多维色谱与 MALDI-TOF MS 联用技术对人血清中低丰度蛋白的分离与鉴定

《化学生物学》实验课程组 白 泉

实验三

创新实验 I- 化学生物学

化学国家级实验教学示范中心NORTHWEST UNIVERSITY

蛋白质组学：概念、血清蛋白质组学、比较蛋白质组学

蛋白质分离技术平：二维电泳、多维液相色谱

蛋白质鉴定技术：生物质谱， LC-ESI MS, MALDI-TOF MS ，肽质量指纹鉴定蛋白质技术、串联质谱数据鉴定蛋白质技术

生物信息技术：生物信息学、数据库的建立、网站和数据库

实验技能训练要点主要新知识

仪器分析：色谱技术 –快速蛋白质纯化仪、 SEC、 RPLC

、质谱技术 -MALDI-TOF MS ……

化学生物学导论：蛋白质、酶……

蛋白质与酶化学：蛋白质、酶……

蛋白质纯化与表征：液相色谱法、电泳、质谱… ..

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实验技能训练要点主要知识回顾

1995 ，流感嗜血杆菌1830 Kb

1997 ，酵母12.7 Mb

1998 ，线虫9700 Kb

2002 ，水稻~430 Mb

20012001 ，，人人~3 Gb~3 Gb

20002000 ，，果蝇137 Mb137 Mb

背景知识关键词：蛋白质组学、多维液相色谱、生物质谱Proteomics, Multidimensional liquid chromatography,

Biological mass spectrometry

什么是蛋白质组？ 蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质”。

荧光染色的细胞内蛋白质

研究基因编码所有蛋白质的识别和定量，及其在细胞中的定位和在后转录阶段进行的修饰

研究蛋白质之间的相互作用，确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用，说明蛋白质结构和功能间的相互关系

表达蛋白质组学

功能蛋白质组学

前基因组时代的“钓鱼”和后基因组时代的“捞鱼”

二维液相色谱(2D Liquid Chromatography)

与传统 2-DE 相比多维液相色谱系统最突出的优点是 :

(1) 快速 , 灵敏 , 便于自动化 , 能够满足 蛋白质组学研究高通量的要求。 (2) 对蛋白质全组分进行分析时的歧视 效应大大减小。

血清蛋白质组学 (Serum Proteomics)

作为蛋白质组学中的一员——血清，此样本简便易得且成本低廉，是一种非常理想的诊断样品，有关血清蛋白质组学的研究也越来越受到重视。 血清中蕴藏着我们机体所有主要生物过程的线索。 血清是一种复杂的体液成分，蛋白含量动态范围很宽达到了 10 个数量级，其中 22 种主要蛋白就占了血清总蛋白的 99% ，实际研究中对血清低丰度蛋白的识别十分重要。

往往行使着“信使”的功能：通知细胞开关信号传导通路

这样的功能在细胞死亡和疾病发育中扮演着核心角色

Dynamic Range Problem in Serum

C1q Complement C8 Complement

Albumin

lgG Total

Transferrin Fibrinogen

lgA Total Alpha-2-Macroglobulin

lgM TotalAlpha-1-AntitrypsinC3 Complement

10%

Apolipoprotein B Apolipoprotein A-1

1%

C9 Complement Prealbumin

Complement factor BC4 Complement

~60% of serum is Albumin

22 种主要蛋白占血清总蛋白的 99%

血清中蛋白质的动态分布图

血清标本

处理后样品

组分 1 组分 2 组分 3 组分…

组分… 组分… 组分… 组分…

MALDI –TOF MS

SEC

RPLC

稀释 , 变性

多维液相色谱 -质谱离线联用技术平台

AFC组分 X

组分…

HIC 色谱饼

西北大学化学与材料科学学院

实验内容提要一、实验目的

二、实验原理

三、实验仪器与试剂

六、实验延伸

五、实验结果与讨论

四、实验步骤与方法

思考题 参考文献

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一、实验目的

掌握血清预处理的原理与方法；熟练掌握多维液相色谱分离蛋白质的基本原理、操作及在蛋白质组学研究中的应用；掌握MALDI-TOF-MS 鉴定蛋白质、多肽的原理和方法。

通过采用二维液相色谱对人血清分离和质谱鉴定分离组分的蛋白组学过程操作，使学生了解蛋白质组学的概念及研究意义，了解蛋白质组学研究中的分离纯化、生物质谱和生物信息学等技术。

51 52 53 54 55 56 57 58 5n

3 4 5 6 7 8 1 2 n

3 4 5 6 7 8 1 2 n

Abs

orb

ance

min

/

0 3 6 9 12 15 18 21 24 t min/

biomarker assay

第一

维分

离第

二维

分离

二、实验原理 -2DLC

Trypsin+ proteins

p53

IEX-HPLC RP-HPLC多维蛋白质识别技术（MudPIT）

Sephadex Chromatography葡聚糖凝胶色谱

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三、实验仪器和试剂 化学试剂

尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯， Fluka 公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）；质谱分子量校正标准试剂盒， α-氰基 -4-羟基肉桂酸（ CHCA）均购自 Sigma

公司（ St. Louse，MO ，美国）；血清样品。

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三、实验仪器和试剂仪器

纯水仪

快速蛋白质纯化仪离心机

冷冻干燥仪

基质辅助激光解吸飞行时间质谱MALDI-TOF MS

液 -质联用仪

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四、实验步骤和方法 -- 血清样品预处理

用 8.0 mol/L脲溶液对血清样

品进行稀释变性，最终血清溶液

中脲浓度为 5.0 mol/L, 4℃放置

20 h 后，所得血清样品用于实验

。

体积排阻色谱流动相

0.1mol/LNaCl + 20.0mmol/L KH2PO4, pH7.0

反相色谱流动相

A 液： H2O,0.1%TFA

B 液： CH3CN,0.1%TFA

四、实验步骤和方法—流动相的配制

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天数 实验内容 实验准备第 1天 预处理后的样品进样于体积排阻

色谱柱，按分子量大小进行分段收集

装填 Superdex G-75凝胶 ；配制流动相

第 2天 收集的馏分冷冻干燥 预准备冷冻干燥干燥机

第 3天 冷冻干燥的样品进行高效反相液相色谱分离。

装填 C18 大孔反相色谱柱（ 5μm，

30nm）和 C18 小孔反相色谱柱（ 10μm， 10nm）

第 4天 分段收集洗脱各组分冷冻干燥 预准备冷冻干燥干燥机第 5天 MALDI-TOF-MS 鉴定。 送样品做MALDI-TOFMS

四、实验步骤和方法 -实验天数

环节1

环节2

环节3

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SEC 进样量不能过大，实验完成后要用水冲洗色谱系统。RPLC 所用溶剂乙腈有毒，故接收瓶口要进行封口，流动相使用前要进行超声脱气。正确操作液相色谱、 MALDI-TOF MS 、冻干机。质谱点样时要小心避免污染。冻干机使用前要检查真空泵油是否加满，系统应密封，不能漏气。样品冻干时间较长，一般需要 15-24 小时，应注意仪器的运行状态是否正常。

四、实验步骤和方法—注意事项

五、实验结果与讨论 -脲变性后的人血清 SEC

图

流动相为 20 mmol/L KH2PO4 ,100 mmol/L NaCl， pH 7.0；流速 0.5 mL/min ，进样量 300 μL ，检测波长 280 nm 。

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

20

40

60

80

100

A/m

Au

t /min

C

D

A

B

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

50

150

A/m

Au

t /min

100

分离条件：流动相 A： H2O + 0.1% TFA， B： CH3OH + 0.1% TFA；

30 min 线性梯度由 100% A ~ 100% B并延长洗脱 15 min ，检测波长 280

nm 。图中 A、 B和 C、 D 分别为 SEC收集液 A、 B 段和 C、 D 段在相应的大孔反相柱上和小孔反相柱上的反相色谱分离图

五、实验结果与讨论 --血清 SEC收集组分的RPLC图

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0.4~

0.8K

1.2~

1.6K

2.0~

2.4K

2.8~

3.2K

3.6~

4.0K

4.4~

4.8K

5.2~

5.6K

6.0~

7.0K

8.0~

9.0K

10~2

0K

40~8

0K

m/z

Num

bers

五、实验结果与讨论 --MALDI-TOF

MS分析血清 SEC/RPLC

分离后收集组分的质 /荷比分布图

Proteomic aims in cancer research ———Tumor markers 蛋白质组学技术改变传统的分割式研究单个蛋白质的模式，建立全面、立体、快速的分析方法，以透视全体基因在特定细胞或组织的表达。

肿瘤鉴别

肿瘤早期诊断寻找新的肿瘤治疗途径

确立个体化治疗方案等

预防肿瘤治疗耐受

肿瘤分型

肿瘤蛋白质组学

六、实验延伸 - 肿瘤蛋白质组学

General goal: 肿瘤的致病机制与病程Clinical goals: 疾病早期诊断的肿瘤标志物

监测肿瘤复发或转移 鉴定特异治疗疾病靶分子

通过比较正常和病理条件下，细胞或组织中蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，探寻疾病相关的蛋白质（群）

差异蛋白质组研究几乎都是某种意义上的“大海捞针” !

六、实验延伸 -肿瘤标志物

A

B

C

D

E

F

图 3 健康人血清 (F) 与胃癌患者血清 (A-E) 质谱对比图

六、实验延伸 - 不同肿瘤质谱对比

图 4 健康人血清 (D， E) 与食道癌患者血清 (A-C) 质谱对比图

思考题RPLC 分离时为什么要分别用大小孔的填料？为什么反相流动相要加 TFA ？血清预处理中加入脲的作用是什么？ SEC 分离时，先出峰时分子量大的还是小的？基质的作用？用 SEC/RPLC/-MS 研究蛋白质组学有什么优点？除了本实验介绍的方法还可以用什么方法用来研究蛋白质组学？除质谱外，还有什么方法可以作为最终鉴定方法？

参考文献Tirumalai R S, Chan K C, Prieto D A, et al. Characterization of the Low Molecular

Weight Human Serum Proteome. Mol Cell Proteomics, 2003 , 2:1096-1103

Yu K H, Rustgi A K, Blair I A. Characterization of Proteins in Human Pancreatic

Cancer Serum Using Differential Gel Electrophoresis and Tandem Mass

Spectrometry. J Proteome Res, 2005, 4: 1742-1751

宋鑫 , 杨金亮 , 魏于全 . 血清蛋白质组学的研究进展 . 四川医学 , 2005, 26(7): 717-

719

Finke B, Mank M, Daniel H, et al. Offline coupling of low-pressure anion-exchange

chromatography with MALDI-MS to determine the elution order of human milk

oligosaccharides. Anal Biochem, 2000, 284: 256-265

Nyman T A. The role of mass spectrometry in proteome studies. Biomol Eng, 2001,

18: 221-227

Gareaa A V, Grieseb M and Imhof A. Biomarker discovery from body fluids using

mass spectrometry. J Chromatogr B, 2007, 849: 105-114

Montaudo G, Samperi F, Montaudo M S. Characterization of synthetic polymers by

MALDI-MS. Prog Polym Sci, 2006, 31: 277-357

大肠杆菌表达重组人粒细胞 -集落刺激因子包涵体的复性与纯化

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