Сборник материалов форума «Биомедицина...

Сборник материалов форума

«Биомедицина-2016»

2

Организаторы:

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-

исследовательский институт патологии кровообращения имени акад. Е.Н.

Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Национальное общество регенеративной медицины

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения

Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный

исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения

Российской академии наук»

Московский государственный университет, факультет фундаментальной

медицины

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии

развития им. Н.К. Кольцова РАН

Новосибирский государственный университет

Технопарк новосибирского Академгородка

Ведущие модераторы:

Ткачук В.А., акад. РАН, д.б.н., проф.

Караськов А.М., акад. РАН, д.м.н., проф.

Сухих Г.Т., акад. РАН, д.м.н., проф.

Васильев А.В., д.б.н., проф.

Власов В.В., акад. РАН, д.х.н., проф.

Колчанов Н.А., акад. РАН, д.б.н., проф.

Козлов В.А., акад. РАН, д.м.н.

Парфенова Е.В., д.м.н., проф.

Агладзе К.И., к.ф.-м.н., проф.

Иллариошкин С.Н., д.м.н., проф.

Томилин А.Н., чл. корр. РАН, д.б.н.

Закиян С.М., д.б.н., проф.

Покушалов Е.А., д.м.н., проф.

Леонов С.В., к.б.н.

Арутюнян Р.М., чл. корр. НАН Армении, д.б.н., проф.

Нетесов С.В., чл. корр. РАН, д.б.н., проф.

Гуляева Л.Ф., д.б.н., проф.

Шевела А.И., д.м.н., проф.

Рихтер В.А., к.б.н.

Рзаев Д.А., к.м.н.

Медведев С.П., к.б.н.

3

Секретариат форума:

Васькова Е.А.

Григорьева Е.В.

Дементьева Е.В.

Захарова И.С.

Малахова А.А.

Павлова С.В.

Шпак О.А.

Волонтеры:

Байзигитов Д.Р., Валетдинова К.Р., Вардапетян А., Елисафенко Е.А., Живень М.К.,

Мазурок Н.А., Маланханова Т.Б., Милевская Е.А., Немудрый А.А., Смирнова А.М.,

Сорокина А.Е., Стригина Е.В., Устьянцева Е.И., Шевченко А.И., Шерстюк В.В.

4

Содержание

Научная программа форума «Биомедицина-2016» 5

Тезисы пленарных докладов и сообщений на круглых столах 7

Тезисы постерных докладов 86

Авторский указатель 145

Рекламные страницы спонсоров 154

5

Научная программа форума «Биомедицина-2016»

Пленарные доклады

Агладзе К.И. «Зачем современной медицине тканевая инженерия»

Васильев А.В. «Достижение и перспективы клеточных технологий»

Власов В.В. «Клеточные технологии в медицине будущего»

Деев С.М. «Тераностика в современной биомедицине»

Жарков Д.О. «Редактирование эпигенома: можно ли и нужно ли»

Иллариошкин С.Н. «Новейшие молекулярные и клеточные технологии в изучении

нейродегенеративных заболеваний»

Колчанов Н.А.

Лаврик О.И. «Системы репарации ДНК как платформы создания лекарств и повышения

эффективности генной терапии»

Леонов С.В. «Возможно ли добиться нейрорегенерации при нейродегенеративных

заболеваниях»

Макаревич П.И. «Генная терапия в регенеративной медицине: результаты и

перспективы развития»

Медведев С.П. «CRISPR-революция в биологии и медицине»

Парфенова Е.В. «Перспективы регенерации миокарда»

Рубцов Н.Б. «Проблема генетического разнообразия и генетической нестабильности в

исследованиях с использованием стволовых клеток человека»

Таранин А.В. «Иммунотерапия: новые молекулярные и клеточные инструменты в

лечении рака»

Ткачук В.А. «Физиологические механизмы регуляции процессов обновления клеток и

регенерации тканей: роль мезенхимных стромальных клеток»

Томилин А.Н. «Последние достижения новых технологий на основе плюрипотентных

стволовых клеток»

Matsui H. «Drug discovery and research activities in Takeda»

Заседания круглых столов

«Биомедицина: взгляд клинициста»

«Возможности и перспективы применения новых технологий в клинической

неврологии»

«Иммунотерапия и молекулярная визуализация»

«Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека для регенеративной

медицины. 10 лет со дня открытия индуцированных плюрипотентных стволовых

клеток»

«Клеточные технологии в современной медицине: настоящее и будущее»

«Клеточные технологии и тканевая инженерия в медицине»

«На пороге новой биомедицины - перспективы принятия законопроекта «Об

обращении биомедицинских клеточных продуктов»

6

«Новые технологии в нейрохирургии»

«Норма и патология в современной цитогенетике»

«Персонифицированная неврология: современные возможности и перспективы»

«Перспективы и проблемы применения биоинформатики в Российских

биомедицинских лабораториях»

«Противовирусные вакцины и противораковые вирусы»

«Расстройства движений. Диагностика и лечение»

«Современные технологии редактирования геномов в биомедицинских исследованиях»

«Таргетная терапия в онкологии. Вчера, сегодня, завтра»

«Трансляционные биомедицинские исследования. Интеграция усилий научных

коллективов для решения медицинских задач»

Тезисы пленарных докладов и сообщений

на круглых столах

8

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ МОЗГОВЫХ КЛЕТОК ДО И ПОСЛЕ

ТЕРАПИИ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ К ФРАГМЕНТАМ БЕЛКА

RAGE НА ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

Аветисян А.В.1*

, Симонян Р.А.1, Самохин А.Н.

2, Бобкова Н.В.

2

1 НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская область, Россия

*e-mail: [email protected]

Болезнь Альцгеймера (БА) является неизлечимым нейродегенеративным заболеванием,

которым страдают миллионы пожилых людей во всем мире. Основная клиническая

форма болезни спорадическая, в качестве адекватной модели которой служат мыши с

ольфакторной бульбэктомией (ОБЭ). Двустороннее удаление обонятельных луковиц у

половозрелых мышей линии NMRI вызывает в отдаленные сроки (4-5 недель)

нейродегенерацию альцгеймеровского типа, характерные БА основные поведенческие

и биохимические признаки, в том числе, потеря пространственной памяти, выраженный

апоптоз нейронов, нарушение энергетического обмена, а также повышенный уровень

мозгового амилоида-β и фосфо-Tau. На ранних стадиях развития болезни у ОБЭ мышей

регистрируется выраженная дисфункция мозговых митохондрий, коррелирующий с

высоким содержанием в них растворимого белка Aβ1-40, и Aβ-индуцированный

окислительный стресс. Изолированные из неокортекса и гиппокампа митохондрии

демонстрируют такие функциональные нарушения, как, низкая скорость дыхания в

состоянии 3 и 4, сниженный мембранный потенциал и дыхательный контроль,

значительное падение активности комплексов I и IV электрон-транспортной цепи.

Нарушение энергетического метаболизма сопровождается накоплением продуктов

перекисного окисления липидов в митохондриях, что свидетельствует о развитии

окислительного стресса в неокортексе и гиппокампе ОБЭ мышей.

Известно, что в процессе накопления нейротоксического Aβ в мозговых клетках

активно участвуют рецепторы конечных продуктов неферментативного гликирования

RAGE, осуществляющие проникновение Aβ через гематоэнцефалический барьер в

мозг. Одновременно различными клетками, в том числе нейронами, синтезируется и

затем секретируется во внеклеточное пространство растворимая форма рецептора

sRAGE, у которого отсутствует трансмембранный домен. sRAGE связываясь с Aβ,

способствует их выносу в кровяное русло, тем самым очищая мозг от патогенных

лигандов, что необходимо для терапии БА. Показано, что аналогичным действием

обладают и короткие синтетические фрагменты sRAGE [Вольпина и др., 2015]. В

качестве терапевтического средства для восстановления/улучшения оперативной

памяти мышей, а заодно и митохондриальных функций, были тестированы 4

синтетические пептиды неструктурированных фрагментов рецептора RAGE. Для

прямого действия пептидов применили интраназальное введение ОБЭ мышам в

течение 19 дней с последующим изучением поведения, энергетического метаболизма.

Все синтетические пептиды восстанавливали биоэнергетические характеристики

митохондрий неокортекса и гиппокампа, участков мозга, отвечающих за оперативную

память и обучение, почти до контрольного уровня. В то же время тестирование в

водном лабиринте Морриса не выявило улучшения пространственной памяти и

обучения ОБЭ мышей. Таким образом, восстановление энергетического метаболизма

является необходимым, но недостаточным условием для предотвращения/лечения

нейродегенерации в данной модели БА.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-04-00944.

9

НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ПРОТИВ КОТОРЫХ

ЦЕЛЕСООБРАЗНО РАЗРАБАТЫВАТЬ ВАКЦИНЫ

Агафонов А.П.

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская область, Россия

e-mail: [email protected]

Борьба с инфекционными заболеваниями — одна из наиболее значимых, актуальных и

приоритетных задач современного здравоохранения. Болезни, вызываемые

инфекционными агентами, во многих странах являются главной причиной

преждевременной смерти. В мире, в целом, на инфекционные заболевания приходится

более 50% потерянных лет жизни. Даже в странах с высоким уровнем здравоохранения

мероприятия по снижению бремени инфекционных заболеваний входят во все

национальные программы социальной и медицинской направленности.

На сегодняшний день ВИЧ/СПИД, малярия, туберкулез и другие основные

инфекционные болезни остаются наиболее распространенными заболеваниями в мире.

В странах с высоким уровнем доходов ведущей инфекционной причиной смерти

являются инфекции нижних дыхательных путей. В странах с низким уровнем доходов

люди умирают, главным образом, от инфекционных болезней: инфекции нижних

дыхательных путей, ВИЧ/СПИД, диарейные заболевания, малярия и туберкулез

являются причиной почти трети всех случаев смерти в этих странах.

Наиболее опасными вирусами являются ВИЧ (3,1 миллиона смертей в год), ротавирус,

вирусы гепатита В, гепатита С, гриппа (около 0,5 млн. смертей в год каждый), корь

(около 0,2 млн.), хантавирусы, вирусы бешенства, желтой лихорадки, денге (от 20 тыс.

до 70 тыс. смертей ежегодно).

Реализация программы элиминации натуральной оспы, успехи в борьбе с

полиомиелитом и корью доказывают возможность эффективной борьбы и даже полной

эрадикации инфекционного заболевания. Важной проблемой является создание

безопасных и эффективных вакцин против вновь возникающих инфекций.

10

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК И ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЦИТОГЕНЕТИКИ

Арутюнян Р.М.1*

, Арутюнян Т.А.1, Лир Т.

2, Оганесян Г.Г.

1

1 Ереванский государственный университет, Ереван, Армения

2 Институт генетики человека, Йена, Германия


Повреждения хромосомной ДНК, индуцированные мутагенами, как правило,

распределяются неравномерно по всему геному. Неслучайное распределение

первичных поражений определяется структурой и локализацией хромосом в

интерфазных ядрах в момент воздействия мутагена, а также активностью систем

репарации в различных локусах генома. Прогресс в изучении локализации

повреждений в геноме зависит от разработки новых подходов к их идентификации.

Будут представлены результаты применения гибридных методов молекулярной

цитогенетики, основанных на сочетании флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с

методом ДНК-комет и микроядерным тестом. Эти методы позволяют одновременно

выявлять и локализовать повреждения ДНК и хромосом на одних и тех же препаратах.

Поэтапная гибридизация микроядер с центромерными и цельнохромосомными ДНК-

пробами позволила впервые идентифицировать мишени действия цитостатиков:

митомицина С и блеомицина на хромосомах, а также различить кластогенные и

анеугенные эффекты. Выявлены различия состава микроядер в зависимости от

специфики их индукции мутагенами. Показана эффективность комплексного

применения центромерных и цельнохромосомных проб для оценки хромосомного

состава микроядер. Метод ДНК-комет с использованием теломерных PNA проб

позволил оценить уровень повреждений всей ДНК и теломерных участков хромосом в

нормальных и трансформированных клетках. Этот подход рекомендуется для оценки

специфики действия цитостатиков. Эпигенетическая активность афлатоксина B1

(АФВ1) была изучена методом ДНК-комет с использованием изошизомерных

ферментов (HpaII/MspI), один из которых распознает метилированные участки.

Впервые обнаружена способность АФВ1 модифицировать профиль глобального

метилирования ДНК в клетках человека. Молекулярно-цитогенетические исследования

с применением FISH показали способность АФВ1 индуцировать локус-специфические

вариации числа копий участков ДНК (copy number variation). Полученные данные

подтверждают эффект действия АФВ1 на хромосомные локусы за счет ингибирования

процессов репликации. Представленные комплексные подходы существенно повышают

чувствительность стандартных методов оценки действия мутагенов и являются

перспективными для локализации повреждений ДНК и хромосом в геноме человека.

11

СВЯЗЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ, ВЫЗВАННЫХ КЛОФИБРАТОМ И

АВАНДИЕЙ, С УРОВНЕМ ИНДУЦИРОВАННОГО ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗА

У РАЗНЫХ ЛИНИЙ МЫШЕЙ

Багинская Н.В.*, Ильницкая С.И., Каледин В.И.

Федеральный исследовательский центр «Институт цитологии и генетики Сибирского

отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия


Препараты клофибрат и росиглитазон (авандия) — лиганды ядерных рецепторов

активаторов пролиферации пероксисом, PPARα и PPARγ, — применяются для

нормализации углеводно-жирового обмена при нарушениях, вызванных развитием

метаболического синдрома. Есть основания считать, что, снижая выраженность

признаков метаболического синдрома, эти препараты могут также влиять и на развитие

опухолей у животных и человека (1).

В данном исследовании мы предприняли попытку проверить это предположение,

изучая влияние хронического применения клофибрата и авандии на показатели обмена

веществ и развитие опухолей печени, инициированных введением диэтилнитрозамина

(ДЭНА) в раннем онтогенезе. В экспериментах были использованы 3 линии мышей:

C3H/Не и СBA – чувствительные и С57BL/6J – относительно резистентные к индукции

опухолей печени. В возрасте 12-14 дней мышатам-самцам вводили ДЭНА в дозе

50 мг/кг веса тела. Начиная с 2-месячного возраста и до конца эксперимента, часть

животных каждой линии получала с кормом препараты клофибрат (1 г/кг) или авандия

(50 мг/кг). Контролем служили мыши, получившие только инъекцию ДЭНА, и

интактные животные. Показатели обмена веществ оценивали в возрасте 3-4 месяцев,

количество опухолей — в возрасте 8-10 месяцев. У мышей линии С57BL/6J при

введении обоих препаратов были выявлены сходные признаки повышения

чувствительности к инсулину в виде снижения уровней триглицеридов и инсулина в

крови. У мышей линий C3H/Не и СBA только авандия снижала уровень триглицеридов,

тогда как клофибрат повышал содержание глюкозы и холестерина в крови, что может

быть признаком снижения чувствительности к инсулину у этих животных. К 8-10-

месячному возрасту клофибрат существенно повышал количество и размеры опухолей

у мышей линий С3Н/Не и СВА, чувствительных к развитию опухолей печени, и не

влиял на эти показатели у резистентной линии С57BL/6J. В то же время авандия

уменьшала количество опухолей у всех 3 линий мышей, независимо от генотипа.

Таким образом, метаболические нарушения, вызванные клофибратом, на ранних

стадиях канцерогенеза коррелируют с увеличением количества и размеров опухолей на

поздних стадиях. Повышение чувствительности к инсулину при введении авандии

ассоциировано с уменьшением количества опухолей как у резистентных, так и у

чувствительных к гепатоканцерогенезу линий мышей. Из этого следует, что повышение

чувствительности к инсулину при использовании авандии может быть одним из

факторов устойчивости к индуцированному гепатоканцерогенезу.

1. Braun S., Bitton-Worms K., LeRoith Dk. The link between the metabolic syndrome and

cancer. Int. J. Biol. Sci. 2011; 7(7): 1003-1015.

12

ДИЗАЙН ПОЛИЭПИТОПНЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ ИММУНОГЕНОВ –

КАНДИДАТОВ ДНК-ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ И

ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Бажан С.И.*, Антонец Д.В., Карпенко Л.И., Ильичев А.А.

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская область, Россия


Учитывая существующие в настоящее время проблемы в создании вакцин против

онкологических и ряда инфекционных заболеваний, существует острая потребность в

подходах, нацеленных на создание нового поколения эффективных и безопасных

вакцин. В области создания Т-клеточных вакцин одним из новых и перспективных

подходов является конструирование искусственных полиэпитопных иммуногенов,

включающих широкий спектр проективных Т-клеточных эпитопов из вирусных или

раковых антигенов.

Цель наших исследований состояла в поиске рациональных подходов к созданию

полиэпитопных вакцин, индуцирующих ответы Т-лимфоцитов на все эпитопы,

включенные в состав конструкций. Для достижения этой цели в данной работе

проведено конструирование и сравнительное исследование иммуногенности набора

полиэпитопных конструкций, спроектированных так, чтобы обеспечить различные

стратегии процессинга полиэпитопных конструкций и презентацию освободившихся

эпитопов CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитам с использованием современных знаний о

механизмах презентации Т-клеточных антигенов по пути MHC I и II классов.

Полученные результаты показали, что существует вполне закономерная взаимосвязь

между структурой полиэпитопной конструкции и ее антигенными и иммуногенными

характеристиками. В частности, мы показали, что:

1) путем оптимизации структуры иммуногена с помощью спейсерных

последовательностей, содержащих мотивы для связывания с TAP и сайты

протеасомного и лизосомного расщепления, фланкирующие ЦТЛ и Т-хелперные

эпитопы в составе полиэпитопной конструкции, можно значительно повысить

иммуногенный потенциал целевой полиэпитопной вакцины;

2) убиквитин-зависимое нацеливание полиэпитопа на протеасому является более

эффективной стратегией для стимуляции специфического Т-клеточного иммунного

ответа, по сравнению с LAMP-зависимым нацеливанием на лизосому.

Полученные результаты поддерживают концепцию рационального дизайна вакцин,

основанную на имеющихся знаниях о механизмах презентации Т-клеточных антигенов

по пути MHC I и II класса.

Для конструирования полиэпитопных Т-клеточных иммуногенов мы разработали

оригинальное программное обеспечение TEpredict и PolyCTLDesigner, которое мы

позиционируем как универсальную платформу для рационального проектирования

полиэпитопных иммуногенов – кандидатов ДНК-вакцин для индукции Т-клеточного

иммунитета против инфекционных и онкологических заболеваний. С использованием

этого программного обеспечения проведено проектирование ряда полиэпитопных

иммуногенов — кандидатных ДНК-вакцин против инфекционных и онкологических

заболеваний, в том числе против ВИЧ-1, гриппа, меланомы и рака молочной железы.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-

15-00047.

13

ПИЛОТНОЕ КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ И

ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АУТОЛОГИЧНЫХ НЕЙРАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У ПАЦИЕНТОВ СО СПИНАЛЬНОЙ ТРАВМОЙ:

РЕЗУЛЬТАТЫ НАБЛЮДЕНИЯ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА

Дуров О.В.1, Аверьянов А.В.

1, Баклаушев В.П.

1*, Тихоновский М.А.

1, Коноплянников

М.А.1, Кальсин В.А.

1, Ahlfors J.E.

2

1 ФГБУ Федеральный научно-клинический центр специализированных видов

медицинской помощи ФМБА России, Москва, Россия

2 New World Laboratories Inc., Montreal, Canada


Актуальность. Позвоночно-спинномозговая травма (ПСМТ) является вторым после

инсульта заболеванием как по частоте (0,6-1,0 на 10 000 населения), так и по тяжести

инвалидизации и отсутствию эффективных методов терапии неврологических

осложнений. Лишь около 20% пациентов после ПСМТ способны хотя бы частично

восстановить неврологический дефицит с помощью нейрореабилитации. Для

остальных единственной надеждой на восстановление утраченных функций является

регенеративная медицина. Доклинические исследования показали, что нейральные

стволовые клетки (НСК) способствуют регенерации поврежденного спинного мозга у

животных. Описаны отдельные случаи успешного применения НСК, в частности из

обонятельной луковицы, для лечения неврологических осложнений ПСМТ у человека,

однако системные исследования по разработке регенеративной технологии для лечения

ПСМТ пока отсутствуют. Целью нашей работы было оценить безопасность и

эффективность трансплантации первично репрограммированных аутологичных НСК у

пациентов с хронической ПСМТ на уровне грудного отдела позвоночника.

Материалы и методы исследования. Первично репрограммированные НСК из

костного мозга пациентов были получены по технологии J.E. Ahlfors (Canada) с

помощью запатентованного коктейля репрограммирования. В исследовании приняли

участие 4 пациента с ПСМТ на грудном уровне в среднем спустя год после травмы со

сформированным неврологическим дефицитом и исчерпанными возможностями

нейрореабилитации (140-210 баллов по шкале ISNCSCI, ASIA). Трем пациентам перед

операцией было присвоено значение ASIA A (полный перерыв спинного мозга),

одному — ASIA B (неполный перерыв спинного мозга). Пациентам выполняли

открытую операцию, частичное иссечение рубцовой ткани и имплантацию в спинной

мозг аутологичных НСК вместе с регенеративным матриксом (NWL, Canada). В

течение 6 месяцев проводили клиническое наблюдение с оценкой по шкале ASIA, а

также анализом данных МРТ, ЭМГ и биомеханики движений в динамике.

Результаты. Показана безопасность имплантации первично репрограммированных

НСК в течение года после операции. У всех 4 пациентов наблюдалось повышение

показателей шкалы ASIA в среднем на 20 баллов. Уровень анестезии в течение периода

наблюдения уменьшился на 1-3 сегмента как для поверхностной, так и для глубокой

чувствительности. Для двигательной активности нижних конечностей был показан

прогресс по шкале ASIA с 0 баллов до операции до 6-14 баллов через 6 месяцев.

Поверхностная ЭМГ и анализ биомеханики движений показали угасание спонтанной

клонусовидной биоэлектрической активности и появление произвольной активности в

прямых и приводящих мышцах бедра. Контроль за функциями тазовых органов в

течение 6 месяцев после операции, в целом, не изменялся, хотя у части пациентов

наблюдалась нормализация тонуса наружного сфинктера прямой кишки и появление

анального рефлекса.

14

Выводы. Показана безопасность трансплантации первично репрограммированных

НСК в течение года после операции. В существующем виде данная технология

приводит к частичному регрессу неврологического дефицита у пациентов с

хронической ПСМТ. Технология регенеративной терапии ПСМТ требует дальнейшей

оптимизации как с точки зрения нейрохирургической техники, так и выбора

оптимального срока травмы для трансплантации НСК.

15

ПОЛУЧЕНИЕ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ

АТРОФИИ НА ОСНОВЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Валетдинова К.Р.1,2,3,4*

, Григорьева Е.В.1,2,3

, Закиян С.М.1,2,3,4

1 Институт цитологии и генетики, Новосибирск, Россия

2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины, Новосибирск, Россия

3 Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения

имени академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия

4 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия


Спинальная мышечная атрофия (СМА) — наследственное нейродегенеративное

заболевание, вызванное гибелью периферических моторных нейронов. В зависимости

от тяжести и времени начала проявления симптомов различают четыре типа СМА, при

этом наиболее тяжелыми формами являются I и II тип, развивающиеся в раннем

детском возрасте. В среднем один из 6000-10000 детей рождается со СМА, при этом

около 50% больных детей не доживают до двух лет. Генетической причиной этого

заболевания являются мутации в гене SMN1, эффекты которых до конца не известны,

что затрудняет поиск оптимального метода лечения. Поэтому актуальной задачей

является получение адекватной модельной системы СМА. В данной работе

предлагается получение клеточной модели СМА на основе пациент-специфичных

индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека.

Дифференцированные производные ИПСК — моторные нейроны, воспроизводящие

фенотип данного заболевания, могут быть использованы в исследованиях

патогенетических механизмов, приводящих к избирательной гибели данного типа

нервных клеток, и поиске эффективных средств терапии СМА.

В результате репрограммирования фибробластов линии f1SMA от пациента со СМА I

типа, m3SMA от пациента со СМА II типа и m34Sk от здорового человека получено

порядка тридцати стабильных линий ИПСК. Клетки схожи по морфологии с

плюрипотентными стволовыми клетками человека и экспрессируют эндогенную

щелочную фосфатазу. С помощью ПЦР-ПДРФ анализа показано, что во всех линиях

ИПСК, полученных от пациентов со СМА I и II типов, имеется гомозиготная делеция в

7 экзоне гена SMN1, при этом линии ИПСК, полученные от здорового человека имеют

нормальный генотип. С помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени показано,

что в линиях ИПСК, полученных от пациента со СМА I типа содержится две копии

гена SMN2 — основного гена-модификатора при СМА. Для доказательства

плюрипотентного статуса полученных ИПСК выбрано по три линии от каждого

пациента. Линии ИПСК, взятые в анализ, демонстрируют экспрессию основных

маркеров плюрипотентных клеток, таких как поверхностные антигены SSEA4, TRA1-

60, транскрипционные факторы NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, MYC, FGF4, NODAL и ряд

других генов. С помощью иммуноцитохимического анализа и ОТ-ПЦР показана

экспрессия маркеров производных трех зародышевых листков: эктодермы (NF200,

TuJ1, PAX6, MAP2, GFAP), мезодермы (αSMA, CD31, BRACHYURY) и энтодермы

(CollagenI, Fibronectin, KRT18, SOX17, FOXA2, AFP) при спонтанной

дифференцировке in vitro в эмбриоидных тельцах. Гистологический анализ срезов

тератом, полученных при спонтанной дифференцировке in vivo, выявил присутствие

производных экто-, энто- и мезодермы, а также экстраэмбриональных тканей.

Полученные линии ИПСК дифференцированы в моторные нейроны, демонстрирующие

экспрессию основных маркеров данного типа клеток.

16

ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

МОДЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ КАК ОБЪЕКТЫ БИОМЕДИЦИНСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

Васькова Е.А.

ФГБНУ “ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН”, Новосибирск, Россия

Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им.

акад. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия

ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

Новосибирск, Россия


Появление технологии получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

открыло большие возможности для их использования в различных областях, таких как

создание модельных систем для изучения молекулярных основ развития заболеваний,

возможностей их терапии, скрининга библиотек лекарственных заболеваний и ряда

других. Однако, несмотря на огромные преимущества данных моделей, существуют и

ограничения. Так, условия in vitro неспособны отразить в полной мере все

взаимодействия различных типов клеток и тканей живого организма. Совместить

биомедицинские исследования, проводимые in vitro и in vivo, возможно при

использовании животных для моделирования заболеваний. В настоящее время уже

получен огромный массив линий животных, на которых моделируются приобретенные

и наследственные заболевания человека.

В данной работе будет представлен обзор последних достижений в области получения

индуцированных плюрипотентных стволовых клеток различных видов животных и их

использования для решения ряда биомедицинских задач.

17

ЦИФРОВАЯ КАПЕЛЬНАЯ ПЦР И РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА

Вернер А.Э.

ООО «Био-Рад Лаборатории», Москва, Россия


Методы геномного редактирования переживают период необычайного прогресса, а

области их применения постоянно расширяются. Тем примечательнее, что новый метод

в молекулярной биологии — цифровая капельная ПЦР (ddPCR) — оказался идеальной

сопутствующей технологией для оптимизации условий проведения геномного

редактирования и для отбора трансформированных клеток, содержащих целевую

последовательность ДНК. Стратегии использования ddPCR варьируют в зависимости

от того, какой подход, NHEJ или HDR, используется в редактировании генома.

Являясь методом прямого количественного определения ДНК (без использования

калибровочной кривой), ddPCR обеспечивает высокую чувствительность (<0.2%

минорного генома) и высочайшую точность и воспроизводимость результатов. В

сочетании с быстротой получения результата (в течение одного дня) и относительной

дешевизной метод является прекрасной альтернативой другим, более традиционным,

методам тестирования результатов геномного редактирования: секвенированию по

Сэнгеру, NGS и эдонуклеаза T7/Surveyor детекции.

Эффективность использования CRISPR/Cas9 в сочетании с ddPCR была

продемонстрирована в серии интересных публикаций и становится общепринятым

подходом при решении задач геномного редактирования.

18

NGS-ТЕХНОЛОГИИ И ПЕРСОНИФИЦИРОВАННАЯ НЕВРОЛОГИЯ:

НОВЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОЙ

ПАТОЛОГИИ

Ветчинова А.С.*, Абрамычева Н.Ю., Федотова Е.Ю., Клюшников С.А.,

Кунецкий В.Е., Иллариошкин С.Н.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия


Диагностика и профилактика дегенеративных заболеваний мозга представляют собой

чрезвычайно актуальную проблему современной неврологии в связи с их неоспоримой

социальной значимостью, высоким удельным весом в общей структуре

неврологической патологии, неуклонно прогрессирующим течением, тяжестью

клинических проявлений, выраженной физической, психической и социальной

дезадаптацией пациентов. При этом развитие наследственных нейродегенеративных

заболеваний связано с большим количеством самых разнообразных генетических

нарушений: от точковых мутаций до макроделеций и динамических мутаций. Развитие

технологий молекулярно-генетического анализа привело к созданию перспективного

метода секвенирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS),

позволяющего анализировать несколько генов быстро, одновременно и с надежными

результатами. Разработанная нами генетическая панель (300 генов) предназначена для

диагностики социально значимых нейродегенеративных синдромов: паркинсонизма,

тремора, дистонии, параплегии, хореи, лейкоэнцефалопатии, дегенеративной деменции

и болезни мотонейрона. Благодаря разработанному нами подходу в семье, страдающей

наследственной аутосомно-доминантной формой спастической параплегии, у двух

двоюродных братьев была выявлена миссенс-мутация Thr541Asn в гене SPAST,

соответствующая наследственной спастической параплегии типа 4 (SPG4). В случае

спорадического заболевания у 4-летнего ребенка, характеризующегося задержкой

умственного развития, выявлена вставка Gly112_Ser113insGlyGly в гене DDHD1,

связанная с редкой формой параплегии типа 28 (SPG28). Нами также были найдены

положительные находки в генах NPC1 (Болезнь Ниманна-Пика типа С), Notch3

(лейкоэнцефалопатя), GCH1 (дистония) и др.

В клинической практике применение панельного скрининга может быть полезным

инструментом для установления молекулярной диагностики генетически гетерогенных

и редких нейродегенеративных синдромов.

Работа проведена при поддержке Министерства образования и науки Российской

Федерации (уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60714X0094).

19

РЕДКИЙ СЕМЕЙНЫЙ СЛУЧАЙ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА

ХРОМОСОМЫ 21

Гайнер Т.А.1,2*

, Каримова О.Г.1,2

, Слепухина А.А.1

1 ИХБФМ СО РАН, Новосибирск, Россия

2 ООО «Центр персонализированной медицины», Новосибирск, Россия


При исследовании кариотипа с помощью классических цитогенетических методов

перед врачом-цитогенетиком нередко встает вопрос: является ли обнаруженный у

пациента морфологический хромосомный вариант нормой или патологией. Отклонение

в структуре или количестве хромосом, как правило, свидетельствует о наличии

патологии. Исключением являются вариабельные районы в хромосомах человека,

размер которых и морфология могут отличаться у разных индивидов. Это так

называемый нормальный полиморфизм хромосом, который имеет разные степени

выраженности: от малой до экстремальной. Присутствие полиморфизма, особенно в

экстремальном варианте, следует подтверждать с помощью дополнительных методов

окрашивания хромосом: CBG-окрашивания (С-окрашивания), Ag-NOR-окрашивания

(серебрения).

Ниже представлен клинический случай выявления экстремального полиморфизма у

пациента с нарушением фертильности и у его матери.

Мужчина 28 лет обратился к врачу-генетику с жалобой на отсутствие детей в браке в

течение 10 месяцев. Из особенностей фенотипа у него присутствовали: дефект мочки

уха слева, две макушки. При обследовании у пациента выявлены гипогонадотропный

гипогонадизм, на УЗИ органов мошонки — киста придатка правого яичка, при

пятикратном обследовании в течение 10 месяцев — выраженная

олигоастенотератозооспермия (концентрация сперматозоидов в эякуляте менее 2

млн./мл, менее 1 млн. активноподвижных сперматозоидов в 1мл, менее 5% нормальных

форм по данным морфологического анализа по Крюгеру). У пациента не обнаружено

носительства наиболее частых мутаций в гене CFTR; не обнаружено наиболее частых

делеций локуса AZF. На фоне медикаментозного лечения после окончания

стимулирующей терапии наблюдалось улучшение показателей спермограммы –

улучшение до нормы концентрации сперматозоидов и количества активноподвижных

форм; без изменения: индекс Крюгера = 2% — тератозооспермия.

При цитогенетическом исследовании с использованием GTG-окрашивания у пациента

выявлена хромосома 21 нетипичной морфологии, имеющая p-плечо, превышающее по

размеру q-плечо. Для уточнения диагноза было использовано дополнительное

окрашивание (серебрение), выявившее четырехкратное повторение спутничных нитей

и спутников на коротком плече хромосомы 21. Кариотип пациента:

46,XY,21pstkstkstkstkpssss. В литературе нам не удалось найти описаний подобных

случаев. Таким образом, пациент является носителем редчайшего экстремального

варианта нормального полиморфизма хромосом.

В связи с тем, что вариант носит экстремальный характер, была дана рекомендация для

исключения его влияния на фертильность проанализировать наследование хромосомы

21 (исследовать кариотипы родителей или сибсов). Кариотип отца пациента без

особенностей: 46,XY. Кариотип матери: 46,ХХ,21pstkstkstkstkpssss. Данные о фенотипе

матери отсутствуют. Таким образом, сын является носителем материнского варианта

хромосомного полиморфизма. Вероятно, снижение фертильности у пациента не

связано с носительством данного хромосомного варианта.

20

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-МЕХАНИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ СОСУДИСТЫХ ГРАФТОВ ДО И ПОСЛЕ

РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ IN SITU

Глушкова Т.В.1*

, Севостьянова В.В.1, Антонова Л.В.

1, Сергеева Е.А.

1, Миронов А.В.

1,

Васюков Г.Ю.1, Сейфалиан А.М.

2, Кудрявцева Ю.А.

1, Барбараш О.Л.

1, Барбараш Л.С.

1

1 Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых

заболеваний, Кемерово, Россия

2 University College London, London, England


Использование графтов из биодеградируемых материалов является перспективным

подходом тканевой инженерии для выращивания сосуда малого диаметра

непосредственно в организме пациента. Однако деградация полимера после его

имплантации в кровеносное русло при не полностью сформировавшихся тканях сосуда

может привести к потере прочности с последующим образованием аневризм и

разрывов стенки графта. Цель исследования: изучение процесса биомеханического

ремоделирования полимерных графтов, модифицированных сосудистым

эндотелиальным фактором роста (VEGF), после имплантации в брюшную аорту крыс.

Материалы и методы. Сосудистые графты (ø 2 мм) изготавливали из

поликапролактона (PCL) и смеси полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и

поликапролактона методом электроспиннинга. Модификацию графтов молекулами

VEGF осуществляли двухфазным электроспиннингом. Морфологию графтов,

оценивали методом сканирующей электронной микроскопии. PCL/VEGF и

PHBV/PCL/VEGF графты имплантировали в брюшную аорту крыс популяции Wistar.

Изменение морфологии графтов через 6 месяцев после имплантации изучали

гистологическим методом. Физико-механические свойства графтов оценивали по

результатам одноосного растяжения и исследования комплаентности. В качестве

контроля использовали нативные сосуды человека, применяемые при операциях аорто-

коронарного шунтирования. Результаты. PCL и PHBV/PCL графты по прочности не

уступали внутренней грудной артерии человека, но обладали большей жесткостью и

способностью к растяжению. По вязкоэластическим свойствам данные графты

приближены к нативным сосудам. Модификация графтов VEGF способствовала

снижению жесткости материалов. Через 6 месяцев после имплантации повреждений и

аневризм стенки графтов не было выявлено. На внутренней поверхности графтов

наблюдали эндотелиальные клетки, в толще стенки — волокна соединительной ткани и

клеточные элементы: фибробласты, макрофаги, а также клетки инородных тел.

Интеграция графтов с окружающими тканями способствовала изменению их физико-

механических свойств относительно неимплантированного материала. Для PCL/VEGF

и PHBV/PCL/VEGF графтов отмечено снижение предельного напряжения в 3 и 1,8 раз,

относительного удлинения в 5,8 и 1,7 раз и модуля Юнга в 6 и 10 раз, соответственно.

Стоит отметить, что по силе, приложенной к образцу до начала разрушения, графты

после имплантации не имели достоверных отличий от a.mammaria, а по упруго-

деформативным свойствам стали более приближены к нативным сосудам.

Заключение. PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF графты при функционировании в

кровеносном русле в течение 6 месяцев не достигают критического предела снижения

прочности, а их упруго-деформативные свойства приближаются к свойствам нативных

сосудов. Данные графты обладают удовлетворительными физико-механическими

свойствами и потенциально могут быть пригодны для реконструкции кровеносных

сосудов in situ.

21

CAR-ПЛАТФОРМА: ОСОБЕННОСТИ ДИЗАЙНА, ПРОБЛЕМЫ И

ПЕРСПЕКТИВЫ

Горчаков А.А.1,2*

, Кулемзин С.В.1, Кузнецова В.В.

1, Сизенцова Я.Г.

1,2, Чикаев Н.А.

1,

Баранов К.О.1, Гусельников С.В.

1,2, Беловежец Т.Н.

2, Сократян А.М.

1, Волкова О.Ю.

1,

Мечетина Л.В.1,2

, Наякшин А.М.1, Таранин А.В.

1,2

1 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия



Химерные антигенные рецепторы (CAR) позволяют перенаправлять активность Т-

клеток против раковых клеток. Крайне успешные клинические испытания CAR T-

клеток в терапии ряда онкогематологических заболеваний стимулируют активное

развитие этой платформы в различных направлениях, таких как создание CAR-

продуктов для терапии солидных видов рака, переход от аутологичных к

универсальным/аллогенным CAR-форматам, обеспечение возможности генетического

или фармакологического контроля степени активации CAR Т-клеток, повышение

избирательности и т.д.

Ключевыми в структуре CAR являются два домена: антигенраспознающий и

сигнальный. Чаще всего в роли антигенраспознающего модуля CAR используются

scFv-фрагменты антител. Кроме того, в последнее время появились CAR c

альтернативными доменами на основе пептидов, нативных лиганд-рецепторных пар,

VLR, VHH, аднектинов и т.д., которые способны эффективно выполнять ту же

функцию распознавания антигена. Такие форматы позволят значительно расширить

список узнаваемых CAR антигенов и их комбинаций, что должно обеспечить большую

избирательность и эффективность CAR Т-клеток.

Сигнальные последовательности в составе CAR определяют не только силу

активационного сигнала, но и его качество, что приводит к различной способности

CAR Т-клеточных продуктов активироваться при встрече с клетками-мишенями и

долговременно персистировать в организме пациентов. Таким образом, исследование

взаимосвязи структурных элементов CAR и терапевтического эффекта является

приоритетным направлением противораковой клеточной иммунотерапии.

Нами создана большая коллекция ленти- и ретровирусных конструкций, кодирующих

варианты CAR с различной модульной структурой против таких мишеней. как PSCA,

PSMA, CD20, VEGFR2, IGF-1R, CEA и т.д. Полученные CAR используют как

традиционные scFv, так и домены на основе Fn3-модулей в качестве

антигенраспознающих доменов. Вклад этих и других структурных отличий в

функциональность CAR был успешно протестирован in vitro на Т-клеточной линии

Jurkat (активационный тест) и NK-клеточной линии YT (цитотоксический тест).

22

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В МОДЕЛИРОВАНИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ

Григорьева Е.В.

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО

РАН», Новосибирск, Россия

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии

кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения

РФ, Новосибирск, Россия

ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН»,



Благодаря использованию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

человека (ИПСК) появилась возможность моделирования процессов заболеваний,

скрининга лекарственных препаратов и токсикологического скрининга, развития новых

терапевтических подходов. Направленная дифференцировка ИПСК в

узкоспециализированные типы клеток представляет уникальный инструмент для

изучения и моделирования ряда нейродегенеративных заболеваний, поражающих

специфические нейральные типы клеток. К таким заболеваниям относятся спинальная

мышечная атрофия (СМА), амиотрофический боковой склероз (АБС), полиомиелит,

вызванные избирательной гибелью моторных нейронов, болезнь Паркинсона, при

которой происходит гибель средних шипиковых нейронов, болезнь Альцгеймера,

поражающая кортексные нейроны. Дифференцированные производные ИПСК

являются удобной модельной системой для изучения in vitro наследственных

заболеваний и поиска средств их терапии. Однако имеются некоторые ограничения в

использовании ИПСК, такие как потенциальная туморогенность любых стволовых

клеток, низкая эффективность репрограммирования соматических клеток векторами, не

интегрирующимися в геном реципиента. Также важной проблемой при направленной

дифференцировке ИПСК является получение гомогенной популяции, состоящей из

большого количества узкоспециализированных клеток, что, зачастую, осложнено в

связи с несовершенством технологий. Одним из существенных ограничений

использования в заместительной терапии дифференцированных производных ИПСК

является большая трудоемкость и дороговизна разработанных на сегодняшний день

протоколов. Задача современных исследователей — поиск новых эффективных,

безопасных и менее затратных методов нейрональной дифференцировки в

узкоспециализированные типы клеток, что сделает более доступными современные

технологии заместительной клеточной терапии.

23

ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ

МЕТОД СОЗДАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ НУЖД

РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

Губарева Е.А.*, Куевда Е.В., Сотниченко А.С., Гуменюк И.С., Гилевич И.В.,

Накохов Р.З., Редько А.Н., Алексеенко С.Н.

Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия


Тканевая инженерия является одним из перспективных направлений регенеративной

медицины, в которой применяются основные принципы химии, физики, клеточной

биологии, материаловедения и инженерии для создания конструкций, обеспечивающих

анатомическую и функциональную реконструкцию поврежденных органов и тканей

(для восстановления структурной целостности и функциональной активности

поврежденных органов и тканей). В настоящее время ведется активный поиск

надежных, нетоксичных, устойчивых к инфекциям биосовместимых материалов,

способных обеспечивать механическую стабильность на уровне целого органа, а также

поддерживать адгезию и жизнеспособность различных типов клеток in vitro и

выступать в качестве основы для роста и дифференцировки клеток реципиента in vivo.

Биологически совместимые материалы не должны вызывать воспаление или реакцию

отторжения, аллергию или сенсибилизацию, препятствовать процессу заживления,

быть канцерогенными или вызывать местные осложнения. Для создания биологических

каркасов мы применяли метод децеллюляризации донорских органов. В процессе

децеллюляризации органы или ткани подвергаются физическому или химическому

воздействию для удаления иммунногенных клеток, однако с сохранением

ультраструктуры и компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), поддерживающего

биомеханические свойства органа. Оптимальный метод децеллюляризации зависит от

ткани/органа. Для децеллюляризации интраторакальных органов и тканей (сердце,

легкие, диафрагма) на моделях крыс применялся детергентно-энзиматический метод.

Мы использовали модифицированные протоколы с сокращением времени воздействия

детергентами и энзимами: [очищенная вода, дезоксихолат натрия (Sigma, Швеция),

Triton-X 100 (Sigma, Швеция), PBS, ДНКаза I типа (Invitrogen, Швеция), ЭДТА (Sigma,

Швеция)]. В децеллюляризированных органах и тканях отсутствовали ядра и другие

клеточные элементы. Архитектоника соединительной ткани осталась сохранной, как и

адвентициальные оболочки мелких сосудов. Морфологические исследования

продемонстрировали удаление внутриклеточных компонентов, включая такой

тканеспецифичный белок как тропомиозин, а также MHC I и MHC II класса, фактор

Виллебранда. При этом не наблюдается значительного повреждения компонентов

ВКМ: сохранность ультраструктуры при сканирующей электронной микроскопии,

сохранность внеклеточных белков, таких как коллаген I, коллаген IV, ламинин,

фибронектин, эластин. Отсутствие иммуногенности было подтверждено

количественных анализом ДНК в децеллюляризированных матриксах. При оценке

биомеханических свойств каркасов установлено, что как нативные, так и

децеллюляризированные органы обладали практически идентичными свойствами.

Колориметрический анализ с использованием ХТТ-реагента, а также Live/Dead тест

показал наличие жизнеспособности и метаболической активности клеток, засеянных на

децеллюляризированные матриксы. В заключение стоит отметить, что получение

децеллюляризированных матриксов сердца, легких и диафрагмы открывает

перспективные возможности для создания тканеинженерных интраторакальных

органов и тканей в обозримом будущем.

24

ПРОЕКТ UGENE В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И В ОБУЧЕНИИ —

ИМПОРТОЗАМЕЩЕНИЕ В ДЕЙСТВИИ

Данилова Ю.Э.*, Голосова О.И., Грехов Г.А., Пушкова Е.А., Кандров Д.Ю.,

Быкова И.В.

Новосибирский центр информационных технологий "УНИПРО", Новосибирск, Россия


Уже не одно десятилетие российские исследователи в области молекулярной биологии

пользуются в основном зарубежными пакетами. Продвинутые в программировании

биологи также сами пишут разные программы и алгоритмы, делятся ими друг с другом.

Однако в отрыве от авторов такие разработки иногда ведут себя непредсказуемо. Есть

ли в РФ перспектива работы на отечественном и качественном биоинформационном

софте?

Новосибирская ИТ-команда, специализирующаяся на системном и корпоративном

программировании, c начала 2000-х заинтересовалась биоинформатикой, в

сотрудничестве с биологами ННЦ разработала первые программные продукты. В 2008

году появился проект UGENE [1], открытая и свободная платформа биоинформатики.

Области молекулярной биологии, которые сейчас покрывает UGENE [2] — это

аннотирование генетических последовательностей с помощью десятков методов и

удаленных баз данных, множественное выравнивание и филогения, синтетическая

биология, обработка данных NGS [3], работа с белками. Единый программный и

графический интерфейсы объединяют разнородные методы и алгоритмы, а дизайнер

вычислительных схем существенно упрощает комплексные расчеты.

Сейчас число программных запусков продукта по всему миру исчисляется уже

миллионами в год. Только 12 % пользователей — из РФ, остальные — из-за рубежа.

Число серьезных научных статей, ссылающихся на проект, подходит уже к двум

сотням. Продуктом пользуются престижные российские и зарубежные научно-

исследовательские организации и университеты, а также коммерческие

биотехнологические компании.

Поддержке пользователей уделяется много внимания: ни одно обращение не остается

без ответа, а живые дискуссии приводят к улучшению функциональных возможностей

проекта. Постоянно ведутся обучающие семинары и вебинары. В НГУ готовится к

запуску новый междисциплинарный учебный курс "Практическая биоинформатика" с

использованием UGENE. Число обращений за коммерческой поддержкой и

разработкой специфичных инструментов анализа растет, и радует то, что сейчас они

уже больше из России.

Ссылки:

1. Сайт UGENE http://ugene.net

2. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified

bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012. 28(8): 1166-1167.

3. Golosova O., Henderson R., Vaskin Y., Gabrielian A., Grekhov G., Nagarajan V., Oler

A.J., Quiñones M., Hurt D., Fursov M., Huyen Y. Unipro UGENE NGS pipelines and

components for variant calling, RNA-seq and ChIP-seq data analyses. PeerJ. 2014. 2: e644.

doi:10.7717/peerj.644

https://peerj.com/

25

НАДМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ДЛЯ ТЕРАНОСТИКИ

Деев С.М.

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, Москва, Россия


В настоящее время в России в условиях резкого ухудшения экологии и постоянного

роста стрессовых воздействий все большее количество населения подвергается риску

заболеть раком. Необходимы новые подходы и лекарственные средства для лечения

онкологических заболеваний как на ранних стадиях, когда лечение особенно

эффективно, так и на поздних стадиях, когда из-за метастазирования применение

хирургических методов уже не дает положительных результатов. Благодаря последним

достижениям фундаментальной науки стало возможным определять молекулярный

профиль заболевания и адресно воздействовать на конкретные молекулярные мишени.

Значительный прогресс в области новых приборов и материалов определил

возникновение новой медицинской дисциплины — тераностики, объединяющей

точную диагностику молекулярной мишени и эффективное и направленное

терапевтическое воздействие на нее. В докладе будет рассмотрен ряд

мультифункциональных надмолекулярных соединений для тераностики опухолей,

сконструированных и охарактеризованных в лаборатории авторов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №

14-24-00106).

1. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Plückthun A. Design of

multivalent complexes using the barnase barstar module. Nat. Biotechnol. 2003. 21: 1486-

1492.

2. Деев С.М. Лебеденко Е.Н. Супрамолекулярные агенты для тераностики.

Биоорганическая химия. 2015. Т. 41. № 5. С. 539–552.

3. Aghayeva U.F., Nikitin M.P., Lukash S.V., Deyev S.M. Denaturation-resistant bifunctional

colloidal superstructures assembled via the proteinaceousbarnase-barstar interface. ACS

Nano. 2013. 7(2): 950-961.

4. Balalaeva I.V., Zdobnova T.A., Krutova I.V., Brilkina A.A., Lebedenko E.N., Deyev S.M.

Passive and active targeting of quantum dots for whole-body fluorescence imaging of

breast cancer xenografts. J. Biophotonics. 2012. 5(11-12): 860-867.

5. Zdobnova T.A., Stremovskiy O.A., Lebedenko E.N., Deyev S.M. Self-assembling

complexes of quantum dots and scFv antibodies for targeting and imaging of cancer cells.

PLоS One. 2012. 7: e48248.

6. Nikitin M.P., Zdobnova T.A., Lukash S.V., Stremovskiy O.A., Deyev S.M. Protein-

assisted self-assembly of multifunctional nanoparticles. PNAS USA. 2010. 107(13): 5827-

5832.

7. Zdobnova T., Sokolova E., Stremovskiy O., Karpenko D., Telford W., Turchin I.,

Balalaeva I., Deyev S. A novel far-red fluorescent xenograft model of ovarian carcinoma

for preclinical evaluation of HER2-targeted immunotoxins. Oncotarget. 2015. 6: 30919-

30928.

8. Generalova A.N., Kochneva I.K., Khaydukov E.V., Semchishen V.A., Guller A.E.,

Nechaev A.V., Shekhter A.B., Zubov V.P., Zvyagin A.V., Deyev S.M. Submicron

polyacrolein particles in situ embedded with upconversion nanoparticles for bioassay.

Nanoscale. 2015. 7(5): 1709-1717.

26

ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ

Дементьева Е.В.

Федеральный исследовательский центр «Институт цитологии и генетики Сибирского

отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-

исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина»,

Минздрав РФ, Новосибирск, Россия

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической

биологии и фундаментальной медицины, Сибирское отделение Российской академии

наук, Новосибирск, Россия


Сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующие позиции среди причин

смертности населения. Несмотря на определенные успехи в лечении сердечно-

сосудистых заболеваний, до сих пор сохраняется ряд проблем, включая получение

моделей сердечно-сосудистых заболеваний для исследования их механизмов и

тестирования лекарственных препаратов.

Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток открыла новые

возможности для получения пациент-специфичных кардиомиоцитов и создания на их

основе клеточных моделей сердечно-сосудистых заболеваний. В докладе будет

рассмотрен принцип использования индуцированных плюрипотентных стволовых

клеток для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний, вызываемых

нарушением функционирования ионных каналов или саркомеров кардиомиоцитов,

представлены основные результаты применения данной технологии, а также затронуты

проблемы, которые необходимо решить для дальнейшего внедрения моделей сердечно-

сосудистых заболеваний на основе пациент-специфичных индуцированных

плюрипотентных стволовых клеток и кардиомиоцитов в биомедицину.

27

ВОЗМОЖНОСТИ ХРОНИЧЕСКОЙ СПИНАЛЬНОЙ СТИМУЛЯЦИИ В

ТЕРАПИИ НЕЙРОПАТИЧЕСКОГО БОЛЕВОГО СИНДРОМА РАЗЛИЧНОЙ

ЭТИОЛОГИИ. ОПЫТ ФЦН

Дмитриев А.Б.*, Денисова Н.П.

ФГБУ ФЦН, Новосибирск, Россия


Цель: оценить эффективность хронической эпидуральной стимуляции в терапии

больных с хроническим фармакорезистентным болевым синдромом, обусловленным

различной патологией.

Материалы и методы: система для хронической спинальной стимуляции (St.Jude)

была имплантирована 129 пациентам с нейропатическим болевым синдромом. У 84

больных (65,3%) диагностирован синдром оперированного позвоночника (FBSS), у 10

(7,7%) — последствия перенесенной спинальной травмы, у 9 (7%) — диабетическая

полинейропатия нижних конечностей, у 7 (5,4%) — комплексный регионарный болевой

синдром II типа, у 7 (5,4%) — идиопатические тазово-промежностные боли, у 7 (5,4%)

— затылочная невралгия, у 2 (1,5%) — постгерпетическая межреберная невралгия, у 2

(1,5%) — культевая боль, у 1 (0,8%) пациента — болевой синдром вследствие

критической ишемии нижней конечности. Оценка эффективности лечения проводилась

по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) и опроснику DN4. Катамнез составил от 6 до 32

месяцев.

Результаты: За 2013-2015 гг. в ФГБУ ФЦН была проведена тестовая стимуляция у 244

пациентов, при этом у 129 больных (52,8%) отмечено значительное уменьшение

болевого синдрома. Им был выполнен второй этап хирургического лечения —

имплантация постоянных электродов и генератора. Средний показатель ВАШ до

операции составил 6,5 баллов (максимально — 9; минимально — 5), при выписке — 3,2

балла, через 3 и 6 месяцев средний показатель ВАШ снизился до 3,1 балла. Через 12

месяцев ВАШ составил 3,6 балла. Осложнения в виде выраженного болевого синдрома

в месте имплантации генератора и необходимость удаления системы отмечались в 7

случаях (5,4%), миграция электродов — в 19 (14,7%).

Заключение: Хроническая эпидуральная стимуляция является эффективной и

безопасной методикой в лечении хронических фармакорезистентных болевых

синдромов.

28

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК ПРИ

ВОССТАНОВЛЕНИИ КОЖНОГО ПОКРОВА У ДЕТЕЙ С ОЖОГОВОЙ

ТРАВМОЙ

Докукина Л.Н.*, Чарыкова И.Н.

ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия


Актуальность. Развитие и совершенствование клеточных технологий — основное

направление последних лет в сфере технологий восстановления кожного покрова у

пациентов с ожогами.

Цель — стимуляция процессов репаративной регенерации кожного покрова у детей с

ожоговой травмой путем применения аутологичных клеток в сочетании с фибриновым

клеем «Тиссукол».

Материалы и методы. Пролечено 104 пациента в возрасте от 5 месяцев до 15 лет с

ожогами II-III степени на площади от 4 до 80% поверхности тела. Площадь

закрываемой аутоклетками поверхности составила от 100 до 800 см кв. Аутологичные

клетки выделяли из предварительно забранного трансплантата и использовали при

дермальных либо при глубоких ожогах после выполнения некрэктомии с соблюдением

всех предусмотренных законодательством требований. Клеточная взвесь наносилась на

рану, фиксировалась фибриновым клеем «Тиссукол» и прозрачным индифферентным

раневым покрытием типа «Реперен».

Результаты. При поверхностных ожогах на 5-7 сутки отмечали полную эпителизацию

ран и пациентов выписывали из стационара. В эти же сроки при глубоких ожогах

раневое покрытие оставляли на ране и удаляли его по мере эпителизации. Сроки

восстановления кожного покрова при глубоких ожогах составили от 7 до 14 дней, в

зависимости от площади ран.

Выводы. Полученные результаты продемонстрировали хороший эффект во всех

случаях применения аутологичных клеток кожи. Сочетанное применение фибринового

клея «Тиссукол» с трансплантацией аутологичных клеток минимизирует оперативное

вмешательство и является альтернативой свободной пересадки кожи при глубоких

ожоговых поражениях, особенно при дефиците донорских участков.

29

СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ СОСУДИСТОЙ НЕЙРОХИРУРГИИ

Дубовой А.В.

ФГБУ «Федеральный Центр Нейрохирургии», Новосибирск, Россия


Нейрохирургия — очень быстро развивающаяся отрасль медицины. Сосудистая

нейрохирургия претерпела в последние 10-15 лет значительные изменения, связанные с

разработкой и внедрением в практику новых методов диагностики и лечения аневризм,

артерио-венозных мальформаций, стено-окклюзирующих заболеваний мозговых и

брахиоцефальных артерий.

Сейчас на смену бывшему «золотому» стандарту диагностики сосудистой патологии

головного мозга пришли неинвазивные методы: мультиспиральная компьютерно-

томографическая ангиография и высокопольная магнитно-резонансная ангиография.

Использование компьютерно-томографической и магнитно-резонансной перфузии

позволяет изучить дефицит кровотока определенной зоны головного мозга.

Появились новые инструменты для выполнения эндоваскулярных операций, такие как

стенты, перенаправляющие поток крови, новые виды отделяемых микроспиралей с

памятью формы для создания 3D-клубка, новые микроспирали с гидрогелем. Эти

достижения позволяют выключать из кровотока аневризмы, которые ранее считались

неоперабельными. Также повысилась и радикальность эндоваскулярных методов

хирургии. Для лечения артерио-венозных мальформаций в последние годы созданы и

успешно используются различные клеевые композиции как на основе цианакрилатов,

так и на основе полиэтиленвинилалкоголя, позволяющие за несколько этапов заполнять

и выключать из кровотока анатомически сложные артерио-венозные мальформации.

При минимальном количестве осложнений эндоваскулярная хирургия становится

хирургией «одного дня».

Сосудистая микрохирургия также не стоит на месте. Последние десятилетия

разработаны и внедрены в практику методики создания низкопоточных и

высокопоточных анастомозов как экстра-интракраниальных, так и интра-

интракраниальных. Это позволяет беспрепятственно оперировать на длительно

выключенных из кровотока артериях мозга, а также создавать альтернативные пути

тока крови в полости черепа. Такие методы реваскуляризации мозга помогают

выключить из кровотока и удалить, если это необходимо, аневризму любой

конфигурации, любого размера и почти любой локализации. Также за счет активного

внедрения техники экстра-интракраниальных анастомозов удается выполнять

реваскуляризирующие операции при сложной патологии брахиоцефальных артерий,

например при субкраниально расположенной извитости или при протяженном

критическом стенозе.

Внедрение операций под микроскопом с использованием большого увеличения и

хорошего освещения позволяет улучшить качество визуализации мелких структур

головного мозга (артерии, вены, нервные стволы, арахноидальные мембраны), что, в

свою очередь, ведет к уменьшению травматичности хирургических манипуляций и

ускорению восстановления больного. Благодаря большому оптическому увеличению и

множеству новых высокоточных микрохирургических инструментов, удается создавать

анастомозы на поверхности и даже в глубине мозга с сосудами менее 1 мм в диаметре.

Дальнейшее совершенствование микрохирургической и эндоваскулярной техники

неуклонно приведет к еще большему повышению качества помощи больным.

30

СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ГЕНОТОКСИКОЛОГИИ

Жанатаев А.К.*, Дурнев А.Д.

ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова», Москва, Россия


Обязательной составной частью системы доклинического изучения безопасности

новых лекарственных средств является их генотоксикологическая оценка. Наряду с

международной гармонизацией подходов и совершенствованием методологии,

внимание специалистов в этой области сосредоточено на новых вызовах, возникающих

вследствие инновационного развития современной фармакологии, а также развития

новых знаний о патогенетической роли генотоксических событий.

Пересмотра требует существующая методология оценки генотоксичности в

генеративных клетках. Регламентированные тесты в силу ряда недостатков не

позволяют в полной мере оценить вероятные риски, что требует разработки и

валидизации новых подходов с учетом особенностей процессов спермато- и оогенеза.

При этом важнейшей задачей представляется оценка потенциальной анеугенности,

лежащей, по современным представлениям, в основе многих репродуктивных

нарушений.

Все большую актуальность приобретает проблема генотоксичности лекарств,

полученных с применением нанотехнологий. Ведется активная разработка и внедрение

в практику таких средств, но при этом до сих пор не разработана адекватная

методология оценки их генотоксических эффектов и прогноза генотоксического риска

применения человеком. Накопленный на сегодня пул экспериментальных данных

свидетельствует о необходимости адаптации разработанных для химических

соединений методических приемов под задачи наногенотоксикологии.

Практически не исследованной проблемой является оценка влияния лекарственных

средств на ДНК митохондрий (мтДНК). Непосредственная близость к дыхательной

цепи — главному источнику эндогенных генотоксикантов, активных форм кислорода,

— и слабая защищенность по сравнению с ядерной ДНК определяют мтДНК как

«легкую» мишень генотоксического воздействия. Фактологическая база по данной

проблеме на сегодня достаточно слаба, что объясняется отсутствием должных методов

детекции повреждений, сложностью оценки и трактовки результатов.

Открытым остается вопрос о методологии оценки генетической безопасности

лекарственных средств для генной терапии. В качестве основных рисков применения

средств этой группы рассматриваются потенциальная возможность вертикального

переноса целевой последовательности ДНК и/или векторных последовательностей в

генеративные клетки, а также вероятность инсерционного мутагенеза и канцерогенеза.

Очевидно, что методология оценки должна быть основана на современных

молекулярно-генетических и цитогенетических методах, однако конкретных решений

или предложений к решению данного вопроса на сегодня нет.

Наконец, в настоящее время в России, в странах Европейского союза и США

утверждаются(ны) регламенты, в соответствии с которыми средства для клеточной

терапии отнесены к лекарственным средствам, в связи с чем требуется оценка

генетической безопасности их применения. Методология этой работы требует

специального обсуждения.

Перечисленные положения сформулированы на основе анализа международного опыта,

собственных экспериментальных и методических разработок в области

генотоксикологических исследований.

31

ОСТЕОТРАНСПЛАНТАТ — ПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ

РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ

Зайдман А.М.1*

, Шевченко А.И.2, Корель А.В.

1, Шерман К.М.

1, Иванова Н.А.

3,

Косарева О.С.3

1 ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России, Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики

Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия

3 ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»,



Задачей тканевой инженерии в травматологии и ортопедии является создание

конструкции, отвечающей ряду требований: восстановление утраченного объема ткани,

отсутствие токсичности и иммунореактивности и способность формировать

органоспецифический регенерат. Подобный остеотрансплантат создан в ННИИТО.

Цель — исследовать тканеспецифичность и регенераторные потенции

остеотранплантата.

Материал и методы. Остеогенную дифференцировку хондротрансплантата,

полученного из хондроцитов мини-поросенка (патент № 2392973) осуществляли в

остеогенной среде в соответствии с протоколом патента (патент RN № 2574942).

Тканеспецифичность трансплантата исследовали методами морфологии и электронной

микроскопии. Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали антитела к

коллагену I, коллагену II, аггрекану; фибронектину, поверхностному антигену CD44 и

фактору фон Виллебранта. Детекцию антител осуществляли с помощью флуоресцентно

меченых коньюгатов Alexa Fluor® 568 и Alexa Fluor® 488 с антителами к

иммуноглобулинам кролика и мыши. Препараты анализировали на флуоресцентном

микроскопе Nicon Ti-E.

Результаты. Через 14 суток трансплантат представлен клетками преостеобластами, а

также сосудистыми полостями, выстланными эндотелием, экспрессирующим

изолектин В4 и фактор фон Виллебрандта. В цитоплазме преостеобластов определяется

щелочная фосфатаза и окаймленные матричные пузырьки (ультраструктурные данные).

В матриксе встречаются кальцификаты (реакция Косса). Через 30 суток трансплантат

состоит из клеток остеогенного ряда, сформированных сосудов и кальцификатов. В

центре трансплантата выявляются остеоидные балочки. Наблюдается экспрессия

коллагена I типа, остеонектина, СD44, фибронектина. Отсутствие экспрессии белков

хондрогенной дифференцировки, аггрекана и коллагена II, свидетельствует о

тканеспецифичности остеотрансплантата. Объектом для исследования

регенераторной потенции и иммунотолерантности остеотрансплантата избрана нижняя

челюсть — производная клеток нервного гребня, для которой свойственен

мембранозный тип остеогенеза. Через 14 дней сформированный дефект нижней

челюсти заполнен костной тканью балочного строения. Через 30 суток дефект

выполнен органоспецифической костной тканью. В контрольной серии в дефекте

располагается соединительная ткань с редкими костными включениями.

Заключение. Хондротрансплантат, помещенный в остеогенную среду, претерпевает

процесс трансдифференцировки по эволюционно-закрепленному пути: мезенхима –

хрящ – кость. Использование трансплантата с направленной дифференцировкой клеток

позволяет осуществить регенерацию костной ткани по типу первичного ангиогенного

остеогенеза. Отсутствие гематогенной ткани в остеотрансплантате является фактором

иммунной толерантности остеотрансплантата.

32

РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ КЛЕТОЧНО-

НАПОЛНЕННЫХ СОСУДИСТЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ

Захарова И.С.1,2,3*

, Саая Ш.Б.3, Живень М.К.

1,2,3, Шевченко А.И.

1,2,3, Струнов А.А.

1,

Смирнова А.М.1,3,4

, Карпенко А.А.3, Покушалов Е.А.

3, Иванова Л.Н.

1,4, Закиян С.М.

1,2,3,4

1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского

отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия

2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения

Российской академии наук, Новосибирск, Россия

3 Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения

имени академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской

Федерации, Новосибирск, Россия

4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет,



В настоящее время в мире ведутся разработки тканеинженерных протезов сосудов.

Актуальность этого направления связана с тем, что лечение ряда патологий

кровеносных сосудов предусматривает замену на аллотрансплантаты,

аутотрансплантаты и синтетические протезы. Существуют проблемы выбора донора,

отторжения трансплантата, непригодности аутотрансплантатов, неудовлетворительные

отдаленные показатели при использовании синтетических протезов, невозможность

роста трансплантата. Разработка тканеинженерных конструкций, заселенных

функциональными васкулярными клетками, будет способствовать созданию более

долговечных сосудистых трансплантатов и приблизит их свойства к физиологическим.

В данной работе впервые разработан протокол получения и обогащения

функциональных эндотелиальных и гладкомышечных клеточных популяций из

послеоперационного материала миокарда выходного отдела правого желудочка

человека. Проведенная молекулярно-генетическая характеристика полученных клеток

показала их функциональность и ангиогенную активность in vitro и in vivo. Показан

высокий уровень экспрессии эндотелиальных маркеров CD31, фактора фон

Виллебранда, способность образовывать капилляроподобные структуры в матригеле,

метаболизировать ацетилированные формы липопротеина низкой плотности,

нарабатывать компоненты межклеточного матрикса. С помощью электронной

микроскопии детектированы наличие и динамика формирования функциональных

микровезикул — телец Вейбеля-Паладе, специфичных для эндотелиальных клеток.

Совместное введение эндотелиальных и гладкомышечных клеток показывает высокий

регенеративный потенциал в восстановлении кровообращения в ишемизированной

области задней конечности и на модели васкуляризованного абдоминального

трансплантата иммунодефицитных мышей. Функциональная оценка in vivo в

эксперименте по трансплантации в аорту иммунодефицитных мышей подложек из

синтетического материала, заселенных исследуемыми клетками, показала

проходимость аорты на сроках от 4 до 20 недель.

Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-00082.

33

КАРКАСНЫЕ БЕЛКИ, ЭКСПОНИРУЮЩИЕ ПЕПТИДЫ-ИМИТАТОРЫ

ЭПИТОПОВ ВИЧ-1, УЗНАВАЕМЫХ ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ

АНТИТЕЛАМИ

Карпенко Л.И.*, Рудометов А.П., Чикаев А.Н., Щербаков Д.Н., Бакулина А.Ю.,

Каплина О.Н., Ильичев А.А.

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово,

Новосибирская область, Россия


Стремительное распространение эпидемии СПИДа во всем мире (не исключая Россию)

обуславливает необходимость создания вакцин для профилактики ВИЧ-инфекции.

Несмотря на колоссальные ресурсы, затраченные на получение вакцины и острейшую

конкуренцию в этой сфере, поставленная задача так и остается нерешенной по

сегодняшний день. Традиционные подходы, основанные на использовании убитых или

аттенуированных вирусов, а также субъединичных антигенов, оказались либо

неэффективны, либо неприемлемы из соображений безопасности. Надежды на успех

ученые сегодня связывают с появлением принципиально новых типов вакцин, для их

создания необходимы антигены новых поколений.

Одно из перспективных направлений в создании новой генерации эффективных и

безопасных вакцин основано на получении скафолдов (каркасных белков),

экспонирующих линейные эпитопы ВИЧ-1 или их имитаторов, узнаваемых

широконейтрализующими антителами (bNabs).

В качестве носителя в первую очередь рассматривали частицы бактериофага М13,

экспонирующие пептиды, отобранные в результате аффинной селекции с bNAbs

VRC01.

Другим кандидатом в качестве белка-носителя являлся белок YkuJ из Bacillus subtilis.

Этот белок выбран с помощью компьютерного моделирования, его третичная

структура совпадала со структурой эпитопов, узнаваемых bNAbs 10E8. Две копии

фрагмента эпитопа, узнаваемого 10Е8, были встроены в YkuJ. Рекомбинантный белок

был назван DNI. Ген, кодирующий белок DNI, был синтезирован и клонирован в

составе плазмиды pET21a. В результате был получен электрофоретически гомогенный

препарат белка, пригодный для иммунизации лабораторных животных, который был

охарактеризован с помощью ЭФ и иммуноблоттинга.

Третий кандидат в качестве белка-носителя — ВПЧ НВсАg. Были получены химерные

варианты HBcAg, несущие пептиды-имитаторы, узнаваемые NAb VRC01. Полученные

белки охарактеризованы и наработаны в препаративном количестве для проведения

иммунизации лабораторных животных для оценки их способности индуцировать

нейтрализующие антитела.

Работа выполнена при поддержке гранта РФН № 14-14-00660.

34

ДИСФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИЙ КАК МИШЕНЬ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ

СПОРАДИЧЕСКОЙ ФОРМЫ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА:

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Колосова Н.Г.*, Максимова К.Ю., Тюменцев М.А., Муралева Н.А., Рудницкая Е.А.,

Телегина Д.В., Киселева Е.В., Стефанова Н.А.

Институт цитологии и генетики, Новосибирск, Россия


Болезнь Альцгеймера (БА) — самое распространенное нейродегенеративное

заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофических изменений

мозга. Заболеваемость БА растет по мере увеличения продолжительности жизни

людей, эффективных способов профилактики и лечения БА нет. Это обусловлено

неполнотой знаний патогенеза и поздней постановкой диагноза, базирующейся в

основном на оценке когнитивных нарушений и поведения. Согласно доминирующей

гипотезе «амилоидного каскада» центральным событием в патогенезе БА становится

накопление нейротоксических форм пептида амилоида-бета (Aβ), но препараты,

нацеленные на его подавление, оказались неэффективными. Растет количество

аргументов в пользу того, что гиперпродукция Aβ не выступает в роли фактора,

инициирующего наиболее распространенную (~95%) спорадическую форму БА. Как

один из ключевых факторов ее развития рассматриваются дисфункции митохондрий

(М). Согласно гипотезе «митохондриального каскада», снижение синтеза АТФ и

окислительный стресс вызывают гиперпродукцию Aβ, токсическое действие которого

на М активизирует нейродегенеративные процессы. Механизмы, инициирующие

нарушение функций М, и причинно-следственная связь между дисфункцией М и

гиперпродукцией токсического Aβ при развитии БА остаются неясными. Создание и

характеристика биологических моделей заболеваний человека — продуктивный подход

к выяснению молекулярно-генетических механизмов их патогенеза и разработке новых

способов лечения и профилактики. Нами получены убедительные доказательства того,

что уникальной моделью спорадической формы БА является созданная в ИЦиГ СО

РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS, у которых развиваются все

ключевые признаки БА. Нами проведена оценка вклада дисфункции М в развитие

признаков БА у крыс OXYS и влияние на него митохондриального антиоксиданта SkQ1

(пластохинонил-децил-трифенилфосфония). Установлено, что структурные аномалии

М, гиперфосфорилирование тау белка, потеря синапсов, гибель нейронов в мозге крыс

OXYS регистрируются раньше, чем усиленное накопление Aβ (Aβ1-42) и его

внеклеточных агрегатов, которые выявляются позднее и соответствуют необратимым

стадиям БА. Исследование транскриптома коры мозга крыс OXYS разного возраста

методом RNA-seq подтвердило связь развития у них признаков БА с дисфункцией М и

нарушением синаптической пластичности. Прием SkQ1 (250 нмоль/кг/день) с возраста

12 до 18 месяцев повысил способность к обучению и память у крыс OXYS и Вистар

(контроль), снизил уровни Aβ 1-42 и Aβ1-40 и фосфорилированного тау белка в

гиппокампе и коре мозга крыс OXYS, подавил гибель нейронов и замедлил снижение

плотности синапсов (оценивали методами электронной микроскопии и по белкам-

маркерам синапсин I и PSD-95). Также SkQ1 увеличил количество М и улучшил их

ультраструктурные параметры в гиппокампе. Результаты указывают на то, что

замедление ассоциированных со старением структурно-функциональных нарушений М

мозга — продуктивный подход к профилактике БА и подтверждают полученные ранее

данные о перспективности использования с этой целью SkQ1.

Работа поддержана грантом РНФ № 16-15-10005.

35

ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ОНКОТОКСИЧЕСКИЕ

БЕЛКИ

Кочнева Г.В.1,3*

, Рихтер В.А.2, Рябчикова Е.И.

2, Нетесов С.В.

3

1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово,


2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,




Конструирование рекомбинантных штаммов вируса осповакцины (ВОВ) с целью

создания на их основе противоопухолевых препаратов является перспективным

направлением биотехнологии. Ряд таких штаммов в настоящее время успешно

проходит клинические испытания за рубежом. ВОВ обладает природной

онкоселективностью, однако ее уровень зависит от штамма вируса. В наших

исследованиях показано, что индекс селективности российского штамма Л-ИВП

(GenBank Acc. КР233807.1) составляет больше 1000 в паре гомологичных культур

клеток эпителия молочной железы раковая/нормальная MCF7 / MCF 10A. Штамм Л-

ИВП способен не только вызывать прямую деструкцию опухолевых клеток, но также

останавливать их деление в S-фазе клеточного цикла.

На основе штамма Л-ИВП нами был сконструирован ряд рекомбинантных штаммов с

делециями генов тимидинкиназы (TK) и ростового фактора (VGF, virus growth factor).

Эти гены кодируют факторы вирулентности, и их удаление приводит к практически

полной неспособности вируса реплицироваться в нормальных неделящихся клетках, но

при этом сохраняется литическая активность в отношении раковых. Для усиления

противоопухолевой активности в район делеции гена VGF проведена встройка

трансгенов онкотоксических белков: апоптина (Apo), NS1 парвовируса (NS1) или

лактаптина (Lact). Показано, что эти белки обладают адресной апоптоз-индуцирующей

активностью в отношении опухолевых клеток человека. Поскольку при лизисе раковых

клеток происходит высвобождение ассоциированных с опухолью антигенов, которые,

как известно, являются слабо иммуногенными, необходимо введение дополнительного

иммуностимулирующего цитокина. Лучшим на данный момент является

гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ). Ген

ГМКСФ человека был встроен в район делеции гена TK. Таким образом,

сконструированы три двойных рекомбинантных штамма Л-ИВП с фенотипом ТК-

ГМКСФ+VGF

-Apo

+/NS1

+/Lact

+.

Все рекомбинантные штаммы показали высокую цитотоксическую активность и

онкоселективность в отношении раковых клеток человека как in vitro, так и in vivo.

Методами проточной цитометрии и иммуногистохимии показано, что рекомбинанты

эффективно индуцируют апоптоз раковых клеток человека. Ингибирование роста

опухолей разного генеза и выживаемость продемонстрированы в иммунодефицитных и

иммунокомпетентных мышиных моделях при интратуморальном и внутривенном

введении рекомбинантных вирусов. Строгая внутриопухолевая репликация вирусов и

антиметастатический эффект показаны на модели искусственного метастазирования

эпидермоидной карциномы человека А431 на мышах линии nude с использованием

методов электронной микроскопии и In-vivo Multispectral Imaging System (Bruker).

36

ДИВЕРСИФИЦИРОВАННЫЕ ДОМЕНЫ FNIII-ТИПА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ

ОСНОВА МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АФФИННЫХ БЕЛКОВ И

ХИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Кулемзин С.В.1*

, Баранов К.О.1, Гусельников С.В.

1,2, Горчаков А.А.

1,2, Чикаев Н.А.

1,

Сократян А.М.1, Волкова О.Ю.

1, Кузнецова В.В.

1, Наякшин А.М.

1, Таранин А.В.

1,2

1 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия



Одной из основных тенденций в области конструирования иммунотерапевтических

агентов нового поколения является функциональное усложнение и, в том числе,

увеличение количества распознаваемых такими агентами мишеней. В случае

традиционных моноклональных антител расширение функциональных возможностей в

определенной степени ограничивается большими размерами этих молекул. В связи с

этим проводится активный поиск и изучение искусственных антигенраспознающих

белков неиммуноглобулиновой природы. Одной из альтернативных структур является

домен FNIII-типа (Fn3) фибронектина человека. Он обладает небольшой молекулярной

массой (~10 кДа), высокой стабильностью и низкой (в силу своего человеческого

происхождения) иммуногенностью. Fn3 взаимодействует с лигандами за счет своих

боковых петель, рандомизация которых позволяет создавать комбинаторные

библиотеки с разнообразием до 1015

вариантов. Для поиска доменов необходимой

специфичности в таких библиотеках используются методы in vitro скрининга. Тот факт,

что в природных белках Fn3-домены представлены тандемными повторами (от двух-

трех до нескольких десятков), позволяет предполагать возможность создания на их

основе мультифункциональных терапевтических белков путем соединения доменов

различной специфичности в мультидоменные цепи. В настоящей работе мы создали

панель искусственных Fn3-белков, включающих от двух до пяти доменов. В качестве

элементов этих белков использовали домены, случайно отобранные из созданной нами

комбинаторной Fn3-библиотеки, а также домены с известной антиген-связывающей

активностью. Исследовали различные свойства Fn3-олигомеров в виде секретируемых

продуктов или антиген-распознающих модулей химерных антигенных рецепторов.

Полученные данные показали, с одной стороны, сохранение антиген-связывающей

активности Fn3-доменов в составе мультидоменных цепей, а с другой — важную роль

первичной последовательности диверсифицированных петель в поддержании

растворимости таких белков.

37

ИНГИБИТОР СТРИАТУМ-СПЕЦИФИЧНОЙ ТИРОЗИНОВОЙ ФОСФАТАЗЫ

(БЕНЗОПЕНТАТИЕПИН ТС-2153) СНИЖАЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ

АКТИВНОСТЬ СЕРОТОНИНОВЫХ 5-HT2A РЕЦЕПТОРОВ МОЗГА

Куликова Е.А.1*

, Илларионова Н.Б.1, Волчо К.П.

2, Хоменко Т.А.

2, Салахутдинов Н.Ф.

2,

Хоцкин Н.В.1, Баженова Е.Ю.

1, Куликов А.В.

1

1 Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия

2 Институт органической химии имени Н.Н. Ворожцова, Новосибирск, Россия


Стриатум-специфическая тирозиновая фосфатаза (STEP) является белком

внутриклеточной трансдукции и участвует в механизмах возникновения целого ряда

нейропатологий. В Новосибирском институте органической химии был синтезирован

ингибитор белка STEP — гидрохлорид 8-трифторметил-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-

амин (TC-2153). Было показано участие ТС-2153 в регуляции серотониновой системы

головного мозга (5-HT). Однако механизм взаимосвязи белка STEP и 5-HT системы

еще не был изучен. Известно, что 5-НТ система головного мозга играет значительную

роль в регуляции целого ряда форм нормального и патологического поведения. Одним

из ключевых белков серотониновой системы являются 5-НТ2А рецепторы, которые

располагаются на постсинаптической мембране во всех структурах мозга, оказывая

существенное влияние на работу мозга. Активация этих рецепторов с помощью

агониста DOI приводит к выраженной активации экспрессии белков раннего

реагирования c-fos в мозге и вызывает синдром встряхивания головой.

Целью данной работы было исследование эффекта ингибитора STEP (ТС-2153) на

функциональную активность 5-HT2A рецептора мозга.

Материалы и методы. В качестве ингибитора белка STEP мы использовали TC-2153 в

дозах 10 и 20 мг/кг для острого введения и 20 мг/кг в течение 14 дней для

хронического, per os. Через три часа после введения ТС-2153 животным делали

однократную инъекцию агонистом 5-НТ2А рецепторов — DOI (1 мг/кг, в/б).

Функциональную активность 5-НТ2А рецепторов измеряли по количеству встряхиваний

головой в течение 20 минут, через 5 минут после введения DOI.

Первичная культура нейронов гиппокампа инкубировалась с ТС-2153 (10 µM, 3 часа), а

затем в нее добавляли DOI (1 µM, 10 мин), после часа инкубации методом

иммуноцитохимии исследовали количество c-fos экспрессирующих нейронов.

Результаты. В данной работе было обнаружено, что острое введение ТС-2153 в дозах

10 и 20 мг/кг дозозависимо снижало функциональную активность 5-НТ2А рецепторов

(F2,19=10.06, p<0.001). Также было показано, что хроническое введение ТС-2153 в дозе

20 мг/кг снижало функциональную активность 5-HT2A рецептора по сравнению с

контролем (F1,13= 11.31, p<0.01). На клеточных культурах гиппокампа было обнаружено

достоверное влияние препарата (F3,135=133.5, p<0.001) на процент c-fos положительных

нейронов. Известно, что введение DOI приводит к увеличению c-fos экспрессии в

клетках по сравнению с контролем и в данной работе мы подтвердили этот факт

(p<0.001). Однако введение ингибитора STEP (TC-2153) совместно c DOI отменяло

эффект последнего (p<0.001).

Заключение. Таким образом, впервые было показано участие ингибитора белка STEP

(ТС-2153) в снижении функциональной активности 5-НТ2А рецепторов головного

мозга.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного

проекта № 16-34-00466 мол_а.

38

ПРОБЛЕМЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ

ХРОМОСОМНОГО ДИСБАЛАНСА НА УРОВНЕ CNV

Лебедев И.Н.

ФГБНУ Научно-исследовательский институт медицинской генетики, Томск, Россия


Применение микроматричного анализа и экзомного секвенирования в клинической

практике генерирует огромный массив данных, отражающих изменчивость генома

человека. Получение такой информации вызывает закономерный вопрос об

интерпретации патогенетической значимости выявляемых микроструктурных

геномных вариаций, особенно если они описываются впервые. В клинической и

молекулярной цитогенетике данная проблема концентрируется вокруг полиморфизма

по числу копий крупных блоков повторов ДНК (Copy Number Variation, CNV),

клиническое значение которого обычно ранжируется в следующих категориях:

доброкачественные полиморфные варианты, условно патогенные варианты,

патогенные варианты и, наконец, варианты с неясной патогенетической значимостью.

Отнесение CNV к той или иной категории, а соответственно прогноз для пробанда и

успех медико-генетического консультирования для семьи, часто представляет

нетривиальную задачу, решение которой должно учитывать размер перестройки, состав

затрагиваемых генов, происхождение (de novo или унаследованные варианты), наличие

опубликованных случаев со сходным клиническим эффектом.

Дополнительным критерием, по нашему опыту, может являться локализация CNV в

геноме, особенно в областях, фланкированных низкокопийными повторами ДНК или

сегментными дупликациями. Неаллельная гомологичная рекомбинация между блоками

сегментных дупликаций приводит к закономерному возникновению реципрокных

хромосомных микроделеций и микродупликаций. Не удивительно, что в последнее

время отмечается заметный прогресс в идентификации новых микродупликационных

синдромов, обусловленных реципрокными хромосомными микроперестройками. Вслед

за генетической реципрокностью начинают складываться представления и о гено-

фенотипических корреляциях при таких типах аберраций. Картина так называемых

«сестринских геномных заболеваний» (genomic sister disorders), а к настоящему

времени их насчитывается 58 пар (Кашеварова, Лебедев. Генетика, 52(5), 2016) может

быть представлена как сходными, так и полярными клиническими фенотипами, что

имеет особую ценность для интерпретации патогенетической значимости впервые

описываемых CNV в определенном хромосомном сегменте.

Следует отметить, что взаимоотношения «генотип – фенотип», установленные для

реципрокных микроделеций и микродупликаций, могут и должны быть, по всей

видимости, расширены и на более значительные изменения копийности —трипликации

и даже квадрипликации хромосомных сегментов. Несомненно, это усиливает

клиническую значимость CNV в том или ином регионе генома, особенно в случае

локализации в нем дозозависимых генов, для пациентов с признаками хромосомного

заболевания. Вместе с тем, наличие таких протяженных вариаций акцентирует

внимание на том, что молекулярные механизмы генерации CNV не могут быть

ограничены неравным кроссинговером между блоками сегментных дупликаций, а

включают также механизмы, основанные на процессах репликации и репарации ДНК.

Исследование поддержано грантом РНФ № 14-15-00772.

39

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ В ДОКЛИНИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

Лемак М.С.

OOO «Никон», Москва, Россия


В последние годы одним из приоритетных направлений трансляционной медицины

является использование наноматериалов для таргетной доставки лекарственных

препаратов к их терапевтическим мишеням. Для всесторонней оценки цитотоксичности

и биодоступности новых лекарственных форм важно тщательно исследовать

распределение наноконтейнеров в клетке и их влияние на межбелковые

взаимодействия и клеточные сигнальные каскады. Для решения этой задачи на базе

исследовательского инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E была создана

уникальная модульная система Ti-LApp, которая позволяет объединять одном

микроскопе несколько инструментов для разноплановых исследований под

автоматизированным управлением программного обеспечения NIS Elements JOBS. Так,

например, в систему Ti-LApp входит система управляемого позиционированного

освещения на основе технологии DMD (Digital Mirror Device), которая позволяет

одномоментно освещать в поле зрения область любой заданной формы, площадью от

долей микрона, и является незаменимым инструментом для исследований методами

FRET и фотоконверсии белков, и модуль FRAP для исследования диффузии молекул.

Данные о динамике и взаимодействии биомолекул, полученные методами

широкопольной флюоресцентной микроскопии, накладываются на изображения

клеточных структур, полученных с нанометровым разрешением с использованием N-

STORM 4.0, основанного на методе стохастической оптической реконструкции. Таким

образом, сопоставление структурных и функциональных данных в клеточных моделях

позволяет повысить надежность отбора наиболее эффективных и безопасных

биоконтейнеров и в перспективе повысить вероятность успешного завершения их

клинических испытаний.

40

ЭНДОСКОПИЧЕСКМЕ МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКИХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ ДЕТСКОГО ВОЗРАСТА

Летягин Г.В.

ФГБУ Федеральный центр нейрохирургии, Новосибирск, Россия


Нейроэндоскопия — это дальнейший прогресс в «адекватной» малоинвазивной

микрохирургии, что означает дальнейшее уменьшение повреждения нормально

функционирующей ткани при максимальной эффективности воздействия на

патологию. Эндоскопия центральной нервной системы, однако, сложнее, чем

общехирургическая эндоскопия, в отличие от артроскопии или перитонеальной и

торакальной эндоскопии. Здесь приходится работaть в желудочке или в кистe

головного мозга в жидкой ликворной среде. Поэтому для чувствительной ткани мозга

необходимы специальные эндоскопы с малым диаметром, особая техника промывания

и специальные эндоскопические инструменты и операционные техники.

Кроме «чистой» эндоскопии в нейрохирургии используется эндоскопическая

поддержка в случаях трансназального удаления опухолей хиазмально-селлярной

области, удалении опухолей основания мозга, при клипировании сосудистых аневризм

головного мозга, в резекционной хирургии краниосиностозов костей черепа. Также

эндоскоп используется в хирургии позвоночника и спинного мозга.

Варианты применения эндоскопии в нейрохирургии:

- эндоскопическая перфорация дна III желудочка при окклюзионной гидроцефалии;

- бужирование Сильвиевого водопровода и восстановление проходимости отверстий

Люшка и Мажанди;

- эндоскопическая фенестрация многокамерных кист головного мозга при

многоуровневой гидроцефалии;

- кистоцистернальное шунтирование при латеральных и срединных кистах головного

мозга;

- удаление небольших опухолей желудочков мозга и взятие биопсийного материала.

Современные нейроэндоскопы имеют множество модификаций в зависимости от

производителя и цели предназначения. В целом, их условно можно разделить на

«обзорные» модели и высокотехнологичные «рабочие» эндоскопы с наличием каналов

для продвижения инструментов, катетеров, коагуляционных электродов, лазерных

«скальпелей», зондов, баллон-катетеров. Наиболее современные модели позволяют

одновременно использовать два разных инструмента совместно с подачей и аспирацией

жидкостей. Современные гибкие эндоскопы позволяют проникать в самые удаленные

от прямого обзора области мозга, при этом имеют рабочие каналы для манипуляций.

Самые современные гибкие видеоскопы имеют максимально качественный обзор

изображения и освещения в глубине раны. Имеются разновидности эндоскопов

«специального» назначения: шунтоскопы для работы внутри катетеров, эндоскопы для

«тоннельной» резекции при синостозировании швов черепа. Весь этот арсенал

эндоскопической техники имеется в ФГБУ ФЦН г. Новосибирска и применяется для

хирургического лечения патологий центральной нервной системы у детей.

41

ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОГО НАЗНАЧЕНИЯ

НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ БОЛЬНЫМ РАКОМ МОЛОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ

Литвяков Н.В.1,2*

, Казанцева П.В.1, Цыганов М.М.

1,2, Ибрагимова М.К.

1,2, Слонимская

Е.М.1, Чердынцева Н.В.

1,2

1 Томский НИИ онкологии, Томск, Россия

2 НИ Томский государственный университет, Томск, Россия


В настоящее время ответ опухоли молочной железы на неоадъювантную

химиотерапию (НАХТ) наблюдается в 30-65% случаев в зависимости от молекулярного

подтипа, а решение о ее назначении принимается на основе клинико-морфологических

характеристик. Цель: разработать и клинически валидировать технологию

персонализированного назначения НАХТ больным РМЖ для повышения ее

эффективности. Материалы и методы. Для разработки технологии на первом

ретроспективном этапе было обследовано 68 больных РМЖ (лечение в 2006-2010 гг.),

которым проводили НАХТ. ДНК выделяли из 68 биопсийных образцов опухолевой

ткани до лечения. Микроматричный анализ CNV (Copy Number Variation) проводили на

чипах Affymetrix (USA) CytoScanTM

HD Array. На втором этапе клинически

валидировали разработанную технологию. Проспективную группу составили 37

пациентов с люминальным В РМЖ, которым НАХТ персонализировано назначалась по

результатам микроматричного анализа ДНК биопсийного материала до лечения.

Группу исторического контроля составили 71 больной РМЖ люминального В подтипа,

которым назначали НАХТ по клиническим показателям. Результаты. На первом этапе

исследования были идентифицированы маркеры ожидаемой эффективности НАХТ,

которые позволили бы определить целесообразность ее проведения, а также маркеры

ответа опухоли на отдельные химиопрепараты для назначения схемы НАХТ. Было

установлено, что при делеции хотя бы одного из локусов генов АВС (ABCB5-3q27,

ABCG2-4q22.1, ABCB3-6p21.32, ABCB1-7q21.1, ABCC1-16p11.2) не формировался

фенотип устойчивости и отмечалась 85-100% эффективность НАХТ [Litviakov N.V. et

al., Oncotarget 2016]. Больные с CNV локусов 1q43, 11q22.1 – 23.3 или 18p11.21

отвечали на НАХТ, а у пациентов с нормальным состоянии этих локусов отсутствовал

ответ на НАХТ (р = 0.000005 – 0.0004) [Литвяков Н.В. и др. 2014]. Амплификация

локуса гена TOP2A-17q21.2 обусловливала ответ на антрациклины [Казанцева П.В. и

др. 2016]. Делеция локуса гена TUBB3-16q24.3 определяла ответ на таксотер у 67%

пациентов. Делеция локуса BRCA1-17q21.31 в опухоли молочной железы отмечалась у

37% больных, и они хорошо отвечали на схему химиотерапии CAX (75%), но не на

таксотер. Делеция локуса TYMS-18p11.32 в 100% случаев была сопряжена с ответом на

кселоду (САХ) и в 88% на фторурацил (FAC). На основе этих данных была разработана

технология персонализированного назначения НАХТ. При ее клинической валидации

проводили микроматричное исследование ДНК опухоли до лечения, и при наличии

хотя бы одного из выявленных маркеров ожидаемой эффективности НАХТ пациенты

начинали лечение с НАХТ (в противном случае назначали операцию). Схему НАХТ

подбирали индивидуально: при амплификации гена ТОР2а назначали антрациклины

(FAC или CAX), при делеции TYMS назначали САХ, а не FAC, при делеции TUBB3

назначали таксаны, при делеции BRCA1 в опухоли — препараты платины, а таксаны

были противопоказаны. По результатам клинической валидации эффективность НАХТ

в группе с персонализированным назначением составила 89% против 53% в группе

контроля (р=0,0017 по критерию Фишера).

Поддержано грантом РФФИ № 15-04-03091.

42

СПОСОБНОСТЬ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК

ПОДАВЛЯТЬ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЗАВИСИТ ОТ

СПОСОБА ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Лупатов А.Ю.1*

, Полтавцева Р.А.2, Быстрых О.А.

2, Ярыгин К.Н.

1, Сухих Г.Т.

2

1 Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия

2 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова,

Москва, Россия


Применение нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) в качестве

препарата для лечения заболеваний, связанных с нарушениями нервной системы,

является подходом, хорошо зарекомендовавшим себя в доклинических и клинических

исследованиях. Понимание иммуномодулирующих свойств НСПК позволит не только

стимулировать регенерацию, но и проводить клеточную терапию, направленную на

подавление аутоиммунных процессов, проявляющихся при нейродегенеративных

заболеваниях. Ключевым звеном в развитии специфического иммунного ответа

являются дендритные клетки (ДК). Это связано с их способностью представлять

антигены в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости как первого,

так и второго классов. Однако в литературе имеются противоречивые данные,

касающиеся способности НСПК подавлять дифференцировку ДК из их

предшественников in vitro. В данной работе мы исследовали 3 культуры НСПК

фетального происхождения, полученных с использованием бессывороточных сред, и 4

культуры НСПК, полученных и культивируемых на среде, содержащей фетальную

сыворотку коров. Оба типа культур были способны к росту в виде сфер и

экспрессировали маркеры НСПК, включая нестин, виметин, β-III-тубулин и GFAP. Для

оценки влияния НСПК на дифференцировку ДК клетки сокультивировали с

моноцитами крови здоровых доноров. Через 4 дня совместного культивирования в

присутствии GM-CSF и IL-4 эффективность дифференцировки оценивали по

изменению соотношения уровня экспрессии CD14 и CD1a. НСПК, поддерживаемые на

среде с сывороткой, практически полностью подавляли дифференцировку ДК из

моноцитов. Напротив, «классические» НСПК такой способностью не обладали. Для

сравнения субпопуляционного состава культур НСПК мы оценили экспрессию

поверхностных маркеров. Клетки не экспрессировали маркеры гемопоэтических

стволовых клеток и эпителиальный маркер CD24. Оба типа культур имели довольно

низкий уровень экспрессии маркера ранних стволовых клеток — CD133. Поскольку

способность мезенхимных стволовых клеток (МСК) активно подавлять

дифференцировку ДК является хорошо установленным фактом, было интересно

выяснить, не появляются ли клеточные субпопуляции, несущие маркеры МСК, в НСПК

культурах при использовании сывороточной среды. Мы не обнаружили в культурах

клетки, экспрессирующие CD105 (эндоглин) и CD54 (ICAM-1), присутствующие на

МСК. CD90 (Thy-1), присутствующий как на МСК, так и на нейронах, в небольшой

степени экспрессировался только в бессывороточных культурах, что скорее

свидетельствует об их способности к нейрональной дифференцировке. В сывороточных

культурах присутствовала субпопуляция, экспрессирующая CD44, и в меньшем объеме

CD73+ клетки. Однако размеры этих субпопуляций были незначительны, и их наличие

вряд ли может объяснять иммуномодулирующие свойства исследованных культур.

Таким образом, способность НСПК подавлять дифференцировку ДК может радикально

меняться при изменении условий культивирования. Это должно учитываться при

разработке клеточных препаратов на основе НСПК для лечения повреждений нервной

системы. Работа поддержана РНФ, грант № 14-25-00179.

43

БИОМЕДИЦИНСКИЙ КЛЕТОЧНЫЙ ПРОДУКТ В ТЕРАПИИ

ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Лыков А.П.1,2*

, Бондаренко Н.А. 1,2

, Суровцева М.А.1,2

, Ким И.И.1,2

, Кабаков А.В.1,

Казаков О.В.1, Бгатова Н.П.

1, Повещенко О.В.

1,2, Повещенко А.Ф.

1,2

1 НИИКЭЛ, Новосибирск, Россия

2 НИИПК, Новосибирск, Россия


Введение. Терапия мультипотентными мезенхимальными стромальными/стволовыми

клетками (ММСК) позиционируется как новый и обнадеживающий способ лечения

ряда воспалительно-дегенеративных процессов, так как они являются прогениторными

клетками для всех типов соединительной ткани, снижают апоптоз, модулируют

воспаление и иммунный ответ. ММСК мобилизуются и мигрируют в зону ишемии, где

продуцируют широкий спектр биологически активных веществ, способствующих

ангиогенезу и ремодулированию внеклеточного матрикса. Цель исследования —

оценка клинической эффективности биомедицинского клеточного продукта в терапии

экспериментального острого инфаркта миокарда, экспериментальной диабетической

язвы и экспериментальном воспалительном процессе в кишечнике. Материалы и

методы. Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с

соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Сахарный диабет у

мышей-самцов C57Bl6 индуцировали внутрибрюшинным введением стрептозотоцина.

КМ-ММСК получали из клеток костного мозга бедренных костей от мышей-самцов

C57Bl6. В экспериментах использовали КМ-ММСК от 2-4 пассажа. Кондиционную

среду (КС) от КМ-ММСК собирали при смене питательных сред от КМ-ММСК 2-4

пассажа. Термический ожог кожи модулировали прижиганием металлическим

шпателем после обезболивания. У части животных в область ожога вводили

физиологический раствор 200 мкл, 2х105

ММСК или 200 мкл КС от ММСК или от

фибробластов. Экспериментальный воспалительный процесс в кишечнике у мышей-

самцов C57Bl6 индуцировали 3,5% раствором декстран сульфата, добавленного в воду

для питья. У части животных в/в вводили 2х105

ММСК от GFP-B6 мышей или 200 мкл

КС от ММСК GFP-B6. Острый инфаркт миокарда у крыс-самок Wistar модулировали

перевязкой левой передней нисходящей коронарной артерии. У части животных в

периинфарктную зону миокарда вводили по 80 000 КМ-ММСК в пяти точках, или по

50 мкл КС от КМ-ММСК. Терапевтический потенциал оценивали по данным ЭКГ.

Собственные результаты. Показано, что биомедицинский клеточный продукт

способствует уменьшению выраженности некротических процессов в области ишемии

миокарда по данным изменения комплекса QRS и зубца Т (p < 0,05). Кроме этого,

биомедицинский клеточный продукт статистически значимо уменьшал высоту зубца Р

(p < 0,05). Введение в область ожога биомедицинского клеточного продукта

статистически значимо ускоряло эпителизацию раны в норме и на фоне гипергликемии.

При экспериментальной модели воспалительного процесса в кишечнике введение

биомедицинского клеточного продукта способствовала снижению выраженности

воспалительной реакции и увеличению количества клеток Панета в криптах тонкого

отдела кишечника. Заключение. Таким образом, показана терапевтическая

эффективность КМ-ММСК и продуктов секреции КМ-ММСК при остром инфаркте

миокарда, ожогах и воспалительных процессах в кишке, которая может быть внедрена

в практическое использование гастроэнтерологии, в ожоговых центрах или в практику

эндокринологов при терапии осложнений сахарного диабета — синдрома

диабетической стопы.

44

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ В РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ: РЕЗУЛЬТАТЫ И

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Макаревич П.И.1,2*

, Парфенова Е.В.2, Ткачук В.А.

1

1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва, Россия


Генная терапия, являясь одним из ключевых направлений современной медицины, с

момента появления прошла длительный путь становления, успехов и проблем. В

настоящее время ее роль в лечении целого ряда заболеваний, которые до недавнего

прошлого сопровождались необратимыми потерями функции органов, становится все

более значимой за счет уникального механизма действия, связанного с активацией

регенеративных процессов. За последние несколько лет в России и в мире активное

развитие получил целый ряд отраслей генной терапии: терапевтический ангиогенез,

лечение заболеваний печени, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда,

заболеваний и травм нервной системы, а также их тяжелых последствий.

Важным аспектом современной генной терапии является то, что для нее активно

используются гены белков, участвующих в контроле регенеративных процессов в

ткани. Это относится к факторам роста (VEGF, HGF, bFGF), плеотропным активаторам

плазминогена (uPA), нейтрофинам (BDNF, NGF) и к подходам, использующим

генетическую модификацию стволовых клеток для увеличения их терапевтического

потенциала. В последнее время также большое внимание уделяется выяснению

механизмов, за счет которых реализуется регенеративное действие генной терапии в

тканях. В частности, влияние цитокинов на систему воспаления, клетки эндотелия и

локальную активацию клеток-предшественников, которые являются ключевым

компонентом, обеспечивающим регенерацию и восстановление функции тканей и

органов. Все это позволяет говорить о полноценной роли генно-терапевтических

подходов в регенеративной медицине и обсуждать развитие этого направления в свете

существующих достижений и ряда проблем, связанных с балансом эффективности,

безопасности и этических вопросов.

В докладе освещены основные результаты в этой области с анализом последних

мировых данных и изложены возможные направления развития генной терапии в

регенеративной медицине. Освещены подходы к решению проблемы повышения

эффективности генной терапии, разработки комбинированной генной терапии и

результаты их доклинических испытаний. В качестве актуальных задач рассмотрены

возможности использования регуляции экспрессионной активности генно-

терапевтических препаратов и механизмов переноса генетической информации с

помощью внеклеточных везикул и других систем.

45

СОЗДАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

Малахова А.А.1,2,3*

, Маланханова Т.Б.1,2,3,5

, Сорокин М.А.4, Сорокина А.Е.

1,2,3,

Закиян С.М.1,2,3,5

1 ФГБНУ «ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия

2 ФГБУ «ННИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина»,


3 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,


4 ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия



Моделирование наследственных заболеваний человека с использованием

плюрипотентных стволовых клеток имеет большие перспективы в современной

биомедицине. Используя методы редактирования генома, можно создавать панели

изогенных клеточных линий, различающихся между собой лишь мутациями в

определенных генах, ответственных за развитие того или иного заболевания. При этом

исходные клетки, не несущие мутации, будут являться идеальным «здоровым»

контролем. Болезнь Хантингтона — это наследственное нейродегенеративное

заболевание человека, причиной которого является динамическая мутация удлинения

тракта тринуклеотидных повторов CAG в кодирующей части первого экзона гена HTT

(Huntingtin). Экспрессия мутантного аллеля приводит к формированию в клетке

токсичной формы белка mHTT, имеющей удлиненный полиглутаминовый тракт (более

35 а.о.) и измененные биохимические свойства, в частности склонность к агрегации.

Однако имеется очень мало данных о промежуточном звене, связывающем экспрессию

и накопление внутри клеток mHTT с нейродегенеративными изменениями в

специфических областях головного мозга.

Технология редактирования генома, основанная на использовании нуклеаз

CRISPR/Cas9, позволяет направленно и высокоэффективно вносить двуцепочечные

разрывы в геном культивируемых клеток, которые в присутствии донорной ДНК,

имеющей участки гомологии с областью повреждения, репарируются методом

гомологичной рекомбинации. В результате последовательность геномной ДНК

частично замещается последовательностью донорной ДНК. Для внесения мутации

экспансии тринуклеотидных повторов CAG в ген HTT нами была создана донорная

плазмидная конструкция, содержащая тракт из 215 CAG, фланкированный плечами

гомологии к гену HTT. Эффективность работы созданной системы редактирования

генома была подтверждена на клетках линии НЕК293Т. Получено более 100 клонов,

несущих мутантные аллели гена HTT различной длины, причем наблюдались как

инсерции тракта повторов CAG, так и делеции протяженных участков первого экзона

гена HTT. С использованием разработанной технологии внесения мутаций в геном

культивируемых клеток нами было получено 15 изогенных линий ИПСК, несущих

инсерцию протяженного тракта тринуклеотидных повторов в первом экзоне гена HTT.

В дальнейшем мутантные линии ИПСК будут дифференцированы в нейральном

направлении и использованы для изучения молекулярных механизмов развития

болезни Хантингтона и тестирования потенциальных лекарственных препаратов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-

10128).

46

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ RGD-ПЕПТИДАМИ НА СВОЙСТВА

СОСУДИСТЫХ ГРАФТОВ МАЛОГО ДИАМЕТРА ИЗ

ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА/ВАЛЕРАТА И ПОЛИКАПРОЛАКТОНА

Матвеева В.Г.1*

, Антонова Л.В.1, Сейфалиан А.М.

3, Севостьянова В.В.

1,

Миронов А.В.1,2

, Шабаев А.Р.2, Великанова Е.А.

1, Сергеева Е.А.

1, Кривкина Е.О.

1,

Глушкова Т.В.1, Кудрявцева Ю.А.

1, Барбараш О.Л.

1, Барбараш Л.С.

1

1 НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия

2 Кемеровский кардиологический диспансер, Кемерово, Россия

3 Университетский колледж Лондона, Лондон, Великобритания


Продолжается поиск оптимального материала для изготовления сосудистого графта

(СГ) малого диаметра для заселения клетками in situ. Комбинирование природного и

синтетического биодеградируемых полимеров поли(3-гидроксибутирата-ко-3-

гидроксивалерата) (ПГБВ) и поликапролактона (ПКЛ) улучшает биосовместимость СГ,

но она еще далека от идеальной. Для ее повышения использована RGD последователь-

ность (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), которая присутствует на многих белках

внеклеточного матрикса и является сайтами клеточной адгезии. Цель исследования —

оценить влияние модификации RGD-пептидами на морфологию, физико-механические

свойства, комплаентность и биосовместимость СГ из ПГБВ/ПКЛ. Материалы и

методы. СГ изготовлены электроспиннингом из ПГБВ/ПКЛ, часть СГ модифицирована

RGD-пептидами методом ковалентного связывания. Детекцию аминокислот на

поверхности полимера проводили с помощью окраски оранж II и нингидри-нового

теста, идентификацию RGD-пептидов с помощью Фурье-ИКС, аминокислотный состав

синтезированного RGD-пептида тонкослойной хроматографией (ТСХ). Морфологию

СГ оценивали методом сканирующей электронной микроскопии, физико-механические

свойства на универсальной испытательной машине, комплаентность на оригинальной

установке в условиях пульсирующего потока. Для изучения биосовместимости

модифицированные и немодифицированные RGD-пептидами СГ были

имплантированы в брюшную аорту крыс на 1, 3, 6 месяцев и далее подвергнуты

гистологическому, иммуногистохимическому и иммунофлуоресцентному анализу.

Результаты. Подтверждена успешная модификация поверхности СГ RGD-пептидами

(на образцах с RGD окраска оранжем II и нингидриновый тест обнаружили первичные

амины; метод Фурье-ИКС – специфичные пики для RGD-пептидов; ТСХ – присутствие

в образце аргинина/аспарагиновой кислоты). Модификация RGD-пептидами изменила

пористую структуру СГ (уменьшился средний диаметр волокон и площадь пор), не

повлияла на комплаентность, но снизила прочность, эластичность и жесткость

каркасов, делая их более схожими с показателями внутренней грудной артерии. Через 6

мес. после имплантации все СГ, с и без RGD, были 100% проходимы. При этом СГ с

RGD к 1, 3, 6 мес. имплантации на 25% реже формировали пристеночные тромбы. В

случае отсутствия тромба, частичная эндотелизация СГ с RGD зарегистрирована на 1

мес., а полная на 3мес. имплантации, тогда как СГ без RGD эндотелизировались к 6

мес. Формирование неоинтимы у части СГ с RGD обнаружено на 3 мес. имплантации,

тогда как у СГ без RGD описана не ранее 6 мес. Выводы. Модификация СГ из

ПГБВ/ПКЛ RGD-пептидами не повлияла негативно на комплаентность и физико-

механические свойства, при этом улучшалась биосовместимость материала и снизилось

тромбообразование. Метод может быть использован для создания СГ малого диаметра

на основе ПГБВ/ПКЛ для заселения клетками in situ.

Работа поддержана РНФ (проект № 14-25-00050).

47

CRISPR-РЕВОЛЮЦИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Медведев С.П.

ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия

ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,


Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения

Минздрава России, Новосибирск, Россия

Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия


Относительно недавно в арсенале исследователей появился универсальный инструмент

редактирования генов и геномов, который произвел настоящую революцию в области

изучения функций генетических элементов в нормальных и патологических процессах,

а также вывел на новый уровень биотехнологические исследования, —это система

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 (CRISPR-

associated). CRISPR/Cas9 является адаптированной для функционирования в клетках

эукариот системой «приобретенного иммунитета» бактерий и архей, с помощью

которой они борются с бактериофагами и чужеродными плазмидами. Благодаря

простоте устройства данного инструмента, в настоящее время для редактирования

геномов эукариот чаще всего используют нуклеазу Cas9 бактерии Streptococcus

pyogenes совместно с химерной направляющей РНК (single guide RNA или sgRNA), он

широко применяется во множестве исследовательских лабораторий по всему миру.

Благодаря этому, по своему вкладу в развитие биологических и биомедицинских

исследований его часто ставят на одну ступень с методом полимеразной цепной

реакции. Уже сейчас, спустя всего три года с момента выхода первых работ по

применению CRISPR/Cas9 для редактирования геномов эукариотических клеток,

данная система применяется в биотехнологии и фундаментальной медицине. В

частности, ее активно используют для создания растений и животных с новыми

свойствами. При этом сроки и стоимость создания данных организмов кардинально

сокращаются. Система CRISPR/Cas9 применяется для редактирования геномов

культивируемых стволовых клеток человека, в том числе индуцированных

плюрипотентных стволовых клеток. Это позволяет создавать изогенные клеточные

модели наследственных болезней, а также получать материал для их заместительной

терапии. Кроме того, проведено множество исследований по поиску генов,

ответственных за развитие патологических процессов, в том числе генов, продукты

которых участвуют в процессах пролиферации и метастазирования раковых клеток.

Одним из основных преимуществ системы CRISPR/Cas9 является возможность

создания библиотек векторов, которые нацелены на большинство генов генома, что

делает возможным скрининговые исследования в широчайшем масштабе. Таким

образом, сегодня CRISPR/Cas9 является универсальным инструментом

биомедицинских исследований. При этом сама технология совершенствуется. В

арсенале исследователей появляются разновидности и ортологи белка Cas9, которые

обладают новыми свойствами. Рациональному дизайну подвергаются и направляющие

РНК. Все это вселяет осторожный оптимизм и надежду, что развитие данной

технологии в будущем позволит эффективно и безопасно исправлять наследственные

дефекты во взрослых организмах.

48

ОСОБЕННОСТИ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПРЕПАРАТОВ НА

ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Мурашев А.Н.*, Рассказова Е.А.

Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института

биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино,

Россия


Препараты на основе моноклональных антител (МкАТ) относятся к

биотехнологическим лекарственным средствам. Методические рекомендации

проведения доклинических исследований для таких препаратов отражены в следующих

нормативных документах: ГОСТ Р 56699-2015 «Лекарственные средства для

медицинского применения. Доклинические исследования безопасности

биотехнологических лекарственных препаратов. Общие рекомендации», Руководство

по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Москва, 2012,

глава 9 «Методические рекомендации по доклиническому изучению безопасности

лекарственных средств, полученных на основе биотехнологий»), Руководство

международной конференции по гармонизации (ICH) по оценке безопасности

лекарственны средств (S6, Biotechnological products), Руководство Всемирной

организации здравоохранения (Guidelines on evaluation of similar biotherapeutic

products). Одним из обязательных условий для одобрения к применению

биотехнологических препаратов по рекомендациям Европейского агентства по

лекарственным препаратам (ЕМА) и Управления по контролю за качеством продуктов

питания и лекарственных средств США (FDA) является оценка их иммуногенности.

Способность препаратов МкАТ, полученных с помощью биотехнологических методов,

генерировать антитела может являться механизмом, обуславливающим отсутствие

ответа на терапию, и причиной безуспешного лечения. Антитела, вырабатывающиеся в

организме в ответ на введение МкАТ, могут снижать их эффективность, конкурируя с

эндогенными лигандами (нейтрализующие антитела) и способствовать образованию

иммунных комплексов, ускоряющих выведение препарата, снижая его биодоступность.

На частоту и выраженность иммунного ответа влияют факторы, связанные со

структурой МкАТ, присутствием примесей, особенностями заболевания, состоянием

пациента. Препараты МкАТ, характеризующиеся минимальным присутствием

аминокислотных последовательностей мышиного происхождения или их полным

отсутствием, проявляют менее выраженную антигенную активность. Принципиальным

моментом в проведении доклинических исследований иммуногенности препаратов

МкАТ является выбор адекватных in vivo моделей и оценка их имунологического

статуса перед началом введения препаратов. В ряде исследований было выявлено

существование парадоксальной зависимости между дозой вводимого препарата МкАТ

и иммуногенностью. Так, было показано, что начальные более высокие дозы таких

препаратов МкАТ, как инфликсимаб или адалимумаб являются менее иммуногенными,

по сравнению с более низкими дозами. Это обстоятельство указывает на то, что

целесообразно проводить изучение иммуногенности при разных уровнях доз

препаратов МкАТ.

Согласно Федеральному закону от 22.12.2014 №429-ФЗ «О внесении изменений в

Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств» доклинические

исследования лекарственных средств для медицинского применения должны

проводиться в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики,

утвержденными уполномоченным федеральным органом исполнительной власти.

49

Основные положения надлежащей лабораторной практики отражены в

межгосударственном стандарте ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей

лабораторной практики», который введен в действие в РФ с 1 августа 2015 года. Он

идентичен документу Организации экономического сотрудничества и развития (Guide

№1:1998 «OECD Principles of good laboratory practice»).

50

ТАРГЕТНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ПЕРИФЕРИЙНЫЙ МОНИТОРИНГ В

ОНКОЛОГИИ

Натальин П.Б.

Thermo Fisher Scientific. Inc., Москва, Россия


Успехи научных и клинических исследований привели к смене парадигмы в онкологии:

от анатомической классификации рака к молекулярному пониманию причин на уровне

мутаций в определенных генах, активирующих или дезактивирующих сигнальные пути

в клетке. Эта работа привела к появлению таргетных препаратов, оказывающих

значимый терапевтический эффект для пациентов, несущих определенную мутацию.

Число таргетных препаратов растет, а с ним растет и количество мутаций, от выявления

которых зависит назначение лекарства. Рутинный анализ большого количества

генетических маркеров осложняется ограниченным количеством биоматериала, его

генетической гетерогенностью, потребностью выявления увеличивающегося числа

маркеров одновременно, недостаточной чувствительностью и высокой стоимостью

традиционных молекулярных методов. Высокопроизводительное секвенирование

(NGS) позволяет преодолеть указанные трудности. Мы разработали технологию

таргетного секвенирования, обладающую высокой производительностью, точностью и

чувствительностью. В сочетании с набором готовых и создаваемых на заказ таргетных

панелей генов, наш подход позволяет одновременно детектировать герминальные и

соматические мутации с аллельной частотой 1% и меньше, выявлять инсерции-

делеции, CNV и химерные транскрипты в нескольких нанограммах ДНК и РНК,

полученных из опухолевых тканей, фиксированных формалином (FFPE) или образцов

«жидкой биопсии». Мы также разработали технологию для захвата циркулирующих

опухолевых клеток, которая в сочетании с NGS позволяет проводить периферийный

мониторинг для раннего обнаружения повторного возникновения опухолей.

Для задач, не требующих генотипирования большого количества локусов, а также для

подтверждения результатов NGS используется секвенирование по Сэнгеру. Мы

разработали протокол и программное обеспечение, позволяющее выявлять аллельные

варианты с частотой 5% и менее процентов, используя капиллярные генетические

анализаторы.

51

ПОЛУЧЕНИЕ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛАКТАПТИНА

Немудрая А.А.1*

, Макарцова А.А.1, Кулигина Е.В.

1, Коваль О.А.

1,2, Рихтер В.А.

1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической

биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия



Рекомбинантный аналог протеолитического фрагмента к-казеина человека RL2

индуцируeт апоптоз раковых клеток мыши и человека в культуре и тормозит рост и

метастазирование опухолей животных и человека (Koval O.A. et al., 2012; Koval O.A.,

2014). Доклинические испытания лекарственного средства «Лактаптин», созданного на

основе RL2, показали безопасность и противоопухолевую эффективность препарата.

Однако «Лактаптин», как и другие белковые терапевтические препараты, равномерно

распределяется по органам и тканям организма, что снижает эффективность его

противоопухолевого действия (Бондаренко Д.А. с соавт., 2015).

Одним из путей повышения эффективности терапевтического действия

противоопухолевых лекарственных средств является создание рекомбинантных белков

(слитых белков), которые объединяют онкотоксическое лекарство и

опухолеспецифический пептид, обеспечивающий доставку лекарства непосредственно

в опухоль. В настоящее время поиск и получение опухолеспецифических пептидов

успешно проводят с использованием фаговых пептидных библиотек.

Целью исследования является получение рекомбинантных слитых белков, состоящих

из RL2 и опухолеспецифических пептидов, отобранных методом аффинной селекции

из фаговых пептидных библиотек.

Для получения специфических пептидов скрининг фаговой пептидной библиотеки

(Ph.D.™-12 Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs, США)) проводили

на раковых клетках и опухолевых моделях, которые обладают высокой

чувствительностью к действию RL2. Проведен биопэннинг in vitro на клетках

гепатоаденокарциномы-1 (ГА-1) мыши и клетках аденокарциномы молочной железы

человека линий MDA-MB-231 и MCF-7. Биопэннинг in vivo выполнен на мышиной

опухолевой модели ГА-1 и опухоли человека MDA-MB-231 в модели-ксенографтов.

На основе последовательностей отобранных пептидов и RL2 сконструированы

рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие синтез слитых белков

«опухолеспецифический пептид-RL2» в клетках штамма-продуцента E. coli. Проведена

сравнительная оценка цитотоксической активности in vitro и противоопухолевой

эффективности in vivo полученных слитых белков.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации

ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-

технологического комплекса России на 2014–2020 годы», соглашение № 14.607.21.0063

(RFMEFI60714X0063).

52

РЕДАКТИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА AVP КРЫС ЛИНИИ

BRATTLEBORO С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS

Немудрый А.А.1,2,3,*

, Маланханова Т.Б.1,2,3,4

, Васькова Е.А.1,2,3

, Медведев С.П.1,2,3

,

Закиян С.М.1,2,3

1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный


Российской академии наук», Новосибирск, Россия


биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии


3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-

исследовательский институт патологии кровообращения имени академика

Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации,




Данная научная работа направлена на разработку терапии наследственных заболеваний

с использованием современных методов редактирования геномов ex vivo.

Наследственные заболевания, вызванные разного рода мутациями (точковые мутации в

генах, хромосомные перестройки и т.д.), в настоящее время неизлечимы, поскольку их

терапия сводится к устранению симптомов, не влияя на первопричину болезни

(мутацию в геноме). Сочетание современных методов редактирования геномов и

репрограммирования клеток к плюрипотентному состоянию является перспективным

подходом, который позволит проводить регенерацию или восполнить функцию

поврежденных в результате патогенеза наследственного заболевания клеток и тканей.

Закономерным этапом перед внедрением подобных технологий является их

доскональное изучение на модельных системах. В настоящее время существует

потребность в создании модельных систем с использованием лабораторных животных,

которые позволили бы проводить доклинические испытания.

В данной работе в качестве модельного объекта для апробации методов

редактирования геномов и разработки клеточной терапии наследственных заболеваний

использованы крысы линии Brattleboro, являющиеся носителями мутации в гене Avp,

вызывающей наследственный гипоталамический несахарный диабет. В данной работе

мы использовали систему CRISPR/Cas для внесения направленных изменений в

целевой ген Avp, последовательность которого практически идентична

последовательности гена Oxt. Тем не менее с помощью тщательного выбора сайтов для

действия CRISPR/Cas9 нам удалось обеспечить узнавание целевого гена и избежать

нецелевых эффектов в гене Oxt. Также в данной работе была создана система для

гомологичной рекомбинации в гене Avp крыс линии Brattleboro, состоящая из векторов,

кодирующих элементы системы CRISPR/Cas, и донорных плазмидных векторов;

проведены эксперименты по исправлению мутации в гене Avp.

53

ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ И ЛЕЧЕБНЫЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСОВ:

НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ

Нетесов С.В.


ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»,

Кольцово, Новосибирская область, Россия


Первые серьезные успехи в борьбе с инфекциями были достигнуты с помощью вирус-

содержащих профилактических препаратов: инактивированных и живых вакцин против

натуральной оспы и бешенства. Позднее были разработаны вакцины против желтой

лихорадки, кори, паротита и других вирусных инфекций, и, в результате, в конце 20

века Всемирная организация здравоохранения назвала разработку и применение вакцин

самым эффективным вкладом ученых в увеличение средней продолжительности жизни

людей. В настоящее время число вирусных заболеваний, от которых имеются

эффективные вакцины, уже приближается к двум десяткам, но в связи с выявлением

немалого числа ранее неизвестных вирусов — патогенов человека, список

необходимых и актуальных вакцин просто необходимо увеличить. Со всей

очевидностью, вакцины нужны против таких заболеваний, как ВИЧ-инфекция и вирус

гепатита С, и против ряда тропических инфекций: лихорадка денге, лихорадка

Западного Нила, японский энцефалит, лихорадка чикунгунья, Зика. Однако все яснее

также становится необходимость разработки вакцин против ряда респираторных

инфекций: коронавирусов, пневмовирусов и парамиксовирусов, — поскольку они

вызывают существенно больше серьезных респираторных заболеваний, чем вирусы

гриппа.

Другая серьезная сфера применений вирусных препаратов — это борьба с раковыми

заболеваниями. Первые положительные результаты в данном направлении появились

еще в начале 20 века, но ввиду их низкого процента и непредсказуемости такие методы

лечения ушли в забвение до конца 20 века. К этому времени кардинально возросли

знания о природе онкозаболеваний и механизмах репликации вирусов, что дало

возможность целенаправленно и существенно более успешно применять специально

сконструированные вирусы для лечения некоторых генетически диагностированных

форм рака. И в конце октября 2015 года весьма консервативное учреждение —

Управление по контролю пищи и лекарств США (FDA) — дало официальное

разрешение на 3 фазу клинических испытаний рекомбинантного онколитического

герпесвируса. Таким образом, данное направление лечения онкозаболеваний вышло на

новую ступень развития.

Третье направление использования вирусов в лечебных целях — это генная терапия

наследственных или приобретенных заболеваний. Здесь вирусы используются для

внедрения корректных копий человеческих генов в клетки организма больного

человека с тем, чтобы скомпенсировать имеющиеся дефекты. На этом пути также были

и удачи, и поражения, но исследователи и практики сейчас рассматривают данный

способ введения корректирующей генетической информации как весьма

перспективный, и его отдельные клинические применения уже доказали, что этим

стоит заниматься.

54

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ БИОМЕДИЦИНСКИХ

КЛЕТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ

МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК. ОПЫТ ЦЕНТРА

БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. БУРНАЗЯНА

Никитина В.А.*, Астрелина Т.А., Нугис В.Ю., Кобзева И.В., Сучкова Ю.Б.,

Карасева Т.В., Осташкин А.С., Добровольская Е.И., Усупжанова Д.Ю., Брумберг В.А.,

Лаук-Дубицкий С.Е., Козлова М.Г., Бушманов А.Ю., Самойлов А.С.

ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия


Сохранение исходных или направленно измененных свойств и адекватная оценка

качества и безопасности биомедицинских клеточных продуктов уменьшает риск

нежелательных побочных эффектов, влияющих на лечебный, восстановительный,

регуляторный потенциал клеточной терапии. Генетическая гетерогенность клеточных

культур определяется наличием в их составе генетически различающихся клеток, что

может быть вызвано как внешними (меж- и внутривидовая кросс-контаминация), так и

внутренними факторами (клональные и неклональные хромосомные аберрации). В

Центре биомедицинских технологий ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна создается

генетическая информационная база данных, описывающая ДНК профиль (по STR-

локусам) и кариотип клеточных культур мультипотентных мезенхимных стромальных

клеток, выделенных из костного мозга, жировой ткани, плаценты, десны.

Мультиплексный анализ STR-локусов ДНК и кариотипирование — методы,

рекомендованные для аутентификации клеточных культур в медицинских криобанках.

Их использование позволяет избежать ошибок, связанных с нарушением технологий

культивирования, приготовления культуральных сред, криоконсервации, маркировки

клеточных продуктов и адекватной оценки их генетической стабильности. Первичная

оценка проводится в клетках ткани-источника или на первом пассаже, вторичная — до

пятого пассажа культивирования. Если возникает необходимость превысить

регламентируемый клиническим протоколом предел уровня пассажей аттестованной

культуры, проводится дополнительное исследование. Анализ ДНК профиля

выполняется с помощью набора для амплификации 19 полиморфных STR-маркеров и

локуса амелогенина человека, COrDIS Plus (ООО Гордиз, Россия). Кариотип клеточной

культуры первично описывается с помощью GTG бэндинга хромосом, выборка для

анализа (от 20 клеток) может увеличиваться, если необходимо подтвердить наличие

клона, описание проводится согласно Международной номенклатуре хромосом

человека. В спорных ситуациях или при недостаточном для проведения полноценного

анализа количестве метафазных пластинок применяются методы молекулярной

цитогенетики (mFISH, FISH с использованием центромерных, локус-специфичных или

цельнохромосомных зондов, FISH на интерфазных ядрах), а также методы

классической генотоксикологии: гель-электрофорез отдельных клеток, микроядерный

тест. Клеточные культуры с нехарактерным (при кросс-контаминации) или

измененным (например, потеря гетерозиготности при анеуплоидии, однородительской

дисомии, нереципрокных хромосомных транслокациях) STR профилем; с клоном

клеток, характеризующихся любой хромосомной аномалией (транслокация,

анеуплоидия, полиплоидия), а также с высоким уровнем случайных хромосомных

аберраций, ДНК повреждений и микроядер, не могут быть использованы для

клинического применения. В таких случаях хранение запаса клеточного биопродукта в

составе главного и посевного банков позволяет провести его дополнительное

размораживание и экспансию, а после получения удовлетворительных результатов

тестирования применять в клинических исследованиях.

55

СОХРАННОСТЬ ПРОФИЛЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ РАКА

МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Нуштаева А.А.1*

, Кулигина Е.В.1, Рихтер В.А.

1, Коваль О.А.

1,2

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,




Разработка новых подходов к изучению и лечению онкологических заболеваний

является актуальной задачей молекулярной биологии. Линии клеток рака молочной

железы (РМЖ) широко используются как модели для исследования нарушения

регуляции пролиферации, апоптоза и миграции раковых клеток в опухолевой

прогрессии, а также как модели при исследовании противоопухолевых препаратов. Ни

одна из существующих клеточных линий не воспроизводит достоверно модель РМЖ

человека, а длительное их культивирование приводит к появлению субпопуляций,

которые вносят значительные изменения в характеристические параметры линии. Для

решения указанных проблем в настоящее время разрабатывают несколько подходов, в

основе которых лежит создание первичных культур клеток.

Задачей данного исследование являлось получение первичных клеточных культур

РМЖ, анализ молекулярных маркеров в полученных клеточных культурах, сравнение

профиля маркеров с исходным биоптатом, а также изучение туморогенности

полученных культур на мышах SCID.

Для этого нами были разработаны способы получения первичных клеточных культур

нормальной и онкотрансформированной ткани молочной железы. Полученные

первичные клеточные культуры (BC2-BC7. BrC1, BrC2, BrCCh1, BrCCh1N, BN1, BN2)

обладали многоядерностью (с ядрами овальной формы), имели цитоплазматические

выступы и «шипики», от которых можно было наблюдать отделение везикул. В

качестве молекулярных маркеров полученных культур были выбраны рецепторы

эстрогена альфа и бета (Era и Erb), прогестерона (PGR), рецептора эпидермального

фактора роста (НЕR2) и фермента ароматазы (Cyp19). Для большинства первичных

клеточных культур было характерно увеличение уровня экспрессии мРНК PGR и

снижение уровня экспрессии мРНК Erb по сравнению с исходным биоптатом. Уровень

экспрессии мРНК Era рецепторов остается неизменным для большинства первичных

клеточных культур в сравнении с биоптатом. Исследование мРНК НЕR2 и Cyp19

показало, что нет четкой тенденции изменения уровня экспрессии мРНК в первичных

клеточных культурах по сравнению с биоптатом. Наблюдаемые различия в уровне

экспрессии молекулярных маркеров в культуре и биоптате можно объяснить

гетерогенностью клеточного состава биоптата; также условия культивирования

первичной культуры вносят вклад в изменении профиля экспрессии.

Поскольку опухоли молочной железы с высоким уровнем экспрессии PGR/Era/Erb

рецепторов, как правило, требуют дополнительной гормональной стимуляции роста

при трансплантации на животных, для исследования туморогенности на

иммунодефицитных мышах SCID нами были выбраны клеточные линии с низким

уровнем экспрессии стероидных гормонов (BrC1, BrCCh1, BC7, BC5, BC6). Первичная

культура клеток BC6 c фенотипом Era-/Erb

-/PGR low/Cyp19

- образовывала опухоль в

месте введения клеток с эффективностью 100%. Обнаружено, что для этой опухоли

характерно метастазирование в легкие и печень. Полученная опухолевая культура BC6

может быть использована для тестирования новых лекарственных препаратов и

канцерогенеза.

56

РЕГЕНЕРАЦИЯ МИОКАРДА: ИСТОЧНИК КАРДИОМИОЦИТОВ В

ПОСТНАТАЛЬНОМ СЕРДЦЕ

Павлова С.В.

1 ФГБНУ ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия

2 ФГБУ ННИИПК имени академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия

3 ФГБНУ ИХБФМ СО РАН, Новосибирск, Россия


Сердце млекопитающих не является терминально дифференцированным органом,

однако скорость его самообновления чрезвычайно незначительна и составляет не более

1% кардиомиоцитов в год (Bergmann, 2009; Senyo, 2012).

До недавнего времени приоритетной идеей считалась регенерация сердца за счет

кардиальной дифференцировки региональных стволовых клеток с фенотипом c-kit+.

Однако в недавних экспериментах по изучению судьбы кардиальных c-kit+ клеток в

эмбриональном и постнатальном развитии, а также после ишемического поражения

миокарда было показано, что они являются предшественниками васкулярных клеток и

интерстициальных фибробластов в сердце и не участвуют в кардиомиогенезе (van

Berlo, 2014; Sultana, 2015). Следует отметить, что in vitro кардиальные клетки с

фенотипом c-kit+ не являются предшественниками васкулярных клеток и

характеризуются наличием мезенхимальных стромальных маркеров. Присутствие

маркера c-kit+ у клеток первичной культуры, по всей видимости, отражает их

способность к миграции и, возможно, является свидетельством эпителиально-

мезенхимального перехода клеток эпикарда при культивировании фрагментов сердца in

vitro (например, ушка предсердия).

Таким образом, механизм самообновления кардиомиоцитов в постнатальном сердце

млекопитающих не определен. Возможно, что регенерация миокарда происходит за

счет существования пула незрелых кардиомиоцитов, способных к пролиферации.

Недавно было показано, что такие кардиомиоциты существуют в миокарде мышей в

зоне естественной гипоксии и их количество согласуется с оценками скорости

самообновления сердца (Kimura, 2015).

57

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СОВРЕМЕННЫХ

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В РОССИИ – ОПЫТ «ГосНИИ

ОЧБ»

Петров А.В.

ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия


В течение последних 6 лет в ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России разработана

технологическая платформа по созданию штаммов-продуцентов рекомбинантных

белков для медицинского применения на основе клеток млекопитающих. Платформа

включает в себя экспрессионные плазмиды, обеспечивающие высокую интенсивность и

стабильность экспрессии белков, а также линии клеток СНО, адаптированные к

суспензионному культивированию в бессывороточной среде с химически

определенным составом. С использованием данной платформы созданы штаммы-

продуценты рекомбинантных гликопротеинов, в том числе терапевтических антител, на

основе которых разрабатываются технологии получения активных субстанций

оригинальных и воспроизведенных биофармацевтических препаратов.

В ходе доклада на круглом столе будет проведена демонстрация примеров

использования разработанной технологической платформы, а также обсуждение

технических и организационных проблем при разработке технологии производства,

проведении доклинических и клинических испытаний биопрепаратов в России,

проведении переговоров с представителями отечественного бизнеса.

58

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОИНФОРМАТИКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПЕРИНАТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ

НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ

Пиянзин А.И.

Алтайский государственный университет, Барнаул, Россия

Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул, Россия


Перинатальное поражение центральной нервной системы характеризуется высокой

распространенностью и разнообразием последствий, приводит в ряде случаев к

инвалидности. Важным моментом в профилактике данной патологии является

установление причин развития различных клинических форм перинатального

поражения центральной нервной системы. Биоинформатика изучает патологические

процессы методами и средствами математики и информатики, областью исследований

могут быть интеллектуальные системы анализа и прогнозирования различных

заболеваний. Пациенты и методы. Беременные женщины, новорожденные с

перинатальным поражением центральной нервной системы (возраст детей 4-7 день

после рождения). Методы математической статистики, математического

программирования и искусственные нейронные сети (основа — Back Propagation).

Полученные результаты. Классическими статистическими методами определяли

значимые симптомы неблагоприятного течения беременности, родов и состояния

ребенка сразу после родов, оказывающие существенное влияние на постановку

диагноза перинатального поражения центральной нервной системы у детей.

Основными причинами риска рождения детей в зависимости от клинической формы

перинатального поражения центральной нервной системы были: респираторно-

вирусная инфекция — от 14,3% до 21,1% (р 0,01), угроза прерывания беременности —

от 42,9% до 49,5% (р 0,01). Дополнительные факторы: гестоз, отслойка плаценты,

слабость родовой деятельности, затрудненное выведение плечиков, обвитие

пуповиной, первые роды, выпадение ручки, короткая пуповина, поперечное положение

плода и аномалия предлежания плаценты. Прогнозирование рождения детей с

перинатальным поражением центральной нервной системы показало, что классические

статистические методы не имеют оптимального соотношения чувствительности и

специфичности. Для улучшения диагностики и прогнозирования использовались

искусственные нейронные сети. Проводилось построение разных по архитектуре

искусственных нейронных сетей с различным числом нейронов в скрытом и выходном

слоях. Обучение и тестирование нейронной сети основывалось на информации, которая

содержала статистически значимые симптомы. Анализ обучения и тестирования сетей

показал, что обученные на статистически значимых различиях симптомов они

обладают большей безошибочностью. Отношение чувствительности и специфичности

является близким к оптимальному соотношению. Безошибочность тестирования

нейронной сети в зависимости от клинической формы перинатального поражения

центральной нервной системы составляла 74-93%. Созданная программа диагностики

различных клинических форм перинатального поражения центральной нервной

системы помещена на сайте кафедра педиатрии с курсом ФПК и ППС Алтайского

государственного медицинского университета. Заключение. На основе искусственных

нейронных сетей разработана система обработки информации и принятия решения для

диагностики перинатального поражения центральной нервной системы у детей, которая

позволяет в режиме реального времени оценить различные клинические формы

перинатального поражения центральной нервной системы.

59

ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ КАК МОДЕДЬ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

БИОСОВМЕСТИМОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОКРЫТИЙ НА

МЕТАЛЛИЧЕСКИХ ИМПЛАНТАТАХ

Плехова Н.Г.1*

, Ляпун И.Н.2, Гнеденков С.В.

3, Синебрюхов С.Л.

3, Пузь А.В.

3

1 ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава

России, Владивосток, Россия

2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

имени Г.П. Сомова», Владивосток, Россия

3 ФГБНУ «Институт химии» ДВО РАН, Владивосток, Россия


Процесс ремоделирования костной ткани на металлических имплантатах происходит

при сбалансированной кооперации остеобластов и остеокластов, деятельность которых

контролируется с помощью молекулярных факторов, в том числе продуцируемыми

клетками иммунной системы. Антигенпредставляющие дендритные клетки (ДК) при

формировании воспалительного очага в месте внедрения имплантата индуцируют

процесс дифференцировки и выживаемости остеокластов, оказывая опосредованное

влияние на деградацию костной ткани (Wythe et al., 2014). Топография поверхности и

химический состав материла, из которого изготовлен имплантат, играют важную роль в

инициации про- или противовоспалительного иммунного ответа, контролируемого ДК.

Цель исследования — при контакте с новыми антикоррозионными

остеогенерирующими покрытиями, нанесенными на титан марки ВТ1-0, изучить

экспрессию рецепторов на плазматической мембране, морфологию и функциональную

активность ДК.

Для исследования использовали пластины титана ВТ1-0 без покрытия (Ti), с

биоактивным кальций-фосфатным покрытием, сформированным с помощью

плазменного электролитического оксидирования (ПЭО Ti), и с покрытием,

включающем гидроксиапатит (ГА ПЭО Ti). С помощью сканирующей электронной

микроскопии обнаружено, что процесс созревания ДК, адгезированных к покрытиям

происходил быстрее, чем при их контакте титаном. Клетки, адгезированные на Ti, были

небольшого размера, округлые с плоской поверхностью и малочисленными

псевдоподиями (3-е сут. инкубации). Тогда как ДК на покрытиях титана были

большими, со складчатой поверхностью и имели многочисленные микроворсинки и

разветвленные псевдоподии. Результаты исследования иммуномодулирующих свойств

образцов показали, что при адгезии на покрытия в популяции гемопоэтических клеток

обнаруживается повышение экспрессии рецептора адгезии CD34, рецептора

активационного антигена CD38, тогда как количество лейкоцитарного маркера CD14

снижалось при повышении маркеров дифференцировки ДК CD80/CD86. Достоверное

различие между показателями для интактных клеток и после контакта с образцами

было обнаружено в отношении продукции цитокинов ДК ФНОα и регулятора

активации экспрессии и секреции RANTES. Причем наибольшее количество цитокинов

продуцировалось клетками при контакте с титаном Ti 1, а наименьшее — при контакте

с кальций-фосфатным покрытием Ti 2. Подобная зависимость была установлена и в

отношении продукции клетками противовоспалительных цитокинов: интерлейкинов 6,

10 и 12. Таким образом, вышеизложенные результаты демонстрируют, что процесс

созревания и морфофункциональное состояние ДК зависит от химических свойств

испытуемых покрытий на титане, что подтверждает возможность их использования в

качестве модели для исследования биосовместимости металлических имплантатов и

новых покрытий на них.

60

ПОИСК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ СТРЕСС-

ЗАВИСИМОЙ ФОРМЫ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ НА МОДЕЛИ КРЫС

НИСАГ

Редина О.Е.1*

, Абрамова Т.О.1, Рязанова М.А.

1,

Антонов Е.В.1, Смоленская С.Э.

1,

Ефимов В.М.1,2

, Маркель А.Л.1,2

1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского

отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия



Артериальная гипертония (АГ) является комплексным заболеванием. К настоящему

времени известно множество генов, которые могут давать вклад в развитие

заболевания. Однако, несмотря на прогресс в этой области знаний, выявление генов-

мишеней для лекарственной терапии остается нетривиальной задачей.

Целью настоящей работы было выявление генов-мишеней, которые потенциально

могут быть использованы для лекарственной терапии стресс-зависимой формы АГ.

Предполагалось, что в список генов-мишеней могут быть отнесены гены,

ассоциированные с АГ и оказывающие значительное влияние на различия в проявлении

контролируемого ими признака у гипертензивных крыс по сравнению с контрольными

в разные периоды развития заболевания. Кроме того, потенциальные гены-мишени

должны оказывать сходное действие на проявление фенотипа на разных моделях АГ и

у животных разных видов.

Работу проводили на крысах линии НИСАГ с наследуемой индуцируемой стрессом АГ.

Повышенный уровень артериального давления (АД) у крыс данной линии

устанавливается к возрасту 2-х месяцев. Сравнительное исследование уровня

экспрессии генов у крыс гипертензивной линии НИСАГ и контрольной

нормотензивной линии WAG проводили в возрасте 1, 3 и 6 мес. Анализировали ствол

мозга, гипоталамус, надпочечник, корковое и мозговое вещество почки. Анализ

транскриптомов этих органов у животных в возрасте 1 и 3 мес. проводили методом

RNA-Seq, транскриптомы органов 6-месячных крыс анализировали с помощью

микрочипов для анализа 22228 генов (Illumina RatRef-12 Expression BeadChip, USA).

Гены, дающие максимальный вклад в межлинейные различия, определялись с

помощью построения дискриминатных осей в многомерном пространстве методом

PLS-DA (partial-least squares discriminant analysis) так, чтобы расстояние между

крысами двух линий оказалось максимальным, с последующим корреляционным

анализом полученных дискриминатных осей с уровнем экспрессии каждого гена.

Результаты работы показали, что в большинстве проанализированных органов крыс

всех трех возрастов среди генов, дающих максимальный вклад в межлинейные

различия, присутствует ген Ephx2 (epoxide hydrolase 2), кодирующий растворимую

эпоксидгидролазу (sEH), известную как ключевой фермент в катаболизме

эпоксиэйкозатриеновых кислот (EETs). Одной из наиболее важных функций EETs

является контроль сосудистого тонуса. Воздействие ингибиторов sEH у мышей и крыс

понижает уровень АД и предотвращает повреждающее воздействие высокого АД на

почки, сердце и сосуды. Предполагается, что sEH может быть перспективной мишенью

для фармацевтического воздействия при лечении гипертонии.

Известно, что снижение кровотока в мозговом веществе почек может оказывать

значительный эффект на формирование почечной дисфункции и развитие АГ.

Измерение концентрации sEH, проведенное методом иммуноферментного анализа с

помощью Rat Epoxide hydrolase 2 ELISA Kit (MyBioSource, США) в мозговом веществе

117

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ miRNA С mRNA ГЕНОВ ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Ниязова Р.Е.*, Иващенко А.Т., Атамбаева Ш.А., Пыркова А.Ю.

Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, Казахстан


В mRNA 185 генов, участвующих в развитии инфаркта миокарда, только в mRNA 61

генов для 2564 миР найдены 304 сайта связывания miRNA. Из них 95 сайтов

расположены в CDS, 50 находятся в 5´UTR и 169 сайта имеются в 3´UTR. Из базы

данных по miRNA, участвующих в развитии инфаркта миокарда, ни одна из miRNA не

имела сайтов связывания в mRNA 185 генов. Возможно, эти miRNA действуют на

mRNA генов, которые не вошли в базу генов, участвующих в развитии инфаркта

миокарда. Это предположение требует проверки.

Среди mRNA 61 генов мишеней некоторые могут связывать пять и более miRNA. По

пять miRNA связываются с mRNA генов LRP1, LRP8. По семь miRNA связываются с

mRNA генов CYP1A2 и DNASE1. Девять miRNA связывается с mRNA гена CCL5 и SP1.

Эти данные свидетельствуют о сильной зависимости экспрессии этих генов от miRNA.

mRNA генов TFAM и SP1 имеют множественные сайты связывания miR-466, которая

относится к классу уникальных miRNA. mRNA гена ADRB1 имеет множественные

сайты связывания miR-3960, которая тоже относится к классу уникальных miRNA.

mRNA генов CD40LG, CDKN2B и IGF имеют множественные сайты связывания miR-

574-5р, относящейся к классу уникальных miRNA. Выявлена новая miRNA (miR-762),

которая имеет множественные сайты связывания с mRNA гена CDKN1C. Ранее нами

было показано, что в геноме человека кодируются уникальные miRNA, которые имеют

более 300 сайтов связывания. К числу таких miRNA относятся miR-619, miR-5095, miR-

5096, miR-3960, miR-1322 и некоторые miRNA из семейства miR-1273. Экспрессия

значительной части генов, участвующих в развитии инфаркта миокарда, может

зависеть от этих уникальных miRNA. Например, miR-619-5р имеет 14 генов-мишеней,

miR-5585-3p имеет 12 генов-мишеней, miR-5095 и miR-5096 имеют восемь и шесть

генов мишеней соответственно. Семейство miR-1273a,c,d,e,f,g,h имеет 34 сайтов

связывания, включая 19 сайтов связывания miR-1273g-3p в mRNA 14 генов.

Некоторые miRNA имеют большую свободную энергию связывания с mRNA

нескольких генов. miR-1273d, miR-4758-5p и miR-4763-5p связываются с mRNA генов

PPIA, NFKB1 и SH2B1 со свободной энергией связывания, равной 125 kJ/mole, что

составляет 88-94% от максимальной свободной энергии связывания этих miRNA. miR-

1226-5p, состоящая из 26 н., связывается с mRNA гена ALDH2 со свободной энергией

связывания, равной 127 kJ/mole, что составляет 86% от максимальной свободной

энергии связывания. miR-1183, состоящая из 27 н., связывается с mRNA гена THBS1 с

свободной энергией связывания, равной 132 kJ/mole, что составляет 90% от

максимальной свободной энергии связывания. miR-6089-5p, состоящая из 24 н.,

связывается с mRNA генов ADAM8 и TFAM с свободной энергией связывания равной,

132 kJ/mole, что составляет 89% от максимальной свободной энергии связывания. Эта

же miRNA связывается с mRNA гена IL6R с свободной энергией связывания, равной

138 kJ/mole, что составляет 93% от максимальной свободной энергии связывания.

Приведенные данные показывают, что взаимодействие рассмотренных miRNA и mRNA

может служить основой для выбора ассоциаций miRNA и mRNA для диагностики

инфаркта миокарда. Под ассоциацией понимается связь одной miRNA с mRNA одного

или нескольких генов либо одной или нескольких miRNA с mRNA одного гена.

118

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НОВОГО

ИММУНОФЕРМЕНТНОГО НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МИКРОКОЛИЧЕСТВ АЛЬБУМИНА В МОЧЕ ЧЕЛОВЕКА

Серченя Т.С.1*

, Ольшевская И.В.2, Нечесова Т.А.

3, Свиридов О.В.

1

1 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

2 Международный государственный экологический институт им. А.Д. Сахарова

Белорусского государственного университета, Минск, Беларусь

3 РНПЦ «Кардиология», Минск, Беларусь


В результате исследования разработан новый диагностический набор реагентов для

измерения микроколичеств альбумина в моче человека методом конкурентного

иммуноферментного анализа для in vitro диагностики микроальбуминурии.

Микроальбуминурия является маркером эндотелиальной дисфункции, отражает ранние

стадии поражения почек у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и

сахарным диабетом и является предиктором неблагоприятного прогноза этих

заболеваний у данной категории пациентов. Разработанный набор реагентов

характеризуется широким диапазоном определяемых концентраций (0,5-300 мг/л) и

высокой аналитической чувствительностью (0,3 мг/л), «открытие» и «линейность»

находятся в диапазоне 85-115%, коэффициент вариации не превышает 10%. Анализ

проходит в одну стадию и не требует предварительного разведения исследуемых проб.

Для установления клинико-диагностических характеристик набора были проведены

сравнительные медико-биологические исследования. В работе использовали

значительную выборку проб пациентов с установленным диагнозом заболеваний

сердечно-сосудистой системы (n=136), которые находились на лечении в

кардиологических отделениях ГУ РНПЦ «Кардиология». Средний возраст

обследуемых составил 55,9 ± 2,4 лет, мужчины — 68 человек и женщины — 68

человек. 126 пациентов находились на обследовании по поводу артериальной

гипертензии (АГ), из них у 15 пациентов была АГ I степени, у 82 человек — АГ II

степени и у 29 пациентов — АГ III степени. Степень АГ устанавливали согласно

Рекомендациям Европейского общества по АГ (2003 г.). У 10 пациентов был

установлен диагноз ишемической болезни сердца (ИБС), который верифицировался по

данным нагрузочных проб. В качестве исследуемого материала использовали

утреннюю порцию мочи. Для проведения анализа отбирали по 20 мкл образцов, в

пробы не добавляли консерванты и стабилизаторы. Наличие альбумина в моче в

диапазоне 20-200 мг/л диагностировали как микроальбуминурию. В результате

исследования установлено, что частота встречаемости микроальбуминурии у пациентов

с АГ повышается по мере увеличения ее степени и в группах с АГ II и III степени

составила 15,9 и 20,7%, соответственно. В группе пациентов с АГ I степени

отсутствовали пробы с уровнем альбумина более 20 мг/л. Распространенность

повышенного содержания этого белка у пациентов с ИБС составила 20%. При этом

средняя концентрация альбумина у обследуемых пациентов в случае

нормоальбуминурии увеличивалась в ряду АГ I – АГ II – АГ III – ИБС и составила 6,2,

7,1, 8,1 и 9,2 мг/л, соответственно. По результатам биомедицинских исследований

распространенность микроальбуминурии во всей группе пациентов с сердечно-

сосудистыми заболеваниями была 15,4%, что согласуется с имеющимися данными по

частоте встречаемости микроальбуминурии у пациентов с контролируемой АГ.

Тенденция к увеличению содержания альбумина в моче в зависимости от степени АГ

при нормоальбуминурии подтверждает значимость этого маркера для оценки

прогрессирования сосудистых изменений и установления сердечно-сосудистых рисков.

119

МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЙ ПОДХОД В ОЦЕНКЕ И КОНТРОЛЕ

ФИЗИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ

Пиянзин А.И.1,2*

, Понькина Е.В.

1

1 Алтайский государственный университет, Барнаул, Россия

2 Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул, Россия


Физическое развитие детей является важным показателем роста и формирования

организма, используется при комплексной оценке состояния здоровья каждого ребенка

или детского коллектива, контроле клинических испытаний лекарственных препаратов

и разрабатываемых программ питания. Нормативы физического развития

основываются на следующих методах: метод индексов (весо-ростовые соотношения),

процентильный (центильный) метод — вероятностное распределение в процентных

интервалах), метод регрессионного анализа (расчет коэффициента регрессии массы

тела по длине тела). Все перечисленные подходы в оценке физического развития имеют

те или иные преимущества и недостатки. Основной недостаток этих методов —

отсутствие прогноза изменений антропометрических параметров для отдельно взятого

ребенка. В связи с этим одной из актуальных задач современной педиатрии является

разработка методов индивидуальной характеристики физического развития детей и

подростков. Изучение закономерностей роста и развития детей является комплексной

научной проблемой, которая должна решаться совместно с врачами-педиатрами,

антропологами, математиками, специалистами по информационным технологиям и др.

Физическое развитие ребенка является протекающим во времени процессом.

Возрастные антропометрические показатели детей (рост, вес и др.) можно

рассматривать как временной ряд. Использование методов прогнозирования временных

рядов позволяет выполнить анализ траектории физического развития ребенка и оценить

перспективы на краткосрочный период.

Пациенты и методы. База данных сформирована из антропометрических данных

детей, не имеющих значительных отклонений здоровья, и детей с эндокринными и

онкологическими заболеваниями. В качестве базового метода анализа и

прогнозирования траектории физического развития ребенка рассматривается метод

эмпирической спецификации и идентификации трендов с последующей

экстраполяцией тренда на краткосрочный и среднесрочный периоды. Анализ и

прогнозирование временных рядов показателей физического развития детей

проводился с помощью электронных таблиц Еxcel 13.0. С помощью метода

наименьших квадратов строилась линия тренда. Дополнительно анализировалась линия

скользящего среднего, величина достоверности аппроксимации.

Полученные результаты. Апробация выбранного нами подхода с использованием

реальных данных физического развития детей показала его работоспособность и

достаточную высокую точность прогнозирования.

Заключение. Мониторинг динамики физического развития ребенка позволяет

спрогнозировать возможные дальнейшие отклонения антропометрических показателей

ребенка, назначить соответствующие профилактические мероприятия.

Междисциплинарный подход к решению медицинской задачи анализа, контроля и

прогнозирования физического развития детей создает условия для повышения

эффективности работы врача-педиатра и является перспективным для

персонализированной медицины.

120

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОГО

ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ ТЕРАПИИ ХСН ДО И ПОСЛЕ

КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ С ЭРИТРОПОЭТИНОМ

Чернявский А.М.1, Повещенко О.В.

1,2*, Лыков А.П.

1,2, Бондаренко Н.А.

1,2,

Суровцева М.А.1,2

, Ким И.И.1,2

, Фомичев А.В.1

1 ННИИПК им. ак. Е.Н.Мешалкина, Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ НИИКЭЛ, Новосибирск, Россия


Клеточные технологии с использованием аутологичных костномозговых

стволовых/прогениторных клеток (СПК) являются альтернативным способом лечения

пациентов с ишемической болезнью (ИБС) и хронической сердечной недостаточностью

(ХСН), так как способствуют улучшению перфузии миокарда и увеличению фракции

выброса левого желудочка. Основной проблемой трансплантации СПК в органы

является степень приживаемости их в месте введения. Цель исследования – оценить

морфофункциональные свойства СПК до и после кратковременной инкубации с

эритропоэтином. Работа выполнена с соблюдением принципов ВМА (2013). Клетки

костного мозга получали от 14 пациентов с ИБС и ХСН II-III класса (NYHA) при

помощи пункции гребня подвздошной кости. Обогащенную фракцию СПК получали

центрифугированием на градиенте плотности фиколл/верографина.

Прекондиционирование СПК с эритропоэтином проводили в культуральных флаконах

с добавлением 10% аутологичной сыворотки в течение 40 минут при 370С в СО2-

инкубаторе. Фенотип СПК до и после кондиционирования с эритропоэтином

проводили на проточном цитометре "FACS CantoII" (BD, США) с использованием

коммерческих моноклональных антител к CD34, CD45, CD133, KDR (VEGFR2), CD184

(BD, США) и к рецептору эритропоэтина, меченных FITC, PE, APC. Апоптоз СПК

изучали с использованием Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (BD, США).

Нахождение СПК в фазах клеточного цикла изучали с использованием PI (BD, США).

Пролиферативный потенциал оценивали в MTT-тесте. Показано, что в трансплантате

присутствуют не только гемопоэтические стволовые клетки, но и эндотелиальные

прогениторные клетки (ЭПК), экспрессирующие не только CD34, но и CD133, KDR.

Кроме того, в трансплантате содержатся «более зрелые» ЭПК с фенотипом CD31.

Показано, что СПК экспрессируют хоуминг-рецептор (CXCR4, CD184), а также

рецептор к эритропоэтину. После прекондиционирования СПК с эритропоэтином

отмечено значимое увеличение экспрессии хоуминг-рецептора и рецептора к

эритропоэтину на СПК по сравнению с исходным уровнем (p < 0,05).

Прекондиционирование СПК с эритропоэтином значимо способствовало уменьшению

количества апоптотических клеток и возрастанию количества клеток в G0G1 и M фазах

клеточного цикла (p < 0,05). Нами не выявлено значимых различий пролиферативного

потенциала СПК до и после кондиционирования клеток с эритропоэтином как

спонтанного, так и антиген- или митоген-стимулированного. Таким образом, что

клеточный трансплантат пациентов с ХСН содержит не только гемопоэтические

стволовые клетки, но и эндотелиальные прогениторные клетки на разных стадиях

цитодифференцировки, экспрессирующие хоуминг-рецептор и рецептор к

эритропоэтину. Прекондиционирование СПК с эритропоэтином способствует

усилению уровня экспрессии рецептора к эритропоэтину на клетках, снижению

апоптоза и увеличению митоза, что указывает на высокую вероятность приживления

данных клеток в месте их введения.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (номер проекта 16-15-

00057).

121

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СПИРТОВ НА РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВОЛНЫ

ВОЗБУЖДЕНИЯ В МОНОСЛОЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ ЖЕЛУДОЧКОВЫХ

МИОЦИТОВ КРЫС

Подгурская А.Д.*, Цвелая В.А., Крашенинникова А.В., Слотвицкий М.М.,

Кудряшова Н.Н., Агладзе К.И.

Московский физико-технический институт (ГУ), Долгопрудный, Россия


Широкий спектр химических соединений и лекарственных средств обладает

потенциальным кардиотоксическим эффектом; особую роль в данном ряду занимают

спирты. Показано, что употребление этанола в больших количествах является основной

причиной развития кардиомиопатии, в то время как лежащий в основе этого механизм

остается малоизученным. Тем не менее в исследованиях на изолированных

кардиомиоцитах было выявлено, что этанол ингибирует потенциал-зависимые ионные

каналы (быстрые натриевые, кальциевые L-типа и каналы транзиторного выходящего

калиевого тока). Гептанол используется электрофизиологами в качестве ингибитора

щелевых контактов. Таким образом, целью данной работы являлось исследование

скоростей распространения волны возбуждения и предельно усваиваемых частот в

монослое неонатальных желудочковых миоцитов крыс в зависимости от добавленных

концентраций этанола и гептанола. Так, в экспериментах с этанолом и гептанолом

скорость распространения волны возбуждения убывала экспоненциально при

концентрациях от 0.05 до 1.8 мМ. В экспериментах с гептанолом наблюдался блок

проводимости при 1.8 мМ, что подтверждает его разобщающую роль для клеток. В

отличие от этанола, при высоких (0.8-1.4 мМ) концентрациях которого скорость

распространения волны возбуждения падала в 5 раз по сравнению с нормальными

условиями. Соответственно, значительно уменьшалась длина бегущего импульса, и,

следовательно, уменьшался размер, необходимый для существования реентри.

Значения предельно усваиваемых частот также убывали при увеличении концентрации

этанола: при 0.8-1.4 мМ более чем на 60%. Таким образом, этанол может обладать

проаритмогенным действием.

122

ЭНДОТЕЛИЗАЦИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ ПРОТЕЗОВ СОСУДОВ МАЛОГО

ДИАМЕТРА, ИЗГОТОВЛЕННЫХ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОСПИННИНГА

Степанова А.О.*, Рассказов Г.А., Лактионов П.П.

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины, Новосибирск, Россия

2 ННИИ патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия


Необходимым условием нормального функционирования в организме

тканеинженерных протезов сосудов, и особенно не склонных к стенозированию

протезов сосудов малого диаметра, является формирование на внутренней поверхности

протеза нормального эндотелия (Melchiorri, 2013). Для формирования такого слоя

необходимо обеспечить эффективную адгезию и пролиферацию клеток эндотелия (и

клеток предшественников) на поверхности протеза. Кроме того, для получения

протезов, заселенных клетками эндотелия, необходим биореактор и протоколы

заселения, культивирования эндотелиоцитов на внутренней стенке протеза.

На модели первичных эндотелиоцитов из пупочной вены человека (HUVEC) нами

оптимизирован состав 3D матриксов, используемых для изготовления сосудистых

протезов, разработан и изготовлен биореактор для культивирования клеток,

оптимизированы условия заселения и культивирования HUVEC на внутренней

поверхности протезов в биореакторе.

3D матриксы и протезы сосудов внутренним диаметром 1,8 мм были изготовлены

методом электроспиннинга из раствора поликапролактона (ПКЛ) с желатином в

1,1,1,3,3,3-гексфторизопропаноле. Данные об эффективности адгезии и

жизнеспособности клеток на поверхности матриксов с разной концентрацией желатина

продемонстрировали, что оптимальной подложкой для эндотелиоцитов являются

матриксы из ПКЛ с 10% желатина, обработанные глутаровым альдегидом. Скорость

оседания и адгезии эндотелиоцитов (106

клеток/мл, высота столба 6 мм) на поверхности

культурального пластика и 3D матриксов определяли методом световой и

флуоресцентной микроскопии. Показано, что скорость оседания составляет 50

кл/мин·мм2, клетки начинают формировать контакты с подложкой уже через 10 мин.

после посева и полностью адгезируют через 45 мин. Для культивирования

эндотелиоцитов на внутренней стенке протезов сосудов сконструирован и изготовлен

биореактор, устанавливаемый в чашку Петри 100×100×16 мм (Sarstedt), с

электромагнитными приводами мембранного насоса и узла вращения протеза сосуда.

Исполнительные устройства приводятся в действие блоком электромагнитов, который

устанавливается в СО2-инкубатор и управляется внешним программируемым

контроллером. Отработана стадия равномерного заселения стенки протеза клетками,

которая включает вращение протеза на ¼ оборота каждые 30 секунд в течение первого

часа и на ¼ оборота каждые 5 мин. в течение 5 ч. После заселения HUVEC

культивировали в потоке культуральной среды (60 мкл/0,3 сек, 1 цикл включает 3

включения мембранного насоса и вращение на ¼ оборота в течение 2 мин). Показано,

что при культивировании в таких условиях клетки равномерно заселяют стенку

протеза, причем в режиме вращения длинная ось клеток ориентирована

перпендикулярно, а в режиме прокачивания — вдоль оси протеза.

Таким образом, изготовлены 3D матриксы и протезы сосудов, пригодные для

культивирования эндотелиальных клеток, разработан и изготовлен биореактор для

получения клеточно-наполненных тканеинженерных конструктов, отработаны условия

получения сосудистых протезов с эндотелиальным слоем на внутренней поверхности.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 14-15-00493.

123

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА CRISPR-CAS9 ДЛЯ

СОЗДАНИЯ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК СО СЛОЖНЫМ КАРИОТИПОМ

Карагяур М.Н.1, Васильев П.А.

1, Дыйканов Д.Т.

1, Рысенкова К.Д.

1, Семина Е.В.

2,

Рубцов Ю.П.1

1 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-

производственного комплекса Минздрава РФ, Москва, Россия


CRISPR-Cas9 — это революционный подход, позволяющий быстро и достаточно точно

модифицировать геном эукариотических клеток. Эту систему с успехом используют

для нокаута генов в линейных клетках с целью создания удобных модельных систем

для изучения роли отдельных белков или РНК в жизнедеятельности клетки. Несмотря

на быстроту и удобство модификации геномов клеточных линий, нередко возникают

осложнения, связанные с тем, что для популярных линий иммортализованных или

трансформированных клеток характерен неустойчивый переменный кариотип. Это

приводит к тому, что выбранный для модификации ген может быть расположен не на

двух хромосомах, а представлен большим числом копий (вплоть до 5) из-за

переменного числа хромосом. Поэтому при создании клеточных моделей с

выключенными генами возникает необходимость более строгого контроля степени

модификации генома, а, кроме того, возникает потребность в повторной модификации

с целью увеличения процента клеток, в которых произошла модификация выбранного

участка геномной ДНК. В связи с этим потенциально может увеличиваться пропорция

клеток, в которых нуклеаза Cas9 расщепляет ДНК не в месте выбора, а в других,

нежелательных местах (т.н. off-target активность).

В представленной работе мы использовали CRISPR-Cas9 для получения линий клеток с

нокаутами отдельных генов. Мы исследовали эффективность модификации при

трансфекции линейных клеток конструкциями, кодирующими направляющие РНК к

различным генам. При этом мы определяли процент клеток, которые потеряли

способность синтезировать белковые продукты, число модифицированных копий

нокаутируемых генов, а также частоту появления наиболее вероятных побочных

модификаций генома. В результате мы разработали оптимизированную методику,

позволяющую уменьшить время и усилия необходимые для получения нокаутных

линий клеток со сложным кариотипом, обеспечивающую минимальное число

нежелательных модификаций генома.

124

КОНСТРУИРОВАНИЕ ХИМЕРНЫХ ЧАСТИЦ НВсАg, ЭКСПОНИРУЮЩИХ

ИМИТАТОРЫ ЭПИТОПА, УЗНАВАЕМЫЕ ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМ

АНТИТЕЛОМ VRC01

Рудометов А.П.*, Чикаев А.Н., Карпенко Л.И.

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово,



Коровый белок вируса гепатита В (НВсАg) рассматривается как одна из перспективных

систем презентации чужеродных эпитопов для создания высокоиммуногенных вакцин.

НВсАg состоит, в среднем, из 200 идентичных белковых субъединиц размером 21 кДа,

которые обладают способностью самоорганизовываться в коровую частицу. Стоит

также отметить качества HBcAg, удобные для биотехнологических работ: высокий

уровень экспрессии гена HВcAg и правильная самосборка в коровые частицы

природной формы в различных системах экспрессии (как прокариотических, так и

эукариотических). При этом самосборка НВс-белка в вирусоподобные частицы

возможна при отсутствии других вирусных компонентов и не требует процессинга.

Для встройки в HBcAg были выбраны имитаторы эпитопа, узнаваемые антителом

VRC01, которое способно нейтрализовать широкий спектр изолятов ВИЧ-1 разных

субтипов. Эпитоп, узнаваемый данным антителом, перекрывается с областью CD4bs

поверхностного белка gp120 ВИЧ-1 и сформирован дискретным набором

аминокислотных остатков, т.е. является конформационным. Ранее с помощью

аффинной селекции из библиотек бактериофагов были отобраны фаговые клоны,

экспонирующие на своей поверхности пептиды, специфично связывающиеся с VRC01.

Пептиды, входящие в состав фаготопов, которые обладали наибольшей аффинностью к

VRC01, было решено использовать для встраивания в HBcAg. В качестве вектора,

несущего ген С, была использована плазмида рUСНВс. Встройку олигонуклеотидов,

кодирующих пептиды-имитаторы ВИЧ-1, проводили в область, соответствующую 81

а.о. НВсАg, (район главной антигенной детерминанты кора е1). Наличие

олигонуклеотидных вставок было подтверждено рестрикционным анализом и

секвенированием. Полученные рекомбинантные белки, содержащие пептиды-

имитаторы эпитопа, узнаваемого VRC01, были охарактеризованы в вестерн-блот

анализе и ИФА с использованием моноклональных антител (МКА) VRC01 и МКА к

НВсАg.

Химерные белки на основе НВсАg были наработаны в препаративном количестве и

очищены для проведения иммунизации лабораторных животных с целью оценки их

способности индуцировать ВИЧ-1-нейтрализующие антитела. С помощью ИФА было

показано наличие антиген-специфических антител в сыворотках иммунизированных

животных. Планируется исследование вируснейтрализующей активности сывороток.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 14-14-00660.

125

УЧАСТИЕ УРОКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ И В

РЕГУЛЯЦИИ ВЫЖИВАЕМОСТИ НЕЙРОНОВ

Рысенкова К.Д.*, Климович П.С., Семина Е.В., Рубина К.А., Ткачук В.А.

ФГБОУ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия


Активация урокиназной системы, которая включает в себя сериновую протеазу

урокиназу (uPA) и урокиназный рецептор (uPAR), обеспечивает ремоделирование

внеклеточного матрикса при регенерации сосудов и нервов. Связываясь на

поверхности клеток с uPAR, uPA активирует плазминоген, запуская каскад

протеолитических реакций, что приводит к локальному разрушению белков

внеклеточного матрикса и высвобождению связанных в матриксе факторов роста, а

также активирует внутриклеточную сигнализацию, стимулируя миграцию и

пролиферацию клеток. В регуляции направленного роста аксонов участвуют

навигационные молекулы, рецепторы хемокинов и факторов роста, экспрессируемые

на конусе растущего аксона. На сегодняшний день урокиназную систему относят к

навигационным молекулам, она участвует в процессах морфогенеза при регенерации

нервов, однако ее роль в дифференцировке и выживаемости нейронов до конца не

ясна.

В данной работе мы исследовали влияние uPAR на активацию внутриклеточной

сигнализации, дифференцировку и выживаемость клеток нейробластомы Neuro2a.

Дифференцировка Neuro2a в нейроны достигалась культивированием клеток в среде с

пониженным содержанием сыворотки. Оказалось, что экспрессия uPAR зависит от

времени инкубации в дифференцировочной среде: чем дольше по времени

происходила дифференцировка клеток в нейроны, тем выше была экспрессия uPAR.

Максимальная экспрессия uPAR отмечалась через 72 ч. после индукции

дифференцировки и достигала разницы в 50% по сравнению с исходным уровнем

экспрессии. uPAR на мембране нейронов со-локализовался с рецептором

эпидермального фактора роста (EGFR), одним из важнейших маркеров

дифференцировки, при этом при гиперэкспрессии uPAR увеличивалась его со-

локализация с EGFR. Мы предположили, что uPAR играет важную роль в

дифференцировке нейронов. Известно, что для поддержания дифференцированного

состояния нейронов важен высокий уровень фосфорилирования EGFR. Маркером

дифференцировки нейронов является ядерный белок NeuN. Несмотря на то, что

экспрессия uPAR не влияла на экспрессию белков EGFR и NeuN, тем не менее

блокирование физиологической активности uPAR антителами приводило к быстрому

снижению уровня фосфорилирования EGFR (уже через 5 мин.), а на более отдаленных

сроках подавляло экспрессию NeuN (через 24 ч). Кроме того, блокирование uPAR

активировало EGFR-зависимую внутриклеточную сигнализацию в нейронах с

участием МАР киназы p38 и киназы Akt, а также снижало фосфорилирование киназы

Erk1/2. Поскольку известно, что сигнализация в нейронах с участием р38, Atk и Erk1/2

влияет на жизнеспособность клеток и стимулирует апоптоз, мы оценивали

пролиферацию и деградацию ДНК в дифференцированной Neuro2a. Оказалось, что

блокирование uPAR приводит к почти 4-х кратному снижению пролиферации клеток.

При изучении механизма этого явления было обнаружено, что снижение

пролиферации сопровождается разрушением ДНК и ограниченным протеолизом

фермента PARP-1 с появлением фрагмента 89 кДа, свидетельствующего об

апоптотической гибели клеток.

126

Таким образом, в данном исследовании впервые показана роль uPAR в поддержании

дифференцированного состояния нейронов. Мы обнаружили, что выживаемость

нейронов зависит от активности uPAR, который поддерживает нейроны в

дифференцированном состоянии, как на уровне регуляции внутриклеточной

сигнализации, так и на уровне экспрессии маркеров дифференцировки. Блокирование

uPAR снижает пролиферацию нейронов и индуцирует в них апоптоз.

127

ИССЛЕДОВАНИЕ УФ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПАПАИНА

Сазыкина С.М.*, Холявка М.Г., Артюхов В.Г.

Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия


Папаин (КФ 3.4.22.2) — протеолитический фермент, содержащийся в плодах папаи.

Энзим относится к цистеиновым протеазам. Молекулярная масса — 23 кДа. Молекула

фермента состоит из 212 аминокислотных остатков, где N-концевым остатком является

изолейцин, C-концевым остатком — аспарагин. Он находит широкое применение в

медицине, пищевой промышленности (например, создание на их основе

антигельминтных препаратов, используется при заболевании желудочно-кишечного

тракта, обладает ранозаживляющими свойствами). Учитывая важную роль

протеолитических ферментов в процессах белкового обмена в клетках растений,

изучение механизма действия УФ-света на биосистемы остается актуальной задачей и

позволяет выявить механизмы деструктивно-модифицирующего, регуляторного и

лечебно-профилактического эффекта УФ-излучения. Цель работы — изучить процессы

УФ-индуцированных изменений функциональных свойств папаина.

В качестве объекта исследования нами был выбран папаин фирмы Sigma. Определение

количества белка в препаратах и их активности осуществляли модифицированным

методом Лоури. УФ-облучение растворов белков проводили в дозах 151, 453, 755, 1510,

3020, 4530 и 6040 Дж/м2.

Установлено, что при УФ-облучении папаина в дозе 453 Дж/м2 наблюдается

уменьшение активности фермента на 32% по сравнению с контрольным образцом. При

дальнейшем повышении дозы облучения, энзим сохранял свою активность на

относительно постоянном уровне. Обсуждается механизм реализации описанных

эффектов действия УФ-света.

Список литературы

1. Холявка М.Г., Нарожная М.Н., Останкова И.В., Артюхов В.Г. Исследование УФ-

индуцированных изменений структурно- функциональных свойств инулиназ //

Радиационная биология. Радиоэкология. 2015. Т. 55, № 4. С. 436-441.

2. Артюхов В.Г. Биофизика / учебник для вузов – Москва: Академический Проект;

Екатеринбург: Деловая книга, 2009. – 294 с.

3. Mayur G. Sankalia. Papain Entrapment in Alginate Beads for Stability Improvement and

Site-Specific Delivery: Physicochemical Characterization and Factorial Optimization

Using Neural Network Modeling / Mayur G. Sankalia et al. // AAPS PharmSciTech, 2005.

№ 6 (2). p. 209-222.

128

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК МИКРОГЛИИ НА ИЗМЕНЕНИЕ

ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ В ТРАВМИРОВАННОМ СПИННОМ МОЗГЕ

КРЫС

Санатова Э.Р.*, Салафутдинов И.И., Романова Ю.Р., Лайков А.В., Мухамедшина Я.О.

ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань, Россия


Актуальность. Травматическое повреждение спинного мозга запускает целый каскад

неблагоприятных реакций, включающих апоптоз, окислительный стресс, изменения в

метаболизме, дезинтеграцию цитоскелета и прочее. Существует множество белков,

реагирующих на травму спинного мозга (ТСМ), и знание их влияния на указанные

выше процессы представляет особый интерес для прогнозирования возможности

посттравматической регенерации. Исследования временных и количественных

изменений в белковом профиле травмированного спинного мозга при применении

различных терапевтических подходов для регенерации спинного мозга дает нам

возможность оценить их эффективность.

Цель исследования — оценить влияние однократной трансплантации в область

повреждения генетически модифицированных клеток микроглии на изменение

биосинтеза белковых продуктов в травмированном спинном мозге.

Материалы и методы. Для оценки протеомного профиля белков в травмированной

ткани проводили дозированную контузионную ТСМ крысы (порода Wistar, самцы) на

уровне Th8. Сразу после нанесения повреждения опытным крысам (n=6) вводили

клетки микроглии, трансдуцированные Ad5-EGFP (1 млн в 5 мкл DPBS), в область

травмы при помощи гамильтоновского шприца (Sigma). Животным контрольной

группы (n=6) после нанесения травмы трансплантацию клеток не проводили. Через 30

суток после нанесения травмы животных наркотизировали и забирали фрагмент СМ в

области повреждения. Аналогичным образом забирали материал от интактных

животных той же породы, пола и веса. В исследовании использовали разностный

двумерный гель электрофорез (2D DIGE) для разделения белков ткани мозга,

отдельные, вариабельные белковые пятна вырезались, трипсинизировались и

картировались (peptide mass fingerprinting) с использованием масс-спектрометра ultrafle

Xtreme MALDI-TOF/TOF (Bruker).

Результаты. После окраски гелей азотнокислым серебром выявлено порядка 520

белковых пятен в каждом геле, полученном из образцов интактного и травмированного

спинного мозга (контрольная группа). В ходе анализа вырезанных и

трипсинизированных белковых пятен с использованием масс-спектрометрии

идентифицировано 45 белков, имеющих как повышенную, так и пониженную

концентрацию в области ТСМ при сравнении с интактным спинным мозгом. Оценка

изменения протеомного профиля травмированного спинного мозга крыс на фоне

трансплантации клеток микроглии показала изменения в экспрессии 120 белков, из

которых было идентифицировано 11 белков, экспрессия которых повышается, и 14

белков, имеющих противоположный тренд в области травмы на 30 сутки.

Выводы. В посттравматическом периоде на 30 сутки наблюдаются изменения в

экспрессии белковых продуктов как оказывающих положительное влияние на исход

травматических повреждений, так и отрицательное. При применении клеточной

терапии (клетки микроглии) наблюдается повышение экспрессии белков регенерации и

понижение экспрессии белков деградации нервной ткани.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (МК-4020.2015.7).

129

ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИОННО-

МОДИФИЦИРОВАННЫХ НИКЕЛИД-ТИТАНОВЫХ

САМОРАСШИРЯЮЩИХСЯ СТЕНТОВ С ПЕРИФЕРИЧЕСКИМИ СОСУДАМИ

В ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ У ЖИВОТНЫХ

Сергеевичев Д.С.1*

, Лотков А.И.2, Чепелева Е.В.

1, Козырь К.В.

1, Коробейников А.А.

1,

Кашин О.В.2, Байструков В.И.

1, Зубарев Д.Д.

1, Кретов Е.И.

1

1 ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, Новосибирск,

Россия

2 ФГБУН Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, Россия


Внутрисосудистое стентирование артерий при атеросклеротическом поражении

является одним из самых часто выполняемых вмешательств в сердечно-сосудистой

хирургии на сегодняшний день. Большинство стентов изготавливают из различных

сплавов нержавеющей стали, применяют также и другие металлы: тантал, нитинол —

сплав никеля и титана. Разработка и изучение свойств стентов с улучшенными

свойствами из различных материалов с новыми видами покрытий являются важной

задачей современной науки. В данной работе изучали структуру и свойства

саморасширяющихся стентов из никелида титана, подвергнутых плазменно-

иммерсионной ионной модификации кремнием, а также оценивали биосовместимость

при имплантации стента в организм экспериментальных животных (мини-свиней).

В пилотном эксперименте исследовали 2 группы животных по 3 мини-свиньи в каждой:

опытной группе в общую сонную артерию имплантировали экспериментальный

образец стента из никелида титана, модифицированный кремнием, контрольной группе

— коммерчески доступный аналог из нитинола без обработки. Эндоваскулярную

имплантацию проводили миниинвазивным способом с помощью сосудистого доступа

через бедренную артерию под ренгеноскопическим контролем. Через 3 месяца после

оперативного вмешательства животным выполняли контрольную артериографию и

ультразвуковое исследование для оценки гемодинамики в области имплантации.

В ходе пилотного исследования было установлено, что у животных, которым был

имплантирован стент с модифицированным покрытием, скорость потока в артерии и

градиент давления в проксимальной зоне имплантации были ниже, чем у контрольной

группы. Можно сделать вывод, что иммерсионно-плазменная обработка никелид-

титановых стентов в большей степени способствует сохранению проходимости

периферических сосудов, чем использование обычных нитиноловых стентов.

Работа выполнена при финансовой поддержке проекта ФЦП № 14.578.21.0118,

уникальный идентификатор проекта RFMEFI 57815X0118.

130

SIRT1 И PPARΓ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МИШЕНИ РЕГУЛЯЦИИ

ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА МАКРОФАГОВ

Стафеев Ю.С.1,2*

, Юнусова В.А.1,2

, Меньшиков М.Ю.1, Парфенова Е.В.

1,2

1 Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва, Россия

2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия


Макрофаги представляют собой клетки миелоидной линии, для которых характерна

высокая гетерогенность и пластичность. Одним из свойств, обуславливающих

пластичность макрофагов, является их способность к изменению фенотипа в

провоспалительном (М1) и противовоспалительном (M2) направлениях. Многие

заболевания (ожирение, атеросклероз и др.) связаны с развитием латентного

воспаления, которое обусловлено привлечением макрофагов в ткань и их поляризацией

по М1-фенотипу, поэтому поиск мишеней для изменения соотношения М1 и М2

макрофагов в тканевых популяциях является важной научной задачей.

В нашей работе была проведена поляризация макрофагов RAW264.7 по М1- и М2-

фенотипу по стандартной методике (с использованием бактериального

липополисахарида (50 нг/мл) и интерферона γ (20 нг/мл) (М1-стимуляция) и с

использованием интерлейкина-4 (50 нг/мл) (М2-стимуляция)). Полученные популяции

охарактеризованы морфологически и с использованием ПЦР в реальном времени. В

ходе работы была оценена экспрессия генов-маркеров TNFα, CXCL11, специфических

для М1-макрофагов, и генов-маркеров IGF-1, ALOX15, специфических для М2-

макрофагов. В качестве активатора PPARγ использовали препарат группы

тиазолидиндионов розиглитазон, а в качестве активатора сиртуина 1 типа (SIRT1) —

новый синтетический активатор DCHC (3-(2,4-дихлорфенил)-7-гидрокси-4Н-хромен-4-

он). Методом МТТ выявили рабочую концентрацию используемых лигандов, провели

поляризацию макрофагов в присутствии лигандов и охарактеризовали полученные

популяции методом ПЦР в реальном времени по экспрессии генов-маркеров,

указанных выше.

В ходе работы было показано, что розиглитазон и DCHC не оказывают значимого

влияния на жизнеспособность клеток линии RAW264.7. В ходе характеристики

поляризованных макрофагов показано, что М1-макрофаги, поляризованные в

присутствии DCHC и розиглитазона, обладают сниженным уровнем экспрессии

провоспалительных маркеров (TNFα, CXCL11), а также обладают повышенным

уровнем экспрессии противовоспалительных маркеров (IGF-1, ALOX15), что

согласуется с данными литературы о ингибиторном воздействии сиртуина 1 типа, а

также транскрипционного фактора PPARγ на основной воспалительный

транскрипционный фактор NF-kB. Таким образом, сиртуин 1 типа и PPARγ являются

перспективными мишенями для создания противовоспалительной терапии, которая

может применяться в формате комбинированной терапии для лечения заболеваний,

сопряженных с латентным воспалением.

Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-07840.

131

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ САЙТОВ 2’-О-МЕТИЛИРОВАНИЯ РНК ДЛЯ

ПРИМЕНЕНИЯ В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Степанов Г.А.1*

, Журавлев Е.С.1,2

, Филиппова Ю.А.1, Тикунов А.Ю.

1, Кулигина Е.В.

1,

Семенов Д.В.1, Рихтер В.А.

1

1 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,




Зрелые формы разных классов РНК эукариот содержат в своем составе

многочисленные модифицированные по азотистым основаниям или остатку рибозы

«неканонические» нуклеотиды. Пост-транскрипционные модификации некодирующих

РНК важны для формирования «правильной» пространственной структуры молекул

РНК и межмолекулярных взаимодействий и, в дальнейшем, для функционирования

сложных надмолекулярных комплексов. Недавние исследования показали, что глубина

модификации нуклеотидов в составе как мРНК, так и нкРНК может носить

динамический характер (Chan et al., 2010; Zhou et al., 2015). Одной из наиболее

распространенных модификаций нуклеотидов нкРНК является метилирование по 2’-O-

положению рибозы. В частности, в структуре рибосомных РНК человека известно

порядка 100 консервативных сайтов 2’-O-метилирования.

Метод терминации обратной транскрипции является одним из наиболее часто

используемых подходов к выявлению 2’-О-метилированных нуклеотидов в

протяженных РНК. Стандартная методология предполагает проведение реакции

обратной транскрипции с радиоактивно меченным праймером и разделение кДНК-

продуктов в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией.

В настоящей работе было предложено два варианта модификации данного метода с

целью разработки подходов к количественной оценке глубины 2’-O-метилирования

отдельных нуклеотидов в составе протяженных РНК. Во-первых, была проведена

адаптация метода к использованию 5’-флуоресцентно меченных праймеров с

последующим анализом продуктов терминации обратной транскрипции на

автоматическом ДНК-анализаторе (Филиппова Ю.А. и др., 2015). Предложенный

подход позволяет не только выявлять сайты, но и проводить относительную оценку

глубины 2’-O-метилирования, таким образом получая более полную информацию о

распределении модифицированных мономеров в структуре протяженных участков (до

300-500 н.) РНК-матрицы. Во-вторых, был предложен подход двухстадийной ОТ-ПЦР

в режиме реального времени с «повышенной» (>1,0 мМ) концентрацией дНТФ на

первой стадии, позволяющий определять глубину 2’-O-метилирования отдельных

нуклеотидов в составе РНК-матрицы. С использованием такого подхода была

проведена оценка глубины модификации нескольких природных сайтов 2’-O-

метилирования 28S и 18S рРНК человека: G1490 18S рРНК, C3820 и С4506 28S рРНК.

Оба разработанных подхода исключают необходимость проведения рутинных стадий

секвенирующего электрофореза в полиакриламидном геле и радиоавтографии, что

расширяет возможности использования методов выявления сайтов 2’-O-метилирования

РНК в биомедицинских исследованиях. Возможность количественной оценки глубины

пост-транскрипционных модификаций РНК открывает новые перспективы для

характеризации клеточных моделей и диагностики заболеваний человека.

Работа поддержана грантами РФФИ № 16-04-01414, №16-34-60136 и Стипендией

Президента РФ молодым ученым (2063.2015.4).

132

ИЗМЕНЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГИПОКСИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ CoCl2

Сульдина Л.А.1*

, Захарова И.С.1, Стригина Е.В.

2, Шевченко А.И.

1, Киселева Е.В.

1

1 Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия



Влияние гипоксии на поддержание плюрипотентности эмбриональных стволовых

клеток (ЭСК) является одним из актуальных вопросов клеточных технологий. На

ранних этапах гипоксии подавляется О2-зависимый протеолиз, и происходит активация

белка HIF1α (Semenza, 2001), выступающего регулятором транскрипции множества

генов, в том числе кодирующих митохондриальные белки (Hwang et al, 2015). В

настоящей работе с помощью методов электронной микроскопии и морфометрического

анализа исследовано влияние СоСl2 (50 мкмоль/л), стабилизирующего белок HIF1α, на

общую морфологию ЭСК человека (линия HuES9) и структурную организацию

митохондрий на разных этапах инкубации (0, 1, 2, 3 пассажи). В исходных ЭСК с

типичной для плюрипотентных клеток организацией выявлено 2 типа сгруппированных

вблизи ядер митохондрий: с плотным (19% органелл) и светлым (81%) матриксом,

популяция которых состояла из двух групп органелл, отличающихся по содержанию

узких и расширенных крист. На 0 пассаже (2 дня культивирования в присутствии

СоСl2) в клетках отмечалось более дисперсное расположение митохондрий и

возрастало число аутофагических вакуолей. На последующих (1-3) пассажах

увеличивалась плотность ядрышек, количество мелких прозрачных пузырьков и

коротких цистерн шероховатого и гладкого ЭПР, возрастала активность аппарата

Гольджи, что указывало на начальные этапы дифференцировки клеток (Park et al.,

2004). Анализ динамики структурной организации митохондрий показал, что на 0

пассаже плотные митохондрии практически исчезали. В популяции светлых

митохондрий доля органелл, содержащих преимущественно тонкие кристы,

увеличивалась по сравнению с 52% в контроле до 79%, а на последующих (1, 2, 3)

пассажах уменьшалась и составляла 77%, 53% и 33% соответственно. Численная

плотность узких крист в митохондриях на 0 пассаже увеличивалась, а расширенных

уменьшалась в 1,3 раза по сравнению с контролем. К 3 пассажу численная плотность

тонких крист в митохондриях снижалась в 2 раза, что позволяет предполагать

увеличение их функциональной активности (Perkins, Elisman, 2011). Относительный

объем крист в митохондиях уменьшался в 1,5 раза по сравнению с контролем на 0

пассаже и на последующих не изменялся. Поверхностная плотность крист в

митохондриях оставалась постоянной на всех пассажах. Было выявлено 3 типа

структурных дефектов митохондрий: выпячивание оболочки, нарушение строения

крист, появление разреженных участков в матриксе. На 0 пассаже число митохондрий с

нарушенной структурой снижалось и повышалось на последующих этапах

культивирования.

Таким образом, кратковременное (2 дня) воздействие гипоксии, вызванной инкубацией

с CoCl2, снижает гетерогенность популяции митохондрий в ЭСК человека,

поддерживает их морфологию, специфичную для неактивного состояния, а также

уменьшает частоту возникновения структурных нарушений. Более длительное

воздействие гипоксии вызывает появление признаков начинающейся

дифференцировки.

Работа поддержана бюджетным финансированием проект №0324-2015-003.

133

ВЛИЯНИЕ ЛИЗАТА ТРОМБОЦИТОВ И ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ

ПЛАЗМЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И МИГРАЦИЮ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО

ВРЕМЕНИ

Суровцева М.А.*, Бондаренко Н.А., Лыков А.П., Ким И.И., Повещенко О.В.

ФГБНУ НИИКЭЛ, Новосибирск, Россия


Введение. Обогащенная тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma, PRP) является

аутогенным источником факторов роста. При активации тромбоцитов (лизис

мембраны, ионами кальция, тромбином) из альфа-гранул высвобождается большое

количество ростовых факторов (PDGF, IGF, EGF, TGF, HGF и др.), которые оказывают

влияние на функциональные свойства мультипотентных мезенхимальных стволовых

клеток (ММСК). ММСК являются привлекательным источником клеток для

регенеративной медицины, потому что эти незрелые клетки присутствуют во многих

органах и тканях организма. Цель исследования — оценить влияние PRP и лизата

тромбоцитов на пролиферативную и миграционную активность ММСК костного мозга

(КМ-ММСК) крысы в режиме реального времени. Материалы и методы. КМ-ММСК

получали из клеток костного мозга бедренных костей крыс породы Wistar по

стандартной методике и культивировали в стандартных условиях. Обогащенную

тромбоцитами плазму получали из периферической крови здоровых доноров после

центрифугирования в специальных пробирках (Plasmolifting™) на центрифуге Ева-200

(Hettich, Германия) в режиме 3800 об/мин 6 минут. Из обогащенной тромбоцитами

плазмы готовили лизат тромбоцитов путем двукратного замораживания (-700С) –

быстрого оттаивания (+370С). Пролиферативную и миграционную активность ММСК

изучали на аппарате xCELLigence System (Roche, США), который позволяет в режиме

реального времени оценить функциональную активность клеток. Результаты

представлены клеточным индексом (КИ). Собственные результаты. КМ-ММСК под

влиянием PRP и лизата тромбоцитов начинают адгезироваться к поверхности планшета

и пролиферировать уже в первые часы эксперимента (3-6 часов). К 12 ч. эксперимента

спонтанная пролиферативная активность КМ-ММСК была выше (p=0,03) по сравнению

с пролиферацией клеток в присутствии PRP и лизата тромбоцитов. Через 18 ч.

эксперимента показатели спонтанной и в присутствии PRP пролиферативной

активности становятся практически одинаковыми (КИ=0,17 и КИ=0,18,

соответственно). К концу эксперимента пролиферативная активность КМ-ММСК

статистически значимо увеличилась под действием PRP (КИ=0,2, p=0,03) по сравнению

со спонтанной пролиферацией (КИ=0,14) и пролиферацией в присутствии лизатов

тромбоцитов (КИ=0,07). Отмечено, что к 15 ч. эксперимента миграционная активность

КМ-ММСК увеличивалась в присутствии лизатов тромбоцитов (КИ=0,22, p=0,02) по

сравнению с контролем (КИ= -0,03) и PRP (КИ=0,01). При этом к 21 ч. эксперимента

миграционная активность КМ-ММСК в присутствии лизатов тромбоцитов и PRP была

одинаковой (КИ=0,32), что статистически значимо выше по сравнению с показателями

в контроле (КИ=0,02, p=0,03). К концу эксперимента отмечена тенденция того, что

миграционная активность КМ-ММСК увеличилась под действием PRP (КИ=0,39), что

сопоставимо с действием лизатов тромбоцитов (КИ=0,34). Таким образом, было

выявлено, что на пролиферативную активность КМ-ММСК наибольшим

стимулирующим действием обладает PRP. В свою очередь, на миграционную

активность КМ-ММСК большим стимулирующим эффектом обладают и PRP, и лизат

тромбоцитов, который, в свою очередь, способствует стимуляции миграции клеток в

более ранние сроки, начиная с 9 ч. эксперимента.

134

РОЛЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ

ФИБРОБЛАСТОВ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Суховских А.В.*, Григорьева Э.В.

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики,




Рак предстательной железы — одна из самых распространенных причин смертности от

онкологических заболеваний у мужчин, что часто связано с крайне агрессивным

течением заболевания и быстрым метастазированием опухоли. В связи с этим поиск

молекулярных маркеров рака предстательной железы является актуальной задачей. В

последние годы все более очевидной становится роль микроокружения опухоли,

молекулярные компоненты которого могут служить как диагностическими или

прогностическими маркерами, так и мишенями для таргетной терапии. Цель данной

работы — изучение роли молекул межклеточных контактов во взаимодействии

опухолевых клеток предстательной железы человека с фибробластами в

экспериментальной системе in vitro. Были использованы иммортализованные

фибробласты человека, нормальные эпителиальные клетки предстательной железы

человека PNT2 и гормон-независимые метастазирующие опухолевые клетки PC3. Уровень экспрессии 84 генов, вовлеченных в различные типы межклеточных контактов

(фокальные, плотные, щелевые, адгезивные контакты, десмосомы, полудесмосомы), с

использованием Finder array был определен в нормальных и опухолевых клетках

предстательной железы и фибробластах до и после совместного культивирования c

помощью Human Cell Junction Pathway. Совместное культивирование нормальных

клеток предстательной железы PNT2 с фибробластами не приводит к значительным

изменениям транскрипционной активности генов межклеточных контактов, что

согласуется с визуальным отсутствием конфронтации между этими типами клеток.

Однако в клетках PC3 после совместного культивирования с фибробластами

происходит увеличение экспрессии генов, отвечающих за различные типы

межклеточных контактов, в особенности фокальные контакты, плотные соединения и

адгезивные контакты. В свою очередь, нормальные и опухолевые эпителиальные

клетки предстательной железы оказывали значительное влияние на фибробласты в

плане транскрипционной активности генов, вовлеченных в поддержание межклеточных

контактов, и это воздействие было прямо противоположным. После культивирования с

нормальными клетками PNT2 в фибробластах наблюдается повышение уровня

экспрессии генов, вовлеченных в фокальные контакты, адгезивные контакты и, в

наибольшей степени, плотные контакты. Напротив, совместное культивирование с

опухолевыми клетками PC3 приводило в фибробластах к селективному подавлению

экспрессии генов, участвующих в фокальных, адгезивных и плотных контактах. Таким

образом, представленные данные свидетельствуют, что опухолевые клетки

предстательной железы человека способны значительно подавлять транскрипционную

активность генов, вовлеченных в поддержание межклеточных контактов, в

прилегающих фибробластах, что может приводить к нарушению контактного

торможения и способствовать ускоренной пролиферации опухолевых клеток. Такое

снижение экспрессии ключевых молекул межклеточных контактов в клетках

опухолевого микроокружения может быть использовано в качестве потенциального

диагностического и/или прогностического биомаркера для диагностики и таргетной

терапии данного типа рака.

135

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЦИТОХРОМА Р450 CYP1A1 (ILE462VAL) У

ПОТОМКОВ СМЕШАННЫХ БРАКОВ ТУНДРОВЫХ НЕНЦЕВ С РУССКИМИ

Табиханова Л.Э.1*

, Осипова Л.П.1,2

, Чуркина Т.В.1, Воронина Е.Н.

2,3, Филипенко М.Л.

2,3

1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный


Российской академии наук», Новосибирск, Россия

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего

образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный

университет», Новосибирск, Россия


биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии



В среду обитания человека попадают новые химические вещества (ксенобиотики),

многие из которых являются потенциальными канцерогенами и мутагенами. В связи с

этим они могут рассматриваться в качестве серьезных факторов, способствующих

развитию ряда онкологических и других мультифакториальных заболеваний.

Важнейшую роль в защите организма от этих вредных веществ играют ферменты

системы биотрансформации ксенобиотиков, в том числе семейство цитохромов Р450

(CYP). В данной работе был исследован полиморфизм гена цитохрома Р450 CYP1A1 —

вариант CYP1A1*2С (Ile462Val, rs1048943). В результате этой замены активность

фермента повышается в два раза, что приводит к накоплению реактивных

интермедиатов и резко увеличивает возможность мутационных изменений ДНК и

химически индуцируемого канцерогенеза. Исследования распространенности варианта

CYP1A1 462Val проведены во многих мировых популяциях, в том числе и у коренных

жителей Сибири: нганасан Таймыра и тундровых ненцев Ямало-Ненецкого АО (Тийс и

др., 2016). Было показано, что у ненцев частота аллеля CYP1A1 462Val равна 23,8 %,

что достоверно выше (p<0,001), чем в выборке русских Северной Сибири — 5,8 %.

Довольно широкое распространение данного варианта у аборигенов Сибири указывает

на наличие популяционного риска развития заболеваний, в патогенезе которых может

принимать участие CYP1A1*2С (Ile462Val, rs1048943), особенно в связи с

усиливающимся промышленным загрязнением среды обитания. В настоящее время

наблюдается увеличение числа браков между коренными жителями Сибири и пришлым

населением, поэтому изучение у метисов полиморфизма генов ферментов системы

биотрансформации ксенобиотиков представляется актуальным. Нами изучено 155

потомков 1-го и 2-го поколений от смешанных браков ненцев с русскими.

Генотипирование проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени с

использованием конкурирующих TaqMan-зондов. Частота варианта 462Val в метисной

выборке составила 18,7%. Таким образом, генофонд потомков смешанных браков

ненцев с русскими отличается от родительских популяций, и в настоящей выборке

можно предположить понижение риска развития ряда заболеваний, ассоциированных с

изучаемым вариантом Ile462Val гена цитохрома Р450 CYP1A1.

Поддержано программой Сибирского отделения РАН II.2. № 0324-2015-0033.

Тийс Р.П., Осипова Л.П., Чуркина Т.В. и др. Полиморфизм гена цитохрома Р450

CYP1A1 (ILE462VAL) в популяциях тундровых ненцев Ямало-Ненецкого автономного

округа, нганасан Таймыра и русских Сибири. Вавиловский журнал генетики и

селекции. 2016; 20(1):16-22. DOI 10.18699/VJ16.102

136

ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ ОТОТОКСИЧЕСКОЙ ПОТЕРИ СЛУХА, ПРИ

НАЗНАЧЕНИИ АНТИБИОТИКОВ ИЗ ГРУППЫ АМИНОГЛИКОЗИДОВ,

ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ГИСТОННОЙ ДЕАЦЕТИЛАЗЫ

Донковцева Е.С., Ташметов Э.Р.*, Лялина Е.И.

Карагандинский государственный медицинский университет, Караганда, Республика

Казахстан


Распространенность потери слуха в зарубежных странах и в странах СНГ в настоящее

время по разным оценкам составляет в среднем 1 случай на 5 человек в возрасте старше

12 лет [Павлюшина, 2007; Liu, 2012].

Аминогликозиды являются одними из наиболее часто используемых антибиотиков во

всем мире несмотря на серьезные побочные эффекты, такие как ототоксичность и

нефротоксичность, возникающие при лечении аминогликозидами. Воздействие

аминогликозидов приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий и

активации каспазы, что позволяет предположить, что волосковые клетки внутреннего

уха подвергаются каспаза-опосредованной гибели [Chen, 2009]. Кроме того,

аминогликозиды, действуя на волосковые клетки, повышают деацетилирование

гистонов путем рекрутирования гистондеацетилаз (HDACs) в хроматин [Абакаров,

2005; Huangfu, 2008; Kim, 2010].

Ингибиторы широкого спектра, а также HDAC-специфические ингибиторы в известной

степени в зависимости от концентрации обладают защитными свойствами, что было

изучено на примере экспериментальной модели воспаления, нейродегенерации и

окислительного стресса [Layman, 2015; Lin, 2011; Liu, 2012]. Однако изучение

ингибиторов HDAC в системе внутреннего уха у млекопитающих ограничено за счет

неспособности их проникать через гемато-лабиринтный барьер и вызывать

ототоксичность.

В отчете, опубликованном в Cell Death Discovery, были приведены экспериментальные

данные системного применения ингибитора HDAC и субероиланилид гидроксамовой

кислоты (SAHA), которые показали эффективность прохождения гемато-лабиринтного

барьера и безопасность влияния на порог слуха у взрослых мышей [Robert, 2012]. .При

системном лечении SAHA была зарегистрирована практически полная защита

волосковых клеток внутреннего уха от острого ототоксического повреждения

(канамицин + фуросемид). Интересно, что лечение SAHA коррелирует с

ацетилированием RelA K310 и локализацией RelA в ядре волосковых клеток, которые

обычно отсутствуют при лечении аминогликозидами. Ацетилированный RelA K310 в

ядрах волосковых клеток вызывает активацию NF-kB пути, приводящую к экспрессии

генов про-выживаемости, таких как Cflar (cFLIP) и Bcl2l1 (Bcl-XL) [Robert, 2012].

Согласно другим нейропротекторным исследованиям, экспрессия генов CDKN1A (p21)

и Hspa1a (Hsp70) также была увеличена в организме мышей с применением SAHA. В

то же время экспрессия гена Bcl2l11 про-апоптоза (BIM) была значительно снижена

[Robert, 2012]. Также по данным упомянутого исследования, ингибирование HDAC не

способствует регенерации волосковых клеток у взрослых мышей.

Заключение. На сегодняшний день препарат субероиланилида гидроксамовой кислоты

(SAHA) является FDA-одобренным препаратом, его применение в клинической

практике для предотвращения ототоксического действия может быть следующим

шагом на пути защиты органов слуха у людей, особенно в практике педиатрической

службы.

137

РАЗЛИЧИЯ В КОНТРОЛЕ АПОПТОЗНОЙ ГИБЕЛИ ИНФИЦИРОВАННЫХ

МИКОБАКТЕРИЯМИ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

МОДЕЛЯХ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ МЫШЕЙ EX VIVO И IN VITRO

Уфимцева Е.Г.

ФГБНУ НИИ биохимии, Новосибирск, Россия


В настоящее время туберкулез остается одной из значимых проблем здравоохранения

во всем мире. По данным ВОЗ в 2014 г. зафиксировали 9 млн. случаев заболевания

туберкулезом, около 1.5 млн. больных умерло. Прогрессирующее увеличение числа

случаев заражения антибиотико-устойчивыми штаммами Mycobacterium tuberculosis

является отрицательной тенденцией последних лет, требуя развития новых лекарств.

Микобактерии туберкулезного комплекса являются внутриклеточными патогенами

макрофагов человека и животных. Следовательно, необходимо создание моделей

туберкулезной инфекции, наиболее приближенных к организму млекопитающих, для

разработки и тестирования новых антимикобактериальных средств на основе знания

специфики взаимодействий микобактерий с клетками-хозяевами. В настоящее время

гибель макрофагов с локализованными в них микобактериями по механизмам апоптоза

считается одним из основных способов контроля организма человека и животных за

туберкулезной инфекцией, уменьшающей количество патогенных микроорганизмов и

инфицированных ими клеток. Исследование динамики взаимоотношений между

микобактериями и клетками-хозяевами показало их значительное отличие в

гранулематозных воспалительных образованиях мышей в разработанной нами модели

гранулем ex vivo (Ufimtseva, 2013, 2015) по сравнению с обычно используемой в

мировой практике in vitro инфекцией перитонеальных макрофагов и клеток костного

мозга мышей. Макрофаги гранулем мышей с латентной туберкулезной инфекцией

могли контролировать размножение BCG-микобактерий как in vivo, так и в культуре ex

vivo, с сохранением своей жизнеспособности даже при повышенной зараженности

клеток. В макрофагах мышей в течение инфекции in vitro выявили, наоборот,

значительный рост числа BCG-микобактерий, сопровождавшийся повышенной

гибелью клеток-хозяев с морфологическими признаками как апоптоза, так и некроза

(Ufimtseva, 2016). Гранулемы легких, селезенки и костного мозга мышей Balb/c с

латентной BCG-туберкулезной инфекцией проанализировали ex vivo на наличие

индукторов и ингибиторов, а также маркеров апоптозной гибели клеток. В клетках

гранулем при повышенном содержании индуктора апоптоза TNFα, проапоптозных

белков Вах и Ваd, рецептора смерти Fas/CD95 и скэвинджер-рецептора CD36 не

наблюдали ни стабилизации белка P53, ни активации экзекуторной каспазы-3 в

макрофагах и дендритных клетках, как содержавших кислотоустойчивые бактерии, так

их не имевших. Одновременно выявили значительное количество антиапоптозного

белка Bcl-2 в цитоплазме и митохондриях большинства клеток мышиных гранулем, в

отличие от макрофагов культур клеток костного мозга и перитонеального экссудата

мышей, инфицированных BCG-микобактериями in vitro. Вероятно, белок Bcl-2

участвовал в сохранении жизнеспособности клеток гранулем не только в культуре ex

vivo, но и в организме животных при значительном давлении микобактериальных,

провоспалительных и проапоптозных факторов на разных этапах туберкулезной

инфекции мышей. Таким образом, инфицирование клеток мышей в культуре in vitro и

животных in vivo приводит к разному ответу макрофагов на инфекцию. Выявленные

различия нельзя не учитывать при использовании модельных систем туберкулезной

инфекции для тестирования и проверки действия новых антимикобактериальных

лекарственных средств и вакцин.

138

ФОТОКОНТРОЛИРУЕМЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АЗОБЕНЗОЛА И СТИЛЬБЕНА

МОДУЛИРУЮТ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ

НЕОНАТАЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫС

Фролова Ш.Р.*, Гайко О., Цвелая В.А., Агладзе К.И.

Московский физико-технический институт (ГУ), Долгопрудный, Россия


АзоТАБ (азобензол триметиламмоний бромид), производное азобензола, способен

фотоконтролируемо изменять возбудимость культуры клеток неонатальных

кардиомиоцитов. Энергетически устойчивая транс-форма азоТАБа способна подавлять

спонтанную активность и скорость распространения волн возбуждения, в то время как

цис-форма, энергетически менее стабильная, получаемая в результате облучения

транс-азоТАБа мягким ультрафиолетом (λ~365 нм), не оказывает каких-либо видимых

изменений электрических свойств монослоев из неонатальных кардиомиоцитов. В

результате перевода транс-азоТАБа в цис-азоТАБ возбудимость культуры

кардиомиоцитов восстанавливается. Также восстановления возбудимости культуры

кардиомиоцитов можно добиться отмывом азоТАБа от нее. Причем это свойство

азоТАБа является обратимым, и такой цикл может быть повторен несколько раз. С

целью уменьшения токсичности фотоконтролируемого вещества был синтезирован

СТАБ (стильбен триметиламмоний бромид), производное стильбена. СТАБ структурно

абсолютно идентичен азоТАБу, но является производным стильбена. По действию на

культуру кардиомиоцитов в транс- и цис-форме он также подавляет возбудимость

культуры клеток кардиомиоцитов, но при меньшей концентрации. И главное его

отличие также в том, что после перевода транс-СТАБа в цис-форму блокада

возбуждения сохраняется в отличие от транс-азоТАБа. Восстановить возбудимость

культуры клеток возможно только в результате отмыва ее от транс-СТАБа.

Было проведено исследование влияния транс- и цис-форм азоТАБа и СТАБа на

потенциалзависимые ионные каналы, участвующие в формировании потенциала

действия. Целью работы было понять, является ли изменение проводимости

кардиомиоцитов под действием фотоконтролируемых веществ (азоТАБа и СТАБа)

опосредованным через модуляцию потенциалзависимых ионных каналов. Действие

транс- и цис-форм азоТАБа и СТАБа на потенциалзависимые быстрый натриевый

(INav), кальциевый L-типа (ICav) и калиевые (IKv) токи исследовались на

изолированных неонатальных кардиомиоцитах с помощью метода пэтч-кламп в

конфигурации whole-cell. В результате выяснили, что действительно под действием

вышеуказанных веществ быстрый натриевый и кальциевый ток L-типа подавляется, а

вот медленные калиевые токи, наоборот, увеличиваются. Причем полное подавление в

случае азоТАБа происходит при концентрации 100 μМ, а в случае СТАБа при меньшей

концентрации — 60 μМ. По данным исследования токсичности азоТАБа и СТАБа на

кардиомиоциты в нашей лаборатории было выявлено, что токсичность на клетки

СТАБа меньше азоТАБа, и у СТАБа она начинается после 100 μМ.

Результаты подтверждают наше предположение о том, что подавление возбудимости

культуры клеток кардиомиоцитов происходит в результате подавления

потенциалзависимых натриевого и кальциевого токов, которые отвечают за

формирование потенциала действия. Так как процесс этот обратимый, а в случае

СТАБа еще и варьируемый в зависимости от того, какой эффект мы хотим закрепить

(отмыть и восстановить возбудимость культуры клеток кардиомиоцитов или облучить

мягким ультрафиолетом и закрепить блок проводимости в кардиомиоцитах), то эти

вещества представляют интерес, например, для аблации.

139

БЕЗНАТРИЕВЫЕ ВОЛНЫ ВОЗБУЖДЕНИЯ В МОНОСЛОЕ

КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ГИПЕРКАЛИЕМИИ

Цвелая В.А.1*

, Крашенинникова А.В.2, Кудряшова Н.Н.

1, Агладзе К.И.

1

1 Московский физико-технический институт (государственный университет),

Долгопрудный, Россия

2 ФГБУ Центр экспертизы и контроля качества медицинской помощи Минздрава РФ,

Москва, Россия


Ишемия в сердце может приводить к тяжелым последствиям, в том числе и к

фибрилляции желудочков. При ишемии нарушается кровоснабжение, вследствие чего в

пораженной области возникают гипоксия, ацидоз и гиперкалиемия. Возникшая

аритмия, в дальнейшем, приводит к нарушению насосной функции, прогрессированию

ишемии и, как следствие, смерти в течение нескольких минут. В данной работе мы

ограничимся рассмотрением изменений в динамике волн возбуждения с помощью

оптического картирования и компьютерного моделирования при гиперкалиемии,

которая играет решающую роль в первые минуты развития ишемии.

Эксперимент проводился при низком уровне гиперкалиемии, менее 10 мМ калия в

среде, и при высоком уровне гиперкалиемии, более 10 мМ до 20 мМ. В первом случае

наблюдалось резкое падение скорости проведения волны возбуждения. Однако после

10 мМ скорость переставала изменяться. При ишемии такая концентрация калия может

быть достигнута через 10 минут. Таким образом, при большой концентрации калия

ткань все еще проводит электрическое возбуждение, хотя натриевые каналы должны

быть полностью инактивированы. С помощью блокатора натриевых каналов (ТТХ)

также было показано наличие проведения при сильной гиперкалиемии. Эти данные

полностью соответствуют результатам компьютерного моделирования.

Таким образом, мы обнаружили существование безнатриевых волн возбуждения (англ.

excitation waves with calcium-current dominated upstroke) при сильной гиперкалиемии

(более 10мМ К+ во внеклеточной среде) в монослое кардиомиоцитов и подтвердили

инактивацию натриевых каналов при помощи тетродотоксина (ТТХ).

140

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕОАНГИОГЕНЕЗА

В ПЕРИТУМОРОЗНОЙ ЗОНЕ РАКА ПОЧКИ (ПО ДАННЫМ

ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРА ЭНДОТЕЛИЯ CD31)

Черданцева Т.М.1*, Казарцев А.В.1, Бобров И.П.2, Климачев В.В.1, Лазарев А.Ф.2

1 Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул, Россия 2Алтайский филиал РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Барнаул, Россия


В последние годы выявлен целый ряд изменений, происходящих вблизи опухоли при

раке различных локализаций. Показано, что перитуморозная зона (ПЗ) при многих

злокачественных новообразованиях имеет важное биологическое значение. Изучение

изменений тканей, граничащих с опухолью, важно для выявления фоновых процессов,

способствующих развитию опухоли. Именно к этой зоне относится понятие

«опухолевое поле», и в ней начинается рост опухоли, ПЗ также во многом способствует

прогрессии уже возникшей опухоли. Ангиогенез имеет важное значение для роста и распространения рака почки (РП).

Однако при сложившемся мнении о прогностически неблагоприятном значении

активного опухолевого ангиогенеза, влияние развития сосудистого русла в ПЗ на

прогрессию рака почки изучено недостаточно.

Цель работы — исследование неоангиогенеза в ПЗ при раке почки.

Материал и методы. Изучен операционный материал 42 больных раком почки. При

группировке опухолей по клиническим стадиям (Ι-ΙV) было выделено: Ι стадии

(T1N0M0) соответствовали 22 (52,4%) наблюдения; ΙΙ стадии (T2N0M0) — 1 (2,4%)

наблюдение; ΙΙΙ стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) — 8 (19%) и ΙV стадии

(T4N0M0, T4N1M0, TлюбаяN2M1, TлюбаяNлюбаяM1) — 11 (26,2%). Степень

злокачественности опухолей оценивали по Fuhrman S.A. и соавт (1982) [3]. Средний

возраст пациентов составил 57,4±1,4 года. Мужчин было 25 (59,5%), женщин — 17

(40,5%). В 1-ю группу вошли пациенты с опухолями степени злокачественности G1-2 и

отсутствием метастазов. Во 2-ю группу были включены больные со степенями

злокачественности G3-4. Применяли следующие методы исследования:

морфологический, иммуногистохимический CD31 (клон JC70A «DAKO») и

статистический метод. Рассчитывали плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) в

ПЗ в 6 полях зрения при увеличении микроскопа х 400. Статистический анализ

проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0.

Результаты. Сосуды, расположенные вблизи опухоли, не имели мышечной оболочки,

в них отсутствовала дифференцировка на артерии и вены. По данным

иммуногистохимического выявления маркера CD31 в неизмененной ткани почки,

взятой из максимально удаленных от опухоли участков, число микрососудов

колебалось от 12 до 104 (в среднем 47,8±1,3). При этом в неизмененных почках 1-ой

группы больных ПМЦР составила 61,9±1,8%, а во 2-ой группе уменьшалась до

39,9±1,2. ПМЦР в ПЗ на 1-ой группе пациентов составила 23,4±1,7, а во 2-ой группе

достоверно увеличивалось до 43,5±2,4. ПМЦР в ПЗ взаимосвязаны степенью

злокачественности опухоли (r = 0,65). Выводы. Ангиогенез в ПЗ носит патологический характер. Активность ангиогенеза в

ПЗ зависит от свойств опухоли и значительно возрастает в опухолях с

высокозлокачественным потенциалом. ПМЦР в ПЗ коррелировала с важнейшим

прогностическим параметром опухоли, и поэтому она может быть использована в

качестве дополнительного фактора при прогнозировании лечения рака почки.

141

АКТИВАЦИЯ АНТИОКСИДАНТНОГО ОТВЕТА В КЛЕТКАХ

МАКРОФАГАЛЬНОЙ ЛИНИИ J774 ПРИ ИНКУБАЦИИ С ДЕКСТРАНОМ

Чечушков А.В.*, Зайцева Н.С., Кожин П.М., Меньщикова Е.Б., Шкурупий В.А.

Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинический медицины,



Используемые в клинической практике для восполнения объема циркулирующей крови

декстраны в настоящее время обнаруживают новые сферы применения. Так, гидрогели

на их основе демонстрируют выраженную способность стимулировать регенерацию

кожных покровов при терапии ожоговых ран. В то же время благодаря своей

лизосомотропности и медленной скорости катаболизма лизосомальными ферментами

млекопитающих декстраны могут быть использованы в качестве высокомолекулярной

матрицы для конъюгирования с лекарственными соединениями, в частности с

изониазидом при терапии туберкулеза. Однако внутриклеточные события,

ассоциированные с накоплением декстрана, не известны.

Сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE координирует уровень экспрессии генов белков,

участвующих в детоксикации ксенобиотиков, а также антиоксидантной защите клеток.

Кроме того, она существенным образом вмешивается в метаболические процессы,

главным образом, восстанавливая внутриклеточное содержание доноров электронов

(NADH и NADPH), а также оказывает влияние на внутриклеточные репаративные

процессы. Целью данной работы было исследование активации данной сигнальной

системы при эндоцитозе декстрана с молекулярной массой 70 кДа клетками

моноцитарно-макрофагальной лини J774.

Установлено, что эндоцитоз линейного декстрана с массой 70 кДа сопровождается

дозозависимым увеличением ядерной транслокации транскрипционного фактора Nrf2.

Одновременно наблюдается увеличение объема внутриклеточных агрегатов белка

Keap1, являющегося репрессором Nrf2, что указывает на реализацию неканонического

пути активации Nrf2. Анализ экспрессии ARE-зависимых генов демонстрирует

увеличение экспрессии генов Nqo1, Gstp1, Hmox1, что указывает на увеличение

транскрипционной активности Nrf2. Кодируемые этими генами ферменты, NAD(P)H-

хиноноксидоредуктаза 1 и гемоксигеназа 1, играют важную роль в защите клеток от

перекисного окисления липидов мембран, а от активности глутатион-S-трансферазы P1

зависит редокс-потенциал клеток. Функциональная значимость экспрессии этих генов

при эндоцитозе декстрана подчеркивается существенным снижением интенсивности

процессов перекисного окисления липидов, происходящим через 24 ч. после нагрузки

клеток декстраном.

Обнаруженные особенности внутриклеточного ответа на эндоцитоз декстрана

позволяют утверждать, что в дополнение к использованию в качестве средства

лизосомальной доставки лекарственных препаратов он может снижать токсические

эффекты фармакологической терапии, активируя внутриклеточные системы

антиоксидантной защиты. Индукция ARE-зависимых генов при лизосомотропном

воздействии декстрана интересна также тем, что в генах мастер-регуляторов

лизосомального биогенеза TFE3 и TFEB локализованы эволюционно консервативные

регуляторные мотивы ARE, что указывает на связь сигнальной системы

Keap1/Nrf2/ARE и системы лизосомального биогенеза, биологический смысл которой,

в то же время, пока не ясен.

142

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК НА ТЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА:

КРИТИЧЕСКАЯ РОЛЬ КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОК

Шварц Я.Ш.1,2*

, Белогородцев С.Н.3, Филимонов П.Н.

2, Чередниченко А.Г.

2,

Петренко А.Е.2

1 ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины, Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия

3 Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза МЗ РФ,



Одним из перспективных подходов к адъювантному лечению плохо поддающихся

химиотерапии хронических инфекционных заболеваний может стать клеточная терапия

с применением мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Примером такой инфекции

является туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

Существующий опыт применения МСК-терапии при инфекционных заболеваниях в

целом, и при туберкулезной инфекции в частности, крайне ограничен и нуждается в

экспериментальных обоснованиях.

Кондиционирование МСК в культуре может вызывать их фенотипическую

поляризацию с проявлением преимущественно про- или антиинфекционной

активности. В настоящей работе исследовали эффекты трансплантации происходящих

из костного мозга первичных некондиционированных и поли(A:U)-

кондиционированных МСК на течение микобактериальной инфекции in vivo.

Кондиционирование проводили в течение 24 ч. на МСК третьего пассажа препаратом

полудан (лиганд к TLR3 поли(A:U)) в дозе 1 мкг/мл. Мышей BALB/c инфицировали

внутрибрюшинно M. bovis БЦЖ в дозе 1×107 КОЕ, далее двукратно спустя 11 и 12,5

нед. после инфицирования внутривенно вводили по 7×105 МСК и еще через 1,5 нед.

выводили животных из эксперимента. На гистологических срезах легких, печени и

селезенки, окрашенных гематоксилин-эозином и по Цилю-Нильсену, определяли

выраженность неспецифической и специфической гранулематозной инфильтрации и

численность микобактерий, подсчитывали количество КУМ(+) мазков-отпечатков этих

органов, число микобактерия-положительных гомогенатов, инкубированных в системе

BACTEC MGI 960, и число КОЕ, выросших при посеве гомогенатов на среду

Ловенштейна-Йенсена.

Иммуноферментный анализ продукции ИФН-γ, ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-10 и ТФР-β1 в

культуре МСК выявил отчетливое поли(A:U)-индуцированное смещение цитокинового

профиля в провоспалительную сторону. Гистологическое исследование показало, что

некондиционированные МСК вызывали 3-кратный рост количества микобактерий в

гранулемах селезенки, тогда как кондиционированные МСК, наоборот, снижали

количество микобактерий в БЦЖ-содержащих гранулемах. Введение

некондиционированных МСК было ассоциировано с увеличением числа КУМ(+) и

MGIT(+) препаратов, тогда как все препараты от мышей, получавших

кондиционированные клетки, были микобактерия-негативными. Аналогичным

образом, некондиционированные МСК увеличивали количество КОЕ в исследуемых

органах в 1,5-3 раза, в то время как полудан-кондиционированные МСК, наоборот,

снижали численность микобактерий в органах более, чем в 4 раза.

Сделан вывод, что МСК-терапия микобактериальной инфекции и, очевидно, многих

других инфекций может быть эффективной только при целенаправленном

формировании функционального фенотипа МСК.

143

БИОСОКРАТИМЫЕ ТКАНЕВО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МИКРОКОНСТРУКТЫ ДЛЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ АВТОВОЛНОВЫХ ПРОЦЕССОВ В СЕРДЕЧНОЙ ТКАНИ

Шутько А.В.*, Горбунов В.C., Гурия К.Г., Агладзе К.И.

Московский физико-технический институт, Москва, Россия


Современные методы тканевой инженерии позволяют создавать различные модельные

системы, используемые как для исследований биофизических процессов,

развивающихся в сердечной ткани [1], так и в целях создания тест-систем для решения

прикладных медицинских задач [2]. Стремительное развитие методов мягкой

литографии в последние 20 лет существенно расширило возможности по созданию

биосократимых микросистем и устройств [3,4]. Использование такого рода модельных

систем открывает ряд новых возможностей для исследования автоволновых процессов

в сократимых активных средах.

В настоящей работе было реализовано несколько вариантов биосократимых

конструктов на основе сердечной ткани. В качестве полимерной основы для

микроконструктов использовались тонкие пленки из полидиметилсилоксана (ПДМС)

различной конфигурации. На полученные конструкции высевались неонатальные

кардиомиоциты крысы. Затем клетки инкубировались в среде DMEM при 37°С в 5%

атмосфере СО2 до момента формирования конфлюэнтного монослоя и полного

развития сократительного аппарата кардиомиоцитов. На полученных

экспериментальных моделях методами оптического картирования исследовались

задачи распространения волн возбуждения-сокращения в сердечной ткани.

Созданные нами биосократимые микроконструкты представляются перспективными в

качестве прототипов для создания систем микроваскуляризации в тканевой инженерии,

а также для изготовления различных lab-on-chip систем для тестирования

лекарственных средств.

1. Kadota S. et al. Development of a reentrant arrhythmia model in human pluripotent stem

cell-derived cardiac cell sheets. Eur. Heart J. 34, 1147–56 (2013).

2. Benam KH et al., Engineered In Vitro Disease Models. Annu Rev Pathol Mech Dis., 10(1),

195–262 (2015).

3. Camelliti P, Gallagher JO, Kohl P & McCulloch AD. Micropatterned cell cultures on

elastic membranes as an in vitro model of myocardium. Nat. Protoc. 1, 1379–1391 (2006).

4. Feinberg, A. W. et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices.

Science. 317, 1366–1370 (2007).

144

NEURONAL CELL LINES AS A MODEL TO INVESTIGATE OCHRATOXIN A

NEUROTOXICITY

Babayan N.1,3*

, Grigoryan R.1, Sarkisyan N.

1, Malakyan M.

1, Stopper H.

2, Aroutiounian R.

3

1 Institute of Molecular Biology, NAS RA, Yerevan, Armenia

2 Institute of Pharmacology and Toxicology, Wurzburg, Germany

3 Yerevan State University, Yerevan, Armenia


Mycotoxins cause neuropsychological impairment or mental and emotional disorders but the

mechanism of neurotoxicity of certain mycotoxin remains unknown. Lately it was

hypothesized that Ochratoxin A (OTA) is unlikely to act through a single, well-defined

mechanism of action, but a network of interacting epigenetic mechanisms is involved in its

toxicity (Marin-Kuan et al., 2013). However, the correct model for risk assessment of

mycotoxin neurotoxicity, including predictive test-systems, appropriate endpoints,

extrapolation models from in vitro/in vivo data to human are not clearly identified, that hinder

the comprehensive characterization of mycotoxins' hazard to humans. Regardless of endpoints

it has been suggested that in vitro screens should include human neural cells to allow

evaluation of interspecies differences. The reversible/irreversible effects should be also

considered in evaluating of neurotoxicity (Balls and Walum, 1999). The aim of the work was

the delineation of epigenetic, reversible/irreversible neurotoxic effects of OTA in neuronal

cell lines derived from human or mouse organisms.

The human SH-SY5Y and mouse HT22 cell lines were selected as test-models. The

epigenetic effect of OTA was assessed using methylation sensitive comet assay; the

genotoxicity of OTA was tested using CBMN assay. The DHE assay and FPG-comet assays

were used to study the OTA induced oxidative stress.

It was shown, that OTA does not induce DNA-damage at highest tested concentrations (10-30

µM) in both human (SHSY5Y) and mouse (HT22) neuronal cell lines. The cell viability

tested in parallel experiment was 85-98% (SHSY5Y) and 95-99% (HT22). At the

concentrations of 2.5-10 µM OTA induces epigenetic changes in mouse HT22 neuronal cells

which bring to the increased level (up to 45%) of unmethylated CpG islands in DNA. Those

epigenetic changes may affect genes responsible for oxidative stress, while the increased level

of reactive oxygen species and oxidized purines were detected. All observed processes were

reversible after single-dose treatment, but can be retained in a case of chronic exposure. OTA

induced epigenetic changes were not revealed in human SH-SY5Y neuronal cells, but the low

level and reversible oxidative stress was observed after single-dose treatment with OTA. So,

human and animal neuronal cells have different sensitivity against mycotoxin-induced

toxicity and careful data extrapolation should be performed when use only animal data.

References

Balls M. and Walum E. In Neurotoxicology in Vitro. Pentreath V.W. (Edr), Taylor &

Francis Press, Philadelphia, 1999; 269–283.

Marin-Kuan M. et al., Toxicon, 2008; 52:195–202.

The study was supported by the International Scientific-Technical Center (ISTC-2116) and

Deutsche Akademische Austauschdienst (DAAD-RSUAS-2015).

145

Авторский указатель

Абрамова Т.О. 60

Абрамычева Н.Ю. 18

Аверьянов А.В. 13

Аветисян А.В. 8

Агафонов А.П. 9

Агладзе К.И. 116, 121, 138, 139, 143

Адылов Ш.Ф. 102

Ажикина Т.Л. 63

Айзенштадт А.А. 100, 102

Акулова А.П. 87, 105

Александрова А. 102

Александрова Л. 100

Алексеенко С.Н. 23

Ананян Г.В. 106

Антоненко О.В. 65

Антонец Д.В. 12, 82

Антонов Е.В. 60

Антонова Л.В. 20, 46

Артемьева Л.В. 88

Артюхов В.Г. 107, 127

Арутюнян А.В. 115

Арутюнян Р.М. 10

Арутюнян С.Г. 106

Арутюнян Т.А. 10

Астахова Н.М. 89

Астрелина Т.А. 54, 97

Атамбаева Ш.А. 117

Багаева В. 102

Багинская Н.В. 11

Бажан С.И. 12

Баженова Е.Ю. 37

Байзигитов Д.Р. 90

Байков И.К. 66

Байрамова С.А. 84

Байструков В.И. 129

Баклаушев В.П. 13

Бакулина А.Ю. 33

Баранов К.О. 21, 36

Барбараш Л.С. 20, 46

Барбараш О.Л. 20, 46

Бгатова Н.П. 43

Беклемишев А.Б. 95

Беловежец Т.Н. 21

Белоглазова И.Б. 91, 94, 103

Белогородцев С.Н. 142

Бобкова Н.В. 8

Бобров И.П. 76, 140

Божкова С.А. 93

Божокин М.С. 93

Болдырева М.А. 94, 103

146

Бондаренко Д.А. 66

Бондаренко Н.А. 43, 95, 111, 120, 133

Борисов А.Г. 96

Брумберг В.А. 54, 97

Буздин А.А. 74

Бушманов А.Ю. 54, 97

Быкова И.В. 24

Быстрых О.А. 42

Бычков А.Л. 105

Валетдинова К.Р. 15

Васильев П.А. 123

Васькова Е.А. 16, 52

Васюков Г.Ю. 20

Великанова Е.А. 46

Вернер А.Э. 17

Ветчинова А.С. 18

Виноградов А.В. 104

Власов В.В. 63, 65

Волкова О.Ю. 21, 36

Волчо К.П. 37

Воронина Е.Н. 135

Вяткин Ю.В. 82

Гайко О. 138

Гайнер Т.А. 19

Гайнетдинов И.В. 63

Галембо И. 100

Гальбрайх Л.С. 110

Гао Ю. 98

Гилевич И.В. 23

Глушкова Т.В. 20, 46

Гнеденков С.В. 59

Голосова О.И. 24

Голубицкая Е.А. 79

Горбунов В.C. 143

Гормолысова Е.В. 77

Горчаков А.А. 21, 36

Гостев А.А. 98

Грехов Г.А. 24

Григорьева Е.В. 15, 22

Григорьева Э.В. 134

Гринчук Т.М. 100

Губарев К.К. 97

Губарева Е.А. 23

Гуменюк И.С. 23

Гурия К.Г. 143

Гусельников С.В. 21, 36

Далян Е.Б. 106

Данилова Ю.Э. 24

Деев С.М. 25

Дементьева Е.В. 26, 84

Денисова Н.П. 27

Дергилев К.В. 91

147

Дианов Г.Л. 112

Дмитриев А.Б. 27

Добровольская Е.И. 54, 97

Докукина Л.Н. 28

Долганова О.М. 99

Долгатов А.Ю. 76

Донковцева Е.С. 136

Донченко Н.А. 87, 105

Доронин И.И. 74

Дубовой А.В. 29

Дурнев А.Д. 30

Дуров О.В. 13

Дыйканов Д.Т. 123

Енукашвили Н.И. 100, 102

Еремеева Н.И. 69

Ефимов В.М. 60

Ефремов Я.А. 88

Жанатаев А.К. 30

Живень М.К. 32

Журавин И.А. 115

Журавлев Е.С. 131

Зайдман А.М. 31

Зайцева Н.С. 141

Закиян С.М. 15, 32, 45, 52

Захарова И.С. 32, 132

Золина Т. 100, 102

Зотов А.В. 77

Зубарев Д.Д. 129

Зубкова Е.С. 91, 103

Ибрагимова М.К. 41

Иванова Л.Н. 32

Иванова Н.А. 31

Иващенко А.Т. 117

Изотов Д.В. 104

Илларионова Н.Б. 37

Иллариошкин С.Н. 18

Ильичев А.А. 12,33

Ильницкая С.И. 11

Искаков И.А. 75

Кабаков А.В. 43, 111

Казаков О.В. 43

Казаков Щ.В. 111

Казанцева П.В. 41

Казаринов Н.П. 87, 105

Казарцев А.В. 140

Каледин В.И. 11

Калиновский А.В. 77

Калита И.Ю. 116

Кальсин В.А. 13

Камарова К.А. 113

Кандров Д.Ю. 24

Капицкая К.Ю. 63

148

Каплина О.Н. 33

Карагяур М.Н. 123

Карапетян Н.Г. 106

Карасева Т.В. 54, 97

Каримова О.Г. 19

Карпенко А.А. 32, 98

Карпенко Л.И. 12, 33, 124

Касымов А.Р. 77

Кашин О.В. 129

Ким И.И. 43, 95, 111, 120, 133

Кирилова И.А. 89

Киселева Е.В. 34, 132

Клейменова А.А. 113

Климачев В.В. 76, 140

Климович П.С. 125

Клюшников С.А. 18

Кобзева И.В. 54, 97

Коваленко В.Р. 90

Коваль О.А. 51, 55, 68, 79

Кожин П.М. 141

Козлов В.А. 65

Козлов М.В. 113

Козлова М.Г. 54

Козырь К.В. 129

Колосова И.В. 83

Колосова Н.Г. 34

Коноплянников М.А. 13

Коптелова Н.В. 91

Корель А.В. 31, 89

Коробейников А.А. 129

Королева В.А. 107

Косарева О.С. 31

Котловская Л.Ю. 108

Котловский М.Ю. 108

Кочнева Г.В. 35

Кравченко М.А. 69

Крашенинникова А.В. 121, 139

Кретов Е.И. 129

Кривкина Е.О. 46

Кривошапкин А.Л. 80

Кудрявцев И.В. 96

Кудрявцева Ю.А. 20, 46

Кудряшова Н.Н. 116, 121, 139

Куевда Е.В. 23

Кузнецова В.В. 21, 36

Кулемзин С.В. 21, 36

Кулигина Е.В. 51, 55, 79, 131

Куликов А.В. 37

Куликова Е.А. 37

Кунецкий В.Е. 18

Куринова М.А. 110

Лазарев А.Ф. 140

149

Лайков А.В. 128

Лактионов П.П. 63, 65, 98, 122

Лаук-Дубицкий С.Е. 54, 97

Лебедев И.Н. 38

Лемак М.С. 39

Летягин Г.В. 40

Лир Т. 10

Лисковых М. 100

Литвяков Н.В. 41

Ломовский И.О. 105

Ломовский О.И. 105

Лосик Д.В. 84

Лотков А.И. 129

Лупатов А.Ю. 42,73

Лыков А.П. 43, 95, 111, 120, 133

Лялина Е.И. 136

Ляпун И.Н. 59

Майбородин И.В. 88

Макаревич П.И. 44, 94, 103

Макарцова А.А. 51

Максимова К.Ю. 34

Максютов Р.А. 83

Макушева Ю.С. 112

Маланханова Т.Б. 45, 52

Малахова А.А. 45

Маликова А.З. 113

Мальцева С.В. 80

Мамаев А.Л. 95

Маркель А.Л. 60

Матвеев А.Л. 66, 88

Матвеева В.А. 88

Матвеева В.Г. 46

Медведев С.П. 47, 52, 84

Меньшиков М.Ю. 103, 130

Меньщикова Е.Б. 141

Мечетина Л.В. 21

Милевская Е.А. 114

Милютина Ю.П. 115

Миронов А.В. 20, 46

Морозкин Е.С. 65

Морозов В.В. 88

Морозова А.Ю. 115

Морозова П.Ю. 115

Муралева Н.А. 34

Мурашев А.Н. 48, 66

Мухамедшина Я.О. 128

Наконечный Д.Г. 93

Накохов Р.З. 23

Натальин П.Б. 50

Нащекина Ю.А. 93

Наякшин А.М. 21, 36

Немудрая А.А. 51

150

Немудрый А.А. 52

Нетесов С.В. 35, 53

Нетылько Г.И. 93

Нечесова Т.А. 118

Низамиева А.А. 116

Никитина В.А. 54, 97

Николаев С.В. 89

Ниязова Р.Е. 117

Нугис В.Ю. 54

Нуштаева А.А. 55, 79

Овсянникова Т.В. 88

Оганесян Г.Г. 10

Ольшанникова С.С. 107

Ольшевская И.В. 118

Орищенко К.Е. 89

Орлов К.Ю. 80

Осипова Л.П. 135

Останин А.А. 78

Осташкин А.С. 54, 97

Павлова С.В. 56, 114

Панарин В.А. 80

Парфенова Е.В. 44, 91, 94, 103, 130

Паршин Д.В. 80

Петренко А.Е. 142

Петров А.В. 57

Пиянзин А.И. 58, 119

Плехова Н.Г. 59

Повещенко А.Ф. 43, 95, 111

Повещенко О.В. 43, 72, 95, 111, 120, 133

Подгурская А.Д. 121

Покушалов Е.А. 32, 84

Полтавцева Р.А. 42

Пономарева А.А. 63

Пономарцев Н.В. 100

Пономарцев С.В. 100

Понькина Е.В. 119

Потапова О.Ф. 88

Пузь А.В. 59

Пушкова Е.А. 24

Пыркова А.Ю. 117

Пышная И.А. 79

Райтер Т.В. 111

Рассказов Г.А. 122

Рассказова Е.А. 48

Редина О.Е. 60

Редько А.Н. 23

Рихтер В.А. 35, 51, 55, 68, 79, 131

Романов А.Б. 84

Романова Ю.Р. 128

Рубина К.А. 125

Рубцов Н.Б. 62

Рубцов Ю.П. 123

151

Рудаков В.С. 97

Рудницкая Е.А. 34

Рудометов А.П. 33, 124

Рыкова Е.Ю. 63, 65

Рысенкова К.Д. 123, 125

Рябчикова Е.И. 35

Рязанова М.А. 60

Саая Ш.Б. 32

Савченко А.А. 96

Сазыкина С.М. 127

Салафутдинов И.И. 128

Салахутдинов Н.Ф. 37

Самойлов А.С. 54, 97

Самохин А.Н. 8

Санатова Э.Р. 128

Свиридов Е.А. 79

Свиридов О.В. 118

Севостьянова В.В. 20, 46

Сейфалиан А.М. 20, 46

Семенов Д.В. 131

Семина Е.В. 123, 125

Сергеева Е.А. 20, 46

Сергеевичев Д.С. 129

Серченя Т.С. 118

Сизенцова Я.Г. 21

Сизиков А.Э. 65

Симонян Р.А. 8

Синебрюхов С.Л. 59

Скибина Д. 110

Скорняков С.Н. 69

Слепухина А.А. 19

Слонимская Е.М. 41

Слотвицкий М.М. 121

Смирнова А.М. 32

Смоленская С.Э. 60

Снытникова О.А. 75

Сократян А.М. 21, 36

Соловьев М.А. 108

Сорокин М.А. 45

Сорокина А.Е. 45

Сотниченко А.С. 23

Стафеев Ю.С. 130

Степанов Г.А. 131

Степанова А.О. 122

Степанова В.В. 91

Стефанова Н.А. 34

Стрельников А.Г. 84

Стригина Е.В. 132

Стронин О.В. 66

Стрункин Д.Н. 111

Струнов А.А. 32

Сульдина Л.А. 132

152

Супильникова О.В. 102

Суровцева М.А. 43, 95, 111, 120, 133

Сухих Г.Т. 42

Суховских А.В. 134

Сучкова Ю.Б. 54, 97

Табиханова Л.Э. 135

Таранин А.В. 21, 36

Ташметов Э.Р. 136

Телегина Д.В. 34

Тикунов А.Ю. 131

Тикунова Н.В. 66

Тиллиб С.В. 67

Тимофеев М.С. 108

Тихоновский М.А. 13

Ткаченко А.В. 68

Ткачук В.А. 44, 125

Троицкая О.С. 68

Тюменцев М.А. 34

Тютрин И.И. 108

Удут В.В. 108

Ужакова Е.К. 77

Усупжанова Д.Ю. 54, 97

Уфимцева Е.Г. 69, 137

Фадеева Н.П. 70

Федотова Е.Ю. 18

Филатов А.В. 71

Филимонов П.Н. 99, 142

Филипенко М.Л. 135

Филиппова Ю.А. 131

Фомин А.С. 79

Фомичев А.В. 72, 120

Фролова Ш.Р. 138

Хе А.К. 80

Хличкина А.А. 75

Хлусевич Я.А. 66

Холоденко И.В. 73, 74

Холоденко Р.В. 73,74

Холявка М.Г. 107, 127

Хоменко Т.А. 37

Хоцкин Н.В. 37

Цвелая В.А. 116, 121, 138, 139

Центалович Ю.П. 75

Цыганов М.М. 41

Чарыкова И.Н. 28

Чепелева Е.В. 114, 129

Черданцева Т.М. 76, 140

Чердынцева Н.В. 41, 63

Черевко А.А. 80

Чередниченко А.Г. 142

Чернов С.В. 77

Черноносова В.С. 98

Черных Е.Р. 78

153

Чернявский А.М. 72, 120

Чернявский М.А. 72

Чечушков А.В. 141

Чикаев А.Н. 33, 124

Чикаев Н.А. 21, 36

Чинак О.А. 79

Чичерина Г.С. 88

Чупахин А.П. 80

Чуркина Т.В. 135

Шабаев А.Р. 46

Шахмурадова А.И. 99

Шварц Я.Ш. 99, 142

Шевела Е.Я. 78

Шевченко А.И. 31, 32, 132

Шерман К.М. 31

Шернюков А.В. 79

Шилина М. 100

Шкурупий В.А. 141

Шлихт А.Г. 81

Штокало Д.Н. 82

Шутько А.В. 143

Щелкунов С.Н. 83

Щелкунова Е.И. 89

Щербаков Д.Н. 33

Юнусова А.Ю. 68, 79

Юнусова В.А. 130

Якубицкий С.Н. 83

Якубов А.А. 84

Яньшоле В.В. 75

Яньшоле Л.В. 75

Ярыгин К.Н. 42, 73

Ahlfors J.E. 13

Aroutiounian R. 144

Babayan N. 144

Grigoryan R. 144

Malakyan M. 144

Matsui H. 85

Sarkisyan N. 144

Stopper H. 144

Сборник материалов форума «Биомедицина...

Documents

Transcript of Сборник материалов форума «Биомедицина...