ფაგების გამოყოფა, კლონირება,

კონცენტრირება და გასუფთავება

ბესარიონ ლასარეიშვილი

აგრარული უნივერსიტეტი, უჯრედული იმუნოლოგიის

ლაბორატორია

გ.ელიავას სახელობის ბაქტერიოფაგიის, მიკრობიოლოგიის,

ვირუსოლოგიის ინსტიტუტი

ბაქტერიების ვირუსების მოკლედახასიათება

რატომ იმსახურებენ ფაგები ინტერესს?

• მედიცინა და ვეტერინარია

• ეკოლოგია და გარემოს დაცვა

• ბიოტექნოლოგია და გენეტიკური ინჟინერია

• ინჯინერია

• კვლევის მოდელი ფუნდამენტურ მეცნიერებებში

Historical Background

Eliava Institute of

Bacteriophages,Tbilisi

Since 1923

G. Eliava and F. D’Herelle,

Tbilisi, 1930

Therapeutic phage

preparations (2016, Georgia)

ბაქტერიების ვირუსების ძირითადი

მორფოლოგიურ ტიპები

• ძაფისებური (ფილამენტური) ფაგები

• უკუდო, სფეროსებური ფაგები

• მოკლე კუდით (პოდოვირიდე)

• გრძელი, უკუმშველი კუდით (სიფოვირიდე)

• შედარებით გრძელი, მკუმშავი კუდით (მიოვირიდე)

ფაგების გენომი და ზომები

• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი დნმ

• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი რნმ

რგოლისებური (შედარებით იშვიათად), გახსნილი /ხაზოვანი/ ან

ფრაგმენტირებული ფორმით

• ზომები: 20-დან 100 ნმ-მდე

კუდის დიამეტრი 12-25 ნმ-ია, მისი სიგრძე 14-250 ნმ-ია

სიმწიფის მიხედვით განასხვავებენ

• ინფექციურ (მომწიფებულ) ფაგები

ვირულენტური (მალიზირებელი) ფაგები ანუ ფაგი-აგრესორები

ზომიერი (ლიზოგენური, ლატენტური) ფაგები ანუ ფაგი-

კომენსალები

• არაინფექციური ანუ ვეგეტაციური (მოუმწიფებელი)

ფაგები

ფაგების სასიცოცხლო ციკლი

• პროდუქციული (ლიზისური)

• რედუქციული (ლიზოგენური, ინტეგრაციული)

• აბორტული ინფექცია

ფაგების პროდუქციული (ლიზისური)

სასიცოცხლო ციკლი 20-40 წთ-ი გრძელდება

• ადსორბცია (მოქმედების სპექტრი)

ტიპოსპეციფიკური (ტიპიურ ანუ T-ფაგები)

მონოვალენტური (მონოფაგები, სახეობასპეციფიკური)

პოლივალენტური (პოლიფაგები) ფაგები

• გენომის ინექციის (ეჟექციის)

• ვირიონების ბიოსინთეზიდა აწყობა

• ბაქტერიულიუჯრედისლიზისიდა ვირიონების გამოსვლა

გარემოდან ფაგების გამოყოფა,

კონცენტრირებულიდა გასუფთავებული

ფაგური პრეპარატის მომზადება

კონცენტრირებული და გასუფთავებული

პრეპარატების გამოყენება

• იმუნობიოლოგიური მოქმედების შესწავლა

• ფიზიკო-ქიმიური თვისებების შესწავლა

• მოლეკულურ-ბიოლოგიური თვისებების შესწავლა

• ინტრავენურად საინექციო პრეპარატის წარმოება

კონცენტრირებული და გასუფთავებული

პრეპარატების გამოყენება

• ფაგის იზოლაცია გარემოდან

• ფაგის გენეტიკურად სუფთა ხაზის მიღება და

დახასიათება

• ფაგის დაკონცენტრირება

• გაწმენდა

ფაგების გამოყოფა: ნიმუშის გამდიდრება დადეტექცია

ნიმუშის გაწმენდა მასში არსებული ბაქტერიებისგან

მასპინძელი ბაქტერია

საკვები არე

გამდიდრებული სუსპენზიიდან დაუშლელი

ბაქტერიების მოცილება და ფაგების დეტექცია

ფაგური იზოლატის კლონირება - სუფთა

გენეტიკური ხაზის ფაგის გამოსაყოფა

ნეგატიური კოლონიები (ფაგური ბალთა) ფინჯანზე მეჩხრად

იყოს

ავარჩიოთ კონკრეტული ფორმის და ზომის ნეგატიურ ი

კოლონია

ამოვჩხვლიტოთ სხვა კოლონიებისგან კარგად გამიჯნული,

იზოლირებული ფაგური ბალთა

ერთი მორფოლოგიის ნეგატიური კოლონიის მქონე ფაგების 3-7

-ჯერადი პასირება

ფაგური სუსპენზიის სერიული განზავება

ფაგების დაკონცენტრირებითვის ფაგის დაბაქტერიის ოპტიმალურითანაფარდობა უნდა

დადგინდეს

ფაგის გამრავლების შედეგად პეტრის ფინჯანზე

კულტურის 95-98 %-ზე მეტი ნაწილისლიზისი

ფაგის და ბაქტერიის გამრავლების სიჩქარის თანაფარდობა

ფაგის გამოსავალი 1 ბაქტერიულიუჯრედიდან

კულტურა ექსპონენციალური ზრდის ფაზაში

ბაქტერიის ოპტიმალური კონცენტრაცია - 1×109 -1×1010

ფაგის ოპტიმალურ კონცენტრაციად 103-105 CFU/მლ-ში

ფაგების დაკონცენტრირება (2)

მიღებული ფაგოლიზატის შეგროვება

აგარის და დაუშლელი ბაქტერიების მოცილება

ფინჯნიდან მომზადებულფაგოლიზატში ფაგების

კონცენტრაციამ შეიძლება მიაღწიოს 8 ×1011 - 2×1012

CFU/მლ-ში

მაღალსიჩქარიანი ცენტრიფუგირებით ფაგების ,,დაჯენა”

ბუფერის დამატება და დაყოვნება 1-2 დღით

ფაგური ნალექის ფრთხილი გახსნა

გაუხსნელი აგრეგატების მოცილება

ფაგების დაკონცენტრირება (3)

გახსნილ ნალექში ფაგების რაოდენობა შეადგენს 7-9×1012

CFU/მლ-ში.

მომზადებული მაღალ კონცენტრირებული პრეპარატი

გარდა ინტაქტური ფაგური ვირიონებისა, დიდი

რაოდენობით შეიცავს დაზიანებულ ვირიონებს,

ბაქტერიის უჯრედის კედლის კომპონენტებს, ნუკლეინის

მჟავებს

ფაგების გაწმენდა ბაქტერიული

დებრიზისგან და ნუკლეინის მჟავებისგან (1)

• ულტრაცენტრიფუგირება ცეზიუმის ქლორიდის ორმაგ

გრადიენტზე

• ხსნარები მზადდება PH 7,4 ბუფერზე და ემატება ვირიონების

სტაბილიზატორები

• პირველი ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,52-1,6 ρ სიმკვრივის

ხსნარი

• მეორე ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,35-1,4 ρ სიმკვრივის

ხსნარი

• მესამე ფენა ,,ბალიშის” სახით: საქაროზის 30-40 %-ანი ხსნარი

• ულტრაცენტრიფუგირება

ფაგების გაწმენდა ორმაგ გრადიენტზე

ულტრაცენტრიფუგირებით

1,6 ρ CsCl

1,4 ρ CsCl

40% საქაროზა

ულტრაცენტრიფუგირება

(ფიქსირებულროტორიან ცენტრიფუგაზე)

ულტრაცენტრიფუგირება

(Swing-out როტორიან ცენტრიფუგაზე)

გაწმენდილფაგური ბენდში ფაგების

კონცენტრაცია 1-2×1013 CFU/მლ

გაწმენდილი ფაგური ბენდის გამოტანა

ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზესაფრთხილოდა მგრძნობიარე ეტაპია

სადიალიზო ბუფერი უნდა შეიცავდეს ფაგური ვირიონების

სტაბილიზატორებს

ბუფერის მოცულობა სადიალოზო მოცულობას 100-1000 -ჯერ

უნდა აღემატებოდეს

უნდა გრძელდებოდეს მინიმუმ 3-4 საათის განმავლობაში.

დიალიზის დროს ოსმოსური წნევა თანდათან უნდა

შემცირდეს:

3M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4;

0, 3 M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4

0,9% NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4 ხსნარში

ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზე

კრიტიკული და მგრძნობიარე ეტაპია

სადიალიზო სისტემა შეიძლება ატარებდეს

ფაგების მცირე რაოდენობას

თუ გვაქვს სხვადასხვა ტიპის ფაგები, მათი დიალიზიარ უნდა განხორცილედეს ერთ კონტეინერში

ნეგატიური შეღებვა TEM-ის

P.S. ბადეებზე მუშაობისას ვისუნთქოთ ნელა და ფრთხილად

ფაგებზე მუშაობის კრიტიკული ეტაპები

• კლონირება

• ფილტრიანი პიპეტის წვერების ან ინდივიდუალური

პიპეტების გამოყენება

• ნეგატიური შეღებვისას ბადეებზე ფრთხილი მუშაობა

• ვირიონების სტაბილიზატორების გამოყენება

• გრადიენტის ფრთხილი დაფენა

• გაწმენდილი ფაგური ბენდის ნატიფი გამოღება

• დიალიზი

რა დრო სჭირდება მთელ პროცედურას?

ყველა აღწერილი პროცედურის ბოლომდე შესრულება

ოპტიმალურ პირობებში 4-6 კვირამდე პერიოდს საჭიროებს!

თუმცა ხშირად ამ პროცედურების გასავლელად მკვლევარები

წელიწადზე მეტ დროს კარგავენ

გმადლობთ ყურადღებისთვის!

Production and Application of Phagelysates as New Generation of Immunomodulators

Besarion Lasareishvili

Eka Jaiani, Merina Tediashvili

Agricultural University of Georgia, Tbilisi, Georgia

G. Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and

Virology, Tbilisi, Georgia

Why it’s necessary to stimulate immune

system?

Frequency of immune dysfunctions in population is

increasing

Stimulation of the immune system is important for:

Treatment of malignancies

Treatment of immunodeficiency

Treatment of recurrent, indolent infections

Speed up the healing of chronic wounds and Ulcers

Increase efficacy of antibiotic therapy

Also

Decrease the susceptibility to an emerging infectious agent

Minimize the effects of bio-terroristic attacks

Thinking globally

კლინიკა „კაცთა მაცხოვარი“

Development of immunostimulators

with maximal therapeutic and minimal

adverse effects is of the great practical

value

Groups of Immunothrophic Medications

Immunostimulants

Immunodepressants (immunosupresants)

Immunocorrectors

The microbial lysates were found to be most

effective and cheapest immunostimulants

Immunotherapy by Bacterial Lysates was first

Implemented in 1895

Serratia marcescens (Bact. prodigiosum)

Streptococcus pyogenes

Pioneer of Immunotherapy

William Coley

(1862 – 1936)

Immunotherapy by Very Low dose of Microbial Lysates

Hoya, Germany

Medications based of Lysates:

Bacillus subtilis (Utilin® “H“ )

Mycobacterium phlei (Utilin® “S“ )

Bacillus cereus (Latensin® )

Bacillus firmus (Recarcin® )

Three Major Methods for Obtaining of

Bacterial Lysates

• Physical degradation of microbes (Mechanical, Ultrasound,

freezing-melting out, thermal treatment, electrolise, electrodialise,

etc.)

• Chemical degradation of microbes (Acid and/or alkaline

thermohydrolysis)

• Biological degradation of microbes (Use of enzymes, burst by

antibiotics, phages…)

Microbe derived drugs – The most potent

immunostimulators

Microbial Lysates

PolyMICROBIAL (Bronchomunal, Immudon, IRS-19, Immunovac vp-4,

Respibrin, Paspat, Dentavacs, Respivax, Urostim)

MonoMICROBIAL(Ruzam, Posterizan)

Partially Purified Components

Lypopolisaccharide - LPS (Prodigiosane, Pirogenale, Salmosane,

Zimosane, Lentinane, Krestine)

Peptidoglycan (Ribomunil, Imunomacs, Biostim, Immunopherone)

Nucleic Acides (Sodium Nucleinat, Ridostin, Lariphan, Ridostin)

Immune active Minimal Phragments

Glucosaminylmuramyl dipeptide - GMDP (Lycopide)

CpG -oligonucleotide (Promune, Actilone, Vacsimune)

Microbial Lysates as a pharmaceuticals (1)

Name Manufacturer Country Count of Mycrobial

Species

Pasterisane Dr. Kade, Germany 1

Pasterisane Phorte Dr. Kade, Germany 1

Paspate (autolisate) Germany 6

Spremmunane France 10

Respibrine 8

Respivax Bulgaria 6

Dentivax Bulgaria 5

Urostime Bulgaria 4

MPV Germany 48

BP-4 Immunovac Russia 4

Ribommunil P. Fabre Medicament,

France

4

Name Manufacturer Country Count of Mycrobial

Species

Broncho-munal “LEK” Slovenia 8

Broncho-Vaxome “OM pharma”

Switzerland

8

Immudone “Solvey Pharma“

France

14

IRS-19 “Solvey-Dufart”

Germany

19

Sebreum “ОМ pharma”

Switzerland

18

Uro-Vaxome “OM” pharma”

Switzerland

18

Solkourovake “Solco” Switzerland 5

Solkotriphage “Solco’’ Switzerland 8 (Strain)

Pacibanile (OK-

432)

Japan 1

La (Mega)-Iomolle Japan 1

Microbial Lysates as a pharmaceuticals (2)

Microbes Often Used to Obtain Bacterial

Lysates

• Staphylococcus aureus

• Streptococcus pneumonie, S.viridans,

S.pyogenes, S.sanguis, S.dysgalactie

• Proteus vulgaris

• Serratia marcescens

• Klebsiella pneumonie, Kl.ozoenae

• Haemophilus influenza

• Moraxella catarrhalis, M. flava, M.

pervlava

• Neisseria perflava, N. catarrhalis

• Corynebacterium pseudodiphteriticum

• Acinetobacter calcoaceticus

• Enterococcus fecalis, E. faecium

• Candida albicans

• Hafnia tetragena,

• Fuzobacterium nucleatum

• Lactobaccilus acidophilus, L.helveticus,

L.delbrueckii, L.fermentum

Main Component of Microbial Lysates –

PAMPs and their receptors PRR

Agonists of following receptors :

Expressed on membranes

TLR (Toll-Like Receptors)

Expressed on cytosole

NLR (Nucleotide-binding

Oligomerization Domain)

RLR (RIG-Like Receptors)

DAI- Receptors

Microbial patterns expressed in high amount

by microbial cells

Microbial Patterns can activate all

type of immune cells

13

Receptors Mon/Macr.

Neutr. Eusin. Mast cells

MyeloidDC

Plasm.DC

NK cells

B cells T cells T reg

TLR1 + + + + + - + + + +

TLR2 + + + + - + ++ - - + + +

TLR3 ++/+ - + - ++ - ++ - + -

TLR4 + + + + + + ++ - + - - +

TLR5 + + - - - + - + + - +

TLR6 + + + - + + - + + ++ +

TLR7 + + + - - + - + + +

TLR8 + + + - - + - + - - +

TLR9 + + + - - + + + + -

TLR10 + + + - + - - + + -

Microbial Patterns can activate all type of immune cells

Interaction between PAMP and PRR

Amplification of various

immunological effects:

Production of Proinflamatory

mediators (Cytokines and Lypid

metabolits)

Production of α- and β- IFNs

Secretion of Cytotoxic Molecules

Stimulation of Phagocytic Activity

Stimulation of Antigen Presentation

14

Various Microbial Patterns cause different type deviation CD4+ T Lymphocytes what can be used in the treatment of

Allergies an Cancers

Bacterial Phagelysates: Complex preparations

Combination of a Vaccine, Adjuvant, Immunostimulant and

specific antimicrobial agent

Pathogen Associated Molecular Patterns

(PAMPs)

Highly Immunogenic Antigens

Viruses of Bacteria (Phages)

Potential of Phagelysates: Historical Background

Eliava Institute of

Bacteriophages,Tbilisi

Since 1923

G. Eliava and F. D’Herelle,

Tbilisi, 1930

Therapeutic phage

preparations (2016, Georgia)

Bacteriophages:

highly specific for the target bacteria

Effective against multiple drug-resistant bacteria

Do not affect normal microflora

Do not cause significant side effects (allergy, intoxication etc).

Ecologically safe - do not accumulate in the environment;

Phage preparations express immunomodulatory properties

( Meipariani et al, 1967; Chanishvili et al, 2009)

How to lyse bacteria by use of phages

Lysis from outside

without phage propagation

Phage/Bacteria ratio : 10/1 to 70/1

Lysis from inside

active propagation of phages in

bacterial cells

Phage/Bacteria ratio: 1/10 to 1/100

Lysates prepared by biologycal methods appear to have better

stimulatory effect on the immune system

Phage Lysates in Experimental Studies

Three species of Gram negative bacteria and their specific phages were

used to obtain phagelysates

E.coli - phage Un (Myoviridae, elongated head)

Erw. carotovora - phage ET9 (Myoviridae, isometric head)

P.aeruginosa - phage PNM (Podoviridae)

100nm

100nm

Obtaining and testing of phagelysates –

experimental study

Phage infection at the different

stages of Exponential Growth phase

Important parameters :

Proper selection of bacteria and phage

Phage / bacteria ratio

Time of phage inoculation

Lysis time

Concentration of live phage particles

Content of Nucleic acids and

proteins, LPS

Fractionation procedure

Induction of Rapid Active Immunity by

Bacterial Phage Lysates

Non-specific (Universal defence)

Effective against various infectious agents

Rapid development (12-24 hours) after

injection of a phagelysate (Rapid defence)

Short-lasting defense : Developed resistance

lasts for 10-14 days

Potential use (e.g. in Veterinary): to minimaze

the results of bioterrorisitic attacks or natural

epidemics ( e.g. in industrial farming)

Defensive effects of phagelysates

Injection of lysates

After 24 hours

(up to 7 days)

Injection of lethal doses S.aureus

100 % survival

Injection of lethal

doses S.aureus

100 % died

After 2-4 hr

Control group

Experimental group

Total survival (100%) of animals observed after stimulation by

PhL - in 24 hr and up to 7 days

Rapid Defense developed against

Dosis certae lethalis (Dcl) of S.aureus 3

PhL-Pae

PhL-Erc

PhL-Eco

Control0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8 hr12 hr

15 hr24 hr

72hr5 days

7 days10 days

14days

PhL-Pae

PhL-Erc

PhL-Eco

Control

%

of

su

rviv

al

Phage lysates

P.aeruginosa/PMN, Erwinia corotovora/TE9 and E.coli/Un

1 2

Structural changes in liver and kidney of experimental

animals after inoculation of phagelysates

A

B

3

A – Liver; B- kidney; 1 - control ( intact) animals; 2 - phagelysate inoculation;

3 - Thermolysate inoculation (5 days after inoculation)

Minor transient influence of phagelysates

Phage Lysates in Erlich Carcinoma

immunotherapy

Immunomoregulatory properties of phagelysates:

Increase in numbers of CD3 + CD8 +, CD3 + CD4 + and CD16 + CD56+ cells,

Decrease of T-reg’s (CD4CD25, CD25Foxp3 )K. Gambashidze, P. Khorava,E. Jaiani, B. Lasareishvil,M. Tediashvili, Antitumor and adjuvant effects of phagelysates of E.coli in mice with erlich carcinoma, Exp Oncol, 34, 2, 107–111, 2013

Application Fields - Perspectives

Immunodeficiency Status

Chronic, indolent infections

Unhealed wounds and Ulcers

Tumors

Infectious coused by drug-resistent bacteria

Counter Bioterorism

Cass73,9 nm

BL-260,8 nm

Ec-C56,5 nm

Ec-0969,1nm

BL-161,9 nm

Ps.a.65,2 nm

W.P.63,9 nm

lansing56,2 nm

New Podoviridae Phages isolated from Tbilisi’s

and Michigan’s Rivers and Lakes – for use in

future experiments

THANK YOU

Acknowledgment:

Dr. Marina Tediashvili - Eliava Institute, Tbilisi

Dr. Eka Jaiani – Eliava Institute, Tbilisi

Dr. Ketevan Gambashidze – Tbilisi State Medical University