51

БИОХИМИЯ, 2005, том 70, вып. 1, с. 51 – 67

УДК 577.15.02

Кафедра химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, 119992 Москва ГСП(3; факс: (095) 939(2742;

электронная почта: vit@enz.chem.msu.ru, tishkov@pochta.ru

Поступила в редакцию 15.07.2004

Оксидаза D�аминокислот (DAAO) является FAD�зависимым ферментом. Она играет важную роль в метабо�лизме микроорганизмов, а также в утилизации эндогенных D�аминокислот, регуляции работы нервной сис�темы и процессов старения у млекопитающих. DAAO из дрожжей Rhodotorula gracilis и Trigonopsis variabilisиспользуются при получении из цефалоспорина C 7�аминоцефалоспорановой кислоты – исходного соеди�нения при синтезе полусинтетических цефалоспоринов. В данном обзоре рассмотрены последние данныепо локализации и физиологической роли, клонированию и экспрессии генов этого фермента из различныхисточников, исследованию его структуры, стабильности, механизма действия и практическому применению.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оксидаза D�аминокислот, клонирование, экспрессия, стабильность, белковая инже�нерия, Trigonopsis variabilis, Rhodotorula gracilis.

К флавопротеинам относятся многочислен�ные группы ферментов, существенно различаю�щиеся по своей структуре и функции. Они ката�лизируют большое число ключевых биохими�ческих превращений [1, 2] и являются одним изнаиболее широко исследуемых семейств белков.В отличие от дегидрогеназ – ферментов, катали�зирующих превращение других динуклеотидовNAD+ и NADP+ из окисленной формы в восста�новленную (и наоборот), молекула FAD выпол�няет роль простетической группы и ее состоя�ние (как правило, окисленное) в конце катали�тического цикла остается таким же, как и в егоначале. Среди наиболее интенсивно исследуе�мых и активно применяемых на практике FAD�со�держащих оксидоредуктаз следует отметить та�кие ферменты, как глюкозоксидаза [3], лакта�токсидаза [4], ксантиноксидаза [5], цитохромP450�редуктаза [6], цитохром b5�редуктаза [7] и др.

Одним из FAD�зависимых превращений,происходящих в живой клетке, является окис�

лительное дезаминирование D�аминокислот всоответствующие α�кетокислоты. Эта реакциякатализируется специальным ферментом – ок�сидазой D�аминокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO)(рис. 1). Несмотря на то, что впервые DAAO бы�ла найдена Кребсом в тканях животных еще в30�е годы прошлого столетия [8], этот ферментне привлекал большого внимания исследовате�лей до середины 80�х годов прошлого века. Ак�тивные исследования DAAO в течение послед�них 20 лет обусловлены тем, что ферменты издрожжей Rhodotorula gracilis и Trigonopsis vari(abilis способны эффективно окислять цефалос�порин С. Это первая стадия двухферментногопроцесса биокаталитического превращенияприродного антибиотика цефалоспорина С в7�аминоцефалоспорановую кислоту (7�АСА),являющуюся исходным соединением при полу�чении многочисленных полусинтетических це�фалоспориновых антибиотиков различных по�колений [9, 10]. В настоящее время DAAO ис�пользуется также и для получения α�кетокислот[11, 12], неприродных L�аминокислот [13] и вбиосенсорах [14–16].

До середины 80�х – начала 90�х годов ХХ ве�ка среди оксидаз D�аминокислот наиболее изу�ченным ферментом была DAAO из почексвиньи − первая оксидаза D�аминокислот, длякоторой определили трехмерную структуру с

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ

ПРИМЕНЕНИЕ

Обзор

© 2004 г. В.И. Тишков*, С.В. Хороненкова

П р и н я т ы е с о к р а щ е н и я : DAAO – оксидаза D�ами�нокислот, DASPO – D�аспартат оксидаза, рkDAAO – ок�сидаза D�аминокислот из почек свиньи, RgDAAO – окси�даза D�аминокислот из Rhodotorula gracilis, TvDAAO – ок�сидаза D�аминокислот из Trigonopsis variabilis, 7�АСА –7�аминоцефалоспорановая кислота.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

52

помощью рентгеноструктурного анализа [17,18]. Активное систематическое исследованиеDAAO из дрожжей R.gracilis, начатое в начале90�х годов прошлого века группой исследовате�лей во главе с Л. Полледжиони, в сочетании сданными, полученными для фермента из почексвиньи, привело к тому, что в настоящее времяоксидаза D�аминокислот рассматривается в ка�честве модельного фермента для исследованияосновных закономерностей механизма действияFAD�зависимых оксидаз [19, 20].

Последний обзор, суммирующий данные посвойствам, структуре и механизму действияDAAO на конец 1999 г. был опубликован четырегода назад [19]. Большое количество полезнойинформации об оксидазах L� и D�аминокислотможно также найти и в обзоре [21]. За прошед�шее время появилось большое количество но�вых публикаций по исследованию этого фер�мента: были клонированы или найдены в гено�мах гены новых DAAO из прокариот и эукариот,созданы более эффективные системы экспрес�сии рекомбинантного фермента в клеткахEscherichia coli и различных штаммах дрожжей,получены важные данные по направленномумутагенезу, в банк трехмерных структур PDB до�бавлены новые структуры высокого разреше�ния, получены высокоэффективные биокатали�заторы на основе иммобилизованных фермен�тов. В этой работе мы попытались систематизи�ровать и обобщить эти данные, а также рассмот�реть другие аспекты исследования DAAO, кото�рые не были затронуты в предыдущих обзорах.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ DAAO

До недавнего времени фермент был найдентолько в клетках эукариот. Лишь в последниенесколько лет в результате секвенирования ианнотации целых геномов ряда бактерий (Myco(bacterium tuberculosis [22, 23], Streptomyces avermi(tilis [24], Acinetobacter sp. IP I�671 [25] и sp. ADP1[26] и др.) были обнаружены бактериальныеDAAO. Таким образом, к настоящему времениприсутствие фермента зафиксировано в клеткахмоллюсков, рыб, рептилий, амфибий, насеко�мых, птиц, млекопитающих (почках, легких имозге) [27], а также в разнообразных микроорга�низмах: морских водорослях Chlorella vulgaris[28], микроскопических грибах Neurospora crassa[29], Cephalosporium acremonium [30], Fusariumsolani (Nectria haematococca) [31], дрожжах T. va(riabilis [32, 33], Candida tropicalis [34], R. gracilis(альтернативное название Rhodosporidium toruloi(des) [35], Candida boidinii [36], бактериях Strep(

tomyces avermitilis [24, 37], Arthrobacter protophor(miae [GenBank accession AY306197], Mycobacte(rium tuberculosis [23], Agrobacterium tumefaciens C58[38] и др.

Физиологическая роль фермента очень раз�нообразна и до конца не выяснена. В случаемикроорганизмов DAAO позволяет использо�вать для роста экзогенные D�аминокислоты вкачестве источника углерода и азота [8, 39].Кроме того, этот фермент играет важную роль взащите микроорганизмов от антибиотиков, со�держащих D�аминокислоты.

В эукариотических клетках DAAO локализо�вана в специальных органеллах – пероксисомах.Такая локализация фермента необходима дляэффективного удаления токсичной для клеткиперекиси водорода, образующейся в результатекатализируемой DAAO реакции (этот процессосуществляется с помощью каталаз) [40]. Значи�тельные количества DAAO найдены в клеткахпечени, почек и мозга млекопитающих. Отме�тим, что у некоторых животных, например усвиньи, фермент находится как в печени, так и впочках, в то время как у других животных, нап�ример у мыши, он присутствует только в почках.Д’Аниелло и соавт. [41] показали, что у различ�ных животных, включая человека, в дополнениек обычной DAAO, окисляющей большой наборD�аминокислот, находится второй, узкоспециа�лизированный фермент – D�аспартатоксидаза(DASPO). Наличие этого фермента обусловленотем, что активность классической DAAO с D�ас�парагиновой кислотой практически равна нулю,в то время как скорость превращения L�аспар�тата в его D�изомер в клетках млекопитающихявляется одной из самых высоких среди природ�ных L�аминокислот. Основная роль DAAO иDASPO в почках и печени млекопитающих –детоксификация эндогенных D�аминокислот,которые накапливаются в организме в результа�те рацемизации. Была отмечена обратная связьмежду содержанием D�аминокислот в клетках иуровнем активности двух упомянутых выше ок�сидаз [42].

Накопление D�аминокислот в клетках живот�ных является одним из характерных признаковстарения организма. Наиболее быстро D�ами�нокислоты (особенно D�аспартат и D�гидрок�сипролин) аккумулируются в клетках долгожи�вущих тканей – дентина, зубной эмали, хруста�лика и др. Например, скорость накопленияD�аспартата в белках хрусталика составляет до0,14% в год. [43, 44]. Кроме того, было установ�лено, что с возрастом происходит накоплениеD�аспартата в белом веществе мозга человека[45]. Исследования последних лет также показа�ли важную роль DAAO в поддержании в различных

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

53

тканях мозга соответствующего уровня D�сери�на, который в виде свободной аминокислотыили нейроактивного пептида принимает участиев регуляции деятельности рецепторов N�метил�D�аспартата (NDMA�рецепторы) [46–49]. D�Се�рин образуется в тканях мозга под действием спе�цифической рацемазы [50]. Были высказаны пред�положения и получены предварительные данные,что нарушения в деятельности NDMA�рецепто�ров, связанные с неправильной экспрессией ге�на DAAO, являются одной из причин возникно�вения шизофрении [51–54]. Кроме того, былоустановлено, что активность DAAO в раковыхклетках печени и почек намного ниже, чем со�ответствующая активность в нормальных клет�ках [55], что позволяет использовать этот фактпри диагностике рака этих органов. Генерацияоксидазой D�аминокислот цитотоксичной пе�рекиси водорода была использована для созданияантираковых препаратов на основе DAAO, им�мобилизованной на полиэтиленгликоле [56, 57].

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА

Наиболее полно изучены в настоящее времяDAAO из почек свиньи (pkDAAO) и дрожжейR.gracilis (RgDAAO) и T.variabilis (TvDAAO). Ос�новные свойства этих ферментов приведены втабл. 1. Активной формой pkDAAO является мо�номер, однако in vitro при высоких концентра�

циях наблюдается образование и олигомерныхформ [19]. RgDAAO и TvDAAO функционируютв клетке в виде димера, состоящего из двухидентичных субъединиц, в каждой из которыхнаходится по одной нековалентно связанноймолекуле FAD. Димер RgDAAO является доста�точно прочным, поскольку не наблюдается егодиссоциации на отдельные субъединицы прибольших степенях разбавления [58]. Данныерентгеноструктурного анализа для близкород�ственного фермента глициноксидазы из Bacillussubtilis свидетельствуют, что она является тетра�мером с двумя типами контактов между субъе�диницами (структура типа димер димеров) [59].Для TvDAAO в литературе также имеются дан�ные об образовании тетрамера с молекулярноймассой 170 кДа и более крупных агрегатов привысоких концентрациях фермента [33].

Ферменты из животных и микроорганизмовсущественно различаются сродством к FAD. ВDAAO из микроорганизмов простетическаягруппа связана в активном центре более прочно,чем в ферменте из тканей млекопитающих. ДлярkDAAO константа диссоциации FAD из холо�формы фермента составляет 2,2 · 10–7 M. В слу�чае RgDAAO величина Kd на порядок меньше(2 · 10–8 M, табл. 1). Кроме того, ферменты изпочек свиньи и из дрожжей различным образомингибируются бензоатом и сульфитом (табл. 1).

Методом изоэлектрофокусирования былопоказано, что TvDAAO имеет только одну изо�

Параметры

Максимум поглощения, нмокисленное состояниепереходное состояниевосстановленное состояние

Максимум испускания, нм

Отношение поглощения A272/A455

pKa N(3)�H�связанного FAD

Константа диссоциации FAD (Kd), M

Константа диссоциации бензоата, мM

Константа диссоциации сульфита, мM

Количество аминокислот в субъединице

Молекулярная масса субъединицы, кДа

Изоэлектрическая точка (pI)

pkDAAO[19]

274, 380, 455–

355, 415

530

9,5

9,4

2.2 · 10–7

0,002

3,5

347

39,6

7,0, 7,2

TvDAAO[19, 33]

272, 360, 455––

355, 530

8,4 [19], 6,5 [28]

10,1

–

18,8

–

356

39,3

5,1

RgDAAO[19]

274, 368, 455274, 370, 400, 490

350

355, 530

8,2

10,6

2 · 10–8

0,245

0,11

368

40,0

7,2, 7,4, 7,8

Таблица 1. Основные свойства DAAO из различных источников

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

54

форму, в то время как pkDAAO и RgDAAOпредставлены в клетках двумя и тремя изофор�мами соответственно (табл. 1). Спектр поглоще�ния окисленной формы DAAO имеет вид, ти�пичный для FAD�содержащих ферментов: двапика в видимой области и один в ультрафиоле�товой. Окисленная форма FAD является флуо�рофором, что обеспечивает существование мак�симумов испускания при 530 нм (табл. 1).

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА

Как уже отмечалось выше, до середины 80�х –конца 90�х годов DAAO не была объектом ак�тивных исследований. Это привело к тому, чтоколичество аминокислотных последовательнос�тей этого фермента в базах данных к 2000 г. непревышало одного десятка. Поиск новых DAAOиз микроорганизмов для целей биотехнологии иисследования ее роли в регуляции нервной дея�тельности высших животных привели к тому,что к середине 2004 г. число известных последо�вательностей этого фермента возросло более чемв 4 раза. Еще одним источником аминокислот�ных и нуклеотидных последовательностей DAAOстало секвенирование геномов патогенных мик�роорганизмов и паразитов. Например, геныDAAO и DASPO были найдены в таких социаль�но важных патогенах, как Mycobacterium leprae(GenBank Accession AL049571), Mycobacterium bovis(GenBank Accession BX248340), Mycobacteriumtuberculosis [22, 23], Neisseria meningitides [60],Pseudomonas aeruginosa [61].

Нами было проведено сравнение известныхаминокислотных последовательностей DAAO иDASPO. На рис. 2 представлены некоторые наи�более отличающиеся друг от друга последова�тельности фермента из различных источников.Они расположены в порядке убывания гомоло�гии по сравнению с TvDAAO. На этом рисункетакже указаны участки, входящие в составα�спиралей и β�листов согласно данным рентге�ноструктурного анализа для RgDAAO и pkDAAOи компьютерного моделирования структурыTvDAAO. Последовательности DAAO из разныхклассов продуцентов (дрожжи, водоросли, мик�роскопические грибы, двустворчатые моллюс�ки, рыбы, млекопитающие) имеют довольнонизкую гомологию, не превышающую 30–40%.Наибольшая степень идентичности с TvDAAOнаблюдается для оксидаз из N.crassa (40%),S.pombe (35%) и грибов F.solani (36%). Неожи�данным фактом является низкая гомологиямежду дрожжевыми TvDAAO и RgDAAO, кото�рая составляет всего 30%. Наивысшая гомоло�гия для TvDAAO с оксидазами из млекопитаю�

щих наблюдается для DASPO быка (28%) иDASPO человека (29%) (рис. 1).

Сравнение аминокислотных последователь�ностей DAAO из разных источников позволяетвыявить консервативные аминокислотные ос�татки, а также отдельные участки, составляю�щие активный центр фермента. Например, наN�конце всех ферментов имеется характернаядля нуклеотидсвязывающих доменов последо�вательность GXGXXG [62], указывающая на на�личие в молекуле белка структурного элемента,известного как «укладка по Россману» (Rossmanfold), представляющая собой комбинацию α�спи�ралей и β�структур [63]. Эта структура являетсяконсервативной и отвечает за связывание аде�ниновой части NAD+ и FAD в активном центреочень большого количества ферментов.

Кластеры консервативных остатков в районе189–202, 299–312 и 326–341 (нумерация соглас�но последовательности TvDAAO) формируюткаталитический участок активного центра. Внем расположены важные для катализа остаткиAsn192, Arg302 и Tyr326 (см. раздел «Механизмдействия»). Отметим, что у остатка Arg302 под�вижность αС�атома существенно ограниченаиз�за расположенного рядом остатка Pro303, адля Tyr326, отвечающего за доступ субстрата вактивный центр, должна наблюдаться повы�шенная подвижность, обеспечиваемая располо�женным рядом Gly327. В случае субстратсвязы�вающего домена высокой гомологии в первич�ной структуре DAAO не наблюдается. Это можетбыть связано с тем, что субстратная специфич�ность фермента из различных источников варь�ируется в широком интервале.

Многие DAAO на С�конце содержат специфи�ческую последовательность (Ser�(Lys/His/Arg)�

Рис. 1. Кинетический механизм реакции, катализируемойоксидазой D�аминокислот

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

55

Рис. 2. Аминокислотные последовательности оксидаз D�аминокислот из различных источников. Звездочками отмеченыабсолютно консервативные аминокислотные остатки, белым полужирным шрифтом на черном фоне – каталитическиважные остатки активного центра. Выравнивание выполнено с помощью программы Clustal X версии 1.83

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

56

Leu (рис. 2), являющуюся пероксисомальнойсигнальной последовательностью первого типа,отвечающей за транспорт ферментов в перокси�сомы [64]. Для RgDAAO было показано, что су�ществование трех изоформ обусловлено нали�чием в клетке димерного непроцессированногофермента и димеров, в которых пептидSerLysLeu отщеплен у одной и двух субъединицсоответственно [65]. Рекомбинантная RgDAAO,в гене которой были удалены кодоны для этоготрипептида, существовала только в виде однойизоформы [65].

На рис. 3 представлено филогенетическиедерево ферментов семейства DAAO и DASPO.Филогенетический анализ свидетельствует обольшом эволюционном разнообразии этого се�мейства и довольно необычном пути эволюцииэтого фермента. Например, дрожжевые RgDAAOи TvDAAO удалены эволюционно более сильно,чем RgDAAO и DAAO млекопитающих. На пер�вом этапе эволюции произошло разделениепредшественника DAAO на две группы. В пер�вой группе оказались прокариоты и RgDAAO, вовторой – микроскопические грибы и дрожжи, втом числе и TvDAAO. Впоследствии из первойгруппы ферментов выделились DAAO беспозво�ночных и позвоночных.

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА

В настоящее время имеются данные рентге�ноструктурного анализа (РСА) всего для двухферментов – рkDAAO и RgDAAO. До 2000 г. вбанке трехмерных структур PDB находилисьструктуры для свободного фермента из почексвиньи и в комплексе с различными ингибито�рами. Первые две структуры рkDAAO были по�лучены в 1996 г. независимо двумя научными кол�лективами − японскими авторами (PDB1AA8.ENT,свободный рекомбинантный фермент со свя�занным FAD с разрешением 3,0 Å) [17] и совме�стной группой итальянских и немецких иссле�дователей (PDB1KIF.ENT, комплекс с бензоа�том с разрешением 2,6 Å) [18]. Чуть позже Миу�рой с соавт. с разрешением 2,5 Å была решенаструктура комплекса рекомбинантной pkDAAOс другим конкурентным ингибитором фермента –o�аминобензоатом (PDB1AN9.ENT) [66]. В томже году были опубликованы данные о структу�рах восстановленной формы DAAO в комплексес продуктом реакции – иминотриптофаном(PDB1DDO.ENT) и в комплексе с 3�метил�2�ок�совалериановой кислотой (PDB1DAO.ENT) [67].В 1999 г. в базу данных PDB были добавленыструктуры свободной RgDAAO (PDB1COL.ENT)и в комплексе с D�аланином (PDB1COP.ENT) и

L�лактатом (PDB1COK.ENT) с разрешением 1,73,1,20 и 1,46 Å соответственно [68], а также комп�лекса RgDAAO с двумя молекулами антранилата(PDB1COIL.ENT, разрешение 1,9 Å) [69].

С 2000 г. в банке данных PDB появились ещедве структуры рkDAAO −уточненная до 2,5 Å струк�тура свободного фермента (PDB1VE9.ENT) [17]и восстановленного пурпурного интермедиата вкомплексе с D�пролином (PDB1EV1.ENT) [70].

В декабре 2002 г. в банк данных PDB былидепонированы данные РСА для двух структурдругой оксидазы аминокислот – глициноксидазыиз B.subtilis (свободный фермент PDB1NG3.ENTи комплекс с ацетилглицином – PDB1NG3.ENT

Рис. 3. Филогенетическое дерево оксидаз D�аминокислот.Полные названия микроорганизмов (сверху вниз): Arthro(bacter protophormiae (GenBank accession AY306197), Myco(bacterium leprae (GenBank accession MLCOSL672), Strepto(myces avermitilis (GenBank accession AP005027), Streptomycescoelicolor (GenBank accession AL939111), Caenorhabditis ele(gans (GenBank accession NM_075090), Danio rerio (GenBankaccession BC065882), Rattus norvegicus (GenBank accessionAB003400), Cricetulus griseus (GenBank accession AB016530),Oryctolagus cuniculus (GenBank accession D12494), porcine(GenBank accession PIGAAOA), Human DAAO (GenBank ac�cession X13227), Cavia porcellus (GenBank accession AJ007710),Mus musculus (GenBank accession BC027312), Human DASPO(GenBank accession NM_004032), Bos taurus (GenBankaccession BTDASPO), Drosophila melanogaster (GenBankaccession AY071416), Anopheles gambiae (GenBank accessionXM_315337), Dictyostelium discoideum (GenBank accessionAC116984), Rhodotorula gracilis (GenBank accession RGU60066),Candida boidinii (GenBank accession AB042032), Schizosac(charomyces pombe (GenBank accession CAB40174), Fusariumgraminearum (Gibberella zeae PH�1, GenBank accessionXM_389828), Fusarium solani (Swiss�Prot accession P24552),Neurospora crassa (GenBank accession XM_326412), Trigonop(sis variavilis (GenBank accession AY514426)

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

57

и PDB1NG4.ENT, соответственно с разрешением2,3 и 2,6 Å) [59]. Фермент является тетрамером смолекулярной массой субъединицы 42 кДа. Вработе М. Мортля и соавт. [71] описана структу�ра глициноксидазы из B.subtilis с разрешением1,8 Å, однако в банке данных PDB эта структурапока отсутствует.

В нашей лаборатории для проведения экспе�риментов по улучшению кинетических свойстви стабильности DAAO из T.variabilis с помощьюметода направленного мутагенеза в сотрудниче�стве с И.В. Упоровым было проведено моделиро�вание структуры этого фермента с помощью прог�раммы Insight II (Accelrys, США). За основу примоделировании была взята структура RgDAAO вкомплексе с D�аланином (PDB1COP.ENT),имеющая разрешение 1,2 Å [68].

На рис. 4 представлены структуры субъеди�ниц pkDAAO (А), RgDAAO (Б) и глициноксида�

зы из B.subtilis (Г), а также модельная структурасубъединиицы TvDAAO (В). Из этого рисункавидно, что все субъединицы имеют очень сход�ную третичную структуру, однако четвертичныеструктуры RgDAAO (рис. 4, Д) и глициноксида�зы (рис. 4, Е) сильно различаются. Образованиедимера RgDAAO происходит за счет контактовмежду субъединицами по принципу «голова�хвост» (рис. 4, Д) [58] В случае тетрамерной гли�циноксидазы из B.subtilis наиболее прочныеконтакты между субъединицами также осущес�твляются по принципу «голова–хвост», однако посравнению с RgDAAO субъединицы повернутыотносительно друг друга на 90° (рис. 4, Е) [59].

Активный центр всех DAAO и глицинокси�дазы представляет собой довольно большую по�лость, верхняя стенка которой образована β�лис�том. В нижней части активного центра располо�жена изоаллоксазиновая группа FAD. Верхняя

Рис. 4. Пространственные структуры субъединиц DAAO из почки свиньи (А), дрожжей R.gracilis (Б), глициноксидазы изB.subtilis (Г), модельная структура субъединицы из T.variabilis (В), а также четвертичные структуры димеров DAAO изR.gracilis (Д) и глициноксидазы из B.subtilis (Е)

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

58

часть активного центра является субстратсвязы�вающим доменом. В нем происходят связыва�ние и одновременно ориентация D�аминокис�лот относительно изоаллоксазиновой частиFAD в конформации, оптимальной для катали�за. Отметим, что структура верхней половинысубъединицы TvDAAO наиболее близка к струк�туре субстратсвязывающего домена RgDAAO,что, по�видимому, и обусловливает более высо�кую активность этих ферментов с цефалоспори�ном С по сравнению с pkDAAO (см. ниже).

Нижняя половина субъединицы представля�ет собой FAD�связывающий домен. Во всехферментах FAD связывается в открытой кон�формации (рис. 4, А–Г). В противоположностькаталитическому домену структура кофермен�тсвязывающего домена TvDAAO более похожана структуру такового в pkDAAO, чем вRgDAAO. Отличительной чертой FAD�связыва�ющего домена в RgDAAO является наличие до�полнительной петли из 14 аминокислотных ос�татков (рис. 4, Б), которая также хорошо виднапри сравнении аминокислотных последователь�ностей ферментов (рис. 2). Эта петля соединяетмежду собой элементы β�листа βF5 и βF6 (рис. 2)и принимает участие в создании межсубъеди�ничных взаимодействий в димере RgDAAO. Онаобеспечивает правильную ориентацию и эф�фективное взаимодействие между расположен�ными в ней положительно заряженными остат�ками Arg305 и Arg314 одной субъединицы с от�рицательно заряженными остатками Asp269,Glu275 и Glu276 из α�спиралей I3' и I3'' второйсубъединицы [72]. Были получены мутантныеформы фермента, в которых часть аминокис�лотных остатков в этой петле была удалена [58,72, 73]. Оказалось, что удаления из петли всегопяти остатков достаточно, чтобы RgDAAO поте�ряла способность образовывать димер. Моно�мерная форма мутантной RgDAAO по сравне�нию с ферментом дикого типа обладала намно�го меньшей термостабильностью, а константасвязывания FAD ухудшилась в 5 раз [72, 73]. По�лученные результаты свидетельствуют, что дан�ная петля играет основную роль в существова�нии RgDAAO в природе в виде димера и обеспе�чивает прочное связывание молекулы FAD в ак�тивном центре.

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ DAAO

Клонирование. Список генов DAAO, полу�ченных с помощью процедуры прямого клони�рования, невелик. Гены этого фермента из почекчеловека [41, 74], свиньи [75, 76], кролика [77] и

мыши [78] были клонированы одной группойисследователей еще в 1988–1992 г. С тех пор изпозвоночных было клонировано только четыреновых гена DAAO – из крысы (1998 г.) [79],морской свинки (1999 г.) [80], хомяка (2003 г.)[81] и карпа (2003 г.) [82]. В 2001 г. была установ�лена хромосомная локализация генов DAAO че�ловека и мыши (хромосомы 12q23–24.1 и 5E3�Fсоответственно) [83].

Первым микроорганизмом, из которого кло�нировали ген DААО, был микроскопическийгриб F.solani [31]. Гены RgDAAO и TvDAAO быликлонированы в 1997–1998 г. сразу несколькимигруппами исследователей [84–86]. Ген DAAOбыл также обнаружен в бактериях Agrobacteriumsp. IP I�671 в составе оперона, ответственного заутилизацию гидантоина [87], однако никакихпопыток получения рекомбинантного ферментапредпринято не было. Совсем недавно быликлонированы гены глициноксидазы из B.subtilis[88, 89] и DAAO с необычной субстратной спе�цифичностью из C.boidinii [36]. Известные в нас�тоящее время гены DAAO из других источников(например, из дрозофилы, различных паразитови патогенов) были обнаружены при аннотациипоследовательностей целых геномов.

Экспрессия. Наиболее популярным подхо�дом получения рекомбинантных белков являет�ся гетерологическая экспрессия их генов в клет�ках E.coli, однако в случае DAAO такая процеду�ра сопряжена с большими трудностями. Этосвязано со следующими факторами. Во�первых,при суперэкспрессии фермента в активнойрастворимой форме он будет окислять D�ами�нокислоты, являющиеся компонентами клеточ�ной стенки прокариот и тем самым препятство�вать росту клеток. Во�вторых, пероксид водоро�да – один из продуктов реакции, катализируе�мой DAAO, является сильным цитотоксическимагентом. В нормальных клетках пероксид водо�рода эффективно разлагается каталазой, однакопри уровне экспрессии рекомбинантного фер�мента до 15–30% от общего клеточного белка идостаточной аэрации при культивировании ак�тивности имеющейся в клетке каталазы уже бу�дет недостаточно. Оба фактора значительноснижают скорость роста клеток штамма�хозяи�на, сильно изменяют их морфологию [90] и непозволяют достичь высокой плотности клетокпри культивировании. Например, максималь�ный выход биомассы при получении рекомби�нантной RgDAAO не превышал 2 г сырых кле�ток с 1 л среды [91].

Все гены DAAO из эукариот содержат интро�ны. Необычно большое для дрожжевых геновколичество интронов (пять) было обнаружено вгене RgDAAO [92]. Поэтому для экспрессии

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

59

DAAO в клетках E.coli интроны из ее генов уда�ляют. Для получения рекомбинантной DAAO вклетках E.coli были созданы разнообразныеэкспрессионные вектора, в которых ген фер�мента находился под контролем различных про�моторов (lac�, tac�, промотор РНК�полимеразыфага T7 и др.) [31, 75–82, 88–96], однако ни водном из случаев не удалось достичь высокихвыходов целевого продукта, как по удельной,так и по общей активности. Основная масса ре�комбинантных DAAO получалась в виде нераст�воримых телец включения или неактивной апо�формы. Например, в случае RgDAAO весь фер�мент синтезировался в нерастворимой форме[91]. В активном и растворимом виде экспресси�ровался химерный белок, у которого на N�кон�це находились шесть дополнительных амино�кислот Met�Ala�Arg�Ile�Arg�Ala [91]. Содержа�ние активного фермента для всех DAAO состав�ляло не более 1–3% от общего растворимогобелка E.coli, а общий выход не превышал 10–30мг фермента с 1 л среды. Однако и такие выходыпозволили начать работы по направленному му�тагенезу и наработать pkDAAO и RgDAAO в ко�личествах, достаточных для получения их крис�таллов [91, 94].

Транспорт DAAO в пероксисомы при экспрес�сии в эукариотах позволяет избежать цитоток�сического действия пероксида водорода. Были про�ведены эксперименты по экспрессии TvDAAO вдрожжах Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyceslactis [86] и S.pombe [97], однако выход ферментане превышал выхода, достигнутого при экспрес�сии в клетках E.coli [90]. По�видимому, это былосвязано с тем, что в этих штаммах был недоста�точно высоким уровень синтеза FAD, необходи�мого для получения активной холоформы фер�мента. Недостаток FAD для синтеза холофер�мента также наблюдали и при экспрессииTvDAAO и RgDAAO в клетках E.coli [90, 92, 96].Например, в случае TvDAAO после добавлениясвободного FAD в бесклеточный экстракт ак�тивность фермента возрастала до 10 раз [96].

Наилучшие результаты были достигнуты приэкспрессии гена TvDAAO в метилотрофныхдрожжах Pichia pastoris под контролем промото�ра алкогольоксидазы 1 [98]. Алкогольоксидаза 1также является FAD�зависимым ферментом, аее промотор обеспечивает уровень биосинтезадо 25–30% от общих белков клетки [99]. Культи�вирование рекомбинантного штамма в режимекультуры клеток высокой плотности позволилодостичь выхода фермента до 23 000 ед. актив�ности (~220 мг) с 1 л среды [96], однако удельнаяактивность фермента в клетке была невысокой –всего 473 ед. активности на 1 г сухой биомассы,что соответствует содержанию рекомбинантной

TvDAAO порядка 1% от общих белков клетки.Общее время культивирования составило 40 ч, апродуктивность процесса – 575 ед. с 1 л среды в 1 ч.

В случае DAAO из метилотрофных дрожжейC.boidinii была использована гомологичнаяэкспрессия этого фермента [36]. В результатеповышения числа копий гена DAAO в хромосо�ме с 1 до 8 содержание фермента возросло с 2 до8% от общего белка клетки.

В нашей лаборатории также было проведеноклонирование гена TvDAAO и на его основе соз�дан экспрессионный вектор для получения ре�комбинантного фермента [100]. За счет пра�вильной стратегии при конструировании плаз�миды, а также подбора среды и условий культи�вирования был получен выход фермента более15 000 ед. активности (или 150 мг белка) с 1 лсреды при удельной активности ~2000 ед. актив�ности на 1 г сырой биомассы. Содержание ак�тивного фермента составило 20% от раствори�мых белков E.coli. Такое же количество фементасинтезировалось и в виде телец включения. Куль�тивирование проводилось в качалочных колбахобъемом от 1 до 5 л в течение всего 16 ч (продук�тивность процесса – 935 ед. с 1 л среды за 1 ч).При переходе к культивированию в ферменте�рах, позволяющих более строго контролироватьвсе параметры процесса (аэрация, рН, дозиро�вание питательной среды), выход фермента мо�жет быть повышен как минимум в 3–5 раз.

В заключение этого раздела отметим, чтопроблема создания высокоэффективной систе�мы экспрессии DAAO для ее промышленногоиспользования в качестве биокатализатора ещеочень далека от решения. Процесс получениярекомбинантных белков для целей биотранс�формации является экономически оправдан�ным, если его продуктивность составляет не ме�нее 2 г фермента с 1 л среды в сутки. Существу�ющие в настоящее время системы экспрессииDAAO по своей производительности как мини�мум в 10 раз уступают по данному параметру.

CУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Анализ литературных данных свидетельству�ет о различном спектре субстратной специфич�ности DAAO из различных источников. К сожа�лению, результаты разных авторов очень слож�но сравнивать между собой. Это связано с нес�колькими причинами. Во�первых, авторы ис�пользовали различные методы и условия опре�деления активности. Одним из наиболее попу�лярных методов является определение образую�щегося пероксида водорода в сопряженной ре�акции с пероксидазой. Использование разных

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

60

субстратов пероксидазы и различных условийпроведения реакции (рН, температура) приво�дит к значительным расхождениям в величинахактивности. Кроме того, при работе с бескле�точными экстрактами даже небольшие примесикаталазы сильно влияют на результаты анализа.Другой причиной расхождений полученных ре�зультатов может быть различная концентрациярастворенного кислорода, максимальная вели�чина которой при обычном давлении (0,21 мМпри рН 8,0 и 37° [33]) намного ниже, чем значе�ние Кm фермента по кислороду (0,72 мМ дляpkDAAO и TvDAAO [33]).

В табл. 2 приведены данные по измерениюактивностей нескольких DAAO с D�аминокис�лотами, полученные в одной работе [101] (де�текция образования перекиси водорода с по�мощью пероксидазы и о�дианизидина). В этутаблицу также добавлены данные по субстрат�ной специфичности DAAO из дрожжей C.boidinii[36]. Для иллюстрации влияния метода опреде�

ления активности в табл. 2 также представленырезультаты, полученные с TvDAAO другими ав�торами [33] (электрохимичекая регистрацияпотребления кислорода). Из таблицы хорошовидно, что, исходя из активности с D�аланином,все ферменты можно разделить на две группы.DAAO из микроорганизмов Fusarium oxysporum,Candida parapsilosis и C.boidinii высокоспецифич�ны именно к этой аминокислоте. Остальныеферменты микробиологического проихождениямаксимальную активность проявляют с D�мети�онином, D�триптофаном и D�фенилаланином.Наилучшим субстратом для DAAO из почексвиньи является D�пролин. Из данных, приве�денных в табл. 2, также хорошо видны различияв результатах по изучению субстратной специфич�ности TvDAAO, полученных в разных работах.

Отличительной чертой TvDAAO является са�мая высокая активность среди оксидаз D�ами�нокислот с цефалоспорином С, что и определя�ет его активное использование в разработке био�

свинья [101]

40

28

21

35

75

100

84

2

18

2

4

н.д.

н.д.

1

2

4

3

1

н.д.

н.д.

0,3 [102]

R.gracilis[101]

71

95

57

56

100

57

79

56

41

10

26

1

40

53

5

2

58

н.д.

4

3

2

C. boidinii[36]

100

8

7

н.д.

14

1,4

1,5

0

32

1,2

0

0

0,18

0

0

0

0

0

н.д.

н.д.

н.д.

C. parapsilosis[101]

100

15

92

н.д.

н.д.

41

19

9

6

н.д.

6

н.д.

2

5

25

25

4

н.д.

54

15

н.д.

F. oxysporum[101]

100

62

29

19

28

22

41

14

18

2

8

н.д.

3

15

н.д.

7

14

н.д.

н.д.

н.д.

1

V. luteoalbum[101]

57

41

42

15

100

4

50

н.д.

9

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

51

н.д.

н.д.

н.д.

7

10

2

1

Аминокислота

D�Аланин

D�Валин

D�Лейцин

D�Изолейцин

D�Метионин

D�Пролин

D�Фенилаланин

D�Триптофан

D�Серин

D�Треонин

D�Тирозин

D�Цистеин

D�Аспарагин

D�Глутамин

D�Лизин

D�Аргинин

D�Гистидин

D�Аспартат

D�Глутамат

Глицин

Цефалоспорин С

T.variabilis[33]

32

39

30–40

30–40

100

2

80

100

2

30–40

н.д.

0

70

н.д.

н.д.

30–40

88

0

<6

н.д.

25

Таблица 2. Субстратная специфичность оксидаз D�аминокислот из различных источников

Примечание: значения активности указаны в процентах к максимальной активности с наилучшим субстратом, н.д. – нетданных.

T.variabilis[101]

97

100

32

76

78

25

36

38

22

4

17

н.д.

65

81

17

43

88

4

9

н.д.

13

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

61

каталитических процессов получения 7�амино�цефалоспорановой кислоты (7�АСА) (см. ниже).TvDAAO также характеризуется высоким срод�ством к аминокислотам, с которыми она прояв�ляет максимальную активность. Значения Km

для D�фенилаланина, D�метионина, цефалос�порина С и D�аланина, определенные дляTvDAAO при рН 8,0, 37° и концентрации кисло�рода 0,21 мМ, составили 0,20, 0,29, 0,83 и 6,5 мМсоответственно [33]. Другие авторы [102], про�водившие измерения с TvDAAO при рН 8,5, 25°и концентрации кислорода 21% от насыщения,получили такое же значение Km для D�аланина(7,0 ± 0,9 мМ), в то время как величина Km дляцефалоспорина С была в 3 раза выше (2,4 мМ).Значение Km для D�аланина в случае RgDAAO иDAAO из C.boidinii составили 1,0 [84, 102] и 4,5 мМ[36] соответственно.

В заключение этого раздела отметим, что раз�личие в спектрах субстратной специфичностиDAAO из разных источников может быть исполь�зовано для селективного определения концентра�ции отдельных D�аминокислот в их смеси на ос�нове мультибиосенсора с различными ферментами.

СТАБИЛЬНОСТЬ DAAO

Температурная стабильность. Анализ зависи�мости величины остаточной ферментативнойактивности после 30�минутной инкубации ре�комбинантных pkDAAO, RgDAAO и нативнойTvDAAO при различных температурах показал,что по своей термостабильности TvDAAO нам�ного превосходит остальные ферменты [102].Значения Тм (температура, при которой теряет�ся 50% исходной активности после 30�минутнойинкубации) для исследованных перпаратовpkDAAO, RgDAAO и TvDAAO составили 39, 44 и54° соответственно (рН 8,0). Термостабильностьферментов сильно зависит от рН. Снижение рНраствора всего на 0,5 единицы (до 7,5) приводитк тому, что период полуинактивации RgDAAOпри 40° составляет уже 8 ч, а TvDAAO за этот пе�риод теряет менее 10% исходной активности[103]. Стабильность глициноксидазы из B.subtilisпри рН 7,0 сравнима со стабильностью TvDAAOпри рН 8,0 [88].

Инактивация мономерной pkDAAO и димер�ных RgDAAO и TvDAAO протекает по разныммеханизмам. Скорость инактивации pkDAAO независит от концентрации фермента, в то время какснижение концентрации RgDAAO всего в 3 раза(с 0,15 до 0,05 мг/мл) приводит к уменьшениюпериода полуинактивации с 8 ч до 45 мин [103].Аналогичные зависимости изменения величиныТм от концентрации фермента были получены

при исследовании термоинактивации RgDAAOс помощью других методов (сканирующая мик�рокалориметрия, флуоресценция и т.д.) [73].Эти данные указывают на то, что первым этапомпроцесса термоинактивации RgDAAO являетсядиссоциация фермента на отдельные субъеди�ницы. Для выяснения влияния олигомерногосостава RgDAAO на механизм термоинактива�ции фермент был получен в виде мономера с по�мощью метода направленного мутагенеза [72](см. выше). Оказалось, что перевод RgDAAO вмономерную форму приводит к сильной деста�билизации фермента (снижение величины Тм на5–6 град.), однако значение Тм остается посто�янным во всем изученном диапазоне концент�раций (0,1–3,5 мг/мл) [73].

В случае TvDAAO стабильность также зави�сит от концентрации фермента [103]. Нами бы�ло проведено детальное исследование зависи�мости скорости инактивации рекомбинантнойTvDAAO при разных концентрациях и темпера�турах. При комнатной температуре (20–22°) ирН 8,0 фермент не терял активности в течениенескольких дней. Исследование процесса тер�моинактивации TvDAAO в диапазоне темпера�тур 52–60° показало, что кривая зависимостиостаточной активности от времени описывают�ся суммой двух экспонент. Это свидетельствуето том, что инактивация фермента происходиткак минимум в две стадии. Величина константыскорости инактивации первой стадии обратнопропорционально зависела от концентрацииTvDAAO, в то время как константа скоростивторой стадии оставалась постоянной при всехизученных концентрациях фермента. Получен�ные данные соответствуют кинетической схеме,в которой на первой стадии происходит диссо�циация димера на отдельные субъединицы, ко�торые затем необратимо денатурируют:

k1 k2

N ↔ 2M → D , (2)k–1

где N – нативный димер, M – мономер и D –денатурированная форма фермента.

Значения активационных параметров – эн�тальпии ∆H# и энтропии ∆S#, рассчитанных длявторой стадии из зависимости величины конс�танты k2 от температуры, свидетельствуют, чтонаиболее вероятно протекание этой стадии помеханизму термоденатурации – разворачиваниябелковой глобулы.

Зависимости активности и стабильности DAAOот рН. D�Аминокислота с депротонированнойаминогруппой является лучшим субстратомDAAO, чем ее форма, в которой аминогруппа

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

62

имеет положительный заряд [19, 104]. Это связа�но с тем, что удаление протона с аминогруппыприводит к увеличению константы скорости от�рыва гидрид�иона от αC�атома субстрата в ак�тивном центре фермента. Поэтому можно пола�гать, что максимальная активность DAAO долж�на наблюдаться при щелочных рН, при которыхаминогруппа не имеет положительного заряда.Однако значение максимальной скорости реак�ции для RgDAAO c D�аланином достигается ужепри рН 8,5 [102, 104], что намного ниже величи�ны рК диссоциации протона от α�аминогруппы(9,0–9,5). Это связано с тем, что при связыва�нии D�аланина в активном центре фермента засчет изменения микросреды окружения рК егоаминогруппы снижается на 1 единицу − до зна�чения 8,0 [104]. В случае с TvDAAO уменьшениевеличины рК аминогруппы D�аланина, по�ви�димому, еще больше, так как фермент проявля�ет максимальную активность уже при рН � 7,5[102]. У pkDAAO рК аминогруппы D�аланинапри связывании в активном центре ферментаснижается всего на 0,5 единицы рН [102].

Как уже отмечалось выше, снижение рН сре�ды до величины 7,5 приводит к значительномуувеличению термостабильности DААО. Прикомнатной температуре (25°) зависимость ста�бильности этих ферментов от рН выражена нам�ного слабее. pkDAAO, RgDAAO и TvDAAO ста�бильны в диапазоне рН 6,0–8,0, а затем стабиль�ность дрожжевых ферментов падает, причем дляRgDAAO снижение стабильности начинаетсянемного раньше и идет более активно по срав�нению с TvDAAO. В случае pkDAAO при рН 9,5фермент в 2 раза более стабилен, чем при нейт�ральных рН [102].

КИНЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА РЕАКЦИИ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

На рис. 1 представлена обобщенная схемареакции, катализируемой DAAO. На первомэтапе происходит образование двойного комп�лекса фермент–D�аминокислота. Далее в этомкомплексе происходит перенос гидрид�иона отαC�атома аминокислоты на N(5)�атом изоал�локсазинового кольца с образованием восста�новленной формы FAD. Затем в зависимости отисточника фермента и от типа аминокислотывозможно протекание реакции по двум направ�лениям. В случае реакции pkDAAO с положи�тельно заряженными D�аминокислотами реак�ция протекает по верхнему пути, так как лими�тирующей стадией реакции является отщепле�ние иминокислоты (константа k4) и окислениеFAD перекисью водорода происходит до ее дис�

социации из активного центра [19]. В случаеRgDAAO лимитирующей стадией реакции явля�ется перенос гидрид�иона в двойном фермент�субстратном комплексе (константа k2) и для это�го фермента реакция протекает по классическо�му механизму типа «пинг�понг», когда окисле�ние восстановленного флавина происходит пос�ле диссоциации иминокислоты из двойногокомплекса фермент–восстановленный�FAD�про�дукт (E�Flred–P на рис. 1). Подробный анализданных в пользу таких кинетических схем при�веден в работе [19]. Данные кинетических ис�следований для глициноксидазы из B.subtilis по�казали, что кинетический механизм этого фер�мента аналогичен таковому для DAAO из млеко�питающих [105].

До недавнего времени предметом активнойдискуссии был механизм восстановления FAD вкомплексе DAAO−D�аминокислота. Ряд авто�ров высказывался в пользу двухстадийного кар�банионного механизма, согласно которому сна�чала происходит отрыв протона от αC�атомаD�аминокислоты с последующим переносомдвух электронов на N(5)�атом изоаллоксазино�вого кольца FAD. Вторым наиболее вероятныммеханизмом восстановления FAD является од�ностадийный прямой перенос гидрид�иона.Анализ структур высокого разрешения комп�лексов pkDAAO и RgDAAO с различнымиD�аминокислотами, их неприродными аналога�ми (например, трифтораланином) и ингибито�рами свидетельствует об отсутствии в активномцентре фермента функциональных групп – по�тенциальных кислот и оснований, необходимыхдля катализа стадии отрыва протона [19, 67–70].Дополнительные доказательства в пользу меха�низма прямого гидридного переноса были полу�чены при исследовании рН�зависимости пер�вичного дейтериевого изотопного эффекта икинетического изотопного растворителя в реак�ции окисления D�аланина и D�аспарагина, ка�тализируемой RgDAAO [104].

Сравнение аминокислотных последователь�ностей DAAO из разных источников, а такжеданные рентгеноструктруного анализа pkDAAOи RgDAAO свидетельствуют, что только несколь�ко остатков в активном центре участвует в ката�лизе ферментативной реакции [19] – Tyr223,Tyr238 и Arg285 (нумерация дана для остатковRgDAAO). Их роль в механизме действия pkDAAOи RgDAAO была изучена с помощью методанаправленного мутагенеза [106–110]. Получен�ные данные свидетельствуют, что основнаяфункция этих остатков заключается в правиль�ной ориентации D�аминокислоты в активномцентре относительно изоаллоксазинового коль�ца FAD за счет образования водородных связей

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

63

с карбоксильной группой субстрата [19]. Связы�вание α�аминогруппы происходит с помощьюводородных связей при участии остатка Ser335 имолекулы воды. Подробные сведения об орга�низации активного центра DAAO и роли отдель�ных остатков в катализе, связывании FAD исубстратов можно найти в работе [111].

DAAO обладают очень низкой специфич�ностью или вообще не катализируют окислениеD�аспарагиновой кислоты (табл. 2). Для окисле�ния этой аминокислоты у млекопитающих естьспециальные D�аспартатоксидазы. С. Саччи исоавт. [112] была предпринята попытка выяснитьпричины этого явления и получить мутантнуюRgDAAO с расширенным спектром субстратнойспецифичности. Сравнение аминокислотныхпоследовательностей, а также трехмерной струк�туры RgDAAO и модельной структуры DASPOиз почек быка показало, что в последнем фер�менте положение остатка Arg237 эквивалетноположению Tyr238 в структуре дрожжевой окси�дазы. Кроме того, в активном центре RgDAAOна расстоянии 3,8 Å от субстрата находится ос�таток Met213. Для более эффективного связыва�ния β�карбоксильной группы D�Asp были полу�чены точечный мутант RgDAAO Met213Arg идвойной мутант RgDAAO Met213Arg/Tyr238Arg,обеспечивавшие дополнительное введение в ак�тивный центр фермента одного и двух положитель�ных зарядов соответственно. Мутация Met213Argпривела к тому, что в реакции окисления D�ас�партата величина kcat возросла в 8 раз, а значениеКм снизилось в 10 раз по сравнению с соответ�ствующими значениями для RgDAAO дикоготипа. По своей каталитической эффективности(отношение kcat/Км) мутантная RgDAAO не усту�пала нативной DASPO из почек быка. В случаедвойного мутанта Met213Arg/Tyr238Arg величи�на kcat возросла в 53 раза, однако за счет худшейконстанты Михаэлиса величина kcat/Км была в2 раза меньше, чем для точечного мутантаRgDAAO Met213Arg. Данная работа являетсяпервым исследованием по инженерии субстрат�ной специфичности оксидаз D�аминокислот иполученные результаты вселяют оптимизм ввозможность создания мутантных форм фер�мента, обладающего более высокими каталити�ческим свойствами в реакции окисления цефа�лоспорина С – процесса, имеющего большоебиотехнологическое значение.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ DAAO

Основное внимание к DAAO в прикладномаспекте обусловлено перспективой ее примене�ния в двухферментном процессе получения

7�АСА из природного антибиотика цефалоспо�рина С. Общая схема процесса приведена нарис. 5. В отличие от одноферментного биоката�литического процесса получения 6�аминопени�циллановой кислоты из пенициллина G с помощьюпенициллинацилазы гидролиз цефалоспорина Сдо 7�АСА нельзя осуществить в одну стадию, таккак до сих пор не найден фермент с такой актив�ностью. DAAO катализирует первую стадию –окисление цефалоспорина С до α�кетоадипил�7�АСА (рис. 5). Далее под действием перекиси во�дорода, образовавшейся в результате оксидаз�ной реакции, происходит неферментативноеокислительное декарбоксилирование α�кетоади�пил�7�АСА до 7�β�(4�карбоксибутанамидо)це�фалоспорановой кислоты (глутарил� 7�АСА). Гид�ролиз глутарил�7�АСА до свободной 7�АСА про�текает при участии второго фермента глутарил�гидролазы. В процессе используются DAAO мик�робиологического происхождения, поскольку ихактивность с цефалоспорином С минимум на двапорядка выше, чем у ферментов из млекопитаю�щих [102]. Эта же биферментная система можетбыть использована для получения 7�аминодеза�цетоксиаминоцефалоспорановой кислоты [113].

В базе патентов «Derwent» имеется ~60 реги�ональных и международных патентов, посвящен�ных различным способам проведения процесса.Первоначально в качестве биокатализаторовпредполагалось использовать как целые свобод�ные, так и иммобилизванные клетки T.variabilisи R.gracilis [114–116]. Недостатком подхода с ис�пользованием целых клеток являются большиедиффузионные затруднения и наличие каталаз,разлагающих перекись водорода, необходимуюдля окисления кетоадипил�7�АСА. Для повы�шения активности клетки подвергали пермеби�ализации с помощью различных соединений[117, 118], а для снижения каталазной активнос�ти были получены мутантные по этому фермен�ту штаммы или клетки предварительно выдер�живали при рН 11 [119] или подвергали тепло�вой обработке при 40° [117].

Основным недостатком использования целыхклеток в качестве катализатора является низкоесодержание фермента. Были преприняты по�пытки повысить выход фермента за счет опти�мизации условия культивирования диких и по�лучения мутантных штаммов T.variabilis и R.gra(cilis [120, 121], а также рекомбинантных штам�мов других микроорганизмов [80]. Однако, нес�мотря на более чем 25�летний период исследо�ваний, пока так и не удалось создать высокоак�тивный промышленный катализатор на основецелых клеток.

Более успешным оказалось создание биока�тализатора на основе иммобилизованного фер�

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

64

мента [103, 122, 123]. Например, иммобилизацияTvDAAO и RgDAAO на активированной глиокси�лагарозе позволила существенно повысить тем�пературную стабильность ферментов, а опера�ционная стабильность RgDAAO была повышенав 15 000 раз. Для защиты ферментов от инакти�вации перекисью водорода [124] с помощью ме�тода направленного мутагенеза были удаленыостатки метионина, окисление которых вызыва�ло потерю ферментативной активности [125].

Одним из параметров, определяющих эф�фективность процесса, является концентрациярастворенного кислорода. Для достижения мак�симально возможного уровня окислителя ис�пользуют продувку раствора чистым кислоро�дом [102]. Технология рекомбинантных ДНКпозволила использовать принципиально новыйпуть повышения каталитической эффективнос�ти DAAO [126]. С помощью методов генной ин�женерии был получен химерный белок, состоя�щий из гемоглобина протеобактерий Vitreoscilla(Vhb) и RgDAAO. Связывание кислорода гемог�лобином повышало локальную концентрациюкислорода вблизи активного центра RgDAAO. Врезультате каталитическая эффективность им�мобилизованного химерного фермента по срав�нению с иммобилизованной RgDAAO была в 12

раз выше, при этом сродство к цефалоспоринуувеличилось в 2 раза, а операционная стабиль�ность возросла втрое. Химерный фермент Vhb�RgDAAO сохранял более 90% исходной актив�ности после 50 циклов проведения реакции.Степень конверсии цефалоспорина С составила99%, а чистота полученной глутарил�7�АСА –99,77% [127].

Успехи последних лет позволяют предполо�жить, что уже в ближайшее время будет созданпромышленный катализатор на основе иммоби�лизованной рекомбинантной DAAO. Проблемаполучения второго фермента – глутарилгидро�лазы − также близка к завершению [127]. Учиты�вая объем производимых цефалоспориновыхантибиотиков, биокаталитичекое получение7�АСА и дезацетокси�7�АСА будет одним из са�мых крупномасштабных процессов с участиемиммобилизованных ферментов.

Высокая стереоспецифичность DAAO по от�ношению к D�аминокислотам обусловливает ееприменение в аналитической биотехнологии.Иммобилизация фермента на поверхности элект�родов, регистрирующих расход кислорода илиобразование перекиси, позволяет создать безре�агентные электрохимические биосенсоры. Та�кие биосенсоры уже созданы для непрерывного

Рис. 5. Получение 7�аминоцефалоспорановой кислоты (7�ACA) из цефалоспорина С с помощью двухферментной систе�мы оксидаза D�аминокислот (DAAO) – глутарилгидролаза (GA)

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

65

1. Ghisla, S., and Massey, V. (1989) Eur. J. Biochem., 181,1–17.

2. Palfey, B.A., and Massey, V. (1996) in ComprehensiveBiochemical Catalisys (Sinnott, M., ed.), Academic Press,N.Y., pp. 83–154.

3. Swoboda, B.E. (1969) Biochim. Biophys. Acta, 175,365–379.

4. Choong, Y.S., Shepherd, M.G., and Sullivan, P.A. (1975)Biochem. J., 145, 37–45.

5. Massey, V., and Harris, C.M. (1997) Biochem. Soc. Trans.,25, 750–755.

6. Vermilion, J.L., and Coon, J.M. (1978) J. Biol. Chem., 253,8812–8819.

7. Stritmatter, P. (1961) J. Biol. Chem., 236, 2329–2335.8. Krebs, H.A. (1935) Biochem. J., 29, 1620–1644.9. Conlon, H. D., Baqai, J., Baker, K., Shen, Y.Q., Wong,

B.L., Noiles, R., and Rausch, C.W. (1995) Biotechnol.Bioeng., 46, 510–513.

10. Курочкина В.Б., Ныс П.С. (2002) Антибиотики ихимиотерапия, 47, 29–37.

11. Brodelius, P., Nilsson, K., and Mosbach, K. (1981) Appl.Biochem. Biotechnol., 6, 293–308.

12. Beard, T.M., and Turner, N.J. (2002) Chem.Commun.(Camb.), 3, 246–247.

13. Nakajima, N., Conrad, D., Sumi, H., Suzuki, K., Esaki, N.,Wandrey, C., and Soda, K. (1990) J. Ferm. Bioeng., 70, 322–325.

14. Van Staden, J.F., Stefan, R.I., and Aboul�Enein, H.Y.(2000). Fresenius J. Anal. Chem., 367, 178–180.

15. Dominguez, R., Serra, B., Reviejo, A.J., and Pingarron,J.M. (2001) Anal. Biochem., 298, 275–282.

16. Inaba, Y., Mizukami, K., Hamada�Sato, N., Kobayashi, T.,Imada, C., and Watanabe, E. (2003) Biosens. Bioelectron.,19, 423–431.

17. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y.,Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. (1996) J. Biochem.(Tokyo), 120, 14–17.

18. Mattevi, A., Vanoni, M.A., Todone, F., Rizzi, M.,Bolognesi, M., Coda, A., and Curti, B. (1996) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 93, 7496–7501.

19. Pilone M.S. (2000) Cell. Mol. Life Sci., 57, 1732–1747.20. Fraaije, M. W., and Mattevi, A. (2000) Trends Biochem.

Sci., 25, 126–132.21. Curti, B., Ronchi, S., and Pilone, M. S. (1992) in

Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes, vol. 3(Mueller, F., ed.), CRC Press, Boca Raton, pp. 69–94.

22. Cole, S.T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher,C., Harris, D., Gordon, S.V., Eiglmeier, K., Gas, S., BarryIII, C.E., Tekaia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown,D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K.,Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S.,Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Moule, S.,Murphy, L., Oliver, S., Osborne, J., Quail, M.A.,Rajandream, M.A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K.,Skelton, S., Squares, S., Sqares, R., Sulston, J.E., Taylor,

K., Whitehead, S., and Barrell, B.G. (1998) Nature, 393,537–544.

23. Camus, J.C., Pryor, M.J., Medigue, C., and Cole, S.T.(2002) Microbiol., 148, 2967–2973.

24. Omura, S., Ikeda, H., Ishikawa, J., Hanamoto, A.,Takahashi, C., Shinose, M., Takahashi, Y., Horikawa, H.,Nakazawa, H., Osonoe, T., Kikuchi, H., Shiba, T., Sakaki,Y., and Hattori, M. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98,12215–12220.

25. Hils, M., Munch, P., Altenbuchner, J., Syldatk, C., andMattes, R. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol., 57, 680–688.

26. Barbe, V., Vallenet, D., Fonknechten, N., Kreimeyer, A.,Oztas, S., Labarre, L., Cruveiller, S., Robert, C., Duprat,S., Wincker, P., Ornston, L.N., Weissenbach, J., Marliere,P., Cohen, G.N., and Medigue, C. (2004) Nucl. Acids Res.,in press.

27. Meister A. (1965) in Biochemisry of the Aminoacids, 2nd ed.,vol. 1, Academic Press, N. Y., pp. 297–304.

28. Pistorius, E.K., and Voss, H.A. (1977) Biochim. Biophys.Acta, 481, 395–406.

29. Sikora, L., and Marzluf, G.A. (1982) Mol. Genet. Gen.,186, 33–39.

30. Benz, F., Liersch, M., Nuesch, J., and Treichler H.J.(1971) Eur. J. Biochem., 20, 81–88.

31. Isogai, T., Ono, H., Ishitani, Y., Kojo, H., Ueda, Y., andKohsaka, M. (1990) J. Biochem. (Tokyo), 108, 1063–1069.

32. Sentheshanmuganathan, S., and Nickerson, W.J. (1962) J.Gen. Microbiol., 27, 465–471.

33. Schrader, T., and Andreesen, J.R. (1996) Arch. Microbiol.,165, 41–47.

34. Yoshizawa, M., Ueda, M., Mozaffar, S., and Tanaka, A.(1986) Agric. Biol. Chem., 50, 2637–2638.

35. Simonetta, M.P., Vanoni, M.A., and Curti, B. (1982)FEMS Microbiol. Rev., 15, 27–31.

36. Yurimoto, H., Hasegawa, T., Sakai, Y., and Kato, N.(2001) Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 627–633.

37. Ikeda, H., Ishikawa, J., Hanamoto, A., Shinose, M.,Kikuchi, H., Shiba, T., Sakaki, Y., Hattori, M., andOmura, S. (2003) Nat. Biotechnol., 21, 526–531.

38. Goodner, B., Hinkle, G., Gattung, S., Miller, N.,Blanchard, M., Qurollo, B., Goldman, B.S., Cao, Y.,Askenazi, M., Halling, C., Mullin, L., Houmiel, K.,Gordon, J., Vaudin, M., Iartchouk, O., Epp, A., Liu, F.,Wollam, C., Allinger, M., Doughty, D., Scott, C., Lappas,C., Markelz, B., Flanagan, C., Crowell, C., Gurson, J.,Lomo, C., Sear, C., Strub, G., Cielo, C., and Slater, S.(2001) Science, 294, 2323–2328.

39. La Rue, T.A., and Spencer, J.F.T. (1967) Can. J. Microbiol.,13, 777–788.

40. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., and Miyake, Y.(1988) FEBS Lett., 238, 180–184.

41. D’Aniello, A., D’Onofrio, G., Pischetola, M., D’Aniello,M., Vetere, A., Petrucelli, L., and Fisher, G.H. (1993) J.Biol. Chem., 268, 26941–26949.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

контроля процесса ферментации при получе�нии D�аланина [128], определения содержанияD�аминокислот в пищевых продуктах [129, 130],в лекарственных препаратов [14, 131, 132] и др.

DAAO из дрожжей и млекопитающих такжебыли использованы для хирального синтеза раз�личных синтонов – исходных соединений приполучении оптически чистых лекарственных

препаратов [133]. В качестве одного из приме�ров можно привести ферментативный синтезомапатрилата – ингибитора агеотензинпревра�щающего фермента [134].

Данная работа выполнена в рамках Федераль�ной целевой программы «Интеграция науки и выс�шей школы на 2002–2006 г.» (грант № Л�0114/999).

ТИШКОВ, ХОРОНЕНКОВА

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

66

42. Hasegawa, H., Matsukawa, T., Shinohara, Y., Konno, R.,and Hashimoto, T. (2004) Am. J. Physiol. Endocrinol.Metab., 287, 160–165.

43. Ohtani, S., Matsushima, Y., Ohira, H., and Watanabe,A.(1995) Growth Dev. Aging, 59, 55–61.

44. Poinar, H.N., Hoss, M., Bada, J. L., and Paabo, S. (1999)Science, 272, 864–866.

45. Man, E.H., Fisher, G.H., Payan, I.L., Cadilla�Perezrios,R., Garcia, N.M., Chemburkar, R., Arends, G., and Frey,W.H. (1987) J. Neurochem., 48, 510–515.

46. Schell, M.J., Molliver, M.E., and Snyder, S. H. (1995)Neurobiology, 92, 3948–3952.

47. Wolosker, H., Shetch, K.M., Takahashi, M., Mothet, J.P.,Brady, R.O., Ferris, C.D., and Snyder, S.H. (1999) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96, 721–725.

48. Hamase, K., Inoue, T., Morikawa, A., Konno, R., andZaitsu, K. (2001) Anal. Biochem., 298, 253–258.

49. Haradahira, T., Okauchi, T., Maeda, J., Zhang, M.R.,Nishikawa, T., Konno, R., Suzuki, K., and Suhara, T.(2003) Synapse, 50, 130–136.

50. Stevens, E.R., Esguerra, M., Kim, P.M., Newman, E.A.,Snyder, S.H., Zahs, K.R., and Miller, R.F. (2003) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6789–6794.

51. Cloninger, C.R. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,13365–13367.

52. Chumakov, I., Blumenfeld, M., Guerassimenko, O.,Cavarec, L., Palicio, M., Abderrahim, H., Bougueleret, L.,Barry, C., Tanaka, H., La Rosa, P., Puech, A., Tahri, N.,Cohen�Akenine, A., Delabrosse, S., Lissarrague, S.,Picard, F.P., Maurice, K., Essioux, L., Millasseau, P., Grel,P., Debailleul, V., Simon, A.M., Caterina, D., Dufaure, I.,Malekzadeh, K., Belova, M., Luan, J.J., Bouillot, M.,Sambucy, J.L., Primas, G., Saumier, M., Boubkiri, N.,Martin�Saumier, S., Nasroune, M., Peixoto, H., Delaye,A., Pinchot, V., Bastucci, M., Guillou, S., Chevillon, M.,Sainz�Fuertes, R., Meguenni, S., Aurich�Costa, J., Cherif,D., Gimalac, A., van Duijn, C., Gauvreau, D., Ouellette,G., Fortier, I., Raelson, J., Sherbatich, T., Riazanskaia, N.,Rogaev, E., Raeymaekers, P., Aerssens, J., Konings, F.,Luyten, W., Macciardi, F., Sham, P.C., Straub, R.E.,Weinberger, D.R., Cohen, N., Cohen, D., Ouelette, G.,and Realson, J. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,13675–13680.

53. Harrison, P.J., and Owen, M.J. (2003) Lancet, 361,417–419.

54. Schumacher, J., Jamra, R.A., Freudenberg, J., Becker, T.,Ohlraun, S., Otte, A.C., Tullius, M., Kovalenko, S.,Bogaert, A.V., Maier, W., Rietschel, M., Propping, P.,Nothen, M.M., and Cichon, S. (2004) Mol. Psyhiatry, 9,203–207.

55. Sasamura, T., Matsuda, A., and Kokuba, Y. (2002) Ann.Clin. Biochem., 39, 595–598.

56. Fang, J., Sawa, T., Akaike, T., and Maeda, H. (2002)Cancer Res., 62, 3138–3143.

57. Fang, J., Sawa, T., Akaike, T., Greish, K., and Maeda, H.(2004) Int. J. Cancer, 109, 1–8.

58. Piubelli, L., Caldinelli, L., Molla, G., Pilone, M.S., andPollegioni, L. (2002) FEBS Lett., 526, 43–48.

59. Settembre, E.C., Dorrestein, P.C., Park, J.H., Augustine,A.M., Begley, T.P., and Ealick, S.E. (2003) Biochemistry,42, 2971–2981.

60. Tettelin, H., Saunders, N.J., Heidelberg, J., Jeffries, A.C.,Nelson, K.E., Eisen, J.A., Ketchum, K.A., Hood, D.W.,Peden, J.F., Dodson, R.J., Nelson, W.C., Gwinn, M.L.,DeBoy, R., Peterson, J.D., Hickey, E.K., Haft, D.H.,Salzberg, S.L., White, O., Fleischmann, R.D., Dougherty,B.A., Mason, T., Ciecko, A., Parksey, D.S., Blair, E.,Cittone, H., Clark, E.B., Cotton, M.D., Utterback, T.R.,Khouri, H., Qin, H., Vamathevan, J., Gill, J., Scarlato, V.,Masignani, V., Pizza, M., Grandi, G., Sun, L., Smith,

H.O., Fraser, C.M., Moxon, E.R., Rappuoli, R., andVenter, J.C. (2000) Science, 287, 1809–1815.

61. He, J., Baldini, R.L., Deziel, E., Saucier, M., Zhang, Q.,Liberati, N.T., Lee, D., Urbach, J., Goodman, H.M., andRahme, L.G. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101,2530–2535.

62. Wierenga, R.K., Drenth, J., and Schulz, G.E. (1983) J.Mol. Biol., 167, 725–739.

63. Rossman, M.G., Liljas, A., Branden, C.�I., and Banaszak,L.J. (1975) in The Enzymes, 3rd ed., vol.11 (Boyer, P.D.,ed.), Academic Press, N.Y., pp. 61–102.

64. Subramani, S., (1993) Ann. Rev. Cell Biol., 9, 445–478.65. Campaner, S., Pollegioni, L., Ross, B.D., and Pilone, M.S.

(1998) Biochem. J., 330, 615–621.66. Miura, R., Setoyama, C., Nishina, Y., Shiga, K., Mizutani,

H., Miyahara, I., and Hirotsu, K. (1997) J. Biochem.(Tokyo), 122, 825–833.

67. Todone, F., Vanoni, M.A., Mozzarelli, A., Bolognesi, M.,Coda, A., Curti, B., and Mattevi, A. (1997) Biochemistry,36, 5853–5860.

68. Umhau, S., Pollegioni, L., Molla, G., Diederichs, K.,Welte, W., Pilone, M.S., and Ghisla, S. (2000) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 97, 12463–12468.

69. Pollegioni, L., Diederichs, K., Molla, G., Umhau, S.,Welte, W., Ghisla, S., and Pilone, M.S. (2002) J. Mol. Biol.,324, 535–546.

70. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K. J., Nishina, Y.,Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. (2000) J. Biochem.(Tokyo), 128, 73–81.

71. Mortl, M., Diederichs, K., Welte, W., Molla, G.,Motteran, L., Andriolo, G., Pilone, M.S., and Pollegioni,L. (2004) J. Biol. Chem., in press.

72. Piubelli, L., Molla, G., Caldinelli, L., Pilone, M.S., andPollegioni, L. (2003) Prot. Eng., 16, 1063–1069.

73. Pollegioni, L., Iametti, S., Fessas, D., Caldinelli, L.,Piubelli, L., Barbiroli, A., Pilone, M.S., and Bonomi, F.(2003) Prot. Sci., 12, 1018–1029.

74. Fukui, K., and Miyake, Y. (1992) J. Biol. Chem., 267, 18631–18638.75. Fukui, K., Momoi, K., Watanabe, F., and Miyake, Y.

(1988) Biochemistry, 27, 6693–6697.76. Watanabe, F., Fukui, K., Momoi, K., and Miyake, Y.

(1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 165, 1422–1427.77. Momoi, K., Fukui, K., Tada, M., and Miyake, Y. (1990) J.

Biochem. (Tokyo), 108, 406–413.78. Tada, M., Fukui, K., Momoi, K., and Miyake, Y. (1990)

Gene, 90, 293–297.79. Konno, R. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1395, 165–17080. Konno, R., Kurabayashi, A., Tsuchiya, M., and Niwa, A.

(1999) DNA Seq., 10, 85–91.81. Tsuchiya, M., Kurabayashi, A., and Konno, R. (2003)

Amino Acids, 24, 223–226.82. Sarower, M.G., Okada, S., and Abe, H. (2003) Arch.

Biochem. Biophys., 420, 121–129.83. Konno, R. (2001) Amino Acids, 20, 401–408.84. Pollegioni, L., Molla, G., Campaner, S., Martegani, E.,

and Pilone, M.S. (1997) J. Biotechnol., 58, 115–123.85. Liao, G.J., Lee, Y.J., Lee, Y.H., Chen, L.L., and Chu, W.S.

(1998) Biotechnol. Appl. Biochem., 27, 55–61.86. Gonzalez, F.J., Montes, J., Martin, F., Lopez, M.C.,

Ferminan, E., Catalan, J., Galan, M.A., and Dominguez,A. (1997) Yeast, 13, 1399–2008.

87. Hils, M., Munch, P., Altenbuchner, J., Syldatk, C., andMattes, R. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol., 57,680–688.

88. Job, V., Molla, G., Pilone, M.S., and Pollegioni, L. (2002)Eur. J. Biochem., 269, 1456–1463.

89. Job, V., Marcone, G.L., Pilone, M.S., and Pollegioni, L.(2002) J. Biol. Chem., 277, 6985–6993.

90. Lin, L., Chien, H.R., Wang, W., Hwang, T., Fu, H., andHsu, W. (2000) Enz. Microb. Technol., 27, 482–491.

ОКСИДАЗА D�АМИНОКИСЛОТ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

БИОХИМИЯ том 70 вып. 1 2005

67

91. Molla, G., Vegezzi, C., Pilone, M.S., and Pollegioni, L.(1998) Prot. Expr. Purif., 14, 289–294.

92. Alonso, J., Barredo, J.L., Diez, B., Mellado, E., Salto, F.,Garcia, J.L., and Cortes, E. (1998) Microbiology, 144, 1095–1101.

93. Pollegioni, L., Fuku, K., and Massey, V. (1994) J. Biol.Chem., 269, 31666–31673.

94. Setoyama, C., Miura, R., Nishina, Y., Shiga, K.,Mizutani, H., Miyahara, I., and Hirotsu, K. (1996) J.Biochem. (Tokyo), 119, 1114–1117.

95. Ciccarelli, E., Massaer, M., Guillaume, J.P., Herzog, A.,Loriau, R., Cravador, A., Jacobs, P., and Bollen, A. (1989)Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 865–872.

96. Alonso, J., Barredo, J.L., Armisen, P., Diez, B., Salto, F.,Guisand, J.M., L. Garcia, J., and Cortesa, E. (1999) Enz.Microb. Technol., 25, 88–95.

97. Isogai, A., Kimura, H., Reichert, A., Schorgendorfer, K.,Nikaido, K., Tohda, H., Giga�Hama, Y., Mutoh, N., andKumagai,H. (2002) Biotechnol. Bioeng., 80, 22–32.

98. Yu, J., Li, D.�Y., Zhang, Y.�J., Yang, S., Li, R.�B., and YuanZ.�Y. (2002) J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 18, 291–297.

99. Cereghino, J.L., and Cregg, J.M. (2000) FEMS Microbiol.Rev., 24, 45–66.

100. Давыдова Е.Е., Тишков В.И. (2002) Вестн. МГУ.Сер.2. Химия, 43, 353–355.

101. Gabler, M., Hense, M., and Fischer, L. (2000) Enz.Microb. Technol., 27, 605–611.

102. Pollegioni, L., Caldinelli, L., Molla, G., Sacchi, S., andPilone, M.S. (2004) Biotechnol. Prog., 20, 467–473.

103. Betancor, L., Hidalgo, A., Fernandez�Lorente, G., MateoC., Rodriguez, V., Fuentes, M., Lоpez�Gallego, F.,Fernandez�Lafuente, R., and Guisan, G.M. (2003)Biotechnol. Prog., 19, 784–788

104. Harris, C.M., Pollegioni, L., and Ghisla, S. (2001) Eur. J.Biochem., 268, 5504–5520.

105. Molla, G., Motteran, L., Job, V., Pilone, M.S., andPollegioni, L. (2003) Eur. J. Biochem., 270, 1474–1482.

106. Molla, G., Porrini, D., Job, V., Motteran, L., Vegezzi, C.,Campaner, S., Pilone, M.S., and Pollegioni, L. (2000) J.Biol. Chem., 275, 24715–24721.

107. Pollegioni, L., Porrini, D., Molla, G., and Pilone, M.S.(2000) Eur. J. Biochem., 267, 6624–6632.

108. Pollegioni, L., Harris, C.M., Molla, G., Pilone, M.S., andGhisla, S. (2001) FEBS Lett., 507, 323–326.

109. Nishina, Y., Sato, K., Shi, R., Setoyama, C., Miura, R.,and Shiga, K. (2001) J. Biochem. (Tokyo), 130, 637–647.

110. Setoyama, C., Nishina, Y., Tamaoki, H., Mizutani, H.,Miyahara, I., Hirotsu, K., Shiga, K., and Miura, R. (2002)J. Biochem. (Tokyo), 131, 59–69.

111. Pollegioni, L., Diederichs, K., Molla, G., Umhau, S., Welte, W.,Ghisla, S., and Pilone, M.S. (2002) J. Mol. Biol., 324, 535–546.

112. Sacchi, S., Lorenzi, S., Molla, G., Pilone, M.S., Rossetti,C., and Pollegioni, L. (2002) J. Biol. Chem., 277, 27510–27516.

113. Velasco, J., Luis, A.J., Angel, M.M., Diez, B., Soler, G.,and Barredo, J.L. (2000) Nat. Biotechnol., 18, 857–861.

114. Vicenzi, J.T., and Hansen G.J. (1993) Enz. Microb.Technol., 15, 281–285.

115. Kurillova, L., Gemeiner, P., Vikartovska, A., Mikova, H.,Rosenberg, M., and Ilavsky, M. (2000) J. Microencapsul.,17, 279–296.

116. Becka, S., Skrob, F., Plhackova, K., Kujan, P., Holler, P.,and Kyslik, P. (2003) Biotechnol. Lett., 25, 227–233.

117. Upadhya, R., Nagajyothi, I., and Bhat, S.G. (2000)Biotechnol. Bioeng., 68, 430–436.

118. Zhu, T.B., Chen, J., Zhang, Y.F., Yang, Y.L., and Jiao,R.S. (2001) Sheng Wu Gong. Cheng Xue. Bao., 17, 73–77.

119. Vicenzi, J.T. (1995) Deactivation of Catalase Enzyme UsingD(Aminoacid Oxidase Enzyme – by Contacting Enzymeswith Aq. Basic Soln. at pH of 11 to 12, Patent USA,US392438, 22 Feb 1995.

120. Kujan, P., Prell, A., Safar, H., Holler, P., Plhackova, K.,and Sobotka, M. (2001) Folia Microbiol. (Praha), 46, 427–431.

121. Molla, G., Motteran, L., Piubelli, L., Pilone, M.S., andPollegioni, L. (2003) Yeast, 20, 1061–1069.

122. Mateo, C., Abian, O., Fernandez�Lafuente, R., andGuisan, J.M. (2000) Biotechnol. Bioeng., 68, 98–105.

123. Dsouza, S.F., and Deshpande, A. (2001). Appl. Biochem.Biotechnol., 95, 83–92.

124. De la Matta, I., Ramon, F., Obregon, V.V., Castillon, M.P.,and Acebal, C. (2000) Enzyme Microb. Technol., 27, 234–239.

125. Ju, S.S., Lin, L.L., Chien, H.R., and Hsu, W.H. (2000).FEMS Microbiol. Lett., 186, 215–219.

126. Khang, Y.H., Kim, I.W., Hah, Y.R., Hwangbo, J.H., andKang, K.K. (2003) Biotechnol. Bioeng., 82, 480–488.

127. Monti, D., Carrea, G., Riva, S., Baldaro, E., and Frare,G. (2000) Biotechnol. Bioeng., 70, 239–244

128. Inaba,Y., Mizukami,K., Hamada�Sato,N., Kobayashi,T., Imada, C.,and Watanabe,E. (2003) Biosens. Bioelectron., 19, 423–431.

129. Voss, K., and Galensa, R. (2000) Amino Acids, 18, 339–352.130. Dominguez, R., Serra, B., Reviejo, A.J., and Pingarron,

J.M. (2001) Anal. Biochem., 298, 275–282.131. Stefan, R.I., van Staden, J.K., and Aboul�Enein, H.Y.

(2000) Biosens. Bioelectron., 15, 1–5.132. Stefan, R.I., Bokretsion, R.G., van Staden, J.F., and

Aboul�Enein, H.Y. (2003) Biosens. Bioelectron., 19, 261–267.133. Patel, R.N. (2000) Adv. Appl. Microbiol., 47, 33–78.134. Patel, R.N. (2001) Biomol. Eng, 17, 167–182.

D�AMINO ACID OXIDASE: STRUCTURE, MECHANISM, AND PRACTICAL APPLICATION

V. I. Tishkov, S. V. Khoronenkova

Department of Chemical Enzymology, Chemistry Faculty, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119992 GSP(3, Russia; fax +7(095)939(27(42, E(mail vit@enz.chem.msu.ru, tishkov@pochta.ru

Received July 15, 2004

D�amino acid oxidase (EC 1.4.3.3, DAAO) is an FAD�dependent enzyme. In microorganisms it participates inassimilation of exogenous D�amino acids. In mammals DAAO utilizes endogenous D�amino acids and regulates thelevel of D�serine in cerebral cells. DAAO from the yeast Rhodotorula gracilis and Trigonopsis variabilis are used in abiocatalytic two�enzyme process of preparation of 7�aminocephalosporanic acid from cephalosporin C – a keyintermediate in production of various semi�synthetic cephalosporins. This paper presents an overview of the mostrecent data on DAAO research in fundamental and practical aspects.

Key words: D�amino acid oxidase, cloning, expression, stability, protein engineering, Trigonopsis variabilis,Rhodotorula gracilis