诲诲㊥Ȫ ″ 瞛瞝瞝 - Facultad de Biología...

诲诲㊥瞛瞝�瞝ȪȪȪ ″

Ester Gangoso Rodríguez

4º Bioquímica

Curso: 2006/2007

USAL

Sello

2

Í�DICE

Páginas

1-I�TRODUCCIÓ� 4

2-A�ALÍSIS FÍSICO-QUÍMICO DE ALIME�TOS

2.1-Cloruros 5-6

2.2-Nitritos 6-7

2.3-Nitratos 7-8

2.4-Humedad en carnes 8-9

3-A�ÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIME�TOS

3.1- Aerobios mesófilos totales 10 3.2-Clostridium sulfito reductor 10

3.3- Enterobacterias lactosa positivas-coliformes 10 3.4-Clostridium perfringes 11

3.5-Enterobacterias totales 11

3.6- Escherichia Coli 11-12

3.7-Staphylococcus Aureus 12

4-A�ÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO AGUAS

4.1 Color 13-14

4.2-Olor 14

4.3-Sabor 14

4.4-Ph 14-15

4.5-Conductividad eléctrica 15-16

4.6-Determinación amonio 16

4.7-Turbidez 17

4.8-Oxidabilidad 18-19

5-A�ÁLISIS MICROBIÓLICO DE AGUAS

5.1- Clostridium perfringes 20

5.2-Coliformes 20-21

5.3- Escherichia Coli 21-22

5.4-Recuento de colonias a 22ºC 22-23

6-CO�CLUSIÓ� Y RESULTADO DE LAS PRÁCTICAS 24

3

1- I�TRODUCCIÓ�

• DATOS DE LAS PRÁCTICAS

- EMPRESA: BIORAMA

-ALUM�A: Ester Gangoso Rodríguez

-TUTOR: Almudena Sánchez Rios

-DIRECCIÓ� DE LA EMPRESA: C/Príncipe Felipe, 10, bajo. 37 770 - Guijuelo

(Salamanca).

-DURACIÓ� DE LAS PRÁCTICAS: Julio y Agosto de 2007 (320 horas).

• OBJETIVOS DE LAS PRÁCTICAS

- Análisis microbiológico de alimentos

- Análisis microbiológico de aguas

- Análisis físico químico de aguas

- Análisis calidad embutidos y pimentón (contenido de proteínas, grasas, humedad,

cenizas….)

- Cromatografía de gases para la determinación de perfil de ácidos grasos en tocino de

cerdo ibérico

- Preparación de medios de cultivo, autoclave….

- Preparación y análisis de superficies de trabajo

4

2- A�ÁLISIS FISICO-QUÍMICO DE ALIME�TOS

Todas las muestras que llegan al laboratorio se registran, asignándoles una etiqueta de un

color (dependiendo del día de la semana) y con un número. Si la muestra no va a ser analizada

en un tiempo breve se congela.

Durante el periodo de prácticas he desarrollado varios tipos de análisis físico-químicos.

Hemos determinado en alimentos ; cloruros, nitritos, nitratos, humedad en carnes, cenizas en

carne, grasa en carnes, proteínas en carnes, hidroxiprolina y pruebas de antibióticos. Referente

al pimentón hemos realizado análisis de humedad e índice de color.

Solo voy a desarrollar los protocolos que he realizado con más frecuencia durante los dos

meses de prácticas.

2.1_ CLORUROS

MATERIAL Y APARATOS

- Balanza analítica

- Embudos

- Placa calefactora

- Agitador metálico con calefacción

- Centrífuga y tubos de base redonda de al menos 100 ml

REACTIVOS Y SOLUCIONES

- Ácido Nítrico 60%

- Agua destilada

- Alcohol etílico 96%

- Hierro III y amonio sulfato 12-hidrato

- Nitrobenceno

- Plata nitrato 0.1 N

- Potasio ferrocianuro 3- hidrato

- Potasio sulfocianuro 0.1 N

- Zinc acetato 2-hidrato

- Solución acuosa de Hierro II y amonio sulfato 4%: 4 gr de hierro III y amonio sulfato

12 hidrato en 100 ml de agua destilada

- Reactivo de Carrez:

I - solución acuosa de potasio ferrocianuro 15%

5

II – solución acuosa de zinc acetato 30%

PROCEDIMIENTO

Preparar, con precisión de 1gr, 10 gr de muestra e introducirla en un erlenmeyer de 250 ml.

Añadir 150 ml de alcohol etílico 40%. Poner en el agitador y calentar suavemente, prolongando

la agitación durante 1 hora. Trasvasarse a un matraz aforado de 25º con alcohol etílico 40%.

Añadir consecutivamente 5 ml de cada reactivo de Carrez y enrasar con agua destilada. Agitar y

dejar reposar durante 10 min. Centrifugar 5 min a 2000 r.p.m . Separar la grasa sobrenadante,

filtrar en el matraz de 200 hasta enrase. Verter el contenido del matraz en un vaso de 500 ml y

colocarlo en la placa calefactora, evaporar el líquido hasta aproximadamente 100 ml para

eliminar el alcohol. Dejar enfriar y llevar el líquido al matraz de 200 y enrasar con agua

destilada. El extracto obtenido lo vamos a utilizar para cloruros, nitratos y nitritos.

Valorar introduciendo el líquido en un erlenmeyer de 250 ml, agitando suavemente entre

adicción y adicción:

- 10 ml de Nitrato de plata 0.1 N

- 10 ml de Ac. Nítrico 60%

- 1 ml de solución de hierro III y amonio sulfato 4%

- 10 ml de extracto problema

- 50 ml de agua destilada

Dejar reposar durante 10 minutos en la oscuridad. Añadir 1 ml de Nitrobenceno para

aglomerar el precipitado y obtener una solución limpia. Valorar el exceso de nitrato de plata con

potasio sulfocianuro ó tiocianuro 0.1 N, hasta viraje

CÁLCULOS

P = peso, en gramos, de la muestra

n = volumen, en ml, de potasio tiosulfato 0.1 n gastados

6

2.2- �ITRITOS

MATERIAL Y APARATOS

- Baño maría

- Papel de filtro

- Espectrofotómetro

- Tubos de ensayo


- Ac Acético glacial

- Ác Sulfanílico

- Agua destilada

- 1- Naftilamina cloruro

- Sodio cloruro

- Sodio nitrito

Reactivo colorimétrico, se obtiene añadiendo mezclando volúmenes igual de:

-Solución I : disolver calentando al baño maria, 1,5 gr de Ác Sulfanílico en 50 ml de

Ác. Acético glacial y 100 ml de agua destilada. Añadir 50 ml de una solución de sodio

cloruro que contenga 100 g/ l de sodio cloruro. Enrasar con agua destilada hasta 250 ml.

-Solución II: Disolver 0.4 gr de 1- Naftilamina en 100m l de agua destilada, esta es la

solución madre. Tomamos 25 ml de solución madre y añadir 50 ml de Ác. Acético glacial,

enrasar con agua destilada hasta 250 ml.

Solución patrón sodio-nitrito: Pesar, con aproximación de 1mg, 0,25 gr de sodio nitrito,

disolver en agua destilada y completar hasta 250 ml. Tomar 1 ml de esta disolución e

introducirla en un matraz aforado de 200, enrasar con agua destilada

PROCEDIMIENTO

Se utiliza el extracto obtenido en la analítica de coluros. Del extracto obtenido, tomamos 25

ml y añadimos 1 gr de carbón activo en polvo si es necesario decolorar. Filtramos hasta que el

filtrado sea transparente y de éste tomamos una alícuota de 10 ml en un tubo de ensayo.

Añadimos 10 ml del reactivo colorimétrico, mezclamos y dejamos la solución en reposo durante

15 minutos, al abrigo de la luz.

A partir de 20 min y antes de 4 horas, medir la densidad ótica de la solución a una longitud

de onda de 520 nm

7

Tomar de la solución patrón alícuotas de 5, 10 y 20 ml y llevar a 100 ml de agua destilada.

El contenido de estas disoluciones e de 0.25, 0.5 y 1 p.p.m. de nitrito de sodio.

Transferir 10 ml de cada una de estas disoluciones a un tubo de ensayo, añadir 10 ml del

reactivo colorimétrico y proceder a su valoración colorimétria a 520 nm.

Con la absorbancia obtenida en la medición y la curva patrón, obtenemos las p.p.m (µg/ ml)

de sodio nitrito que tiene la solución, a partir de aquí calculamos :

C: concentración en sodio nitrito expresado en µg/ ml, determinada en la curva patrón

M: peso de la muestra

V: volumen, en ml , tomando del extracto decolorado

2.3 �ITRATOS

MATERIALES Y APARATOS

- Matraces aforados de 50 ml

- Espectrofotómetro


- Ác. Clorhídrico 37.5%

- Ác Sulfanílico

- Agua destilada

- Ác. Sulfúrico 96 %

- Brucina

- Potasio nitrato

- Reactivo Brucina- Ác. Sulfanílico: Disolver 1 gr de brucina y 0.1 gr de Ác

sulfanílico en unos 70 ml de agua destilada caliente, añadir 3 ml de Ác clorhídrico 37.5

%, dejar enfriar y enrasar a 100 ml con agua destilada. Guardar la solución en frascos

color topacio.

- Solución de ác. Sulfúrico: Añadir con cuidado 500 ml de Ác. Sulfúrico 96 % a

75 ml de agua destilada. Conservar herméticamente cerrado.

- Solución patrón nitratos: Disolver 0.04 gr de potasio nitrato en agua destilada y

enrasar a 250 ml.

8

PROCEDIMIENTO

Preparamos el extracto igual que en la analítica de cloruros. En un matraz aforado de 50 ml,

introducimos 10 ml del extracto, 1 ml del reactivo de Brucina-Ác sulfanílico y 10 ml de

solución de Ác Sulfúrico, mezclamos y dejamos en reposo durante 10 min de abrigo de la luz

Pasado este tiempo, añadimos agua destilada (agitando) hasta completar unos 40 ml y

dejamos en reposo durante 15 ml en la oscuridad.

Enfriamos el matraz en un baño de agua de hielo hasta que alcance tª ambiente,

preferiblemente en la oscuridad. Alcanzada la t ª, enrasar hasta 50 ml con agua destilada,

homogeneizar y leer absorbancia a 410 nm. El cero se ajusta con agua destilada sometida al

procedimiento anteriormente descrito.

Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrón y expresar el correspondiente contenido en

nitratos en mg/Kg

2.4 HUMEDAD E� CAR�ES

MATERIAL Y APARATOS

- Balanza analítica

- Cápsulas

- Varillas fina de vidrio

- Desecador

- Baño maria

- Estufa ecléctica regulada a 102

REACTIVOS

- Etanol 96%

- Arena de mar lavada

- Gel de sílice como indicador

PROCEDIMIENTO

Secar la cápsula durante 30 min en la estufa reculada a 102 ºC. Pasado eSte tiempo sacarla

de la estufa e introducirla en el desecador, hasta que alcance la temperatura ambiente, y pesar el

conjunto con 0.1 mg de precisión. Pesar 4 gr muestra.

Añadir a la cápsula 5ml de etanol 96% y remover con la varilla de vidrio.

9

Colocar la cápsula en el baño a 60-80 ºC, mantener el calentamiento hasta la evaporación

del etanol.

Secar la muestra durante cuatro horas en la estufa a 102 ºC

Retirar la cápsula de la estufa y colocarla en el desecado hasta que alcance t ª ambiente

Pesar con una aproximación de 0.1 gr

CÁLCULOS

M0: masa, en gr, de la cápsula

M1: mas, en gr, de la cápsula y la muestra antes desecado

M2: masa, en gr, de la cápsula y la muestra después del desecado

% E.S. : 100 - % HUMEDAD

10

3- A�ÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIME�TOS

3.1 AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES

Medio de cultivo: TSA Agar

Instrucciones: Siembra en masa

- Toma alícuota 1 ml de cada dilución y depositar en una placa petri

- Añadir aproximadamente 15 ml de medio previamente atemperado

- Incubar 24 horas a 37 ºC

Interpretación: se cuentan todas las colonias, expresando el resultado en número de

colonias por gramo

3.2 CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

Medio de cultivo: SPS según Angelote

Instrucciones : Siembra en tubo

- Tomar una alícuota de 1 ml de cada dilución y añadirla en 10 ml medio SPS,

diluido previamente en tubos

- Agitar el tubo y sellarlo con parafina estéril

- Incubar 24 horas a 37 ºC

Interpretación: las colonias que crezcan con color negro a lo largo del tubo, serán

consideradas sospechosas

El resultado se expresa en u.f.c./g

3.3 E�TEROBACTERIAS LACTOSA POSTIVAS-

COLIFORMES

Medio de cultivo: Agar rojo bilis violeta lactosa (VRBL)

Instrucciones: siembra en masa

- tomar una alícuota 1 ml de cada dilución y depositarla en una placa petri


- Incubar durante 24 horas a 37 ºC

Interpretación: las colonias que crezcan con color morado, serán consideradas

sospechosas


11

3.4 CLOSTRIDIUM PERFRI�GES

Medio de cultivo: TSC


- Tomar una alícuota de 1 ml de cada dilución y añadirla en 10 ml medio TSC,

una vez solidificado en medio se añade otra capa de agar para conseguir condiciones de

anaerobiosis


Interpretación: las colonias que crezcan con color negro, serán consideradas sospechosas

Confirmación: Nitrato movilidad positivo

Las colonias sospechosas serán confirmados, inoculamos la colonia sospechosa, por

picadura, en medio Nitrato movilidad sellando con parafina estéril incubar durante 24 horas a 37

ºC. Si aparece coloración roja en la superficie del tubo, significa que ha habido crecimiento y se

considera como nitrato movilidad positivo, si no aparece coloración roja se considera movilidad

negativa


3.5 E�TEROBACTERIAS TOTALES

Medio De cultivo: Agar Rojo bilis violeta glucosa


- Tomar una alícuota de 1 ml de cada dilución y depositarla en una placa petri



Interpretación: Las colonias que crezcan con color morado, serán consideradas

sospechosas.

Confirmación: se utiliza oxidasa negativa. La colonia sospechosa se coloca en un soporte

de vidrio o papel secante y le añadimos unas gotas de p- etilendiamina (10mg/1ml). Si se

produce un viareje azul, la colonia es oxidasa positiva, si no aparece viraje azul se considera

oxidas negativa.


3.6 ESCHERICHIA COLI

Caldo preenriquecimiento: Bilis verde brillante 2%

Medio de cultivo: EMB levine

12

Instrucciones:

- Tomar alícuota 1 ml de cada dilución y añadirla en 10 ml caldo enriquecido con

campana Dirham


- Se contabiliza el numero de tubos por dilución que contenga gas tras el cultivo

El recuento se lleva a la tabla de número más probable, que nos dará un número

aproximado del número de colonias que tiene la muestra.

Confirmación: en medio EMB Levine. Se inocula 0.1 ml de los tubos positivos sobre agar

EMB Levine e incubar durante 24 horas a 44ºC. Si la colonia es sospechosa en E.Coli,

aparecerá rodeada de un color verde metálico fluorescente.

3.7 STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Medio de cultivo: Baird Parker Agar con emulsión de yema de huevo telurito

Instrucciones:

- Tomar una alícuota de 0.1 ml de cada dilución y sembrar en estría sobre agar

Baird Parker

- Incubar guante 24 horas a 37 ºC

Serán colonias sospechosas aquellas que presentan coloración negra con un halo

blanquecino.

Confirmación: se inocular con asa de siembra la colonias sospechosa e incubamos durante

24 horas a 37ºC en medio Danza agar. Sobre el crecimiento se vierte HCL 1N, pasados unos

minutos si se observa la aparición de una zona transparente alrededor de las colonias de

S.Aureus ha liberado desoxirribonucleasas y el crecimiento se considera positivo.

13

4- A�ÁLISIS FÍSICO- QUÍMICO DEL AGUA

4.1- COLOR:

Principio:

Comparación de la muestra de agua con una solución de cloruro de cobalto y cloroplatinato

de potasio, expresándose la intensidad de color en función de los mg de platino contenidos en

un litro.

Material y aparatos:

- Turbidímetro.

- Cubeta.

Reactivos:

- Ácido clorhídrico.

- Agua destilada.

- Cobalto (II) cloruro 6-hidrato.

- Potasio cloroplatinato.

Soluciones:

1. Solución concentrada de cobalto (II) cloruro 6-hidrato y potasio cloroplatinato:

Disolver 1.246 g de potasio cloroplatinato, equivalente a 500 mg de platino y 1.000 g de

cobalto (II) cloruro 6-hidrato en agua destilada con 100 ml de ácido clorhídrico al 37 % y diluir

con agua destilada a 1000 ml.

A esta solución se le asigna una intensidad de color de 500 mg de platino / litro. Esta

solución conservada en el frigorífico es estable seis meses.

2. Soluciones patrón de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60 y 70 mg de platino / litro,

preparadas recientemente.

Procedimiento:

1. Preparación de la muestra:

Si la muestra contiene partículas en suspensión, la intensidad de color se determinará

después de haberlas eliminado por centrifugación.

Se prepararán también las soluciones patrón de referencia con las que compararemos la

muestra.

Preparar la solución de cobalto (II) cloruro 6-hidrato y potasio cloroplatinato.

2. Determinación:

Llenar un tubo con el agua a examinar añadiendo la solución de cobalto (II) cloruro 6-

hidrato y potasio cloroplatinato y comparar la intensidad de color que tiene con los patrones de

referencia

14

La observación de esa intensidad se efectuará verticalmente a través de los tubos patrón

haciendo que la luz se refleje hacia arriba.

Expresión de resultados:

Los resultados de la determinación se expresarán en números enteros en un intervalo entre 0

que es el mínimo y 20 que es el máximo:

1-50 mg de platino / litro……………….1

51-100 mg de platino / litro……………5

101-250 mg de platino / litro…………..10

251-500 mg de platino / litro…………..20

4.2- OLOR:

El olor en el agua puede utilizarse de manera subjetiva para describir cualitativamente su

calidad, estado, procedencia o contenido. Aun cuando esta propiedad pueda tener un amplio

espectro de posibilidades para propósitos de calidad de agua existen ciertos aromas

característicos que tipifican algunas fuentes u orígenes como pueden ser: olor a pescado, olor a

vegetación, olor a metales, etc.

4.3- SABOR:

El sabor es un parámetro organoléptico que va íntimamente unido al color y al olor; si hay

presencia de color y olor en una muestra también habrá sabor.

4.4- PH:

Principio:

Medida del potencial eléctrico que se crea en la membrana de un electrodo de vidrio, que es

función de la actividad de los iones hidrógeno a ambos lados de la membrana.


- pH-metro.

- Material de vidrio.

Patrones de referencia:

- Solución patrón pH: 7.0.

- Solución patrón pH: 4.0.

15

Procedimiento:

1. Verificación del aparato:

- En vaso de precipitados, colocar un volumen adecuado de la solución patrón pH: 7.0.

- Introducir en ella los electrodos y agitar durante un minuto.

- Proceder a la lectura pasados otros dos minutos.

- El valor del ph obtenido es 7.0 entre 15 y 30º C; en caso de no corresponder con el teórico

lo corregiremos con las instrucciones del aparato usado.

- A continuación, y después de ser enjuagados convenientemente, sumergir los electrodos

en la solución patrón pH: 4.0.

- Si el valor del ph obtenido no corresponde al teórico de la solución habrá que corregirlo

como en el apartado anterior.

2. Medida del pH de las muestras de agua a una temperatura de 25º C.

3. Si en alguna muestra el pH alcanza un valor superior a 9.50 deberá repetirse la

determinación.

Expresión de resultados: En unidades de pH con precisión 0.1 a la temperatura en que se

efectuó la medida.

4.5-CO�DUCTIVIDAD ELÉCTRICA:

Principio:

Mediante un puente de Wheatstone y una célula de conductividad apropiada se determina la

conductividad eléctrica por comparación, a la misma temperatura de la muestra y de una

solución valorada de cloruro de potasio, refiriendo el resultado a 20º C.


-Conductímetro.

-Material de vidrio.

Reactivos:

- Agua destilada.

- Cloruro de potasio.

Soluciones:

- Patrón estándar de referencia de 84 µS.

- Patrón estándar de referencia de 1413 µS.

Procedimiento:

1. Verificación del aparato:

Verificar periódicamente la constante de la célula de medida utilizando agua y cloruro de

potasio como reactivos patrón.

16

2. Medir la conductividad de la muestra a 20º C ± 1º C.


La conductividad se expresa en µS / cm a 20º C.

4.6- DETERMI�ACIÓ� AMO�IO:

Método: La concentración de amonio se determina semicuantitativamente por comparación

visual del color de la solución de medición con las zonas de color de una tarjeta colorimétrica

Intervalo de medida: La escala colorimétrica tiene la siguiente graduación: 0.2, 0.4, 0.6, 1,

2, 3 y 5 mg / l de amonio.

Reactivos:

Para determinar amonio emplearemos:

- Reactivo NH4-1.

- Reactivo NH4-2.

- Reactivo NH4-3.

-1 jeringa de plástico graduada de 5 ml.

-2 tubos de ensayo con tapa roscada.

-1 comparador desplazable.

Técnica:

1. Enjuagar varias veces el tubo con el agua a ensayar.

2. Introducir 5 ml del agua en el tubo de ensayo con la jeringa.

3. Añadir 12 gotas del reactivo NH4-1 y mezclar.

4. Después de mezclar poner en el tubo una cucharilla rasa del reactivo NH4-2.

5. Cerrar el tubo agitando vigorosamente hasta que el reactivo se haya disuelto

completamente.

6. Esperar 5 minutos.

7. Transcurrido ese tiempo, añadir 4 gotas del reactivo NH4-3 y mezclar.

8. Esperar 7 minutos.

9. Colocar los tubos en el comparador desplazable poniéndolo sobre la tarjeta

colorimétrica y comprobar la cantidad de amonio, o no, que hay en la muestra de agua.

Conclusión:

El valor medido es el “amonio total”.

17

4.7- TURBIDEZ:

Método:

Este parámetro esta basado en el método de la formacina.

Principio: Cuando en una muestra de agua incide un rayo luminoso, las partículas en

suspensión difractan parte de la luz que penetra en la muestra.

Esta luz difractada, recogida sobre una célula fotoeléctrica, origina una corriente eléctrica,

en función de su intensidad y, por tanto, del grado de turbidez de la muestra.


-Material de uso corriente en el laboratorio.

-Turbidímetro.

Verificación del aparato:

La verificación del turbidímetro se realiza con dos tubos patrón de 0 y 10 UNF que se

usarán en caso de que alguna muestra dé una lectura de turbidez extraña.

Así se verificará que el aparato no está en mal estado.

Procedimiento:

1. Lavar el tubo portamuestras con el agua a analizar, al menos, dos veces.

2. Una vez lavado llenar el tubo con 10 ml de muestra, procurando que no contenga

burbujas de aire adheridas a las paredes del tubo.

3. Limpiar el exterior del tubo con su toallita específica e introducirlo en el turbidímetro.

4. Lectura del valor de turbidez; si esta lectura es anómala comprobar con agua

procediendo igual que si fuera la muestra.

5. Verificar el aparato con los tubos de referencia y leer igual que anteriormente.

6. Repetir esta operación por lo menos tres veces más, tomando como valor definitivo el

más bajo.

7. Limpiar el tubo portamuestras con agua destilada para eliminar los restos de muestra.


Los resultados se expresarán en Unidades Nefelométricas de Formacina (UNF).

18

4.8- OXIDABILIDAD

PRINCIPIO

Valorar las sustancias presentes en el agua de piscinas, oxidables por el permanganato

potásico.

MATERIAL Y APARATOS

Matraces preparados previamente: se añaden 100 ml de agua destilada y perlas de vidrio a

los matraces volumétricos necesarios para el ensayo y se procede exactamente como en el

ensayo. Terminado este se vierte el contenido y ya están preparados para la analítica problema.


- Ácido Oxálico 0.1N

- Ácido sulfúrico 96%

- Potasio permanganato 0.1 N

- Solución Ác. Sulfúrico al 25%

- Solución Ácido Oxálico 0.01 N

- Solución Ácido Sulfúrico al 50%

- Solución Permanganto potásico 0.01N

PROCEDIMINETO (en un matraz previamente tratado)

Comprobar si la muestra contiene nitritos, en caso positivo hervir la muestra durante 10

minutos antes de la adición del permanganto.

Colocar 100 ml de agua de la muestra problema en el matraz

Añadir:

- 10 ml Ác. Solución sulfúrico 25%

- perlas de vidrio

Calentar hasta ebullición (si la muestra tiene nitritos mantener en ebullición 15 minutos, el

agua evaporada se sustituye por agua destilada y se prosigue con el ensayo).

A la solución hirviente se le añaden 25 ml de solución permanganato 0.01 N

Mantener en ebullición suave durante 10 minutos

Pasados los 10 minutos en ebullición añadir 30 ml solución oxálico 0.01N

Mantener en ebullición suave durante 10 minutos

Pasados 10 minutos en ebullición añadir 30 ml solución oxálico 0.01 N

Continuar la ebullición hasta transparencia

Valorar con el permanganato titulado, hasta coloración rosada persiste

19

TITULACIÓN PERMANGANATO POTÁSICO

En un matraz se colocan 25 ml de Ác. Oxálico 0.01 N y se diluyen en 100 ml de agua

destilada

Se añaden 10 ml de solución de sulfúrico al 50%

Se calienta hasta ebullición

Se valora en caliente con permanganato 0.01 N hasta coloración rosa

Para calcular el factor se aplica la siguiente formula: (NVf)KMn04 = (NV) H2C2O4

RESULTADOS

Se expresan en mg de oxígeno consumido por litro de agua

meq O2/L =meq kmNO4 añadido – (meq H2C2O4añadido – meq H2C204gastado)

meq O2/L = N25f – (30N – Nvgastadof)

meq O2/L = (25f – 30+ Vgastadof)N

meq O2 = (25f – 30 + Vgastadof) N

meq O2 = meq O2 muestra - meq O2 blanco

mg O2/L = (meq O2/L) X 17

20

5- A�ÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS

5.1- CLOSTRIDIUM PERFRI�GE�S:

Objeto: Determinación de clostridium perfringens en una muestra de agua.

Método: Sistema de filtración por membrana de 0.45 µm de poro.


- Equipo de filtración con bomba de vacío.

- Material estéril.

- Membrana de 0.45µm de poro.

- Placa petri específica de aguas.

Medio de cultivo: TSC

Procedimiento:

1. Colocar el filtro en el sistema de filtración, con pinzas estériles y comprobando que la cara

filtrada de la membrana está boca arriba.

2. Montar el sistema de filtración y filtrar 100 ml de muestra.

3. Con pinzas estériles colocar la membrana, con la cara boca arriba, en contacto con el medio

dentro de la placa de cultivo.

4. Añadir otra placa de medio de cultivo para tener condiciones de anaerobiosis.

5. Incubar en anaerobiosis durante 21±3 horas a 36±2º C.

Interpretación:

Las colonias que crezcan con coloración negra, serán consideradas sospechosas.

El resultado se expresa en u.f.c. / 100 ml.

5.2- COLIFORMES:

Objeto: Determinación de coliformes en una muestra de agua.



- Equipo de filtración con membrana de vacío.


- Membrana de 0.45 µm de poro.

- Placa petri específica de aguas.

Medio de cultivo: Agar Chapman TTC.

21

Procedimiento:

1. Colocar el filtro en el sistema de filtración, con pinzas estériles y comprobar que la cara





4. Incubar en aerobiosis durante 21±3 horas a 36±2º C.

Interpretación: Las colonias que crezcan en color rojo serán sospechosas.

Confirmación: OXIDASA �EGATIVA.

Prueba de la oxidasa: reactivo: p-etilendiamina (10 mg / 1 ml).

1. Colocamos la colonia sospechosa en un soporte de vidrio o papel

secante y le añadimos unas gotas del reactivo.

2. Si se produce viraje a azul, la colonia es oxidasa positiva, si no aparece

viraje a azul se considera oxidasa negativa.

3. El resultado se expresa en u.f.c. / 100 ml

5.3- ESCHERICHIA COLI:

Objeto: Determinación de Escherichia Coli en una muestra de agua



- Equipo de filtración con bomba de vacío.


- Membrana de 0.45 µm de poro.

- Placa petri de específica de aguas.

Medio de cultivo: Agar Chapman TTC + 2, 2,5 Trifenil dihidrato terazolio cloruro.

22

Procedimiento:

1. Colocar el filtro en el sistema de filtración, con pinzas estériles y comprobar que la cara





4. Incubar en aerobiosis durante 21±3 horas a 36±2º C.

Interpretación: Las colonias que crezcan con coloración amarilla son sospechosas.

Confirmación: OXIDASA �EGATIVA E I�DOL POSITIVO.

Las colonias sospechosas serán confirmadas mediante dos pruebas:

• Prueba de la oxidasa: reactivo: p-etilendiamina (10 mg / 1 ml).

1. Colocamos la colonia sospechosa en un soporte de vidrio o papel

secante y le añadimos unas gotas del reactivo.

2. Si se produce viraje a azul, la colonia es oxidasa positiva, si no aparece

viraje a azul se considera oxidasa negativa

3. El resultado se expresa en u.f.c. / 100 ml

• Indol: reactivo de Kovacs.

1. Las colonias sospechosas se inoculan en agua de peptona e incubamos durante

24 h a 37º C.

2. Posteriormente añadimos al tubo unas gotas del reactivo de Kovacs.

3. Si aparece un anillo de color rojo / rosa se considera indol positivo, si el anillo

es de color amarillento indol negativo.

4. El resultado se expresa en u.f.c. / 100 ml.

5.4- RECUE�TO DE COLO�IAS A 22º C:

Objeto: Determinación de aerobios mesófilos y recuento de éstos a 22º C.

Método: Siembra en masa de aerobios mesófilos.


- Placa petri.


Medio de cultivo: TSA Agar.

23

Procedimiento:

1. Inocular 1 ml de agua de muestra en una placa petri y añadir unos 15 ml de

medio licuado.

2. Realizar giros concéntricos con la placa de derecha a izquierda, para conseguir

una distribución homogénea de la muestra con el medio.

3. Incubar en aerobiosis durante 44+4 h a 22±2ºC.

Interpretación: Se cuentan todas las colonias, expresando el resultado en número de

colonias por ml.

24

6- CO�CLUSIÓ� Y RESULTADO DE LAS PRÁCTICAS

En los dos meses de duración de las prácticas he trabajado en los dos laboratorios en los

que se divide la empresa; microbiológico y físico químico, pudiendo aumentar mis

conocimientos tanto teóricos como prácticos en ambos campos. Las prácticas me han parecido

una manera positiva, para empezar a desenvolverme en un laboratorio.

Los protocolos que he desarrollado en la memoria, son los que he realizado más

frecuentemente, pero todos los objetivos propuestos para estás prácticas los he podido hacer.

Estos son más frecuentes debido a la época en la que he realizado las prácticas, porque también

he realizado análisis de ácidos grasos en tocino, pero una manera menos habitual debido a que

no es temporada.

Estoy muy agradecida con la gente que he estado en el laboratorio, debido a que desde el

primer momento que llegue allí, me han hecho sentir como una persona más dentro de la

empresa. Y además una vez que me enseñaron a hacer el trabajo, me daban bastante libertad en

el laboratorio, pudiendo manejar la mayoría de aparatos (rotavapor, centrífuga,

espectrofotómetro…) sola.

诲诲㊥Ȫ ″ 瞛瞝瞝 - Facultad de Biología...

Documents

Transcript of 诲诲㊥Ȫ ″ 瞛瞝瞝 - Facultad de Biología...