第十三章 第十三章 DNADNA的生物合成的生物合成

DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。

生物体的遗传信息就贮存在 DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。

DNA 通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。 DNA 的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

在 RNA 病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是 RNA 通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

DNA dependent DNA polymerase——DDDP

DNA dependent RNA polymerase——DDRP

RNA dependent RNA polymerase——RDRP

RNA dependent DNA polymerase——RDDP

DNA生物合成有两种方式： DNA复制和反转录

DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器 DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）

DNA的体外复制：分子克隆。

第一节 第一节 DNADNA的复制的复制

一、 DNA的复制特点（一）、半保留复制

DNA在复制时，以亲代 DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代 DNA中都含有一股亲代 DNA 链，这种现象称为 DNA 的半保 留 复 制 (semi-conservative replication)。

1、 DNA以半保留方式进行复制，是在 1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含 15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为 15N。将大肠杆菌移至只含 14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取 DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

2、、复制起始点DNA 在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。

复制起点是以一条链为模板起始 DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如 D环复制）。

在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。

多数生物的复制起点，都是 DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含 A.T。

3、、需要引物 参与 DNA 复制的 DNA 聚合酶，必须以一段具有 3’端自由羟基（ 3’-OH）的 RNA作为引物 (primer) ，才能开始聚合子代DNA链。

RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～ 100个核苷酸，而在真核生物中约为 10个核苷酸。 RNA引物的碱基顺序，与其模板 DNA 的碱基顺序相配对。

3、、双向复制

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

（二）、半不连续复制

由于 DNA 聚合酶只能以 5'→3' 方向聚合子代 DNA链，即模板 DNA链的方向必须为 3'→5' 。因此，分别以两条亲代 DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。

以 3'→5' 方向的亲代DNA 链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为 5'→3' ，这一条链被称为领头链 (leading strand) 。 而 以5'→3'方向的亲代 DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是 5'→3' ，这条链被称为随从链(lagging strand)。

由于亲代 DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。 DNA 在复制时，由随从链所形成的一些子代 DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～ 2000个核苷酸，而在真核生物中约为 100个核苷酸。

二、 二、 DNADNA复制的条件复制的条件

（一）、底物

以四种脱氧核糖核酸 (deoxynucleotide triphosphate) 为 底 物 ， 即dATP， dGTP， dCTP， dTTP。

 (dNMP)n+dNTP

(dNMP)n+1+PPi

（二）、模板 (template)DNA 复制是模板依赖性的，必须要以亲代 DNA 链作为模板。亲代 DNA 的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

（三）、引发体和 RNA引物

引发体 (primosome) 由引发前体与引物酶（ primase）组装而成。

引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白 i、蛋白 n、蛋白 n”、蛋白 dnaC与引物预合成有关，蛋白 n’与蛋白 dnaB与识别复制起始点有关，并具有 ATPase活性。

引物酶本质上是一种依赖 DNA的 RNA聚合酶（ DDRP），该酶以 DNA为模板，聚合一段RNA 短链引物 (primer) ，以提供自由的 3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

（四）、（四）、 DNADNA 聚合酶聚合酶 (DDDP)(DDDP)

1、种类和生理功能：在原核生物中，目前发现的 DNA聚合酶有三种，分别命名为 DNA 聚合酶Ⅰ（ pol Ⅰ ）， DNA Ⅱ聚合酶 （ pol Ⅱ）， DNA Ⅲ聚合酶 （ pol Ⅲ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与 DNA复制的主要是 pol Ⅲ和pol Ⅰ。

pol Ⅰ为单一肽链的大分子蛋白质 ,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为 Klenow fragment ，具有 5'→3'聚合酶活性和 3'→5'外切酶的活性。

pol Ⅲ由十种亚基组成，其中 α亚基具有 5'→3'聚合 DNA的酶活性，因而具有复制 DNA 的功能；而 ε 亚基具有3'→5' 外切酶的活性，因而与 DNA 复制的校正功能有关。

原核生物中的三种DNA  聚合酶 pol Ⅰ pol Ⅱ pol Ⅲ 5' → 3'聚合酶活性 + + + 5' → 3'外切酶活性 + - - 3' → 5'外切酶活性 + + + 生理功能 去除引物,填补缺口 未知 DNA复制 修复损伤 校正错误

校正错误

在真核生物中，目前发现的 DNA聚合酶有五种，分别命名为 DNA 聚合酶α（ pol α）， DNA聚合酶 β（ pol β ） ， DNA 聚 合 酶 γ （ pol γ ） ， DNA 聚 合 酶 δ （ pol δ），DNA聚合酶 ε（ pol ε）。

其中，参与染色体 DNA 复制的是 pol α（延长随从链）和 pol δ（延长领头链），参与线粒体 DNA 复制的是 pol γ， polε与 DNA损伤修复、校读和填补缺口有关， pol β只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

2、DNA复制的保真性： 为了保证遗传的稳定， DNA的复制必须具有高保真性。 DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：

遵守严格的碱基配对规律；DNA 聚合酶在复制时对碱基的正确选择；

对复制过程中出现的错误及时进行校正。

（五）、DNA连接酶

DNA 连接酶 (DNA ligase) 可催化两段 DNA 片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。

DNA 连接酶催化的① 条件是： 需一段

DNA 片段具有 3'-OH ， 而 另 一 段DNA片段具有 5'-Pi

② 基； 未封闭的缺口位于双链 DNA 中，即其中有一条链是完

③ 整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生 物 中 由 ATP 供能。

（六）、单链DNA结合蛋白

单 链 DNA 结 合 蛋 白 （ single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（ HDP）。这是一些能够与单链 DNA结

① 合的蛋白质因子。其作用为： 使解开双螺旋后的 DNA 单链能够稳定存在，即稳定单链DNA ，便于以其为模板复制子代 DNA ② ；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

（七）、解螺旋酶

解螺旋酶（ unwinding enzyme ） ，又称解链酶或 rep蛋白，是用于解开 DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子 ATP 。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

（八）、拓扑异构酶(topoisomerase)

Ⅰ拓扑异构酶 可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将 DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓

Ⅱ扑异构酶 可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。 Ⅰ大肠杆菌拓朴异构酶 的结构

三、 三、 DNADNA生物合成过程生物合成过程

＃复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 （一）预引发： 1．解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使 DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链 DNA。单链 DNA结合蛋白（ SSB）结合在两条单链 DNA上，形成复制叉。

DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

2．引发体组装：由蛋白因子（如 dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

（二）引发：

在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的 RNA片段，从而获得3'端自由羟基（ 3'-OH）。

＃复制的延长＃复制的延长 （一）聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以 3'→5'方向的亲代

DNA链为模板，从 5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA Ⅲ聚合酶 ；而在真核生物中，是DNA聚合酶 α(延长随从链 )和 δ（延长领头链）。

（二）引发体移动：

引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

＃复制的终止＃复制的终止

（一）去除引物，填补缺口：

在原核生物中，由DNA Ⅰ聚合酶 来水解去除 RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中， RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

（二）连接冈崎片段：

在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

（三）真核生物端粒的形成：端粒（ telomere）是指真核生物染色体线性

DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、 C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

一段 DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。

功能：⑴保证线性 DNA的完整复制⑵保护染色体末端⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表

达端粒酶。

线性 DNA在复制完成后，其末端由于引物 RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（ telomerase）的催化下，进行延长反应。

端粒酶是一种 RNA- 蛋白质复合体，它可以其 RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

端粒酶端粒酶 (telomerase)(telomerase)的作用机制的作用机制

人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短 50-200bp ，短至 1-4Kbp 时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。

# DNA复制的真实性

生物体 DNA复制具有高度真实性，复制 107-1011碱基对 ,只有一个错误碱基。

碱基对的自由能通常在 4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入 100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠 Watson-Crick 双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达 10-2 。

1    、 DNA聚合酶对碱基的选择作用酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的 dNTP 能长时间停留，而参与聚合。 DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。酶积极参与理论： DNA 聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入 DNA引物端的速度也不同。动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时， dNTP

—结合在酶与模板 引物复合物的聚合位点上， DNA聚合酶能识别正确与错误的 dNTP。

DNA聚合酶对底物的识别作用， DNA聚合酶有两种底物，一种是 DNA —模板 引物，另一种是 dNTP。

DNA聚合酶先识别 DNA模板和引物的 3 ，未端，再识别底物 dNTP，是一种有序的识别过程。

2    、 3 ，→ 5 ，外切活性的校正阅读 E. coli. DNA pol.Ⅰ和 pol.Ⅲ有 3 ，→ 5 ，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。

缺失 3 ， → 5 ，外切活性的 E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化 DNA合成时，出现错误的几率增高 5-50倍。因此， 3 ，→ 5 ，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高 1-2个数量级。

 

3    、 影响 DNA合成真实性的因素 ⑴高浓度 NMP(如 3 ， -AMP, 5 ， -GMP)

NMP 竞争酶的 dNTP 结合位点，抑制3 ，→ 5 ，外切活性。

⑵某一种 dNTP浓度银高 ,可使引物 3 ，末端离开外切活性中心。

⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式， Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和 3 ，→ 3 ，外切活性。

4    、 为什么用 RNA引物⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链， DNA聚合酶的 5 ，→ 3 ，校对功能难发挥作用。

第二节 逆转录 第二节 逆转录

以 RNA为模板，合成 DNA，称为逆转录（ reverse transcription）。与通常转录过程中遗传信息流从 DNA到 RNA的方向相反，又称为反转录。

致癌 RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基

因治疗的载体。

所有已知的致癌 RNA病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（ retrovirus），反转录病毒的复制需要经过一个 DNA 中间体（前病毒）。

反转录病毒的基因组结构的特点：（ 1 ） 反转录病毒基因组通常由两条相同的（ +） RNA链组成。 5’端附近区域以氢键结合在一起，全长 7-10Kb。（ 2） 每一条 RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（ 3） 5’端有帽子结构， 3’端有 polyA，与真核 mRNA相似。（ 4） 5’端带有 1分子的宿主 tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是 tRNApro

1986年 7月 25日，世界卫生组织（WHO）发布公报，国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改称为人类免疫缺陷毒（ Hmuan Immunodeficiency Virus）简称 HIV。

HIV呈袋状球形，直径约 150毫微米，包膜由一薄层类脂质构成，具有抗原性。

HIV有 10%碱基序列不同。是单链RNA病毒，外有核壳蛋白，还有一种特殊的逆转录酶，以单链RNA作为模块，转录为双链DNA，该双链DNA可与宿主细胞的DNA结合然后逆转录为病毒的单链DNA，因此感染艾滋病病毒后，病毒的核酸永远与宿主细胞结合在一起，使得感染不能消失，机体无法清除病毒。

一、逆转录的条件一、逆转录的条件 1.逆转录酶RNA指导的 DNA聚合酶活力； RNase H酶活力，水解 RNA—DNA杂种分子中的 RNA； DNA指导的DNA聚合酶活力。

2.模板 (RNA或 DNA)以自身病毒类型的 RNA为模板时，该酶活力最大，但是带有适当引物的任何种类的 RNA 都能作为合成DNA的模板。

3.引物 (RNA或 DNA)引物不少于四个核苷酸。 4.底物： dNTP 5.二价阳离子：Mg2+或Mn2+

二、 逆转录过程 二、 逆转录过程

以前任宿主的 tRNA为引物复制末端 ,需要借助末“ ”端重复结构进行 跳跃 。

当致癌 RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒 RNA及逆转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使 RNA反转录成双链 DNA。

①逆转录过程包括： 以病毒（ +） RNA为模板，合成互补的（ -） DNA ②。 切除 RNA—DNA杂种分子中的 RNA ③。 以（ -） DNA链为模板，合成（ +） DNA链，最后形成两端带有LTR（长末端重复序列）的双链 DNA。

三、 意义 三、 意义

1.逆转录与细胞恶性转化有关，为肿瘤的研究和防治提供了重要线索。艾滋病、乙肝等也有逆转录过程。

2.逆转录病毒经过改造，可作为信息载体，用于肿瘤和遗传疾病的基因治疗。

3.真核生物的基因组中多含逆假基因，可能是信使 RNA经逆转录而整合到基因组中的。所以真核生物正常细胞也存在逆转录过程。

第三节 第三节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复

一、DNA的损伤（突变） 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。

常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

（一）引起突变的因素：1．自发因素： (1)自发脱碱基：由于 N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。

(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

2．物理因素：由紫外线、电离辐射、 X射线等引起的 DNA损伤。其中， X 射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如 TT， TC， CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

3．化学因素： (1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速 C脱氨基生成U，A脱氨基生成 I。

(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。

(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。

(4)碱基类似物：如 5-FU， 6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。

(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

（二）（二） DNADNA突变的类型：突变的类型：

转换– – – 相同类型碱基的取代。 颠换– – – 不同类型碱基的取代。 点突变 插入– – – 增加一个碱基。 缺失– – – 减少一个碱基。 插入– – – 增加一段顺序。 缺失– – – 减少一段顺序。 复突变 倒位– – – 一段碱基顺序发生颠倒。 移位– – – 一段碱基顺序的位置发生改变。 重排– – – 一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。

碱基的转换碱基的转换

（三）DNA突变的效应： 1．同义突变：基因突变导致mRNA暗码子第三位碱基的改变但不引起暗码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

3．无义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

二、二、 DNADNA损伤的修复损伤的修复 DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

光复活 直接修复 转甲基作用 直接连接 无差错修复 切除修复 取代修复 重组修复 有差错倾向修复 SOS修复

（一）直接修复： 1．光复活：（ light repairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为 ： 光 复 活 酶 （ photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与

→之结合形成复合物 在 300～ 600nm 可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的

→丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DNA上解离。

2．转甲基作用：在转甲基酶的催化下，将 DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接连接：DNA断裂形成的缺口，可以在 DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

（二）取代修复： 1 ． 切 除 修 复 (excision

repairing)：这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种 DNA 损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是 DNA 糖苷酶。

特异性的核酸内切酶识别 DNA DNA糖苷酶识别受损伤的 的损伤部位，并在该部位的 5' 碱基，并将该碱基切除 端作一切口 由核酸外切酶（或 DNA聚合 在插入酶的催化下，以正确 Ⅰ酶 ）从 5' → 3'端逐一切除损 的碱基插入空位，修复 DNA 伤的单链片段 在 DNA聚合酶的催化下，以 互补链为模板，合成新的单链 片段以填补缺口 由 DNA连接酶催化连接片段， 封闭缺口

2．重组修复(recombination repairing)：

这是 DNA 的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。

3． SOS修复： 这是一种在 DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以 SOS借喻细胞处于危急状态。

DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。

 损伤诱导一种特异性较低的新的 DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。

 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位 DNA 的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。