Решения на базеcongress-ph.ru/common/htdocs/upload/fm/microbiology/17/... · 2017. 4....
Transcript of Решения на базеcongress-ph.ru/common/htdocs/upload/fm/microbiology/17/... · 2017. 4....
1
Решения на базе
MALDI-TOF масс-спектрометрии
для экспресс идентификации микроорганизмов
Виктор Сергеевич Казаков
Sales Manager Bruker Daltonics Russia
Масс-спектрометрия - аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества по их поведению в электрических и/или магнитных полях (молекулярные весы)
Масс-спектрометр -
это инструмент, способный в условиях вакуума разделять находящийся в газовой фазе пучок заряженных частиц на фракции с одинаковым отношением массы к заряду и определять массу иона (m/z ratio).
Некоторые определения
3
MALDI-TOF масс-спектрометр
MALDI источник
ионов
Time-of-Flight (TOF)
анализатор
детек
тор
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Первичная ионизация
M+hν → MH+, M+˙, MNa+, M+˙
Вторичная ионизация
M-˙ + A → M + A-˙
M+˙ + A → M + A+˙
MH+˙ +A → M + AH+
MNa+ + A → M + ANa+
M – матрица А – анализируемое вещество
МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,—метод «мягкой» ионизации твердого вещества, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.
• Используется для анализа белков, пептидов, олигонуклеотидов, жирных кислот, полимеров • При MALDI ионизации образуются, как правило, однозарядные ионы, захватившие протон либо иной катион
Нобелевская премия 2002 Коичи Танака
По
вер
хно
сть
MA
LDI-
чип
а
анализатор
Источник ионов
Идентификация МО на MALDI-TOF MS
• MALDI Biotyper – программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-TOF масс-спектрометров серии FLEX
• Метод выявляет уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов – своеобразный «отпечаток пальца»
• Идентификация происходит в основном по рибосомальным белкам, которые встречаются во всех микроорганизмах
• Биоинформационная модель основанная на анализе белков позволяет надёжно и точно проводить идентификацию конкретного микроорганизма до вида путём сопоставления получаемых масс-спектров белков с обширной базой данных
5
4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
200
400
600
800
1000
1200
1400
a.i.
MALDI Biotyper Принцип определения
«Протеомная дактилоскопия» - надежный экспресс-метод идентификации микроорганизмов с минимальными трудовыми и финансовыми затратами на пробоподготовку и анализ
Неизвестный микроорганизм Нанесение образца Получение масс-спектра
Результат идентификации через несколько минут
Один метод подготовки для любых микроорганизмов
7
Представление результатов
Вид отчета (10 штаммов)
9
Основная база данных
10
База Данных 6903
Статистика пополнения базы данных
11
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
MSP
Общее кол-во MSPs
Годы
12
Содержание
• Каждая запись MSP содержит больше 25
спектров
• Каждая запись подтверждена методом
секвенирования НК
• База данных содержит как клинически-
значимые микроорганизмы, так и
ветеринарные, промышленные и очень редкие.
MSP Род Вид
Грам - 2838 203 1015
Грам + 3289 151 1211
Дрожжи 711 45 193
Миц. грибы 65 25 42
Всего 6903 424 2461
13
Основные изменения в новой базе данных
•938 новых записей
777 записей для улучшения идентификации видов, уже присутствующих в базе данных 161 запись для новых видов
• 15 новых родов и 96 новых видов
• Улучшена дифференциация Candida haemuloni/duobushaemuloni
• Улучшена дифференциация Haemophilus haemolyticus/influenza
MSP Род Вид
Грам - 2838 203 1015
Грам + 3289 151 1211
Дрожжи 711 45 193
Миц. грибы 65 25 42
Всего 6903 424 2461
Идентификация
ID гемокультур
ID спор, токсинов и вирусов
Субтипирование
Эпидемиология
Вирулентность
Резистентность
Другие технологии
&
14
Система MALDI Biotyper
Возможности
SNP
Система MALDI Biotyper
Резистентность
15
MBT STAR-BL
Модуль определения бета-лактамазной активности
Уже реализован
MBT RESIST
Модуль определения чувствительности к антибиотикам с
помощью изотопно-меченых аминокислот
В стадии разработки и тестирования
MBT ASTRA
Модуль определения чувствительности к антибиотикам с
помощью количественного мониторинга роста клетки
В стадии разработки и тестирования
Модуль STAR-BL Определение бета-лактамазной активности
16
+ 18 Da - 44 Da
Используя MALDI-TOF масс-спектрометрию появилась возможность наблюдать напрямую за реакцией на антибиотик внутри бактериальной клетки
17
Группы Антибиотики*
Производные
пенициллина
Ampicillin
Piperacillin
Цефалоспорины
Cefotaxime
Ceftazidime
Монобактамы Aztreonam
Карбапенемы
Ertapenem
Meropenem
Imipenem
Различные ß-лактамные антибиотики
* примеры
Модуль STAR-BL
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
18
Автоматический программный модуль MBT
Subtyping Module
Уже реализован
Субтипирование микроорганизмов с помощью
программного обеспечения FlexAnalysis и
биоинформатических алгоритмов
(кластерный анализ, корреляционный индекс и пр.)
Проводится вручную
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
19
Автоматический программный модуль
Система MALDI Biotyper
MBT Suptyping Module
20
Типирование Staphylococcus aureus
для определения MRSA
Типирование Listeria monocytogenes
Типирование Mycobacterium chimerae/intracellulare
Типирование Klebsiella pneumoniae для определения
карбапенемазной устойчивости
Типирование Bacteroides fragilis для определения
карбапенемазной устойчивости
Система MALDI Biotyper
MBT Suptyping Module
21
Типирование Staphylococcus aureus
MRSA (= Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) – группа Staphylococcus aureus, которые устойчивы к метицилину и другим антибиотикам MSSA (= Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus) – группа Staphylococcus aureus, которые чувствительны к различным антибиотикам
Система MALDI Biotyper
MBT Suptyping Module
22
Важность определения MRSA
Percentage of Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistant (MRSA), by country (most recent year, 2011–14)
Система MALDI Biotyper
MBT Suptyping Module
23
Принцип детекции MRSA
Модуль субтипирования определяет наличие пептида PSM-mec, который связан с типами II, III and VIII SCCmec кассет, присутствующие в геномах MRSA штаммов:
Если PSM-mec присутствует: MRSA (с очень высокой вероятностью) Если нет, это не значит, что MRSA
Встречаемость этого пептида варьируется от <10-90% в зависимости от региона
Результат в ПО MBT Compass
24
Система MALDI Biotyper
MBT Suptyping Module
25
Примеры возможных добавлений
Streptococcus agalactiae ST1, ST17 Propionibacterium acnes И др.
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
26
Субтипирование микроорганизмов с помощью
программного обеспечения FlexAnalysis
0
2000
4000
6000
8000
Inte
ns. [
a.u.
]
9600 9650 9700 9750 9800 9850m/z
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
27
Alfa Streptococcus – 12 штаммов
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [a
.u.]
9350 9400 9450 9500 9550 9600 9650 9700m/z
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
28
Биоинформационные алгоритмы (MSP дендрограмма)
1002003004005006007008009001000
2031
83-89
2069
807
703
1597
939-952
145
151
153
213
4044
4052
160
MSP Dendrogram
Distance Level
Система MALDI Biotyper
Субтипирование микроорганизмов
29
Биоинформационные алгоритмы (псевдогель)
• Поскольку принцип MALDI Biotyper основан на сравнение «паттерна» пиков из полученного неизвестного MALDI-TOF спектра с паттерном пиков в референсной библиотеке, возможность применения системы не ограничена только микробиологией.
• Есть возможность идентифицировать любой объект, который может ионизироваться в MALDI-TOF и дает возможность получить воспроизводимые и специфичные спектры.
30
Система MALDI Biotyper
Идентификация других объектов
Система MALDI Biotyper
Идентификация других объектов
31
Идентификация вирусов
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-
TOF) mass spectrometry applied to virus identification
Adriana Calderaro и др. Department of Clinical and Experimental Medicine, Unit of Microbiology and Virology, University of Parma, Italy.
Идентификация спор бактерий и грибов
Identification of bacteria and spores suitable as biological warfare
agents by the MALDI Biotyper
Идентификация токсинов
Evolution of Botulinum Neurotoxin Detection from Mouse to MALDI
Идентификация липополисахаридов - эндотоксинов
Соматические антигены клеточной стенки бактерий имеют
липополисахаридную природу (например О-антиген)
• Каждый вид Trichinella удается различить с высоким коэффициентом достоверности
• Таким образом, MALDI-TOF технология может быть успешно использована в пищевой паразитологии
32
Экстракция личинки (легкая пробоподготовка!)
Mayer-Scholl A, Murugaiyan J, Neumann J, Bahn P, Reckinger S, Nöckler, K (2016). Rapid Identification of the Foodborne Pathogen Trichinella spp. by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. PLoS One 11
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация Trichinella spp.
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация комаров
33
Identification of European mosquito species by
MALDI-TOF MS
ARTICLE in PARASITOLOGY RESEARCH · APRIL 2014 Ae. cinereus Luleå, Sweden [1.978–1.999] Ae. vexans Camargue, France [2.106–2.357] Gotland, Sweden [2.015] Marseille, France [1.855] Ae. caspius Camargue, France [1.762–2.239] An. claviger Uppsala, Sweden [1.908–2.252] An. hyrcanus Camargue, France [2.111–2.272] An. maculipennis Camargue, France [2.042–2.090] Cq. richiardii Uppsala, Sweden [1.628–2.096] Cx. pipiens Camargue, France [1.837–1.936] Cx. modestus Camargue, France [1.795–2.016] Ae. rusticus Gotland, Sweden [2.218–2.378] Ae. excrucians Luleå, Sweden [2.124–2.212] Cs. longiareolatab Aix en Provence/France [1.315–1.351]
34
Identification of flea species using MALDI-TOF/MS
Amina Yssoufa, Cristina Socolovschia, Hamza Leulmia, Tahar Kernifb,
Idir Bitamc, Gilles Audolya, Lionel Almerasa, Didier Raoulta.
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация блох
Poster 2015: Identification of animal species from meat using MALDI-TOF MS. Stoll, P., Rau, J. CVUA Stuttgart, Germany
• Определение состава мясных изделий в последнее время становится важной задачей. На сегодняшний день основными методами являются молекулярные, иммунологические и органолептические методы идентификации.
• На данный момент уже разработана библиотека видов мяса для системы MALDI Biotyper и она доступна онлайн
• Посмотреть актуальное состояние можно по ссылке http://www.maldi-up.ua-bw.de Статус Сентябрь 12 2016 г.: 144 записи
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса
35
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса
36
Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса
37
38
Вопросы?