条带进行灰度扫描，将灰度值进行统计学处理。

内参基因引物检出限内参 actin 基因的引物检出限

----1.56×10 (7)----1.56×10 (6)----1.56×10 (5)----1.56×10 (4) ----1.56×10 (3)----1.56×10 (2)----1.56×10 (1)---- 空白对照

检测蛋白表达水平 用Western blot方法检测 IκB的蛋白表达水平。 LPS攻击细胞，用裂解缓冲液裂解细胞，经 SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。加入兔IκB多克隆抗体，加入 HRP标记的羊抗兔IgG， DAB显色，用凝胶分析软件对显色条带进行半定量分析，面积与荧光强度的乘积代表 IκB蛋白表达的相对量。

NF-kB基因引物检出限

NF-kB基因的引物检出限----1.22×10 (7)----1.22×10 (6)----1.22×10 (5)----1.22×10 (4) ----1.22×10 (3)----1.22×10 (2)----1.22×10 (1)---- 空白对照

内参 actin基因的标准曲线

acti n内参 基因的标准曲线

y = -3. 4743x + 35. 306R2 = 0. 9986

5

10

15

20

25

30

35

0. 5 1. 5 2. 5 3. 5 4. 5 5. 5 6. 5 7. 5l og(i ni t i al copy number of templ ate DNA)

Thre

shol

d cy

cle

NF-kB基因的标准曲线

NF-kB基因的标准曲线

y = -3. 5661x + 32. 651R2 = 0. 9984

0

5

10

15

20

25

30

35

0. 5 1. 5 2. 5 3. 5 4. 5 5. 5 6. 5 7. 5l og(i ni t i al copy number of templ ate DNA)

Thre

shol

d cy

cle

数据处理实时荧光定量 PCR：目的基因的相对表达量用 ΔΔCt法计算， ΔCt（目的基因） =Ct（目的基因）－ Ct（内参基因）， ΔΔCt=ΔCt（处理组）－ ΔCt（空白组）。目的基因的相对表达量 =2-ΔΔCt ，数据用 spass11.5进行统计分析，荧光实时定量 PCR结果使用均值 ±标准误表示，其中各基因的表达量所示结果均经过内参 β-actin表达量进行校正。

数据处理 Western Blotting:检查 PVDF膜上的预染Marker在膜上的对应位置及电泳起始点，确定目标条带后用Gel-ProAnalyzer6.0软件测定目标条带面积和灰度值，将 NF-κB p65和 β-actin对比做半定量分析。

蛋白含量 =条带面积 ×平均灰度；蛋白半定量值= NF-κB p65蛋白含量 /β-actin蛋白含量。数据采用均值 ±标准误表示，统计分析应用 SPSS11.5统计软件，多组间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平为 P＜ 0.05，极显著性差异水平为 P＜0.01。

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结 果

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TNF-α

IL-6

RT-PCR

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WesternBlotELISAELISA细胞鉴定细胞鉴定

RIMMVECs的培养

RIMMVECs的鉴定

ELISA检测结果

ELISA检测结果

RT-PCR扩增曲线

NF-κB p65 亚基基因的扩增曲线

RT-PCR扩增曲线

内参 β-actin 的扩增曲线

RT-PCR熔解曲线

NF-κBp65 亚基的熔解曲线

RT-PCR熔解曲线

β-actin 的熔解曲线

RT-PCR试验结果 NF-κB基因在不同处理组中的实时荧光定量

PCR 结果

Western Blotting结果

NF-κB p65的蛋白Western Blotting β-actin

NF-κB p65

Western Blotting结果

Western Blotting结果

结 论

乳酸对 LPS激活 RIMMVEC的 NF-κB细胞信号转导通路具有明显的抑制作用，下调了转录因子 NF-κB的转录活性，进而抑制了炎性因子 TNF-α和 IL-6的表达。

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