Определение HLA-антител для успешной трансплантации...
Transcript of Определение HLA-антител для успешной трансплантации...
Определение HLA-антител для успешной
трансплантации почки
• Предсуществующие HLA-антитела, образовавшиеся в результатегемотрансфузий,беременностейилипредыдущихтрансплантаций,совпадаяпоспецифичностисгенотипомдонора,приводяткостройи сверхострой реакции отторжения трансплантата в первые часыилиднипослеоперации.
• HLA-антитела,появляющиесяпослетрансплантациипротивдонорскихантигеновdenovo,запускаютреакциихроническогоотторжения,ухуд-шаякачествофункционированиятрансплантатаивремяегожизни.
• НавсехядросодержащихклеткахорганизмаэкспрессируютсяHLA-антигены 1-ого класса:HLA-A,B,Слокусов.
• На иммунокомпетентных клетках (B-лимфоцитах), антигенпрезен-тирующихклетках(макрофаги,дендритныеклетки)иклеткахэндо-телиясосудовпредставленыHLA-антигены 2-го класса:HLA-DRB1(2,3,4,5),DQA1,DQB1,DPA1,DPB1локусов.
• УкаждогочеловекаHLA-антигенывсехлокусов1и2классовэкс-прессируютсяпопарно(кодоминантно)всоответствиисгаплотипа-миродителей.
950090008500800075007000650060005500500045004000350030002500200015001000
5000
1987
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
2015
Class I AllelesClass II Alleles
Чис
ло А
ллел
ей
Год
Рисунок 1. ПолиморфизмаллелейсистемыHLAвдинамикеоткрытияновыхаллелейпогодамс1987по2015г.(http://hla.alleles.org)
Система лейкоцитарных антигенов, ответственных за тканевую совместимость, является самой полиморфной системой антигенов у человека и животных. Число открываемых аллелей растёт с каждым годом (рисунок 1).
Пример генотипа реципиента:HLA-A*02;24HLA-B*07;13HLA-C*08;14HLA-DRB1*03;11HLA-DQB1*03;06
Пример генотипа донора:HLA-A*01;24HLA-B*07;44HLA-C*08;12HLA-DRB1*11;15HLA-DQB1*02;06
Степеньнесовместимости(mismatch)вданномпримересоставляет5/10(пятьиздесяти).
• Описаннаявпримерестепеньнесовместимостихарактерна,напри-мер,притрансплантацииотродственногодонора(гаплосовмести-мыйдонор).Однако,дажепритрансплантацииотнеродственногодонорачастоудаетсядостичьнеплохойсовместимостивсилутого,чтовпопуляцииопределенныеаллеливстречаются гораздочащедругих,иимеетместосцепленностьэтихаллелейвгаплотипы.
• На практике трансплантация солидных органов проводится с тойилиинойстепеньюгенетическогонесоответствия(имеютсяразли-чия в генотипах донораиреципиента поHLA).При этом главнымпринципом,которымследуетруководствоватьсядляпредотвраще-нияреакцийострогоихроническогоотторжениятрансплантата,из-бегать неприемлемых несоответствий.
• При трансплантации органа иммунная система реагирует на всеHLA-антигены,отличныеотHLA-антигеновреципиентапосредствомреакцийклеточногоигуморальногоотторжения.
Донор-специфические HLA-антитела (DSA) являются основным пусковым механизмом в реакции гуморального отторжения при трансплантации солидных органов.
Общие сведения
Неприемлемые несоответствия – это присутствие в генотипе потенциального донора HLA-антигенов, к которым у реципиента имеются антитела или их появление после трансплантации имеет высокую вероятность.
• Реакции клеточного иммунитета, опосредованные черезТ-лимфоциты, удаетсядостаточноуспешносдерживатьпрепарата-мииммуносупрессоров.Однакоонипрактическиневлияютнаре-акции гуморального иммунитета, опосредованные специфически-ми антидонорскимиHLA-антителами. По этой причине выявлениеспецифическихкдоноруHLA-антителдотрансплантациииихмони-торингпослетрансплантациипозволяетгибкореагироватьнарискразвитияотторженияиприниматьсоответствующиепрофилактиче-скиемероприятия.ПривысокомуровнесенсибилизациииналичииантидонорскихHLA-антителреципиентуможетбытьрекомендованплазмоферез. Десенсибилизирующая терапия также имеет боль-шоезначениеприподготовкереципиентактрансплантацииотрод-ственногодонора.
• Интересно,чтореципиентысширокимпрофилемантителдотранс-плантации,которымудаетсяподобратьдонора,кантигенамкоторо-гоантителаотсутствуют,постатистикеимеютлучшийпрогнозвыжи-ваемоститрансплантатапосравнениюснесенсибилизированнымиреципиентами,ввидуменьшейостаточнойиммунореактивности.
• ДействиеHLA-антителстрогоизбирательно.Так,например,антителавсывороткереципиента,образовавшиесяврезультатегемотранс-фузиипротивантигенаHLA-А*03,небудутреагироватьсдонорскимантигеном специфичности HLA-A*23, в силу различия антигенныхэпитопов,поэтомунеприведуткреакцииотторжения.
• Изэтогоправилаестьнекотороеисключение,когдаопределенныеHLA-антигеныимеютсхожиеэпитопы,имогутреагироватьсанти-теламинекоторыхдругихспецифичностей.Такиеантигеныобъеди-нили в кросс-реагирующие группы (CREG), которые представленынарисунках6–8.
• Примером кросс-реагирующих антигенов являютсяHLA-A*23 и 24(серологическая группа А9) или HLA-B*57 и 58 (серологическаягруппаВ17).Этипарыантигеновимеютобщийантигенныйэпитопипоэтомуреагируютсоспецифическимиантителамисовместно.
• Знаякросс-реагирующиесвойстванекоторыхантителуреципиентаследуетизбегатьдоноровссоответствующимигенотипами.
• Сегодня врачКДЛимеетнадежныйметодический арсенал, позво-ляющийнепростовыявитьHLA-антителауреципиента,аглавное,определитьихспецифичностьикомплемент-связывающуюспособ-ность. Это важно для исключения неприемлемых несоответствийскаждымпотенциальнымдонором.
• ПрилабораторномопределенииспецифичностейHLA-антителмето-дамимультиплексногоЛюминексанализапрограммаинтерпретацииуказываетнавсеимеющиесякросс-реактивныегруппыобнаружен-ныхHLA-антител,значенияPRA%,атакжедаетчисленныепоказате-лиинтенсивностисигнала,косвенноуказывающиенатитробнару-женныхантителтойилиинойHLA-специфичности(рисунок2).
• ИндексPRAрассчитываетсявпрограммеавтоматическинаоснова-нии профиля обнаруженных специфических антител и табличнойчастотывстречаемостикаждойспецифичностивпопуляции.Напри-мер, PRA 25% означает, что пациент может иметь положительнуюреакцию«cross-match»с25%потенциальныхдоноров(людейизоб-щейпопуляции).PRAвыше65%характеризуетпотенциальновысо-кийуровеньсенсибилизации,прикоторомвыявитьконкретныеим-мунореактивныеантитела,какправило,неудается.ЗнаязначениеPRA%длякаждогореципиентаможноориентироваться,наскольколегкоемубудетподобратьподходящегодонора.
HLA-антитела обладают достаточно высокой специфичностью.
PRA указывает процент потенциальных доноров, против которых у реципиента есть HLA-антитела.
Рисунок 2.КакотображаютсярезультатыанализавпрограммеинтерпретацииспецифическихHLA-антител,которыевидитврачлаборатории.
• Кроме того, в программеинтерпретациирезультатовприопреде-ленииHLA-антителможноотсортироватьданныепоинтенсивностифлуоресцентногосигнала(MFI)длякаждойспецифичностиантител.ЗначениярасчетногоMFIпредставляютсобойединицыинтенсивно-стифлуоресценции,приведенныекфоновомузначению.Косвенноданныезначенияуказываютнатитрдетектируемыхантител.
• Кпримеру,нарисунке3можновидетьразделениеспецифичностейHLA-антителнаположительные значения (столбики красногоцве-та)иотрицательныезначения(столбикизеленогоцвета).Вданномпримере, наибольший титр антител соответствует специфичностиA*11:01,дляэтоготипаантителвеличинарасчетногоMFIсоставиламаксимальноезначение(20461MFI).
Рисунок 3.РезультатыопределенияHLA-антител,отсортированныепозначениямMFIдлякаждойспецифичности.
1. Лабораторные тесты при плановом обследовании реципиентов «листа ожидания»
• HLA-генотипированиереципиентаполокусамHLA-A,B,DRB1наниз-комразрешении.
• Скрининговый тестнаHLA-антителапозволяетразделитьреципи-ентов«листаожидания»насенсибилизированныхинесенсибилизи-рованных.Сенсибилизированнымпациентампроводятдальнейшееобследованиенаидентификациюантител.
• Идентификационные тестыпозволяютопределить специфичностивыявленныхHLA-антителирассчитать%PRA.
2. Обследование реципиентов непосредственно перед трансплантацией
• Перед проведениемоперации лаборатория как правило уже рас-полагаетинформациейогенотипереципиентаполокусамHLA-A,B,DRB1иналичииунегоHLA-антителтойилиинойспецифичности.
• ПоэтомунапервомэтапепроводятHLA-генотипированиедонора.На основании полученных результатов проводят сопоставлениес генотипами реципиентов «листа ожидания», выделяя наиболееподходящих.
• Важно определить генотип донора не только по локусам HLA-A, BиDRB1,нотакжепоHLA-СиDQA1;DQB1,аповозможностиипоDP-локусу.Этопозволитвдальнейшемсоотнестиспецифичностиобна-руженныхуреципиентаHLA-антителсантигенамидонора,иустано-витьнеприемлемыекомбинациидонорскихантигенов.
• На втором этапе проводят процедурувиртуального кросс-матча,котораязаключаетсявсопоставленииHLA-антигеновдонораспро-филемспецифичностейHLA-антителреципиента.
• В случае, когдаантидонорскиеантителанеобнаружены–вирту-альный кросс-матч отрицательный. При совпадении специфич-ностейHLA-антителсантигенамидоноравиртуальныйкросс-матчположительный.
• На третьем этапе может быть проведен серологический лимфо-цитотоксический тест на совместимость (CDC). Этот вид анализавбольшейстепениноситсубъективныйхарактер,зависитотмето-дадетекции,видаисследуемогообразцаиопределяетвосновномHLA-антителапервогокласса.
Возможные варианты лабораторного заключения
Вариант А:HLA-антитела,втомчиследонор-специфические,невы-явлены или обнаружены HLA-антитела к антигенам первого и/иливторого класса, однако они не являются специфичными к антигенамдонора.Виртуальныйкросс-матчотрицательный.Серологическийлим-фоцитотоксическийтест(кросс-матч)отрицательный.Пациентизгруп-пынизкогориска.
• РекомендованмониторингDSAантителпослетрансплантации.
Вариант B:ОбнаруженыHLA-антитела к антигенамвторого класса,приэтомвыявленныеантителасовпадаютпоспецифичностисдонор-скимиHLA-антигенами.Виртуальныйкросс-матчположительный.Серо-логический лимфоцитотоксический тест (кросс-матч) отрицательный.Пациентизгруппысреднегоиммунологическогориска.
• РекомендованмониторингDSAантителпослетрансплантации.
Основным принципом, которым следует руководствоваться в подборе подходящего донора на основании его генотипа – это избегать неприемлемых несоответствий.
Лабораторные показатели
HLA-типирование необходимо для определения генетического соответствия тканевых (лейкоцитарных) антигенов донора и реципиента.
Вариант C:ОбнаруженыHLA-антителакантигенампервогокласса,приэтомвыявленныеантителасовпадаютпоспецифичностисдонор-скимиHLA-антигенами.Виртуальныйкросс-матчположительный.Серо-логический лимфоцитотоксический тест (кросс-матч) отрицательный.Пациентизгруппывысокогоиммунологическогориска.
• Рекомендованпоискдонора,ккоторомуреципиентнеимеетсенси-билизации.
• Плазмоферез в случае родственного донора (для снижения титраантител).
• МониторингDSAантителпослетрансплантации.
Вариант D:ОбнаруженыHLA-антителакантигенампервогои/иливторого класса, при этом выявленные антитела совпадают по спец-ифичности с донорскими HLA-антигенами. Виртуальный кросс-матчположительный.Серологическийлимфоцитотоксическийтест(кросс-матч)положительный.Пациентизгруппывысокогоиммунологическо-гориска.
• Рекомендованпоискдонора,ккоторомуреципиентнеимеетсенси-билизации.
• Плазмоферез в случае родственного донора (для снижения титраантител).
• МониторингDSAантителпослетрансплантации.
ВозможныевариантыанализаHLA-антителипримерныйбланк за-ключениялабораториипредставленывтаблице1инарисунке9.
3. Мониторинг образованных de novo HLA-антител после трансплантации как ранний маркер отторжения
• На первом этапе IgG HLA-антитела связываются с чужеродными(совпавшими по специфичности) донорскими антигенами на по-верхности клеток трансплантата. Далее этот комплекс взаимо-действует с белками системы комплемента, запуская каскаднуюцепочкуреакций, приводящую к образованиюпорывмембранеклеткиинеизбежномуеелизису.Черезнекотороевремякартинукомплемент-зависимойгибеликлетокможноувидетьморфологи-чески.Вобразцебиоптатадонорскогоорганабудутвидныпогиб-шиеклеткииотложениякомплемента,чтосвидетельствуетопро-цессеотторжения.
• Биопсия, как правило, показывает отсроченную картину оттор-жения, когда уже наступила клеточная гибель и можно видетьотложения комплемента в тканях. Лабораторный тест, подтверж-
HLA-антитела DSACDC
Уровеньриска
Рекомендации1класс 2класс 1класс 2класс
-/+ -/+ - - - низкий МониторингDSA
-/+ + - + - средний МониторингDSA
+ -/+ + +/- - высокийПодборподходящегодонораПлазмоферезМониторингDSA
+ -/+ + -/+ + высокийПодборподходящегодонораПлазмоферезМониторингDSA
Таблица 1.УровнирискаострогоотторженияпочкиирекомендациивзависимостиотвариантаобнаруженияHLA-антител.
Свое повреждающее действие на клетку донор-специфические HLA-антитела реализуют через активацию системы комплемента. Такую реакцию называют комплемент-зависимая цитотоксичность.
дающий наличие антидонорских HLA-антител дает возможностьпредсказатьразвитиеэтойреакциинасамомраннемэтапе,когдаиммуннаясистематолькоготовитсякатаке,аповреждающеевоз-действиеантителещенереализовалосьвкомплемент-зависимуюцитотоксичность. Это дает возможность заранее предпринятьмеры,направленныенаудалениеповреждающихантителизцир-куляции.
Рисунок 4.
Механизмдействиядонор-специфическихантителчерезактивациюси-стемыкомплемента.
• Однако показано, что среди пула циркулирующих донор-спец-ифических HLA-антител не все они обладают комплемент-фикси-рующей активностью. Обнаружить пул комплемент-фиксирующихHLA-антителсредивсехHLA-антителданнойспецифичностипозво-ляетспециальныйлабораторныйтест,выполняемыйнаплатформеЛюминекс к C3d-компоненту комплемента. Появление этого тестав последние годы сделало возможным прогнозировать и предот-вращатьразвитиегуморальногоотторжениянакачественноновомуровне(рисунок5).
Рисунок 5.
ПримеррезультатаанализаHLA-антител,когдауреципиентабылиобна-руженыобщиеанти-HLAантителаклассаIgG(синиестолбики)икомпле-мент-фиксирующиеанти-HLAантитела(красныестолбики).
A*1
1:01
A*0
3:01
A*1
1:02
A*3
6:01
A*0
2:02
A*0
2:03
1200011500110001050010000
950090008500800075007000650060005500500045004000350030002500200015001000
5000
LSA1RT-230315-DV – T1264676 PLACZEK LSA1RT-C3D-240315 – T1264676 PLACZEKSINGLE ANTIGEN I - C3d
IgG
BC
M v
s C
3d B
G A
djus
ted
Antigen
В процессе активации каскада комплемента образуется свободный C3d компонент комплимента, который можно обнаружить с помощью меченных моноклональных анти-С3d антител (рисунок 4).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Рисунок 8.Схемакросс-реагирующихгрупп(CREG)полокусуHLA-Cw.
Рисунок 6.Схемакросс-реагирующихгрупп(CREG)полокусуHLA-A.
Рисунок 7.Схемакросс-реагирующихгрупп(CREG)полокусуHLA-B.
Рисунок 9.Примербланкаотчеталаборатории,проводившейтрансплантационноеобследованиедоноровиреципиентов.
Пример бланка обследования трансплантологического больного
Наименование и реквизиты центра (адрес, телефон)
Лаборатория тканевого типирования
Реципиент ДонорID реципиента 1265 ID донора 152Дата рождения Дата рожденияПол ПолГруппа крови Группа кровиМатериал исследования Материал исследованияДата взятия анализа Дата взятия анализаДата выдачи ответа Дата выдачи ответа
HLA-типирование HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-DQB1Метод исследования (серология, SSP, SSO, SBT) SSO LuminexHLA генотип реципиента А*02;
А*25В*07;В*15
DRB1*01;DRB1*03
He определялось
HLA генотип донора А*02;А*11
В*15;В*35
DQB1*03;DRB1*15
DRB1*03;DQB1*05
Выявленные антитела к HLAМетод исследования (ИФА, Luminex) ЛюминексИндекс реактивных антител PRA% 5%Класс IА - не обнаруженыВ - не обнаруженыС - не обнаруженыКласс IIDRB1 - не обнаруженыDQA1/B1 - DQB1*01; 03; 05; 06; 08Донор специфические-антитела (DSA): DQB1*03; 05Виртуальный кросс-матч (DSA тест): положительныйСерологический кросс-матч (CDC тест): отрицательныйЗаключениеОбнаружены HLA-антитела к антигенам DQB1 (второго класса), антитела DQB1*03; 05 являются специфич-ными к антигенам донора. Виртуальный кросс-матч положительный. Серологический цитотоксическин тест (кросс-матч): отрицательный. Пациент из группы среднего иммунологического риска
Заведующий лабораторией ......................................................................................(Ф.И.О)
Основные лабораторные тесты на генетическую и иммунологическую совместимость
• ОпределениеHLA-генотипареципиентовлистаожиданияполокусамHLAA,B,DR.• ОпределениеHLA-генотипадонораполокусамHLA-A,B,Cw,DR,DQ.• Определение предсуществующих HLA-антител у реципиентов листа ожидания для выявления HLA-
сенсибилизациииопределенияпоказателяPRA%.• Постановкапрямойперекрестнойпробы(cross-match).• Посттрансплантационныймониторингреципиентадляпредупрежденияострогоихроническогоимму-
нологическогоотторжения.
Основные клинические преимущества
• Позволяет прогнозировать развитие ранней реакции отторжения до появления гистологически под-твержденногоанализапосредствомбиопсии.
• Позволяетсократитьколичествоинвазивныхметодовисследованиявнесколькораз.• Позволяетнаправлятьнатрансплантациювысокосенсибилизированныхреципиентов(PRAболее60%),
благодаряопределениюпрофилядонор-специфическихантител.• Позволяет детектировать комплементфиксирующие антитела к HLA-антигенам с помощью выявления
C3dкомпонентакомплемента.• Даетвозможностьпроводитьвиртуальный«кросс-матч»реципиентамлистаожидания,чтопозволяетза-
ранеепланироватьсовместимостьспотенциальнымдонором.• Качественнаядиагностиканапред-ипост-трансплантационномэтапеявляетсязалогомдолгосрочного
функционированиятрансплантатаипозволяетизбежатьповторныхтрансплантаций.
Основные методологические преимущества
• Позволяетпроводитьвеськомплекстестовнагенетическуюииммунологическуюсовместимостьнаод-нойплатформе.
• Сокращениевремениисследования.• Автоматизацияпроцессовгенотипирования,cross-matchиисследованияHLA-антителсавтоматической
интерпретациейрезультатов.• Возможностьсохранятьдонорскийматериал(клеточныйлизат)дляпоследующегомониторингаантидо-
норскогоиммунногоответауреципиента.• Снижениесебестоимоститестапосравнениюсручнымигенетическимиииммунологическимиметодами.• Возможностьэлектронногообменаданнымиирезультатамиисследованиясдругимиклиникамииon-
lineконсультациисгруппойтехническойподдержки.
Мультипараметрический анализатор Люминекс 200 (Luminex 200) в лабораторной диагностике при трансплантации солидных органов
ЗАО БиоХимМак119192,г.Москва,Ломоносовскийпроспектд.29,корп.1телефон(495) 647-27-40 факс(495) 647-2763e-mail: [email protected] www.biochemmack.ru
Каталожный номер
НАИМЕНОВАНИЕ НАБОРАКоличество
тестов
Наборы для HLA-генотипирования методом SSO на платформе Luminex
628911 НабордлягенотипированияLifecodesHLA-ASSOTypingkit 50тестов
628915 НабордлягенотипированияLifecodesHLA-BSSOTypingkit 50тестов
628921 НабордлягенотипированияLifecodesHLA-CSSOTypingkit 50тестов
628923 НабордлягенотипированияLifecodesHLA-DRB1SSOTypingkit 50тестов
628930 НабордлягенотипированияLifecodesHLA-DQA1/B1SSOTypingkit 50тестов
Наборы для определения HLA-антител на платформе Luminex
628215 НабордляскринингаHLA-антителLifecodesLifeScreenDeluxe 96тестов
628200 НабордляидентификацииHLA-антител1классаLifecodesIDI 24теста
628223 НабордляидентификацииHLA-антител2классаLifecodesIDII 24теста
265100 Набор для идентификации HLA-антител 1 класса с рекомбинантными антигенамиLifecodesSingleAntigen(LSAI)
24теста
265200 Набор для идентификации HLA-антител 2 класса с рекомбинантными антигенамиLifecodesSingleAntigen(LSAII)
24теста
265400R НабордляопределениякомпонентакомплементаC3dLifecodesC3dDetection 24теста
Информация для заказа