第九章 第九章 DNADNA 序列测定序列测定

第一节 概 述第一节 概 述一、一、 DNADNA 序列测定序列测定

即核酸 DNA 分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。　　 1963 年， SangerSanger 和 ThompsonThompson 等人第一次完成胰岛素51 个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。 70 年代后期， SangerSanger 和 Maxam----GilbertMaxam----Gilbert 等人又建立了核酸序列测定的方法， Sanger 双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert 化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。

二、二、 DNADNA 序列测定工作原理序列测定工作原理

在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的 A 、 T 、 G 或 C 碱基，将待测 DNA 片段转变成一系列放射性核素标记的单链 DNA 片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差 1

个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出 DNA 的序列。

三、核酸序列分析的目的意义和策略三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（具体方法）

（一）序列分析的目的，（一）序列分析的目的， 22 种：种： 11 、确证性测序、确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列） 22 、从头序列、从头序列 目的是提供一段 DNA 准确的核苷酸序列。（未知基因序列）（二）测定在生物医学领域相应应用，（二）测定在生物医学领域相应应用， 22 个方面：个方面： 11 、、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。 22 、、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。（三）序列分析的策略（具体方案）（三）序列分析的策略（具体方案） 测序目的不同或靶 DNA 片段大小有区别，则序列分析的具体方案有所不同，所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略，这个问题在后面将涉及到，但由于学时限制，不可能完全展开来讲，请同学参看相关书籍。

四、测序的常用方法四、测序的常用方法

DNADNA 序列测定常用方法有如下序列测定常用方法有如下 33 种：种：

1、末端终止法 2、化学裂解法 3 、 DNA测序自动化

使用特异性引物与单链模板 DNA退火，在 DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用 ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差 1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。

用化学试剂在 A 、 G 、C 、 T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过 PAGE放射自显影可直读 DNA顺序。

类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。

优点 简便、迅速、应用广泛。

不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。

1、高负荷， 1块胶可测 16个样品； 2、机读不需放射自显影； 3、安全不用同位素； 4、简单迅速 8-10h。

不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 11 、制备待测、制备待测 DNADNA 序列模板；序列模板； 22 、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（ n=1n=1 ）；）； 33 、、 PAGEPAGE ；； 44 、读序。、读序。（ P255, 图 10-2 ）

五、测序的基本过程五、测序的基本过程

六、测序技术的最近发展六、测序技术的最近发展

11 、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒 解决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性。 22 、自动化测序仪、自动化测序仪 以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础，微机处理。 33 、热循环测序、热循环测序 使极少数测序产物线性放大。 44 、测序商品化、测序商品化 60.-180.￥，搞定。

七、七、 DNADNA 序列测定的应用序列测定的应用

分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列

分析基因序列分析基因序列

基因定点诱变的基础 基因定点诱变的基础

基因工程载体构建中基因工程载体构建中 DNADNA 序列定位和排序的基础序列定位和排序的基础

确定确定 DNADNA 序列中蛋白质的编码区序列中蛋白质的编码区

第二节 第二节 SangerSanger 双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法一、原 理一、原 理

（一）（一） DNADNA 复制的复制的 44 个基本条件个基本条件 11 、、 ssDNAssDNA 模板模板 22 、、 DDDPDDDP

33 、带有、带有 3’-OH3’-OH 末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物 44 、、 44 种种 dNTPdNTP

（二）链终止剂（（二）链终止剂（ chain-reminatorchain-reminator ）） ----2----2 ，， 3-3- 二脱氧核糖核酸酶二脱氧核糖核酸酶 当 3’-OH 由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过 5’磷酸形成 3’ ，5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相同的 4 组引物 -模板混合物，每一组加 4 种 dNTP ，其中 1 种用 32P

（或 35S ）标记，加 1 种 ddNTP ，每组将产生一种特异性的以 ddNTP

为末端的不同长度的核苷酸链，经 PAGE 分离，即可读出被测定的全部顺序（ dNTP 和 ddNTP竞争结合底物）。（ P255 ，图 10-2 ）

（三） （三） SangerSanger 双脱氧链终止法的原理双脱氧链终止法的原理

在 DNA合成时，利用 ddNTP与 dNTP竞争掺入到新生的 DNA 链上使链终止的原理。即在 A 、 C 、G 、 T 4 种反应体系中，分别加入不同的 ddNTP ，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的 5′ 末端，而 3′ 不同的 DNA 片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出 DNA 的核苷酸序列。

二、试 剂二、试 剂

（一）引物（一）引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为 DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶 DNA 片段克隆于 M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链 DNA 分子作为模板。也可用 Sanger 法测定变性双链 DNA模板序列（如变性质粒 DNA ）。以上两种情况都可以采用能与位于靶 DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知 DNA 序列互补的引物。 M13噬菌体重组子的通用测序引物一般长 15-29bp ，与紧靠M13mp18多克隆位点区的 HindIII 或M13mp19多克隆位点区 EcoRI 位点的序列互补。这些引物同样也可用于 PUC 质粒的 DNA 进行“双链”测序，并且已经商品化。

（二）模板（二）模板 纯单链 DNA 和经过热变性或碱变性的双链 DNA都可以用作 Sanger 法测定的模板。模板的质量和所用的 DNA

聚合酶的种类是至关重要的。 通常采用 M13噬菌体颗粒分离到的单链 DNA模板效果最佳，用变性双链 DNA 作模板则难获此效果。小量制备质粒 DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及 DNA 聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒 DNA 测定未知 DNA 克隆片段的序列，并不可取，如果用 CsCl-溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒 DNA ，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。

DNADNA 序列测定模板制备方法序列测定模板制备方法 因为 DNA 是相当大的分子，一般由几 kb 组成，最小的质粒和病毒也在 1kb 以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个 bp （以300-500bp 为好， 300bp最佳），所以测序前，可以用 2 种限制酶消化待测 DNA ，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收。回收片段，如果超过 700-800bp ，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收。然后分别测定每个片段的顺序。由于两种限制酶在 DNA 链上的切点位置不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据 2 片段的这种末端重叠现象，用计算机定出各片段的位置，而排出 DNA 的全部序列。 在测序中，小片段 DNA只需直接克隆到 M13mp 或者质粒载体中，进行双链或单链模板测序。现在常用的 M13mp载体一般是成对设计，如 M13mp18 与 M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一待测的 DNA 片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序。对于数 kb 大片段 DNA 分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克隆，原位亚克隆，包含上述用 2 种限制酶消化 DNA 等。

11 、用噬菌体、用噬菌体 M13M13 克隆待测克隆待测 DNADNA 片段片段 11 ）噬菌体）噬菌体 ---- 是寄生在细菌的病毒。存在 3 种状态，有尾 20 面体，无尾 20 面体和丝状单链噬菌体（ filamentous ）， M13 是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的 DNA 。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型 DNA （ Replicative form

DNA ， RF DNA ），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝。成熟的噬菌体成为单链（正链、 RF 则以正链为模板复制 1条链，再以此链复制正链）分泌到培养液中。因此双链 DNA （ RF ）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆所用的载体。从培养上清液提取成熟的单链 DNA做为测序模板。 在感染过程中， M13 并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制。 dsDNA复制又产生大量的 ssDNA ，它被 1 个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是 M13 不同于其他噬菌体的特点。每ml培养液沉淀的噬菌体可提取 5-10mgssDNA ，产量是很高的。用作克隆载体， M13 有 1 个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源 DNA 其中 1条链的 DNA 分子，后者可在下列工作中充作模板： （（ 11 ）末端终止法测序）末端终止法测序 （（ 22 ）制备“放标”单链用于杂交）制备“放标”单链用于杂交 DNADNA探针探针 （（ 33 ）利用寡核苷酸进行定点诱变。）利用寡核苷酸进行定点诱变。

22 ）） M13mp18M13mp18 和和 M13mp19M13mp19 载体载体 （（ 11 ）） mpmp 系列载体特点：系列载体特点： ① ①都是从同一重组 M13mp1改造而来。 ②②在基因 II-IV （ 500bp ， 570bp左右）之间有 1 个多克隆位点（ multiple cloning sites ， MCS ）可供外源基因插入。 ③ ③该区域（ MCS ）插入了 1 小段 Ecoli.DNA ，有 β-半乳糖苷酶基因（ LacZ ）的调控序列及其 N 端 146 个 aa编码信息，它与宿主菌（含LacZ ） α-互补，形成有活性的 β-半乳糖苷酶，使平板上底 X-gal 生色成蓝噬菌斑，当外源基因插入MCS ，破坏了 α-互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志。 （（ 22 ）） M13mp18M13mp18 和和 M13mp19M13mp19 是一对载体，它们有相同的 13 个多克隆位点，但方向相反。（当 RF DNA被两种限制酶切割后， M13mp18 和M13mp19轻易不能重新环化，当连接混合液中含外源匹配末端 dsDNA片段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入。这样 M13mp18正链中含有外源 DNA 的一条链，而在 M13mp19正链中含外源 DNA 的另一条链）。所以 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体可用同一通用引物，（从所插入 DNA 片段任一端开始），测定互为相反两条链的 DNA 序列。（并可制备只与外源 DNA任意 1 条 DNA 链互补的探针）。（分子克隆 P202 ）。

22 、定向连续次级克隆待测大片段、定向连续次级克隆待测大片段 DNADNA 片段片段 测定数 kb 的 DNA 序列时，可以建立一系列一端删切 200-300bp

的 DNA 片段次级克隆。对它们分别测序，就可以连续读出该大片段DNA 的全部序列。核酸酶 BAL31 和核酸外切酶 III ，均可以达到连续删切的目的。 核酸酶核酸酶 BAL31-BAL31---- 是从乳白短杆菌（ Brevibacterium albidum ）细菌中分离。它能以渐进的方式将线型 DNA 分子的 3’ ， 5’两端同时降解，形成小的寡核苷酸片段或单核苷酸。底物可以是带延伸末端的，也可以是平头末端的 dsDNA ，对 3’ ， 5’两端降解有同样性，此酶要求Ca2+ 作辅因子，以 EDTA 作螯合剂，可使该酶失活。 BAL31还有较弱的单链特异内切酶活性，与核酸酶 S1 相似，降解ssDNA 或 ssRNA形成 5’磷酸末端的单或寡核苷酸酶片段，能从 DNA

片段中切除单链尾巴，产生平头末端。核酸酶 S1 是从米曲霉（ Aspergillus Oryze ）中分离的。 外切核酸酶外切核酸酶 III-III---- 是一种从 E.coli 中分离，从 dsDNA 的 3’-OH 末端降解产生 5’ 单核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶 III还有内核酸酶，RnaseH 和 3’-磷酸酶的活性。

（三）（三） DNADNA 聚合酶聚合酶11 、大肠杆菌、大肠杆菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 I KlenowI Klenow 大片段大片段 Klenow 大片段 ----DDDPI 是由分子量 109KD 一条多肽链组成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成 2 个片段， 1 个片段分子量为 76KD ，有聚合酶，3’→5’外切酶活力，此片段称为 Klenow 片段，另一片段 34KD ，有 5’→外切酶活力。 此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物 250 个核苷酸以内的序列。此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列 DNA 次级克隆的鉴定仍有应用价值。22 、测序酶（、测序酶（ SequenaseSequenase ）） 测序酶是经过改造的 T7噬菌体 DNA 聚合酶，消除了 3’→5’外切酶活性。活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长 DNA 序列的首选酶。该酶及名称是 HSB公司的专利。试剂盒已商品化。33 、、 TaqDNATaqDNA 聚合酶聚合酶 Taq酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（ 70-80℃ ）进行反应的优点，因而能克服富含 GC 序列的模板形成自身二级结构对测定的影响，将 PCR与末端终止法测序结合进行，只需少量模板。

（四）放射性同位素标记的（四）放射性同位素标记的 dNTPdNTP

传统 32P-dNTP ，由于 32P衰变过程中产生高能的 β 射线，导致放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量。另外，由于 32P 对 DNA 样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应后 24 小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果。 α-32S-dNTP近年来得到广泛使用，它解决了 32P 的两大缺点，具有很高的分辨率，较低的本底。测序反应产物 -20℃保存一周并不明显影响反应结果。

（五）用于测序的变性凝胶电泳（五）用于测序的变性凝胶电泳

胶长胶长 40cm40cm ，厚度均匀，厚度均匀

4~8%4~8%丙烯酰胺丙烯酰胺

7mol/L7mol/L尿素 尿素

三、三、 SangerSanger 法测序主要反应（实习讲义法测序主要反应（实习讲义 P13P1388 ））

（一）制胶（二）模板变性（双链）（三）测序反应 1 、模板引物退火 2 、链延伸、链标记、链终止反应 3 、上样电泳 4 、读片（序） （分子克隆 P640 ） （必须经过实践才能获得技巧）

四、大片段四、大片段 DNADNA 的测序方法的测序方法

（一）随机法（一）随机法

超声波处理：将超声波处理：将 DNADNA随机断裂成一组相互重叠的随机断裂成一组相互重叠的 3030

0~900bp0~900bp 片段，电泳回收片段，电泳回收 300~600bp300~600bp 片断作亚克隆片断作亚克隆

DNaseIDNaseI 切割：将切割：将 DNADNA随机切割成一组相互重叠的随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆片段，作亚克隆

限制酶消化：限制酶将限制酶消化：限制酶将 DNADNA切割为含粘端的切割为含粘端的 DNADNA

片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序行测序

（二）嵌套缺失法（二）嵌套缺失法

1 、将待测 DNA与M13mp载体相连，构成重组体。 2 、用两种限制酶从待测 DNA 片段的一端与载体序列之间将 DNA切断，产生线性 DNA ，使近待测 DNA 片段的一端为 5′ 突出末端，近载体一端为 3′ 突出末端。 3 、外切核酸酶Ⅲ从 5′ 突出末端消化待测 DNA ， 37°

C 时，每分钟水解 250 个核苷酸 4 、核酸酶 SI去除残余单链，自我环化，转化或转染宿主菌得到次级克隆。 5 、将各克隆用于测序。

（三）引物延伸法

是一种定向测序法，从 DNA 的 3′依赖特定引物延伸测定一段 DNA 序列，再根据测得序列设计新的引物，作下一延伸反应的引物，如此向前推进，最终测得 DNA 的全长序列。

第三节 第三节 Maxam-GilbertMaxam-Gilbert 化学裂解法化学裂解法

化学裂解化学裂解（直读， Sanger 双脱氧末端法也是直读法）法是 Maxam 和 Gilbert 等人 1977 年创建的，用来测定DNA 序列。化学法是用化学试剂在 A 、 G 、 C 、 T处特定地裂解 DNA 片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1 ），经过 PAGE 和放射自显影后，可以直接读出 DNA

的顺序。 某些试剂能修饰或破坏 DNA 链上特定核苷酸的碱基进而使 N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以 β-消除反应，在 3’ 和5’ 位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。 4 种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下：

一、化学裂解法测序的原理一、化学裂解法测序的原理

1 、用放射性核素标记待测 DNA 一侧末端

2 、将标记 DNA 分为 G 、 A+G 、 C+T 、 C 4 个反应体系

3 、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂 DNA

片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的 DNA 片段的混合物

4 、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出 DNA 序列

表表 -------- 特异断裂特异断裂 44 种脱氧核苷酸的方种脱氧核苷酸的方法法

作用的碱基 试剂与反应 碱基释放 DNA断裂

强 G/ 弱 A

稀释 250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（ PH8.0 ） 10MMgCl2 、 0

.1MEDTA20℃60分钟， DNAG 的 N7 和 A 的

N3甲基化

甲基化嘌呤不稳定，在中型 PH加热被破坏

在 0.1M碱中， 90℃15分钟，戊糖脱落， DNA链断裂， G断裂比 A

快 5倍

A 同上0.2NHCl 、 0℃ 、 60

分钟，碱基被破坏同上， A断裂比 G

快

C+T 15-18M联苯胺、 20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放0.5M哌啶处理，断裂 DNA键， C 与 T

有同样速率

C2MNaCl，联氨处理方法同上， 100分钟，此时， T

的破坏被抑制，只有 C被破坏释放同上，只在 C处断裂DNA链

在在 44 种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂 DNADNA 的机制是：的机制是：

G 反应 ----硫酸二甲酯（ DMS ）使 GN7甲基化，其后断开了 C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A 反应 ---- （哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C 反应 ----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C 反应 ---- 在 NaCl存在时，只有 C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。

二、碱基特异性修饰及裂解二、碱基特异性修饰及裂解

反应体系反应体系 碱基修饰试剂碱基修饰试剂 碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂 断裂点断裂点

GG 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶六氢吡啶 GG

G+AG+A 甲酸甲酸 脱嘌呤作用脱嘌呤作用 六氢吡啶六氢吡啶 GG 和和 AA

C+TC+T 肼肼 嘧啶开环嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 CC 和和 TT

CC 肼（加盐）肼（加盐） 胞嘧啶开环胞嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 CC

（一）（一）限制酶消化待测 DNA ，得到长度为 100-200bp 的一组片段，纯化回收每 1 个片段作为测序材料。（二）（二）碱性磷酸酶处理消除 5’磷酸。（三）（三）多核苷酸酶催 32PdNTP 标记（ 5’-OH ）末端。（四）（四）使标记片段变性为单链。（五）（五）分成 4-5 个反应体系，按上述程序（表或 4 个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每 1 个 DNA 分子只有 1 个位置被断裂，这种断裂是随机的，如 G 反应，则在 DNA 链上任意位置 G 断裂）， DNA链上每 50-100 碱基只有 1 个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂 DNA 链，但由于碱基位置不同，产生 1 组不同长度的 DNA 片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测 DNA全长。（六）（六）电泳（七）（七）放射自显影（八）（八） 4 个反应管统一阅读， DNA4 个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测 DNA全部核苷酸序列就可直接读出。

二、化学法测序的基本步骤二、化学法测序的基本步骤

（三、四略讲）（三、四略讲）

三、化学法的优点三、化学法的优点

化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原 DNA 分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究 DNA 二级结构及蛋白质与 DNA 的相互作用。

三、化学裂解法的特点三、化学裂解法的特点

不需酶催化不需酶催化

5 5 ′′ 和和 3 3 ′′ 端均可标记，可从两方向测同一端均可标记，可从两方向测同一 DNADNA

操作繁琐、费时、分辨率较低操作繁琐、费时、分辨率较低

四、化学法读序四、化学法读序

化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为 4 或 5条垂直的阶梯带， A>C 反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读， G+A

和 C+T两列中含有所有相差一个碱基的 DNA 片段。如果 G+A 中出现 1

条带就看 G 列中是否有同样大小的带，若有即为 G 碱基，无则为 A 碱基；同理， C+T 中则检查 C 列中有无同样大小条带，有即为 C ，无则为 T 。在做了 A>C 反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为 A 碱基。化学法必须 4 或 5 个反应管统一阅读， DNA 中 4 个碱基每个位置都有 1 个相应的片段，待测的 DNA全部序列可直接读出。（专业技术人员） 化学法测序采用 32P 标记 DNA 进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为 200-300bp 以内。读序常见问题及解决办法参见分子克隆 P665 。 末端法读序（分子克隆 P640 ）

第三节 第三节 DNADNA 测序自动化和大规模测测序自动化和大规模测序序

特点特点

原理同末端终止法原理同末端终止法

标记物为荧光染料标记物为荧光染料

激光扫描自动测序激光扫描自动测序

结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高

测序速度快 测序速度快 200bp/h200bp/h

DNADNA 自动测序与手工测序的不同点自动测序与手工测序的不同点

11 、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用序采用 44 种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记 ddNTPddNTP 或标记引物或标记引物

22 、加样方式不同：手工测序，一个样品的、加样方式不同：手工测序，一个样品的 44 个测序反应物个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳

33 、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从 44 种寡聚种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出核苷酸的梯子形图谱中读出 DNADNA 序列，而自动测序则采序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑