КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ...

Т.И. Дитченко

КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙИ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ

КУРС ЛЕКЦИЙ

МинскБГУ2007

2

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология растений основана на методах культурыклеток и тканей. Культурой клеток, тканей и органов растенийназывается выращивание отдельных клеток, а также тканей иорганов на искусственной питательной среде в асептическихусловиях. Этот метод лежит в основе изучения биологии клетки,существующей вне организма.

Культура клеток высших растений может рассматриваться стрех точек зрения – как уникальная биологическая система, какмодель в физиологии, биохимии и генетике растений и какинструмент для разнообразных исследований и биотехнологии.

Популяциям растительных клеток, выращиваемым вискусственных условиях, присущи специфические особенности,благодаря которым культура клеток и тканей растенийпредставляет новую экспериментально созданнуюбиологическую систему. Отличия культивируемых клеток отклеток организма, часто специально усиленные путем созданиябиохимических мутантов, гибридных или трансформированныхклеток, помогают глубже проникнуть в механизмы процессов,происходящих в растении.

В качестве биологической модели клетки in vitroпредставляют интерес для многих физиологов и биохимиковрастений, а также генетиков. Однако степень адекватноститакой модели зависит от изучаемого процесса. Культура клеток,как правило, является адекватной моделью для тех процессов,которые протекают в любой растительной клетке, независимо отсуществующих систем контроля. Для тех клеточных функций,где принципиальную роль играют механизмы организменногоконтроля развития, модель может быть неадекватной.

Культура клеток растений широко используется в самыхразнообразных фундаментальных и прикладных исследованиях.На основе культивируемых клеток и тканей высших растений внастоящее время созданы и активно развиваютсяперспективные, принципиально новые технологии дляразличных отраслей промышленности и сельского хозяйства.

3

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В ТЕКСТЕСОКРАЩЕНИЙ

АТФ – аденозинтрифосфатБАВ – биологически активные веществаБАП – 6-бензиламинопуринГТФ – гуанозинтрифосфат2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислотаДМСО – диметилсульфоксидДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаИМК – индолилмасляная кислотаИУК – индолил-3-уксусная кислотаНУК – нафтилуксусная кислотаНАДФН2 – никотинамиддинуклеотидфосфат

восстановленныйПЭГ – полиэтиленгликольРНК – рибонуклеиновая кислота

4

КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ.

ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ

Термин «культура клеток, тканей и органов растений»применяется к следующим асептически выращиваемым частям растения:изолированным зародышам, изолированным органам (кончики корней,меристемы побегов, листовые примордии, части молодых цветков иплодов), каллусной ткани, суспензионной культуре, культурепротопластов (рис. 1.1).

Набор объектов растительного происхождения, которые можноперевести в культуру in vitro, достаточно широк. Как правило,большинство исследований проводится с эксплантами разных органов,тканей и клеток семенных растений. Это можно объяснить большойролью в жизни человечества покрыто- и голосеменных растений. Срединих наиболее удобными объектами для культивирования являютсядвудольные травянистые растения, затем следуют однодольныетравянистые виды и зерновые культуры. Труднее создать условия длястабильных in vitro культур древесных растений, особенноголосеменных.

Рис. 1.1. Варианты культивирования клеток, тканей и органов растений наискусственных питательных средах

ГЛАВА 1

Культура клеток, тканей и органов растений

Изолированныезародыши

Каллуснаякультура

Изолированныеорганы

Суспензионнаякультура

Культурапротопластов

5

В качестве объектов, используемых для культивирования in vitro,также могут выступать мхи, лишайники и папоротники. Культуры ихклеток используют для изучения специфических для указанных растенийпроцессов. Многоклеточные водоросли трудны для поддержания их вкультуре, хотя они, несомненно, перспективны в качестве источниковфитопродуктов для медицины, пищевой промышленности и другихбиотехнологий. Большое внимание биологи отводят выращиваниюмикроводорослей.

В настоящее время нет такого высшего растения, из которого нельзяполучить культивируемые клетки и ткани. Однако выращиваемыеповерхностным способом на агаризованной питательной средекаллусные ткани и растущие в жидкой питательной среде суспензионныеклеточные культуры требуют создания разных условий для роста вслучае различных таксонов.

В основе метода культуры клеток и тканей растений лежитуникальное свойство растительной клетки – тотипотентность.Тотипотентность – это способность клетки реализовывать генетическуюинформацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие доцелого организма.

Тотипотентность присуща оплодотворенной яйцеклетке растений иживотных. Что же касается дифференцированных клеток, то у животныхтотипотентность присуща только некоторым клеткамкишечнополостных. У высших животных с началом специализацииклеток, т.е. уже начиная с ранних этапов эмбриогенеза, тотипотентностьне реализуется. В отличие от животных у растений в природныхусловиях тотипотентность могут проявлять и специализированныеклетки. Например, тотипотентность у растений реализуется призаживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растения врезультате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитиекаллуса (лат. «мозоль»). Образование каллуса можно наблюдать припрививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус первоначальносостоит из недифференцированных клеток. Впоследствии в нем можетиметь место вторичная дифференциация с образованиемспециализированных тканей и органов.

Однако в природных условиях растения ряда систематических групптотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клетокмногие однодольные растения утратили способность к раневой реакциии вегетативному размножению. Между тем в экспериментальныхусловиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов иликлеток на искусственных питательных средах возможна реализация

6

супрессированной in vivo тотипотентности. Говоря о значениитотипотентности, следует подчеркнуть, что тотипотентность, как оченьценная особенность растительной клетки, позволяет моделироватьуникальные дифференцировки и экспериментально исследовать феноменэпигенетической наследственности, а также открывает огромныевозможности для генетической инженерии растений и биотехнологии.

Метод культуры клеток и тканей растений в настоящее время широкоиспользуется для решения ряда теоретических и практических задачбиологии. Это обусловлено тем, что данный метод имеет следующиепреимущества:

простоту клеточных моделей; отсутствие коррелятивных взаимодействий и контроля со стороны

других тканей, органов, целого организма, что позволяет проследитьсостояние клетки на уровне первичных элементарных процессов в ответна любые воздействия;

возможность быстро получать достаточную массу в асептическихусловиях;

контролируемые по многим параметрам условия выращивания.Клетки растений in vitro являются удобной моделью для изучения

многих физиолого-биохимических процессов и генетики растительногоорганизма (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Направления использования культуры клеток и тканей для решениятеоретических вопросов физиологии, биохимии и генетики растений

Клетки и ткани растений in vitro

Регуляция вторичногообмена

Процессы цитодифферен-цировки и морфогенеза

Механизмыопухолеобразования

Генетика соматическихклеток

Механизмы устойчивостирастений к неблагоприятным

факторам среды

7

Культивируемые растительные клетки используются для изучениявторичного метаболизма, его регуляции путем блокирования или усиленияработы отдельных ферментов, а также под влиянием различных факторов.

Важной проблемой физиологии растений является познание сущностипроцессов роста, клеточной дифференциации и морфогенеза. Ее решениевозможно путем моделирования этих процессов в культуре клеток и тканейс применением методов молекулярной биологии и генетики. Накультивируемых клетках-моделях можно изучать такие процессы, какделение и растяжение клеток, индукция делений и каллусообразование,дифференцировка клеток и морфогенез под влиянием как внешних, так ивнутренних факторов, прежде всего фитогормонов.

Метод культуры тканей позволяет создать хорошо воспроизводимуюбиологическую модель для изучения опухолевого роста. Для выявленияструктурных и метаболических особенностей опухолевой ткани еесравнивают с нормальной тканью того же растения.

Культура клеток широко используется для изучения генетикисоматических клеток. В этих исследованиях наряду с моделями,близкими по характеристикам к клеткам интактного растения, широкоиспользуются модельные системы, созданные методами клеточной игенетической инженерии. Этими методами получают гибридные клетки ссамыми разными сочетаниями информационных систем не только ядер,но и хлоропластов и митохондрий.

Культура клеток и тканей также служит моделью для изученияустойчивости растений к различным неблагоприятным факторамокружающей среды: абиотическим (засолению, кислой среде, низкимтемпературам и т.д.) или биотическим факторам (патогены разногопроисхождения, вызывающие болезни растений и др.). Накультивируемых клетках и тканях исследуются различные аспектыфитопатологии, физиологии и биохимии больного растения. Этот подходпозволяет наблюдать прямую реакцию растительной клетки навоздействие патогена.

Однако при использовании культуры клеток и тканей длямоделирования физиологических процессов важно помнить, что клетки всистеме in vitro и в живом организме не всегда равноценны. Несомненно,что дальнейшее изучение биологии культивируемой клетки исовершенствование методов культивирования с целью максимальногоприближения условий in vitro к нативным позволят по-новому иэффективно решать многие проблемы физиологии, биохимии и генетикирастений.

8

Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологииследует рассматривать в нескольких направлениях (рис. 1.3). Первое изних связано со способностью изолированных растительных клетокпродуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и другихотраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды,стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Продуктивностькультивируемых клеток в результате клеточной селекции можетзначительно превышать продуктивность целых растений. Этаособенность широко используется для создания технологийпромышленного получения БАВ. Помимо биосинтеза важныхсоединений, культивируемые клетки способны к биотрансформации, т.е.превращению дешевых предшественников в ценный конечный продукт.

Рис. 1.3. Биотехнологии на основе культивируемых клеток и тканей растений

Второе направление – это использование культуры изолированныхтканей для размножения и оздоровления посадочного материала. Этотметод, названный клональным микроразмножением растений, позволяетполучать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.Преимущества клонального микроразмножения столь велики, что сейчасразработаны рентабельные биотехнологии получения посадочногоматериала хозяйственно ценных оздоровленных сортов картофеля,винограда, овощных, плодовых, декоративных растений и лесных пород.Таким путем создается система безвирусного растениеводства.

Культура клеток, тканей и органов растений

Получение экономическиценных БАВ

Клональное размножениерастений

Ускорение селекционногопроцесса

Генетическое улучшениерастений

Получениеоздоровленных растений

Сохранение генофондаредких видов

9

Третье направление – использование изолированных клеток и тканейв селекции растений. Метод культуры тканей открывает новыевозможности для расширения генетического базиса, для облегчения иускорения селекционного процесса, а также для конструированияпринципиально новых форм растений.

Криосохранение культивируемых клеток является еще однимнаправлением их использования в биотехнологии. Это означаетдлительное хранение штаммов клеток растений при температурежидкого азота (–196 ˚С) в целях создания банка генов редких иисчезающих видов, ценных селекционных объектов и штаммов-продуцентов веществ вторичного происхождения.

На рис. 1.4 представлены основные отрасли народного хозяйства, вкоторых используются культивируемые клетки растений.

Рис. 1.4. Применение культуры клеток, тканей и органов растений в народномхозяйстве

Таким образом, в настоящее время прогресс в растениеводстве,фармакологии, пищевой, парфюмерной, легкой, химическойпромышленности теснейшим образом связан с дальнейшим развитиемклеточных технологий растений и их ускоренным внедрением внародное хозяйство.

Культура клеток, тканей и органов

Медицина

Производстволекарственных

препаратов

Сельско-хозяйственнаябиотехнология

Агропромышленныйкомплекс

Получение БАВ, био-скрининг химических

препаратов

Размножение иоздоровление

растений

Химическаяпромышленность

Генетическоеулучшениерастений

Сохранениегенофонда

10

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ МЕТОДАКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК,

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ

Метод культуры клеток и тканей растений был разработан в первойполовине прошлого столетия. Однако определенные идеи ипредположения, экспериментальные наработки в этом направлении былисделаны более 100 лет назад. В истории развития методакультивирования клеток и тканей растений можно выделить несколькоэтапов.

I этап (1878–1902 гг.) связан с именами таких немецкихисследователей, как Габерландт, Фехтинг, Рехингер. В конце XIX –начале XX века они пытались культивировать изолированные израстений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув приэтом значительных экспериментальных успехов, эти исследователивысказали ряд идей и гипотез, подтвержденных позже.

Фехтинг (1878) выявил наличие полярности у изолированныхфрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали вапикальной части почки, а в базальной – каллус или корни. Он пришел квыводу, что полярность свойственна не только органам растения, но иотдельной клетке. Рехингер (1893) определил минимальные размерыэксплантов, способные продуцировать почки и даже регенерироватьцелые растения. Он изолировал фрагменты из почек тополя и ясеня, изкорней свеклы и турнепса и культивировал их на поверхности сырогопеска, наблюдая, как с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм, чтосоответствовало не более чем 21 клеточному слою, способность крегенерации переставала проявляться. Однако поскольку Рехингервыращивал кусочки тканей не на питательной среде, а в песке сприменением водопроводной воды, т.е. без соблюдения условийасептики, то работы этого ученого не могут считаться началомприменения метода культуры тканей на растительных объектах.

Принципы культивирования клеток (использование питательных среди соблюдение асептических условий) впервые четко сформулировалГаберландт в 1902 г. Он пытался выращивать на питательных средах(раствор Кнопа с добавлением сахарозы, аспарагина и пептона)отдельные растительные клетки и выдвинул гипотезу о тотипотентности

ГЛАВА 2

11

любой живой клетки растений. Однако ему не удалось экспериментальнодоказать свою гениальную догадку, так как он выбрал неудачныеобъекты: узкодифференцированные специализированные клетки,утратившие способность к активному делению и эмбриональному росту(тычиночные волоски традесканции, железистые волоски крапивы,замыкающие клетки устьиц лилейных).

II этап (1902–1922 гг.) ознаменовался созданием первых питательныхсред для культивирования тканей животных. Гаррисон и Каррельразработали методику выращивания животных клеток на питательныхсредах природного происхождения (плазма крови, зародышеваяжидкость, лимфа).

Однако попытки выращивания растительных объектов наестественных питательных средах растительного происхождения –работы Чеха и Прата (1927) – окончились неудачей. Учитывая этитрудности некоторые исследователи считали, что выращиваниерастительных клеток является безнадежным, и тем самым поставили подсомнение представление об их тотипотентности.

III этап (1922–1932 гг.). Новый подход к методам культивированияизолированных клеток и тканей растений был заложен в 1922 г.одновременно в Германии Котте и в США Робинсоном. Онипостулировали необходимость использования для культивированиямеристематических клеток, а также применения более сложных посоставу культуральных сред.

IV этап (1932–1940 гг.). Начало успешному развитию методакультуры тканей и клеток высших растений положили работы двухисследователей – француза Готре и американца Уайта. Их считаютродоначальниками современных методов культивированияизолированных тканей и органов растений.

Уайт занимался выращиванием изолированных корней томатов ипоказал, что корневая меристема может расти неограниченно долго вовремени, если ее периодически пересаживать на свежую питательнуюсреду. Культура некоторых его клонов поддерживалась около 30 лет. Онусовершенствовал состав питательной среды для культивированиярастительных клеток. Среда Уайта, содержащая помимо минеральныхэлементов еще и витамины, широко используется в настоящее время длявыращивания тканей многих растений. Также Уайт показал способностьк неограниченному росту при субкультивировании растительныхопухолей.

Основная заслуга Готре заключается в том, что он ввел в культуруновые объекты – каллусные ткани древесных растений камбиального

12

происхождения и каллусные ткани запасающей паренхимы. Онпредложил ввести в состав питательной среды фитогормон ауксин.Наличие ауксинов в среде способствовало длительной пролиферациикаллусных тканей. В работах Готре каллусная ткань, индуцированная изкамбия, могла продолжать развитие в течение 18 месяцев. Готрепредложил заменить жидкую питательную среду на твердую –агаризованную.

Успех работ Уайта и Готре во многом был определен оптимальнымсочетанием объектов культивирования и состава питательных сред. Онивнесли неоценимый вклад в становление современного метода культурытканей растений, и с этого времени начинается интенсивное развитиеданного направления экспериментальной биологии растений.

V этап (1940–1960 гг.). В этот период ученики и последователи Уайтаи Готре закрепляют успех. Увеличивается число видов растений, тканикоторых культивируются in vitro. Разработаны составы ряда питательныхсред, изучено значение макро- и микроэлементов, витаминов истимуляторов роста растительного происхождения (эндоспермкокосового ореха, каштана, кукурузы, гидролизат дрожжей и т.п.). Этопозволило получать длительные пересадочные культуры из разныхорганов и тканей растений. Их список, приведенный в классическоймонографии по культуре тканей, написанной Готре (1959), включал уже142 вида высших растений.

В 1955 г. Скуг и Миллер открыли новый класс стимуляторов ростарастений – цитокинины – и показали их значение для пролиферацииклеток in vitro. В зависимости от концентрации и соотношения ауксинови цитокининов в питательной среде можно было стимулировать делениеклеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцироватьморфогенез.

VI этап (1960–1975 гг.). Одним из наиболее важных достижений вэтот период явилась разработка профессором Коккингом (1960) методаполучения изолированных протопластов из корней и плодов томатаферментативным путем и культивирования их в контролируемыхусловиях. Позже, в 1970 г., Пауэром и сотр. было осуществленоискусственное слияние протопластов, что открыло новый путь ксозданию соматических гибридов. Это открытие явилось основой дляразвития таких важнейших направлений биотехнологии растений, какклеточная и генная инженерия.

В этот период был разработан метод микроклонального размножения,позволяющий быстро с высоким коэффициентом клонально размножатьрастения в асептических условиях (Mорель, 1959; Бутенко, 1960). Было

13

показано, что растения, полученные из меристем, в ряде случаевосвобождались от вирусных инфекций.

Большое фундаментальное и прикладное значение имело открытиеиндийскими исследователями Гуха, Магешвари (1964) индукцииандрогенеза при культивировании изолированных пыльников игиногенеза при культивировании клеток зародышевого мешка.

Одним из направлений совершенствования метода культуры тканейбыл поиск возможностей выращивания одиночных клеток, результатомкоторого явилась разработка метода получения и выращиванияклеточных суспензий. Именно благодаря этому методу в 60-е гг. былаэкспериментально доказана идея Габерландта о тотипотентностирастительной клетки. Так, в 1965 г. Вэсил и Хильдебрандт впервыепродемонстрировали возможность получения из изолированной клеткитабака нормально развивающегося и достигшего цветения растения.

В 1971 г. впервые были получены и изучены растения-регенерантытабака, представляющие сомаклональные варианты исходной формы(Загорска и др.).

VII этап (1975 г. – по настоящее время). Этот период характеризуетсябыстрым развитием техники in vitro, изучением биологиикультивируемых растительных объектов и созданием биотехнологий наих основе. Разработка методов электрослияния изолированныхпротопластов и разнообразных методов селекции гибридных клетокзначительно облегчила гибридизацию соматических клеток растений.Методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональныхвариантов и экспериментальных гаплоидов используются для созданияновых форм и сортов сельскохозяйственных растений. С использованиемизолированных протопластов и генетических векторов на основе Ti –плазмид, электропорации и баллистического введения генов в клетки иткани реципиентов стало возможным получение трансгенных растений.Характерной чертой настоящего времени является особая организацияисследований для эффективного получения результатов. Как правило,формируются научные коллективы, включающие специалистов поразным проблемам.

Таким образом, в течение длительного времени эмпирический подходявлялся практически единственным методом при работе сизолированными клетками и тканями растений. Его невысокаяэффективность привела исследователей к пониманию необходимостиизучения биологии культивируемых объектов на всех уровнях –молекулярном, субклеточном, клеточном и тканевом, без чегоневозможна разработка практически важных технологий.

14

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ МЕТОДАКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК,

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ

Метод культуры клеток и тканей растений был разработан в первойполовине прошлого столетия. Однако определенные идеи ипредположения, экспериментальные наработки в этом направлении былисделаны более 100 лет назад. В истории развития методакультивирования клеток и тканей растений можно выделить несколькоэтапов.

I этап (1878–1902 гг.) связан с именами таких немецкихисследователей, как Габерландт, Фехтинг, Рехингер. В конце XIX –начале XX века они пытались культивировать изолированные израстений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув приэтом значительных экспериментальных успехов, эти исследователивысказали ряд идей и гипотез, подтвержденных позже.

Фехтинг (1878) выявил наличие полярности у изолированныхфрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали вапикальной части почки, а в базальной – каллус или корни. Он пришел квыводу, что полярность свойственна не только органам растения, но иотдельной клетке. Рехингер (1893) определил минимальные размерыэксплантов, способные продуцировать почки и даже регенерироватьцелые растения. Он изолировал фрагменты из почек тополя и ясеня, изкорней свеклы и турнепса и культивировал их на поверхности сырогопеска, наблюдая, как с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм, чтосоответствовало не более чем 21 клеточному слою, способность крегенерации переставала проявляться. Однако поскольку Рехингервыращивал кусочки тканей не на питательной среде, а в песке сприменением водопроводной воды, т.е. без соблюдения условийасептики, то работы этого ученого не могут считаться началомприменения метода культуры тканей на растительных объектах.

Принципы культивирования клеток (использование питательных среди соблюдение асептических условий) впервые четко сформулировалГаберландт в 1902 г. Он пытался выращивать на питательных средах(раствор Кнопа с добавлением сахарозы, аспарагина и пептона)отдельные растительные клетки и выдвинул гипотезу о тотипотентности

ГЛАВА 2

15

любой живой клетки растений. Однако ему не удалось экспериментальнодоказать свою гениальную догадку, так как он выбрал неудачныеобъекты: узкодифференцированные специализированные клетки,утратившие способность к активному делению и эмбриональному росту(тычиночные волоски традесканции, железистые волоски крапивы,замыкающие клетки устьиц лилейных).

II этап (1902–1922 гг.) ознаменовался созданием первых питательныхсред для культивирования тканей животных. Гаррисон и Каррельразработали методику выращивания животных клеток на питательныхсредах природного происхождения (плазма крови, зародышеваяжидкость, лимфа).

Однако попытки выращивания растительных объектов наестественных питательных средах растительного происхождения –работы Чеха и Прата (1927) – окончились неудачей. Учитывая этитрудности некоторые исследователи считали, что выращиваниерастительных клеток является безнадежным, и тем самым поставили подсомнение представление об их тотипотентности.

III этап (1922–1932 гг.). Новый подход к методам культивированияизолированных клеток и тканей растений был заложен в 1922 г.одновременно в Германии Котте и в США Робинсоном. Онипостулировали необходимость использования для культивированиямеристематических клеток, а также применения более сложных посоставу культуральных сред.

IV этап (1932–1940 гг.). Начало успешному развитию методакультуры тканей и клеток высших растений положили работы двухисследователей – француза Готре и американца Уайта. Их считаютродоначальниками современных методов культивированияизолированных тканей и органов растений.

Уайт занимался выращиванием изолированных корней томатов ипоказал, что корневая меристема может расти неограниченно долго вовремени, если ее периодически пересаживать на свежую питательнуюсреду. Культура некоторых его клонов поддерживалась около 30 лет. Онусовершенствовал состав питательной среды для культивированиярастительных клеток. Среда Уайта, содержащая помимо минеральныхэлементов еще и витамины, широко используется в настоящее время длявыращивания тканей многих растений. Также Уайт показал способностьк неограниченному росту при субкультивировании растительныхопухолей.

Основная заслуга Готре заключается в том, что он ввел в культуруновые объекты – каллусные ткани древесных растений камбиального

16

происхождения и каллусные ткани запасающей паренхимы. Онпредложил ввести в состав питательной среды фитогормон ауксин.Наличие ауксинов в среде способствовало длительной пролиферациикаллусных тканей. В работах Готре каллусная ткань, индуцированная изкамбия, могла продолжать развитие в течение 18 месяцев. Готрепредложил заменить жидкую питательную среду на твердую –агаризованную.

Успех работ Уайта и Готре во многом был определен оптимальнымсочетанием объектов культивирования и состава питательных сред. Онивнесли неоценимый вклад в становление современного метода культурытканей растений, и с этого времени начинается интенсивное развитиеданного направления экспериментальной биологии растений.

V этап (1940–1960 гг.). В этот период ученики и последователи Уайтаи Готре закрепляют успех. Увеличивается число видов растений, тканикоторых культивируются in vitro. Разработаны составы ряда питательныхсред, изучено значение макро- и микроэлементов, витаминов истимуляторов роста растительного происхождения (эндоспермкокосового ореха, каштана, кукурузы, гидролизат дрожжей и т.п.). Этопозволило получать длительные пересадочные культуры из разныхорганов и тканей растений. Их список, приведенный в классическоймонографии по культуре тканей, написанной Готре (1959), включал уже142 вида высших растений.

В 1955 г. Скуг и Миллер открыли новый класс стимуляторов ростарастений – цитокинины – и показали их значение для пролиферацииклеток in vitro. В зависимости от концентрации и соотношения ауксинови цитокининов в питательной среде можно было стимулировать делениеклеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцироватьморфогенез.

VI этап (1960–1975 гг.). Одним из наиболее важных достижений вэтот период явилась разработка профессором Коккингом (1960) методаполучения изолированных протопластов из корней и плодов томатаферментативным путем и культивирования их в контролируемыхусловиях. Позже, в 1970 г., Пауэром и сотр. было осуществленоискусственное слияние протопластов, что открыло новый путь ксозданию соматических гибридов. Это открытие явилось основой дляразвития таких важнейших направлений биотехнологии растений, какклеточная и генная инженерия.

В этот период был разработан метод микроклонального размножения,позволяющий быстро с высоким коэффициентом клонально размножатьрастения в асептических условиях (Mорель, 1959; Бутенко, 1960). Было

17

показано, что растения, полученные из меристем, в ряде случаевосвобождались от вирусных инфекций.

Большое фундаментальное и прикладное значение имело открытиеиндийскими исследователями Гуха, Магешвари (1964) индукцииандрогенеза при культивировании изолированных пыльников игиногенеза при культивировании клеток зародышевого мешка.

Одним из направлений совершенствования метода культуры тканейбыл поиск возможностей выращивания одиночных клеток, результатомкоторого явилась разработка метода получения и выращиванияклеточных суспензий. Именно благодаря этому методу в 60-е гг. былаэкспериментально доказана идея Габерландта о тотипотентностирастительной клетки. Так, в 1965 г. Вэсил и Хильдебрандт впервыепродемонстрировали возможность получения из изолированной клеткитабака нормально развивающегося и достигшего цветения растения.

В 1971 г. впервые были получены и изучены растения-регенерантытабака, представляющие сомаклональные варианты исходной формы(Загорска и др.).

VII этап (1975 г. – по настоящее время). Этот период характеризуетсябыстрым развитием техники in vitro, изучением биологиикультивируемых растительных объектов и созданием биотехнологий наих основе. Разработка методов электрослияния изолированныхпротопластов и разнообразных методов селекции гибридных клетокзначительно облегчила гибридизацию соматических клеток растений.Методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональныхвариантов и экспериментальных гаплоидов используются для созданияновых форм и сортов сельскохозяйственных растений. С использованиемизолированных протопластов и генетических векторов на основе Ti –плазмид, электропорации и баллистического введения генов в клетки иткани реципиентов стало возможным получение трансгенных растений.Характерной чертой настоящего времени является особая организацияисследований для эффективного получения результатов. Как правило,формируются научные коллективы, включающие специалистов поразным проблемам.

Таким образом, в течение длительного времени эмпирический подходявлялся практически единственным методом при работе сизолированными клетками и тканями растений. Его невысокаяэффективность привела исследователей к пониманию необходимостиизучения биологии культивируемых объектов на всех уровнях –молекулярном, субклеточном, клеточном и тканевом, без чегоневозможна разработка практически важных технологий.

18

ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ИТКАНЕЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

3.1. Создание условий асептики

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканейявляется соблюдение строгой стерильности. Для соблюдения условийасептики при выполнении работ по культивированию растений in vitroстерилизации должны подвергаться операционная комната, в которойпроизводят изоляцию и посадку культур, одежда и руки работающегоперсонала, посуда, используемая для культивирования объектов, всенеобходимые инструменты и материалы, питательные среды, объектыкультивирования. Как показывает практика, небрежность, допущеннаяпри проведении эксперимента, даже при хорошей оснащенностирабочего места, сводит к нулю все затраченные усилия. Поэтому чистотагораздо важнее изысканного специального оборудования.

Ламинар-бокс в настоящее время вполне доступен и широкоиспользуется для стерильных пересадок при работе с культурой тканей.В ламинар-боксах асептика достигается подачей стерильного воздуха врабочий объем. Ламинар-боксы, как правило, оснащены УФ лампами,обеспечивающими стерилизацию внутренней поверхности. Однако дажепосле этого рабочую поверхность перед использованием желательнопротереть 70 %-ным этанолом или 20 %-ным водным раствором фенола.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или фольгу,инструменты стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу притемпературе 160 С в течение 1,5–2 ч. Непосредственно перед работой вбоксе инструменты стерилизуют еще раз, помещая в фарфоровый илистеклянный стакан с 96 %-ным спиртом и обжигая каждый из них впламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только дляодноразовой манипуляции. Перед повторным использованием его сноваследует обработать спиртом и обжечь.

Питательные среды, не содержащие термолабильных веществ,стерилизуют автоклавированием при давлении 0,5–1 атм.Продолжительность стерилизации зависит от объема среды в сосуде.Культуральные сосуды со средой объемом 25–50 мл стерилизуют втечение 15–20 мин, объемом 2–4 л – в течение 30–40 мин. Другим

ГЛАВА 3

19

способом стерилизации может быть дробная стерилизации –тиндализация, которую проводят при температуре 100 С и атмосферномдавлении. Среду кипятят в течение 10 мин, затем охлаждают ее иповторяют эту процедуру дважды с промежутком в одни сутки.

Для стерилизации растворов с термолабильными соединениями(растительные экстракты, белки, аминокислоты, витамины, антибиотики,некоторые стимуляторы роста), которые разрушаются приавтоклавировании, применяют метод холодной стерилизации. Для этойцели термолабильное вещество обрабатывают этиловым эфиром,который затем удаляют при пониженной температуре, твердый остатокрастворяют в стерильной воде и в стерильных условиях добавляют костальной ранее простерилизованной среде. Второй способ заключаетсяв фильтровании растворов через стерильные микроскопические фильтрыс диаметром пор 0,22–0,45 мкм, задерживающие вирусы и бактерии.Простерилизованные компоненты добавляют в проавтоклавированнуюохлажденную до 40 С основную среду.

Растительные ткани сами по себе могут служить источникомзаражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитнаямикрофлора. Для поверхностной стерилизации растительных тканейприменяют большой набор химических веществ. Растительныеэкспланты стерилизуют растворами соединений, содержащих активныйхлор (хлорамином, гипохлоритом кальция и натрия, сулемой), бром(бромной водой), диацидом, перекисью водорода, спиртом,антибиотиками.

При выборе стерилизующего агента необходимо учитыватьследующее:

стерилизующее вещество должно губительно действовать на всемикроорганизмы и в то же время минимально повреждать растительныеткани;

вид стерилизующего вещества, его концентрация и длительностьприменения зависят от плотности и чувствительности ткани, котораядолжна быть стерилизована;

стерилизующее вещество должно легко удаляться из тканипромыванием стерильной дистиллированной водой или подвергатьсяразложению.

При правильном выборе стерилизующего вещества степеньинфицирования тканей не превышает 1–3 %.

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только отнаружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннююинфекцию, то его необходимо обработать антибиотиком. Особенно

20

богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропическихрастений с крупными сосудами. Антибиотики также используются дляподавления роста микроорганизмов в суспензионных культурах,стерилизации нежных тканей и корончатогалловых опухолей. Посколькуантибиотики являются термолабильными веществами, их стерилизуюттолько методами фильтрования и добавляют в охлажденную среду. Прииспользовании антибиотиков руководствуются тем правилом, чтоприменяют либо несколько антибиотиков, действующих на разныемикроорганизмы, либо один, но с широким спектром микробногодействия.

Прежде чем приступить к стерилизации ткани, ее предварительномоют в мыльном растворе и ополаскивают дистиллированной водой, азатем погружают на несколько секунд в 70 %-ный этанол. Семенапогружают в спирт на 1–2 мин. Обработка тканей этанолом передпомещением их в стерилизующий раствор, кроме собственногостерилизующего действия спирта, повышает действие стерилизующихвеществ. Добавление незначительного количества поверхностно-активного вещества в стерилизующий раствор (особенно в случае плохосмачиваемых опушенных или покрытых воском тканей) также заметноповышает его эффективность и сокращает время стерилизации.

Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительныйматериал помещают в стерилизующий раствор и отмечают время началастерилизации. В табл. 3.1 приведены условия стерилизации эксплантовразличных объектов (концентрация и время инкубации).

Таблица 3.1Стерилизация исходного растительного материала

Время стерилизации, мин

Объект диацид0,1 %

сулема0,1 %

гипохлоритыNa, Са5–9 %

перекисьводорода10–12 %

Семена сухие 15–20 10–15 15–20 12–15

Семена набухшие 6–16 6–8 10–15 6–8

Ткани стебля 20–40 20–25 20–25 –

Листья 1–3 0,5–3 3–6 3–5

Апексы 1–10 0,5–7 3–15 2–7

По истечении времени стерилизации растительный материалпромывают тремя порциями стерильной воды, выдерживая по 10–15 минв каждой.

21

Если в результате неудовлетворительной стерилизации культуратканей загрязнена быстрорастущими микроорганизмами, то такоезаражение легко обнаруживается уже на 2–3 сутки после посадки.Инфицирование культур, растущих на агаризованной среде, легчевыявляется, если культуральный сосуд просматривать на свет. Заражениерастительной ткани проявляется в виде ореола из бактериальныхмикроорганизмов вокруг ткани на поверхности агара или помутненияагара непосредственно под тканью. Если инфицирована питательнаясреда, то колонии микроорганизмов или грибов распределяются в толщеагарового слоя. Зараженная суспензионная культура мутнеет, приобретаяцвет разбавленного молока. В худшем случае ткань может бытьзагрязнена медленно растущими микроорганизмами или спорами. Приэтом заражение не проявляется в первые дни после посадки эксплантов,а обнаруживается только при последующем размножении ткани илисубкультивировании ее на свежую питательную среду.

3.2. Питательные среды

Общие навыки работы в стерильных условиях, основныепрактические аспекты получения культуры растительных клеток итканей и ее поддержания группируются вокруг проблемы подбораподходящей среды для культивирования. Компоненты среды длявыращивания растительных объектов in vitro условно можно разделитьна 5 групп:

макроэлементы; микроэлементы; источники углерода; витамины; регуляторы роста.Минеральная основа питательных сред для культивирования

изолированных клеток и тканей должна включать все необходимыерастениям макроэлементы (азот, фосфор, серу, калий, кальций, магний,железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.).

Поскольку питание большинства культивируемых тканей являетсягетеротрофным, то обязательным компонентом питательных средявляется источник углерода и энергии. В большинстве сред,используемых для культур растительных тканей, таким источникомявляется сахароза и глюкоза, обычно в концентрациях 20–40 г/л.Сахароза в результате автоклавирования при стерилизации средгидролизуется до более доступных к усвоению моносахаридов. В

22

отдельных экспериментах можно получить автотрофные культуры. Так,в настоящее время уже получены клоны клеток-автотрофов, обладающихзначительной интенсивностью фотосинтеза, и разработаны условия ихкультивирования, что позволяет поддерживать автотрофный рост втечение 5–7 пассажей. Однако, как правило, даже в случаях полученияавтотрофных культур для нормального роста хлорофиллоносных тканейнеобходимы углеводы.

В состав большинства питательных сред для культивирования клетоки тканей растений входят витамины: тиамин, рибофлавин, биотин,пантотеновая кислота, пиридоксин, аскорбиновая кислота.

Содержание регуляторов роста обычно является определяющимфактором для успешного роста культур клеток растений. Изфитогормонов в составе сред наиболее часто используют ауксины ицитокинины. Поскольку различные клетки и ткани в культуре резкоотличаются по способности к автономному синтезу и метаболизмуотдельных групп фитогормонов, то в связи с этим их рост в различнойстепени зависит от снабжения регуляторами роста.

Различия в потребностях в экзогенных ауксинах и цитокининахпозволяют выделить несколько групп тканей:

ткани, растущие на средах только с ауксинами (например,экспланты корня топинамбура, корней цикория);

ткани, требующие для роста введение в среду только цитокининов(культура корешка белого турнепса);

ткани, для роста которых необходимы и ауксины и цитокинины(большинство культивируемых тканей);

ткани, растущие на средах с растительными экстрактами сложногосостава;

опухолевые ткани, способные расти на средах без регуляторовроста.

Для роста большинства тканей в условиях in vitro необходимы иауксины, и цитокинины. В качестве ауксинов для получения иподдержания культур тканей чаще всего используются ИУК вконцентрации 1–30 мг/л, НУК в концентрации 0,1–2 мг/л, 2,4-Д вконцентрациях менее 1 мг/л. Показано, что ИУК в 300 раз менее активна,чем 2,4-Д и в 30 раз менее активна, чем НУК,

В качестве источников цитокининов в искусственных питательныхсредах используют кинетин, БАП, зеатин. БАП и зеатин проявляют болеевысокую активность в поддержании роста изолированных тканей ииндукции органогенеза по сравнению с кинетином.

23

Оптимум концентраций ауксинов и цитокининов, необходимых дляроста культур клеток и тканей, у разных видов растений сильноварьирует. В каждом конкретном случае оптимальное их соотношениеопределяется экспериментальным путем. Для этой цели используетсяметод математического планирования эксперимента.

Из гиббереллинов в составе культуральных сред используютгибберелловую кислоту, как наиболее доступную для индукциипобегообразования у цитрусовых и поддержания роста суспензионныхкультур.

Абсцизовую кислоту применяют при культивировании протопластов.Для индукции первичного каллуса и реже для поддержания его роста

иногда к питательной среде добавляют растительные экстракты или сокинеопределенного состава, обладающие активирующими ростсвойствами. Как правило, это эндоспермы незрелых зародышей ивесенняя пасока некоторых деревьев. Наибольшей ростактивирующейспособностью обладает кокосовое молоко – жидкий эндоспермкокосового ореха. Добавление в среду 5–10 % кокосового молока за 21день приводило к увеличению сырого веса эксплантов моркови в 80–100раз. Однако в настоящее время таких добавок стараются избегать в связис трудностями воспроизведения результатов и наличия в нихнеизвестных факторов роста.

Питательные среды могут также включать и антиоксиданты:аскорбиновую кислоту, глутатион, дитиотриэтол, диэтилтиокарбамат,поливинилпирролидон.

Для приготовления твердых питательных сред в качествеуплотняющего вещества используют агар-агар в конечной концентрации6–10 г/л. Он образует с водой гель, плавящийся при 100 С изатвердевающий при 45 С. Агар-агар теряет способность образовыватьгель в кислой среде. Некоторые компоненты агара могут отрицательновлиять на рост. Поэтому при работе с культурами клеток растений важноиспользовать агар хорошего качества, пригодный длябактериологических работ. Такие нежелательные примеси можноудалить промыванием агара дистиллированной водой. В то же время всоставе агара обнаружены витамины и другие факторы роста. Впоследнее время нашли применение и другие гелеобразующие вещества:гельрит, биогели.

В нативных условиях растительная клетка функционирует в узкихпределах колебаний кислотности среды. Большинство культуризолированных тканей растет на средах с рН 5,5–5,8. Обычно рН готовойсреды устанавливается с помощью 10 %–ного или 1 н раствора KOH или

24

NaOH или 1 н HCI перед автоклавированием. Однако надо учитывать,что после автоклавирования рН среды может снижаться в результатегидролиза сахарозы.

В настоящее время выпускают несколько типов готовых сред в видесухих порошков, содержащих все необходимые элементы, заисключением регуляторов роста, сахарозы и агара. Коммерческие средывесьма удобны для обычного культивирования. Однако у них есть ряднедостатков: они дороги, а их применение ограничено для исследований,в которых необходимо варьирование компонентов сред. На сегодняшнийдень известно большое число различных по составу питательных сред(табл. 3.2).

Таблица 3.2Состав разных питательных сред, применяемых

при культивировании in vitroКонцентрация (мг/л) в средах по прописи

Компоненты сред Мурасигеи Скуга

Гамборга иЭвелега Уайта Нича, Нич Као и Ми–

хайлюкаКNO3NH4NO3Са(NO3)2Са(NO3)2·4H2O(NH4)2SO4MgSO4·7H2OCaCI2·H2OCaCI2·2H2OKCIKH2PO4NaH2PO4·H2OMnSO4·H2OMnSO4·4H2OZnSO4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO4CuSO4·5H2ONa2MoO4·2H2OCoCI2·6H2OFeSO4·7H2ONaEDTA·2H2OCеквестрен 330–FeМезоинозитАскорбиновая кислотаТиамин–HCIПиридоксин–HCIНикотиновая кислотаСахароза

19001650

–––

370–

440–

170––

22,38,6–

6,20,0250,25

0,02527,837,3

–100

–0,50,50,5

30000

3000–––

134500

–150

––

15010––23

0,0750,25

0,025––

28–––––

20000

81–

142––

74––

6512–––––––––––––––––

20000

950720

–––

185166

––

68––

25–

1010

0,0250,25

–27,837,3

–200

331–

60000

1900600

–––

300––

300170

–10–2–

3,60,0250,25

0,0255,0––

100–

0,0050,005

–125

25

Наиболее часто используемой средой по праву можно назвать средуМурасиге и Скуга. Минеральная основа этой среды была подобранаавторами для каллусной ткани табака сорта «Висконсин», возникшей наэкспланте – паренхиме стебля в средней его части. Эта среда содержитхорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается отдругих соотношением аммонийного и нитратного азота. Онаподвергается разным модификациям, что реже относится к макро- имикроэлементам минеральной основы и чаще касается наборавитаминов, гормональных и других регуляторных факторов. СредаМурасиге и Скуга дает хорошие результаты при каллусообразовании убольшинства растений, хорошо поддерживает неорганизованныйкаллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинствадвудольных.

Среда Гамборга и Эвелега (среда В-5) используется прикультивировании клеток и тканей бобовых растений и злаков.

Среда Уайта служит для укоренения побегов и нормального ростастеблевой части после регенерации.

Среда Ничей рекомендуется для индукции андрогенеза в культурепыльников, а также морфогенеза у злаков.

Среда Као и Михайлюка применяется для культивированияединичных (или с малой плотностью высева) изолированныхпротопластов и клеток.

От состава питательной среды в значительной мере зависит успехвыращивания клеток, тканей, органов растений. Поэтому разработке исовершенствованию состава сред уделялось и уделяется много внимания.Поскольку клетки и ткани различных растений растут и функционируютв различных метаболических условиях, то, по-видимому, никогда небудет создана универсальная питательная среда. Скореесовершенствование питательных сред должно идти в направленииразработки их специфического состава по отношению к объекту, группеобъектов или соответственно целям и задачам, стоящим передисследователями.

3.3. Физические факторы культивирования

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканейрастений необходимо соблюдать определенные физические условиявыращивания.

26

Температурный фактор оказывает значительное влияние на рост вусловиях in vitro, активность ферментов, часть из которых являетсянеобходимой для метаболизма источников питания и др. Температура вкамерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается науровне 261 С, для культуры тканей тропических растений она можетдостигать 29–30 С. В случае индукции морфогенеза температурупонижают до 18–20 С.

Условия освещения также оказывают влияние на рост изолированныхклеток, тканей и органов растений. Большинство каллусных тканей ненуждается в свете, так как они не имеют хлоропластов и питаютсягетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусы,такие, как каллусные ткани мандрагоры. Большинство же каллусныхтканей получают в темноте, или при рассеянном свете.Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далеекультивируют их при освещенности 1000–4000 лк. Культивированиеизолированных меристем и их микроразмножение также происходит насвету. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и еефизиологические особенности влияет качество света. Свет разной длиныволны регулирует процессы первичного и вторичного метаболизма.Также необходимо учитывать фотопериод, который требуется дляданного культивируемого объекта.

Влажность в культуральной комнате должна составлять 60–70 %.Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды впробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ееконцентрации и нарушению условий культивирования. Наилучшийсветовой и температурный режимы, а также режим оптимальнойвлажности можно создать с помощью климатических камер.

При поверхностном и суспензионном выращивании клеточныхпопуляций важное значение имеют условия аэрации и состав газов. Хотяоптимальные условия газового режима в культуре клеток и тканейостаются малоизученными, известно, что в зависимости от газовой смеси(кислород, азот, углекислота) резко изменяется как интенсивностьклеточного деления, так и процессы дифференцировки иформообразования.

Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от многихусловий внешней среды, и действие их не всегда хорошо известно.Поэтому при введении в культуру нового вида растений необходимотщательно изучить влияние физических факторов на рост ифизиологические характеристики этой культуры.

27

ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

4.1. Получение каллуса и его культивирование

Каллусные ткани являются одним из основных объектов придлительном культивировании in vitro. Для растения каллус представляетсобой ткань, возникающую в исключительных обстоятельствах (обычнопри травмах) и функционирующую непродолжительное время. Каллусспособствует заживлению ран и первоначально состоит изнедифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхностидают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма,молодые клетки ксилемы). Эта ткань защищает место поранения,накапливает питательные вещества для регенерации анатомическихструктур или утраченного органа. Каллус может образовываться и наизолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro. Образование и росткаллусной культуры регулируется ауксинами и цитокининами. Этигормоны индуцируют образование каллуса у тех растений, которые егоне образуют в ответ на ранение.

Каллусную ткань in vitro можно получить практически из любойживой ткани растения (рис. 4.1). Выбор экспланта в значительнойстепени определяется целями исследования. Необходимо убедиться, чтовыбранный эксплант находится в подходящем биологическом состоянии.Молодые ткани более пригодны для получения каллусной культуры, чемзрелые. Лучшими эксплантами также являются ткани, ответственные запролиферацию. Для индукции каллусогенеза нежелательно использоватьодревесневшие ткани, старые ткани с низким уровнем метаболизма,плохо пролиферирующие ткани (мякоть плодов и др.), ткани, покрытыевосками, суберином и т.п. Проращивание простерилизованных семян васептических условиях часто дает наиболее пригодный материал дляполучения каллусов.

Процесс получения первичного каллуса и дальнейшего егокультивирования требуют стерильности. Обычно используют известныеметодики стерилизации либо разрабатывают их экспериментально длякаждого конкретного объекта.

ГЛАВА 4

28

Рис. 4.1. Типы эксплантов, используемые для получения каллусной тканиДостаточно важным фактором для индукции каллусогенеза является

механическое повреждение ткани экспланта. Еще со времен Габерландтабыстрое деление каллусных клеток связывалось с выделением растениемв связи с травмой некрогормонов (позже эти стимулирующие роствещества получили название травматиновой кислоты). Однако известныпримеры каллусогенеза, не связанного с травмой. Так, образованиекаллуса в культуре изолированных пыльников, зародышевых мешков инекоторых других объектов происходит без наружного травмирования.

Образование каллуса зависит от размеров экспланта. Для каждоговида растений существует минимальный критический размер экспланта– минимальная масса экспланта, при которой идет каллусогенез. При егоуменьшении невозможно индуцировать образование каллуса. Он сильноварьирует у разных видов. Например, экспланты из флоэмы корнейморкови массой всего 3,8 мг вполне жизнеспособны для активного ростакаллуса, тогда как масса аналогичного экспланта земляной грушислишком мала для индукции каллусогенеза. Это, очевидно, зависит отразмеров и, следовательно, числа клеток у эксплантов разных видоврастений.

Многие ткани обладают физиологической полярностью, поэтомуважна определенная ориентация эксплантов в пространстве при переносеих на питательную среду. Кончики корней легко образуют каллус, еслиони помещены на агар горизонтально. Сегменты стебля лучше образуюткаллус, если их поместить вертикально, одним из концов погрузив вагар. При этом каллус образуется более интенсивно на сторонеэкспланта, которая на материнском растении обращена к корню. Вслучае изоляции эксплантов из корнеплодов полярность не имеетсущественного значения.

29

Для образования каллусной ткани in vitro клетки экспланта должныдедифференцироваться, т.е. утратить специфические характеристикиисходной ткани.

Перестройка клеток эксплантов разных специализаций,предшествующая каллусогенезу, происходит сходным образом. Клеткиэксплантов теряют вещества запаса – липиды, крахмал, белки.Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хлоропластов,но при этом возрастает количество амилопластов. Разрушается аппаратГольджи, перестаивается эндоплазматический ретикулум и элементыцитоскелета, увеличивается число полисом. Клетка синтезирует РНК иДНК, и начинается экспрессия генов, присущих каллусным клеткам.Исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки,специфичные для делящихся клеток. Эти наблюдения свидетельствуютоб изменении активности генов и белкового аппарата клеток придедифференцировке. Таким образом, превращению любой клетки вкаллусную предшествует процесс глубокой биохимической иструктурной перестройки.

Добавление к среде экзогенных гормонов приводит к началукаллусогенеза. Обязательным условием дедифференцировки клетки и еепревращения в каллусную клетку является присутствие в питательнойсреде представителей двух групп регуляторов роста: ауксинов ицитокининов. Наиболее удобной моделью для изучения механизмадедифференциации и каллусообразования служит культурасердцевинной паренхимы стебля табака, поскольку для нее существуетстрогая зависимость индукции деления и каллусообразования отприсутствия ауксина и цитокинина.

Установлено, что в растительной клетке существует двойнойгормональный контроль деления: ауксин необходим для переходаспециализированной клетки из фазы G1 в S-фазу клеточного цикла,цитокинин – для завершения этой фазы и прохождения последующихфаз G2, М и цитокинеза (рис. 4.2). В последние годы показано, чтоауксины являются индукторами главной протеинкиназы клеточногоделения, а цитокинины – циклинов.

Отсутствие цитокининов в питательной среде блокирует клеточныйцикл в пресинтетическом периоде. Поэтому, если в питательной средеприсутствует только ауксин, клетки не делятся и после четырехдневнойлатентной фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины безауксинов приводят к такому же старению тканей, как и на среде безгормонов.

30

Рис. 4.2. Схема клеточного цикла:G1 и G2 – пресинтетический и постсинтетический периоды, S – синтетический период;

М – митоз; R1 и R2 – фазы покоя; D – переход к дифференцировке.

В результате процесса дедифференцировки происходит образованиеin vitro первичного каллуса. Но получить каллус первый раз из новогорастительного материала часто бывает трудно, потому что ткани разныхвидов растений и даже разных частей растения требуют длядедифференциации и каллусогенеза разного количества и соотношениягормонов.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре,представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток,не имеющих строго определенной анатомической структуры. Однакобыло бы ошибочно думать, что каллусные ткани однообразны.Исследователи делят их на типы по таким морфологическим признакам,как цвет, консистенция, характер поверхности, а также по интенсивностироста и способности к зеленению.

Цвет каллусной ткани может быть беловатым, желтоватым, бурым,коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофилломили антоцианами. Темно-коричневая окраска часто возникает пристарении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов.Последние окисляюся в хиноны. Для избавления от них в питательныесреды вносят антиоксиданты.

В зависимости от источника получения различают гомогенные(содержат один тип клеток) и гетерогенные (содержат несколько типовклеток) каллусы.

В зависимости от консистенции каллусные ткани бывают рыхлыми,среднеплотными и плотными. Рыхлые каллусы состоят из сильнооводненных клеток и легко распадаются на мелкие агрегаты.Среднеплотные каллусы имеют хорошо выраженные очагимеристематической активности, их клетки могут быть отделены друг от

R2 D

R1 D

G2

G1

S М

31

друга сильным взбалтыванием. Для плотных каллусов характерны оченьмелкие клетки, а также наличие выраженных зон с камбиальными итрахеиподобными элементами. Отмечено, что компактные каллусымогут дать начало рыхлым тканям, но не наоборот.

«Разрыхлить» каллус можно путем исключения из питательной средысолей Са2+ (в том числе, пантотената кальция). Для этой же цели можнопри выращивании в качестве ауксина использовать 2,4–Д. Значительногоразрыхления каллуса можно добиться с помощью ферментов – 0,2 мг/лпектиназы и 0,01 мг/л целлюлазы. Таким образом, консистенция каллусав значительной степени зависит от состава среды.

В случае получения первичного каллуса при оптимально подобраннойсреде часть эксплантов обычно за 3–8 недель образует каллусы вколичестве достаточном для пересадки. Для того, чтобы не произошлостарения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток,полученный каллус переносят на свежую питательную среду. Этуоперацию называют пассированием. Первичный каллус разделяют начасти, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следуетобратить внимание на размеры кусочков каллуса, переносимых насвежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейшийрост каллуса может быть угнетен. Оптимальный размерпересаживаемого каллуса зависит от вида растения. В некоторых случаяхприменяется способ субкультивирования без разделения полученногокаллуса на отдельные кусочки, при котором после пересадки на свежуюсреду, каллус продолжает расти всем объемом.

Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращиватьнеопределенно долго, периодически пересаживая их на свежуюпитательную среду. Удачно полученные линии каллусных культуртребуют регулярной пересадки примерно через каждые 4 недели.

В зависимости от условий культивирования и происхожденияисходного экспланта в каллусных культурах могут происходитьразличные преобразования. Одно из них заключается в образовании«привыкшей» ткани. Под действием факторов среды в процессекультивирования могут возникать мутантные клетки – продуцентыбольших количеств фитогормонов. Если такие клетки получаютпреимущественное развитие, то в культуре обеспечивается уровеньфитогормонов, необходимый для роста ткани на питательной среде безданного регулятора роста. В результате могут формироваться илиауксин-независимые или цитокинин-независимые культуры. Их принятоназывать «привыкшие» ткани или «химические» опухоли.

32

4.2. Суспензионные культуры

Под суспензионными культурами понимают культуры,выращиваемые в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии исостоящие из отдельных клеток и их агрегатов. Для поддержания клетокво взвешенном состоянии при глубинном культивировании ихперемешивают с помощью различных аппаратов. Аэрацияобеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды,либо путем ее продувания стерильным воздухом.

Суспензионные культуры имеют множество преимуществ посравнению с каллусной тканью, выращиваемой на агаризованнойповерхности:

более широкие возможности для изучения влияния экзогенныхфакторов на метаболизм и рост клеточных популяций, поскольку клеткив одинаковой степени становятся доступными для внешнеговоздействия;

надежное длительное поддержание линии вследствие простотыпроцессов субкультивирования;

удобство для проведения биохимических и молекулярно–биологических исследований, а также быстрой регенерации растений;

возможность неограниченного набора биомассы для полученияБАВ.

Для получения суспензионных культур чаще всего используюткаллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется наотдельные клетки и небольшие агрегаты при помещении ее вперемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивированиикаллуса из среды исключают цитокинины или снижают ихконцентрацию, а концентрацию ауксинов увеличивают. Первичныйкаллус использовать нежелательно, т.к. он содержит обычно болееплотные агрегаты клеток. Возможно получение суспензионной культурынепосредственно из эксплантов, помещенных в жидкую среду.Возникающие на поверхности экспланта каллусные клетки могутотрываться и переходить в среду, давая начало суспензии. Но этодлительный и малоэффективный процесс. Для некоторых исследованийсуспензионную культуру клеток получают путем ферментативноймацерации растительных тканей, например, из мезофилла листа, нотакую суспензию невозможно поддерживать в течение длительноговремени.

Для получения первичной суспензии, как правило, используют 2–3 гсвежей массы каллусной ткани на 60–100 мл жидкой питательной среды.

33

Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, большихклеточных агрегатов ее фильтруют через 1–2 слоя марли, нейлон илиотбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждениякрупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение несколькихминут. Колбы помещают на качалку, скорость вращения которой обычносоставляет 110–120 об/мин.

Клеточные суспензии обычно требуют регулярного и более частогосубкультивирования, чем каллусные культуры. Часть суспензионнойкультуры, используемая для пересадки на свежую среду, называетсяинокулюм. Для каждой линии культуры клеток существуетминимальный размер инокулюма, при уменьшении объема которогокультура не растет.

Суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только изодиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50–60 %,остальное приходится на долю групп из 2–10 клеток и многоклеточныеагрегаты. В зависимости от степени агрегированности выделяютслабоагрегированные (до 5–10 клеток), среднеагрегированные (более 10клеток) и высокоагрегированные суспензии (более 50 клеток в агрегате).

Как бы ни заманчива была перспектива получения в суспензиипопуляции, состоящей исключительно из отдельных клеток, с точкизрения биологии растительной клетки такая задача представляетсямалореальной. Для этого необходимо, чтобы после образованиясрединной пластинки дочерние клетки расходились до начала ихследующего деления.

В попытке получить суспензионные культуры, проявляющие высокийуровень клеточной диссоциации, чаще всего прибегают кконтролированию состава питательной среды. Ауксины, как правило,оказывают положительное влияние на процессы диссоциации клеток, ацитокинины, напротив, тормозят их. Следовательно, условия,благоприятствующие растяжению клеток и тормозящие их деление,способствуют максимальной диссоциации клеток в суспензии.

Природа углеводов в питательной среде, оказывая влияние намежклеточные контакты через изменение поверхностных полисахаридов,также может играть определенную роль. Так, введение в питательнуюсреду сахарозы, галактозы и раффинозы способствовало формированиюклеточных агрегатов. Выращивание клеток с добавлениемцеллюлолитических ферментов (мацерозим, пектиназа, целлюлаза) всочетании с осмотиком увеличивало дисперсность суспензии.

Хорошей считается суспензия, состоящая из морфологическивыравненных клеток, имеющих небольшие размеры и агрегированных в

34

мелкие группы, включающие не более 10 клеток. Оптимальнаяплотность клеток в суспензии, обеспечивающая хороший рост,составляет 105 – 106 в 1 мл среды.

Для выращивания клеточных суспензий используют в основном те жепитательные среды, что и для каллусных культур. Однако в настоящеевремя создан ряд сред, предназначенных непосредственно длявыращивания суспензионных культур. При этом наблюдается тенденцияк упрощению их состава и использованию простых минерально-сахарозных сред без комплексных добавок.

Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькимиспособами (рис. 4.3).

Наиболее простым и распространенным является накопительное илипериодическое культивирование. В этом случае размножение популяцииклеток осуществляется в закрытой системе в постоянном объемепитательной среды. Создание достаточной аэрации является условиемхорошего размножения клеток и их активной деятельности. Влабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100–250мл, с небольшим объемом питательной среды – 20–70 мл.

Рис. 4.3. Способы культивирования клеточных суспензий

Крупномасштабное культивирование осуществляется в сосудахобъемом до нескольких десятков литров – ферментерах. По сравнению сглубинным выращиванием в колбах на качалке при культивированииклеток в ферментерах появляются принципиально новые возможности,связанные с их конструкцией. Для культуры клеток в ферментерахможно в любой момент изменять различные факторы (температуру, свет,газовый режим, физиологически активные вещества, рН и др.) иотбирать пробы клеток для определения динамики роста и метаболизма

Системы культивированияклеточных суспензий

Накопительное

Закрытое

ПроточноеПолупроточное

Непрерывное

Открытое

35

популяции в цикле выращивания. Иными словами, не нарушая режимаасептики, можно контролировать рост и продуктивность биомассы,изучать влияние на эти процессы различных воздействий.

Способ, при котором клетки выращиваются в проточном режиме,называется непрерывным культивированием. Непрерывноекультивирование осуществляется в открытых системах, т.е. такихсистемах, в которых происходит, с одной стороны, приток питательнойсреды, а с другой – отток среды или биомассы. Непрерывныекультуральные системы подразделяют на полупроточные и проточные.Последние, в свою очередь могут быть открытыми и закрытыми.

Полупроточный режим выращивания основан на принципе отбораопределенной части клеточной суспензии через определенные интервалывремени и разбавления оставшейся части свежей средой. Оноприменяется в основном для получения больших масс суспензии с цельюее дальнейшего биохимического исследования.

В закрытой проточной культуре в систему постоянно подается свежаяпитательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при томостаются в системе в течение всего цикла выращивания. Такие системымогут быть применимы для оптимизации образования метаболитов, атакже для изучения цитодифференцировки, поскольку в данном случаеклетки будут длительный период поддерживаться в неделящемсясостоянии.

Открытые проточные системы функционируют на принципе балансамежду притоком свежей питательной среды и удалением равного объемаклеточной суспензии. Скорость удаления части клеток из системыдолжна соответствовать скорости образования новых клеток, что создаетравновесное состояние между ростом клеток (постоянство скоростиклеточного деления) и биосинтезом (постоянство метаболическойактивности). Такие системы представляют большой интерес, посколькупозволяют исследовать изменения при переходе от одного равновесногосостояния к другому, сравнивать биосинтетический потенциал клетокразличных клонов в условиях, способствующих одинаковой скоростироста, а также выбрать оптимальный режим для получениямаксимального количества вторичных метаболитов.

Регуляция равновесного состояния может осуществляться попринципу турбидостата или хемостата, разработанных прикультивировании микроорганизмов (рис. 4.4).

В хемостатном режиме непрерывное культивирование зависит отлимитирующего фактора, роль которого выполняет один из компонентовпитательной среды. Скорость роста и плотность клеточной популяции

36

Питательнаясреда

Сливсреды

Воздух

Выхлоп

Воздух

Источниксвета

Удалениесуспензии

Фото-элемент

Хемостат Турбидостат

определяются скоростью поступления среды (скоростью разбавления),т.е. подачей лимитирующего фактора и других компонентов среды.

Рис.4.4. Схема ферментеров различного типа действия

В турбидостате рост клеток популяции поддерживается наопределенном уровне благодаря регулированию оптической плотностикультуры. Для этого подходят суспензии с низкой плотностью клеток ивысокой удельной скоростью роста. Турбидостат снабженфотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности культуры.Оптическая система, определяющая плотность клеток, связана с реле,через которое в случае увеличения плотности клеток поступает сигнал навключение протока. Таким образом, рост клеточной популяцииподдерживается на определенном запрограммированном уровнеавтоматически.

Хемостатный и турбидостатный режимы применяют с цельюстабилизации суспензионной культуры в определенном состоянии ростаи поддержания его неограниченное время. Препятствиями ккультивированию клеток высших растений в проточном режимеявляются их высокая чувствительность к повреждениям,агрегированность, длительное время генерации.

37

4.3. Культивирование одиночных клеток

Для генетических и физиологических исследований, а также дляпрактического использования в клеточной селекции очень ценнымявляется культивирование одиночных клеток. Так, например, вопрос огенетической неоднородности легче решать, используя клон – потомствоодной клетки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта.

Для выделения одиночных клеток используют низкоагрегированныесуспензии, из которых отбирают отдельные клетки. Изолирование клетоктакже можно производить непосредственно из тканей целого растенияпосле их предварительной мацерации. Однако идеальный способполучения одиночных клеток заключается в использованииизолированных протопластов после восстановления ими клеточнойстенки.

Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, чтоотдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растеткаллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делится,разработаны специальные методы. Все они основаны на использованиитак называемого «кондиционирующего фактора».

Многими исследователями было установлено, что активноделящиеся клетки не только адсорбируют питательные вещества изсреды, но и каким-то образом изменяют, «кондиционируют» ее, выделяяпродукты собственной биосинтетической деятельности, способствующиеросту одиночных клеток. Отдельная клетка должна получить сигнал ввиде фактора кондиционирования от соседних клеток, и только тогдаделение индивидуальной клетки становится возможным. Этой целислужат следующие методы:

1. Метод ткани-«няньки» – кондиционирующий фактор выделяетсянаходящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки».

2. Метод «кормящего слоя» – кондиционирующий фактор выделяютактивно делящиеся клетки суспензионной культуры того же видарастений, что и одиночная клетка (рис. 4.5).

3. Кондиционирование среды путем добавления питательной средыот интенсивно делящейся культуры клеток.

4. Метод культивирования одиночных клеток в микрокапле, т.е.очень малом объеме (~20 мкл) богатой, оптимально сбалансированнойпо составу питательной среды.

Несмотря на многочисленные попытки определить химическуюприроду веществ (или вещества), индуцирующих деление отдельнойклетки, и механизм действия фактора кондиционирования, ясности здесь

38

пока нет. Однозначно можно сказать, что фактор кондиционированияимеет не физическую, а химическую природу, не является отдельнымсоединением, его влияние на деление клеток не обладает видовойспецифичностью. Этот фактор термостабилен, водорастворим, включаетнизкомолекулярные вещества, его молекулярная масса ~ 700 Д, незаменяется фитогормонами и является синергистом брассиностероидов.

Рис. 4.5. Использование культуры суспензионных клеток в качестве «кормящегослоя» для выращивания одиночных клеток:

1 – колонии клеток; 2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая сетка;4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток.

Необходимость кондиционирования среды дает основаниепредположить, что одиночная клетка не способна производить всенеобходимые метаболиты для размножения и ее развитие зависит отактивности популяции окружающих клеток.

4.4. Культуры гаплоидных клетокПри культивировании in vitro пыльников или микроспор, а также

незрелых семяпочек возможно получение гаплоидных растений. Этотуникальный феномен связан с переключением развития спорогенныхклеток с обычного для них гаметофитного пути развития напринципиально иной – спорофитный путь. Интерес исследователей кданной проблеме обусловлен ее значимостью для решения задачпрактической генетики и селекции. Следует отметить, что уопределенных видов растений, в частности, у многих злаков микроспорапредставляет собой единственную легко доступную индивидуальнуюклетку. Эта гаплоидная клетка дает уникальные преимущества приизучении деления и дифференцировки клеток.

39

Процесс образования гаплоидного растения (спорофита) измикроспоры или клеток пыльцевого зерна получил названиеандрогенеза. В результате изменения программы развития гаплоидноймикроспоры прекращается формирование пыльцевого зерна (мужскогогаметофита) идут процессы пролиферации клеток, приводящие кобразованию либо эмбриоида, который разовьется в гаплоидноерастение, либо каллуса. В соответствии с этим различают два путирегенерации гаплоидов in vitro – прямой и непрямой.

При непрямом андрогенезе микроспоры или клетки пыльцевого зернаобразуют каллус, который дает начало растению-регенеранту послепереноса на среду, индуцирующую органогенез. Более желателен путьпрямого андрогенеза, при котором микроспора ведет себя как зигота ипроходит целый ряд этапов эмбриогенеза, вплоть до образования напыльнике растеньиц. Прямое развитие эмбриоидов из пыльцевых зерендостигнуто у четырех родов из семейства Solanaceae – Datura, Nicotiana,Atropa, Lycium. Эмбриоиды и каллусы предложено называтьандрогенными новообразованиями, т.к. они несут генотип мужскойгаметы.

Поскольку гаплоидные растения при андрогенезе могутобразовываться либо из микроспор, либо из пыльцевого зерна,содержащего вегетативную и генеративную клетки, то возможны 4основных пути андрогенеза:

1 путь. Микроспора делится на две идентичные дочерние клетки,которые способны к спорофитному развитию. В данном случае непроисходит формирования вегетативных и генеративных клеток.

2 путь. Микроспора в результате неравного деления образуетвегетативную и генеративную клетки. Спорофиты возникают врезультате дальнейшего развития вегетативной клетки, а генеративнаяклетка дегенерирует.

3 путь. Эмбриоиды формируются только из генеративной клетки. Втаких случаях вегетативная клетка либо вовсе не делится, либо делитсядо известного предела.

4 путь. Как и во втором случае, в результате деления одноядерноймикроспоры образуются вегетативная и генеративная клетки, которые вдальнейшем делятся и участвуют в развитии спорофита.

В настоящее время более чем у 200 видов удалось получить целыерастения или линии клеток из микроспор, в их числе немалохозяйственно важных культур.

Методы, с помощью которых можно получить гаплоиды in vitro,подразделяются на методы культуры пыльников (на питательной среде

40

культивируются изолированные пыльники) и методы культуры пыльцы(методы, при которых соматические ткани пыльника удаляются).

Процесс получения гаплоидов методом культуры пыльниковначинается со стерилизации бутонов. Для повышения количестваобразующегося из микроспор материала рекомендуется послестерилизации выдерживать пыльники при пониженной температуре. Длякаждого вида необходимо определить оптимальную температуру и времяинкубации. Эти величины зависят от стадии развития пыльцы. Причемдля пыльцы, находящейся на более поздних стадиях развития, обычноиспользуют более короткое время прединкубации. Воздействие низкойтемпературы можно рассматривать либо как способ задержки процессовразвития микроспор и сохранения их жизнеспособности, либо как стресс,меняющий программу развития пыльцы.

На следующем этапе осуществляется препарирование. Пыльникибольшинства видов растений обладают достаточным размером и поэтомуотносительно легко могут быть извлечены из цветков. Однако унекоторых видов, например, у тропических злаков, препарированиесложных соцветий для удаления крошечных пыльников представляетсобой длительную процедуру. В этом случае рекомендуетсякультивировать соцветия полностью. Во время извлечения пыльников нив коем случае нельзя их повреждать. Поврежденные пыльникиобязательно отбрасывают, т.к. в противном случае каллус можетобразовываться не из пыльцы, а из соматических диплоидных клетоктканей пыльников.

После выделения пыльников осуществляется их перенос на среду длякультивирования. Рекомендуемые многими авторами среды: 0,5 солей попрописи Мурасиге и Скуга (широко используется для представителейсемейства пасленовых), китайская среда №6, среда Ничей и др.

Культивирование пыльников проводят на жидких, полужидких икомбинированных средах – двуслойных. Хорошие результаты дает методплавающих пыльников Сандерленда: пыльники, помещенные на жидкуюили комбинированную среду, через некоторое время раскрываются, имикроспоры высыпаются наружу, т.е. фактически микроспорыкультивируются в присутствии пыльников, что положительносказывается на ранних этапах индукции андрогенеза.

Формирование эмбриоида из микроспоры длится от 3 до 10 недель взависимости от вида растения. В результате последовательных деленийэмбриогенной клетки, происходящих внутри оболочки пыльцевогозерна, формируется шарик из множества мелких клеток. Наконец,экзина, окружающая эмбриоид, разрывается, и он высвобождается.

41

После этого средний размер клеток начинает увеличиваться. Далееэмбриоид развивается вполне аналогично зиготическому зародышу.

К основным недостаткам метода культуры пыльников следует отнестиневысокую эффективность, появление большого числа альбиносныхрастений-регенерантов, возникновение мутаций при эмбриогенезе.

Теоретическая привлекательность метода культуры пыльцызаключается в том, что он позволяет избавиться от ингибиторов,содержащихся в тканях пыльника и избежать конкурирующего спыльцой роста соматических тканей, а также дает возможностьполучения гомогенной популяции многочисленных клеток пыльцы,определенной синхронности ее развития и эмбриогенеза. В настоящеевремя разработано несколько методов отделения пыльцы отсоматических тканей пыльника: спонтанное освобождение,гомогенизация и фильтрация, разрезание пыльников.

Для культуры пыльцы наиболее широко используется среда Ничей.На индуцирование развития пыльцы в условиях культуры in vitroнаибольший эффект оказывает воздействие пониженной температуры (5С) в течение 3 дней.

Недостатки метода культуры пыльцы выражаются в том, чтоконечный выход растений-регенерантов обычно ниже, чем из микроспор,развивающихся внутри пыльника. У некоторых видов, особенно узлаков, микроспоры невозможно отделить от тканей пыльников без того,чтобы резко не снизить их жизнеспособность, а, следовательно,выживаемость и развитие в культуре. В результате метод культурыпыльцы используется на практике реже, чем метод культуры пыльников.

Для успешной индукции андрогенеза in vitro важное значение имеютследующие факторы:

характеристики растения-донора (генотип, возраст, условиявыращивания, стадия развития пыльцы).

состав питательной среды для культивирования (фитогормоны,органические добавки, наличие агара, осмотическое давление).

условия культивирования (температура, свет, плотность посадкипыльников и др.).

Помимо андрогенеза in vitro возможен другой путь получениягаплоидных растений, а именно из клеток зародышевого мешка. Этотпроцесс получил название гиногенеза. Образующийся при этом зародышнаследует только признаки материнского организма.

К преимуществам метода гиногенеза относится возможностьполучение гаплоидов у мужских стерильных растений, а также растений,у которых андрогенный каллус обладает низкой морфогенетической

42

потенцией или приводит к образованию альбиносов. Кроме того,зародышевый мешок в отличие от микроспор способен к индукцииспорофита на всех стадиях развития.

Техника культивирования изолированных семяпочек быларазработана сначала для ячменя, затем стала применяться и для другихрастений. К настоящему времени метод успешно применен дляполучения гаплоидов сахарной свеклы, подсолнечника, кукурузы,картофеля, риса, пшеницы, райграсса пастбищного.

Гиногенетические зародыши развиваются либо из яйцеклетки, либо изантипод. Синергиды обычно разрушаются. При инокуляции семяпочек изавязей на стадии макроспор в течение 1–3 месяцев выявляется стадиязрелого восьмиядерного зародышевого мешка, в течение 5–9 месяцеввозникают эмбриогенные структуры.

При культивировании семяпочек, также как и при культивированиипыльников, необходима обработка холодом. Оптимальнаяпродолжительность воздействия холода связана с генотипом экспланта,стадией инокуляции и условиями культивирования и обычно составляетминимум 1–4 суток. Увеличение продолжительности охлаждения до 10–15 суто от начала формирования макроспор при инокуляции семяпочкина стадии макроспоры приводит к их превращению в зародышевыймешок через один месяц. В тех же условиях при инокуляции на стадиивосьмиядерного зародышевого мешка через такое же время можнодобиться появления зародышей.

К недостаткам метода гиногенеза в первую очередь относится низкийпроцент выхода эмбриоидов, поскольку развитие зародыша в проросток,как правило, блокируется в начале органогенеза в глобулярной илисердцевинной стадии. Частота образования гаплоидов, как правило,составляет 2 растения на 1000 семяпочек. Необходимость эмпирическиподбирать условия для индукции формирующихся клеток гаметофита, атакже возможность появления различных сомаклональных вариантов испонтанных мутаций сдерживают широкое применение этого метода напрактике.

Важный и необходимый этап работы по получению гаплоидныхрастений in vitro – это их идентификация. Основными причинамиобразования негаплоидных растений являются следующие:

слияние ядер при первых делениях микроспоры; образование регенерантов из негаплоидных клеток стенки

пыльника;

43

образование регенерантов из негаплоидной пыльцы, которая можетобразовываться у некоторых видов при нормальных условиях с низкойчастотой;

мутации в начале эмбриогенного развития.Гаплоидные растения идентифицируются по морфологическим

признакам, а также с помощью цитогенетических методов – подсчетачисла хромосом в делящихся клетках кончика корня, определения числахромосом в замыкающих клетках устьиц, определения числа ядрышек,подсчета числа хромоцентров, приходящихся на ядро в клетках листа,подсчета числа пластид в замыкающих клетках. Последний методотличается наибольшей простотой. Он основан на том, что у гаплоидовчисло хлоропластов в замыкающих клетках устьиц почти в 2 разаменьше, чем у диплоидов.

4.5. Культуры изолированных протопластовИзолированные протопласты – одни из наиболее ценных объектов в

биотехнологии. Несомненным преимуществом протопластов являетсяудобство их использования в качестве модели для изучения транспортаразличных веществ и ионов через плазмалемму, электрических свойствмембраны и воздействия на нее физических и химических факторов. Наоснове изолированных протопластов высших растений в настоящеевремя успешно развивается и используется метод пэтч-клампа, которыйпозволяет изучать свойства одиночных ионных каналов. Однако главноеих преимущество – это возможность различных генетическихманипуляций, введение в них генетической информации из клетокдругих растений, прокариотов-симбионтов, и даже клеток животных, втом числе и млекопитающих.

Впервые протопласты растений были выделены Клернером в 1892 г.при изучении плазмолиза в клетках листа телореза во времямеханического повреждения ткани, в связи с чем метод был названмеханическим. Он позволяет выделить лишь небольшое количествопротопластов, характеризуется достаточно низкой эффективностью ивысокой трудоемкостью. Современный метод выделения протопластовзаключается в удалении клеточной стенки с помощью ферментов, ееразрушающих (целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы). Этот методполучил название ферментативного. Первое успешное выделениепротопластов из клеток высших растений данным методом было сделаноЕ. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим ферментативныйметод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и

44

быстро выделять большое количество протопластов, которые неиспытывают сильного осмотического шока. Однако при этомплазмалемма может утрачивать ряд интактных конститутивных свойств,а также могут возникать сложности при выделении протопластов излигнифицированных клеток.

Источниками получения протопластов служат изолированные органырастений и их части (листья, семядоли, корни, гипокотили, лепестки,пыльцевые зерна), суспензионные культуры и каллусная ткань. Вклетках разных типов тканей в зависимости от функциональныхособенностей, возраста, наличия вторичных утолщений соотношенияразличных компонентов клеточной стенки (целлюлоза, гемицеллюлоза,пектиновые вещества, белки) могут варьировать. Поэтому типыферментных препаратов специфичны для каждого вида клеток. Наиболееадекватная составу клеточной стенки комбинация ферментовобеспечивает успех выделения протопластов.

При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис,лист нарезают на сегменты, а затем подвергают энзиматическойобработке (рис. 4.6). Важную роль при этом играет осмотическийстабилизатор. Чаще всего в качестве осмотиков используются сахара(глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит), иногда растворы солейСаСI2, Na2HPO4, KCI в концентрациях 0,3–0,8 М. Точная концентрацияосмотиков всегда подбирается для конкретного вида растения и егофизиологического состояния. Длительность инкубированиярастительного материала в среде с ферментами сильно варьирует исоставляет от 3–4 до 16–18 часов.

После энзиматической обработки суспензия протопластов должнабыть очищена от остатков неразрушенной ткани и осколков клеток, атакже отмыта от ферментов. Для этого используется техникафильтрации-центрифугирования. После удаления ферментов следуетвысев протопластов на питательную среду с добавлением маннита илисорбита. Среда должна быть несколько гипертоничной, чтобыпротопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.Наличие осмотического стабилизатора необходимо для того, чтобыпредотвратить разрыв протопластов. Кроме того, в этих условияхтормозится метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Получение протопластов из каллусных или суспензионных культуросуществляется по той же схеме. Однако в этом случае нетнеобходимости в стерилизации исходного материала. Хорошим выходомсчитается получение 106–5·106 жизнеспособных протопластов на 1 гсвежей массы ткани растения или культивируемых клеток.

45

Рис. 4.6. Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений

Протопласты можно культивировать различными способами.Применение того или иного метода культивирования зависит от целиэксперимента. Для успешного культивирования протопластов в жидкойсреде, так же, как и изолированных клеток, требуется высокая их

лист

проросток каллус суспензия клеток

морфогенез

выделение протопластов

культивированиепротопластов

клеток

стерилизация

фильтрация черезнейлоновый фильтр

центрифу-гирование

отмытыепротопласты

регенерацияклеточной

стенкипротопласты

первое делениеклеточные колониикаллус

растения-регенеранты

46

плотность. В большинстве случаев эта величина составляет 104–105

клеток/мл, а объем культуры 2,5–10 мл. Чтобы обеспечить«кондиционирование» клеток в разбавленной культуре, либо используют«питательный, или кормящий слой», либо применяют обогащенныепитательные среды, либо уменьшают до минимума объем культуры.

Применение богатых сред дает положительный эффект только дляограниченного числа видов растений. Широко используется методкультивирования протопластов в жидких каплях объемом 20–40 мкл привысокой влажности. Капли могут быть висячие или сидячие. С помощьюавтоматической пипетки протопласты распределяются по маленькимкаплям на крышке или дне чашки Петри. В 1978 г. Ю.Ю. Глебаразработал метод культивирования единичных протопластов вмикрокаплях питательной среды объемом до 1 мкл. В микрокапляхтакого объема, если в них находится лишь одна клетка, соотношениеобъема клетки к объему питательной среды является таким же, как и вмакрокультурах с плотностью 103 клеток/мл. Предварительноекультивирование протопластов в течение 1–3 дней в суспензиях высокойплотности (104–105 клеток/мл) значительно повышает эффективностьроста последующей культуры единичных протопластов.

Суспензию протопластов культивируют также в жидкой среде,наслаивая ее тонким слоем в концентрации в два раза больше, чемоптимальная, на полужидкую питательную среду в самых разныхсосудах.

Протопласты можно культивировать и на агаризованной среде, но неповерхностным способом, а заплавляя в него. Суспензию протопластовсмешивают в чашке Петри с равным объемом теплой (45 °С) среды,содержащей 1,2 % агара. После застывания среды протопластыоказываются фиксированными в одном положении и физическиотделены один от другого. Данный метод позволяет наблюдать заповедением каждого конкретного протопласта по мере культивирования.Показано, что деление клеток можно стимулировать, если вместо агара всреде для платирования протопластов использовать агарозу.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны сцелыми клетками. Поэтому питательные среды, применяемые для ихкультивирования, подобны таковым для клеточных культур. Чаще всегоиспользуют среды Мурасиге и Скуга, Нагата и Такебе, Гамборга В5, Каои Михайлюка. Существенным их отличием является увеличение в 2–4раза концентрации кальция и присутствие осмотиков.

Температура, при которой культивируются протопласты, варьирует взначительной степени в зависимости от специфики вида. Например, для

47

пшеницы это 22 С, для другого представителя злаковых – росичкикроваво-красной – 30 С. Обычно протопласты не выдерживают даженезначительного отклонения от оптимальной температуры.

Свет высокой интенсивности губительно действует на свежиевыделенные протопласты. Оптимальные значения освещенностиварьируют в широких пределах. Например, протопласты люцерныобразуют колонии в абсолютной темноте, а протопласты немезииоптимально растут при освещенности 80 000 лк.

В процессе культивирования интактные протопласты регенерируютновую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делитьсяи давать начало каллусной ткани. Дальнейшая задача – получение изкаллусной ткани растений-регенерантов. Пока не удалось получитьрегенеранты из протопластов многих злаковых. Однако успешноосуществляется регенерация растений из протопластов пасленовых идругих культур.

48

БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХРАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

5.1. Цитогенетические особенностикультивируемых клеток

Клетки растений in vitro значительно отличаются от тканевых клетокрастений in vivo. Перевод клеток в культуру существенным образомперестраивает большинство их биологических функций. К основнымперестройкам, происходящим в начале культивирования растительныхклеток в условиях in vitro, относятся:

генетическое перепрограммирование: одни комплексы геноврепрессируются, другие активируются;

изменение морфологии клеток и их цитофизиологических функций(например, изменение кинетики митотического цикла);

изменение трофики клетки; изменение реакции клетки на различные факторы; изменение уровня интеграции и систем регуляции.В многоклеточном растительном организме каждая отдельная клетка

находится под контролем систем как межклеточной регуляции, так исистем интеграции и регуляции на организменном уровне. Выделениеклетки из целого организма и перенос ее в искусственно созданныеусловия культуры практически полностью устраняет влияниемежклеточных и организменных регуляторных систем. Практическиединственной регуляторной системой становятся экзогенные регуляторыроста. Они имитируют сигналы центров регуляции целостногоорганизма. В связи с этим главная парадигма метода культуры клеток итканей растений– все процессы in vitro находятся под постояннымконтролем экзогенных регуляторов роста.

Отключение растительной клетки от всей иерархии регуляторныхсистем приводит к потрясающей цитогенетической вариабельностикультивируемых клеток. Для популяций длительно культивируемых invitro растительных клеток характерны следующие особенности:

морфологическая гетерогенность; физиологическая гетерогенность; генетическая гетерогенность;

ГЛАВА5

49

сохранение генетических особенностей исходного вида и некоторыхего эпигенетических характеристик.

Как каллусная ткань, так и суспензионная культура отличаютсязначительной морфологической гетерогенностью. Морфологическаягетерогенность зависит от вида ткани, состава питательной среды испособа культивирования. Отмечено, что в каллусных культурахнаблюдается гораздо большее разнообразие форм и размеров клеток, чемв суспензионных культурах. Это может быть обусловленосуществующим здесь градиентом доступности питательных веществ игормонов. Гетерогенность каллусной ткани по клеточному составузаключается в том, что она может включать паренхимные,меристематические, некротические клетки, отдельные клетки или зоныпроводящей системы.

В суспензионных культурах наряду с делящимися мелкими(диаметром 15–50 мкм) сферическими клетками с одним крупным ядромимеются более крупные, часто удлиненные вакуолизированные клетки.Как правило, такие гигантские клетки являются полипоидными иобладают низким потенциалом к эмбриогенезу.

Физиологическая гетерогенность состоит в том, что клетки впопуляции находятся в разном физиологическом состоянии, т.е. одни изних делятся, другие растут, третьи стареют и погибают. Такая культураназывается асинхронной. Физиологическая вариабельность клеток всуспензионной культуре менее выражена по сравнению с культуройкаллусной ткани, что связано с более однородными условиями питания,аэрации и удаления токсических метаболитов из клеточного окружения вжидкой перемешиваемой среде.

Обычно для синхронизации используются приемы, останавливающиеклеточный цикл на границах его фаз. Первый способ – применениеингибиторов синтеза ДНК (тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина). Врезультате обработки клеток этими веществами клеточный циклпродолжается только до G1-периода, и клетки накапливаются передсинтетическим периодом. Использование 5-метилоксимочевинынаиболее эффективно, поскольку в этом случае удается собрать более 80% клеток в одной фазе цикла.

Второй вариант – создание условий голодания по одному изкомпонентов культуральной среды (например, ауксину, цитокинину,углеводам, азоту, фосфору). Последующий перенос культуры на среду снедостающим компонентом приводит к синхронизации клеточногоделения.

50

Третий способ синхронизации – действие пониженной температуры.Так, обработка экспоненциально растущей суспензии моркови холодом(4 С в течение 72 ч) после переноса на среду без сахарозы значительноповышала уровень синхронизации.

Синхронизировать популяцию можно лишь на небольшойпромежуток времени. Через 3–4 деления клеток, если не приниматьспециальных мер, популяция вновь становится асинхронной.

Генетическая неоднородность каллусных клеток и клетоксуспензионных культур выражается, прежде всего, в различнойплоидности. Популяции клеток in vitro могут иметь в своем составеполиплоидные, моноплоидные, анеуплоидные клетки и клетки схромосомными абберациями. Можно назвать несколько причиннестабильности генома клеток in vitro:

1. Генетическая гетерогенность определенного вида, сорта, органа,ткани, которые используются для получения первичного каллуса.

2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первичногоэкспланта из растения.

3. Аномалии митотического цикла клеток in vitro.4. Мутагенное действие экзогенных гормонов и стимуляторов.5. Длительное субкультивирование каллусных культур, приводящее к

накоплению в популяции генетически измененных клеток и клонов.Обычно наиболее интенсивно процесс перестройки генома

происходит при получении культуры клеток, а также при существенномизменении условий культивирования.

Генетическая гетерогенность клеток любой популяции не следуетрассматривать как недостаток. Генетическая гетерогенность – это, какправило, необходимое условие ее существования, основа адаптационныхвозможностей популяции. Она является фактором гомеостаза популяции.

Несмотря на генетическую гетерогенность популяцийэукариотических клеток in vitro, в их геноме сохраняются генетическиеосновы вида и индивидуального генотипа растения-донора. Более того, вклетках in vitro часто сохраняются и эпигеномные характеристики,связанные с исходной дифференцировкой экспланта.

Прямым подтверждением сохранения эпигеномных функций служатрезультаты следующих исследований. Хорошо известно, что вкорнеплодах и надземных органах сахарной свеклы активность ферментаинвертазы, расщепляющей сахарозу на фруктозу и глюкозу, значительноразличается. Стеблевые органы, связанные с транспортом и тратойсахаров, имеют активную инвертазу. Оказалось, что высокая активностьинвертазы сохраняется и в культуре клеток, полученной из стеблевых

51

эксплантов. В запасающих клетках корнеплода, в которых содержитсяоколо 20 % сахарозы, активность инвертазы значительно ниже. Вкультуре клеток, полученной из корнеплодов сахарной свеклы,активность инвертазы также оказалась невысокой. Таким образом,различия в активности инвертазы унаследовали и популяции клеток,полученные от стеблевых органов и корнеплодов. Существенно, что этаособенность сохранялась при длительном субкультивировании. Такимобразом, не только генетические характеристики популяции, но иэпигенетические их особенности могут сохраняться длительное времяпри субкультивировании популяций.

5.2. Рост клеток в культуре

Наиболее важной характеристикой популяции является ее рост.Обычно рост популяции клеток in vitro оценивают по числусоставляющих ее клеток или по их общей биомассе. В целом клетки invitro проходят фазы ростового цикла, характерные для роста клетоквысших растений in vivo.

Ростовой цикл, или цикл выращивания, – это период от помещенияинокулюма на свежую питательную среду до следующегосубкультивирования. Несмотря на морфологическую и физиологическуюгетерогенность внутри популяции рост клеточных культур описываетсяS-образной кривой. Различают несколько фаз ростового цикла (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Модельная криваяростового цикла. Фазы роста: 1–латентная; 2 – логарифмическая; 3 –линейная; 4 – замедления; 5 –стационарная.

Время

Число клеток

52

Лаг–фаза – начальный период в ростовом цикле, в котором клетки неразмножаются и не увеличиваются в размерах. Однако на протяженииэтого периода в клетках происходят важные изменения, направленные наподготовку и вступление их в фазу активного деления. Увеличиваетсяпоглощение и экскреция веществ. Увеличивается объем цитоплазмы ичисло органелл. Повышается содержание АТФ, ГТФ, НАДФН2.Активизируется дыхание, в том числе по пентозофосфатному пути.Полисомы свободные. Начинается синтез ДНК.

Логарифмическая фаза – это ограниченный период в ростовом цикле,в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое)увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и какследствие – увеличение сухого вещества. В течение этой фазынаблюдаются следующие цитологические и метаболические изменения.Исчезает вакуоль и увеличивается объем цитоплазмы, гиалоплазмастановится плотной. Увеличивается число митохондрий и полирибосом.Полисомы прикрепленные. Наблюдается максимум синтеза РНК и белка.Отмечается активное дыхание. Происходит синтез индуцибельныхферментов и пластидный синтез липидов, углеводов, пуринов, терпенов.В течение поздней экспоненциальной фазы наблюдается замедлениеклеточного деления, а увеличение биомассы происходит за счетрастяжения клеток.

Линейная фаза очень короткая. Удельная скорость роста культуры вэтой фазе практически постоянная.

Наступление фазы замедления роста обусловлено истощениемпитательной среды (в основном источников углеводного, азотного ифосфорного питания). В течение этой фазы размер клеток ещепродолжает возрастать, однако количество клеток не изменяется.Отмечается увеличение морфологической гетерогенности клеток иорганелл. Цитологические изменения заключаются в изменении числаорганелл, а также изменении формы митохондрий и др. Могутпроисходить выбросы этилена. Наблюдается синтез ферментов,ключевых для вторичного метаболизма, начинается синтез «белковстарения».

Стационарная фаза – период ростового цикла, в ходе которогокаллусная или суспензионная культура достигает максимума сухого веса.В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельностиклеток, угнетающие рост культуры. В клетках резко уменьшается объемцитоплазмы, вакуоль достигает максимальной величины. Наблюдаетсяразрушение органелл. Резко падает активность дыхания. Увеличиваетсяколичество свободных серина, треонина. Повышается активность

53

оксидаз и гидролаз. Для того чтобы не наступила гибель клеток,необходима пересадка культуры на свежую питательную среду.

Рост можно регулировать различными факторами и оценивать потаким показателям как размер, объем, масса, число клеток, количествобелка и ДНК. Тот или иной показатель используется в зависимости отцелей эксперимента.

Переход клеток из одной фазы в другую контролируется каквнутренними, так и внешними факторами. К внутренним факторам,например, относится пролиферативный пул, а также продолжительностьрастяжения, состояние клетки. Внешние факторы – состав питательнойсреды, уровень рН, содержание кислорода, температура, плотностьпосева и т.д.

5.3. Типы дифференцировки в культуре клеток

Дифференцировка клеток растений in vitro может происходитьразличными путями и в разной степени – от дифференцировкиотдельных клеток до развития целого растения. Выделяют следующие еетипы:

1. Наиболее простой вид дифференцировки – появление в каллуснойткани дифференцированных клеток, имеющих специфическоеморфологическое строение и выполняющих особые функции.Достаточно часто наблюдается возникновение эпибластов – клеток,депонирующих запасные вещества, а также вторичные метаболиты.

2. Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) –образование в каллусе различных тканей. В каллусной ткани можетпроходить образование млечников, волокон, трихом; сюда же можноотнести образование элементов сосудистой системы – трахеи и трахеидыксилемы, ситовидные трубки и клетки–спутницы флоэмы.

3. Органогенез – это дифференциация каллусных клеток в целыеорганы; превращение их в апексы стеблей или корней, флоральныеэлементы.

4. Соматический эмбриогенез – образование в каллусной ткани илисуспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков интактного растения,способных развиваться во взрослое растение.

Гистологическая дифференцировка in vitro может осуществляться попути либо ксилемогенеза, либо флоэмогенеза. Для изучения процессагистогенеза в основном используются каллусные культуры и эксплантысердцевины стебля, фрагменты клубней.

54

Превращение каллусной клетки в проводящие элементы происходитследующим образом. Вначале каллусная клетка увеличивается вразмерах, становится полярной. В клеточной стенке увеличиваетсяколичество гемицеллюлоз и уменьшается количество пектинов. Затемосуществляется лигнификация клеточных стенок, при этом возрастаетактивность фенилаланин-аммиаклиазы. Зачастую активность данногофермента достаточно хорошо коррелирует с интенсивностью процессагистогенеза. Поэтому его можно использовать в качестве маркера.

Превращение каллусной клетки в сосудистый элемент определяютпрежде всего гормональные факторы, в основном ауксины. Впервыеэкспериментальное доказательство влияния ауксина на образованиеэлементов проводящей системы в каллусе было выполнено французскимботаником Камусом в 1949 г. Камус прививал маленькие почки –источники синтеза ауксина – на поверхность культуры ткани корняцикория. Примерно через месяц в паренхимной ткани ниже привитыхпочек наблюдалось образование сосудистых узелков и пучков. Позжебыло показано прямое действие ауксина на ксилогенез. Вместоразвивающейся почки на поверхность каллуса помещали агаровый блок,содержащий ауксин, и наблюдали развитие проводящих пучков.

Эффект ауксина на дифференциацию проводящих элементов вкаллусной культуре тесно связан с влиянием сахарозы. Показано, чтопри одной и той же концентрации ауксина в агаровом блоке, но приразных концентрациях сахарозы могут иметь место разные события.Низкие концентрации сахарозы (2 %) вызывают преимущественноеобразование элементов ксилемы, а высокие (8 %) – флоэмы.

Стимулирующее действие цитокининов на дифференциацию трахеидв основном показано при наличии ауксина. Оптимальное соотношениеауксина и цитокинина для индукции гистогенеза изменяется взависимости от вида ткани. Хотя использование гиббереллина в качестверегулятора роста при культивировании клеток и тканей in vitro чащевсего неэффективно, введение его в состав среды одновременно сауксином оказывает явно активирующее действие на дифференциациютрахеид. Таким образом, в настоящее время в значительной меревыяснено первоочередное значение фитогормонов, их взаимодействия, атакже необходимость некоторых веществ трофической природы дляразвития локальных очагов дифференцировки.

Морфогенез в культуре in vitro принято делить на два типа: образование монополярных органов: апексы; вегетативные побеги;

побеги, развивающиеся как флоральные элементы; кончики корней;

55

образование биполярных органов, развивающихся как соматическиеэмбриоиды.

Кроме того, различают прямой и непрямой органогенез.Прямой органогенез – это путь, при котором развитие корней,

стеблевых и цветочных почек происходит непосредственно из клетокэкспланта без образования каллуса. Примером прямого органогенеза invivo и in vitro является образование стеблевых почек у льна. Так, если у15-дневных проростков льна удалить верхушку стебля, то черезопределенный промежуток времени из эпидермальных клетокгипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек.Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценныйстебель. Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 ммпоместить на агаризованную культуральную среду с фитогормонами, торазвитие может получить до 170 проростков, формирующихся как изэпидермальных, так и из субэпидермальных клеток.

Непрямой органогенез – путь формирования морфологическихструктур, приводящий к образованию корней, стеблевых и цветочныхпочек в каллусной культуре.

На рис. 5.2 показаны возможные пути преобразования прикультивировании изолированных растительных тканей и индукцииморфогенеза.

Рис. 5.2. Возможные пути преобразования при культивировании изолированныхтканей

Направление процесса органогенеза in vitro зависит от следующихфакторов:

Эксплант

Эмбриоиды Цветочныепочки

Растения

Эмбриоиды

КорниКорни

Стеблевыепочки

Цветочныепочки

Стеблевыепочки

«Привыкшая»ткань

Растения

Каллус

56

таксономической принадлежности и генотипа исходного растения; онтогенетического возраста растения; локализации ткани, использованной в качестве экспланта; действия физических факторов при культивировании (температура,

содержание кислорода, продолжительность и качество освещения); длительности культивирования; состава питательной среды.Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо

прослеживается при сравнении особенностей культивированияизолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений.У двудольных растений каллусную ткань способную к органогенезуможно индуцировать не только из меристематических клеток, но извполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. Уоднодольных растений для получения каллусной ткани в качествеэксплантов используют только ткани, содержащие меристематическиеклетки. На рис. 5.3 представлена способность к органогенезу разныхсемейств начиная с наиболее «отзывчивых».

Максимальная способность ПасленовыеКрестоцветные

ЗонтичныеСложноцветные

БобовыеЗлаки (травы)

Минимальная способность Злаки (зерновые)

Рис. 5.3. Перечень семейств высших растений, расположенных по степениснижения способности к органогенезу

Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуретканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных имутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса идругих растений. Выявлены соответствующие доноры с высокимморфогенным потенциалом в культуре in vitro.

Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетическогосостояния растения установлена, в частности, при изученииособенностей культивирования листовых эксплантов эчеверии и табака.При культивировании молодых листьев указанных растений происходитобразование корней. Из листьев, вычлененных из растений, средних повозрасту, индуцируется развитие и стеблевых почек, и корней. Излистьев, вычлененных из зрелых растений, развиваются только

57

стеблевые почки. Такие различия в характере органогенеза прикультивировании на средах одинакового состава определяютсясодержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта.

Уровень эндогенных фитогормонов определяет также зависимостьмежду типом органогенеза и локализацией ткани, используемой вкачестве исходного экспланта. При культивировании на среде одного итого же состава сегментов стебля, выделенных из разных частейцветущего растения табака, можно наблюдать проявление разных типоворганогенеза. Из сегментов стебля, изолированных от базальной части,формируются вегетативные почки. Из сегментов, выделенных из среднейчасти стебля, регенерируются вегетативные и цветочные почки вопределенном соотношении. Из сегментов, изолированных из зон,близких к соцветию, развиваются только цветочные почки.

Среди факторов питательной среды, влияющих на особенностирегенерации в культуре ткани, наиболее важными для регуляциинаправления морфогенеза являются регуляторы роста. В этом отношенииклассической является работа, выполненная Скугом и Миллером в 1957г. Из сердцевинной паренхимы стебля цветущего растения табака былаполучена каллусная культура, клетки которой могут размножаться ирасти на среде с ИУК и кинетином. При наличии в среде разногосоотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности (рис.5.4). Определенное превышение концентрации кинетина над ауксиномприводит к образованию стеблевых почек и побегов. Увеличениеконцентрации ауксина приводит к развитию корней. Промежуточноесоотношение концентраций этих фитогормонов поддерживаетнеорганизованный рост каллусной ткани.

Побеги Корни Каллус РастениеИУК 0,03 мг/л 3 мг/л 3 мг/л 2 мг/лКинетин 1 мг/л 0,02 мг/л 0,2 мг/л 1 мг/л

Рис. 5.4. Регулирование регенерации в культуре ткани сердцевиннойпаренхимы табака

58

С увеличением продолжительности культивирования тканейутрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочныхпочек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу.

C точки зрения биотехнологии соматический эмбриогенез имеетмного преимуществ перед органогенезом. Регенерант на основесоматического зародыша полностью сформирован, тогда как побеги,полученные в результате органогенеза надо укоренять, а лишний труднеэкономичен для биотехнологии. Соматический эмбриогенез незаменими для фундаментальных исследований. Дело в том, что тонкиемеханизмы морфогенеза в настоящее время представляются еще внекоторой степени «черным ящиком». С помощью суспензионныхкультур, с которыми чаще всего связано культивирование соматическихэмбриоидов, исследователь может получить много информации осигналах и белках-акцепторах, экзогенных стимуляторах и нативныхэндогенных гормонах, участвующих в морфогенезе.

Различают прямой и непрямой пути соматического эмбриогенеза.Прямой соматический эмбриогенез заключается в формированиивегетативного зародыша из одной или нескольких клеток тканейэкспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Такоеявление наблюдается у цитрусовых. У них в одном семени можетразвиваться до 40 зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Онформируется от слияния половых клеток и несет признаки и отцовскогои материнского организмов. Остальные зародыши – неполовые(соматические) – развиваются из клеток нуцеллуса, окружающихзародышевый мешок, и несут признаки только материнского организма.Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используется для ихклонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitroв условиях, в которых происходит индукция образования эмбриоидов изотдельных клеток. Непрямой соматический эмбриогенез заключается вформировании зародышей из клеток каллусной ткани или суспензионнойкультуры.

В отличие от стеблевых почек соматические зародыши – этонезависимые двухполюсные структуры, физически не прикрепленные кткани, из которой они происходят. Кроме того, соматические эмбриоидыв отличие от органогенеза побегов, более точно воспроизводят генотиписходного растения.

Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на две стадии:1. Начальная клеточная фаза, которая менее других изучена и

наиболее важна – это первичные процессы в проэмбриогенных клетках,

59

связанные с их переходом в детерминированное состояние. Данный этапне характерен для зиготы, развивающейся из зародышевого мешка.

2. Переход к эмбриогенезу или развитию зародыша in vitro. Этот этапвключает стадии, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе:стадии глобулы, сердца, торпедо и сформированного проростка.Морфологически такие стадии практически одинаковы in vivo и in vitro.

Среда с ауксином

Та же среда Среда безс ауксином ауксина

Пассирование Эмбриоидына среде с на средеауксином без гормонов

Рис. 5.5. Схема соматического эмбриогенеза в культуре клеток

Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являютсяфитогормоны. Наиболее эффективен ауксин 2,4-Д, однако он необходимтолько для детерминации клеток. Развивающиеся зародыши ненуждаются в гормонах, так как начинают вырабатывать их сами.Длительное пребывание проэмбрио в среде, содержащей ауксин,приводит к пролиферации клеток, составляющих эмбриональныйкомплекс, и к прекращению дифференциации эмбриоидов, то есть ониснова превращаются в каллусные клетки (рис. 5.5). Эмбриогенныйкаллус, пересаженный на среду без ауксина или с пониженным егосодержанием, образует эмбриоиды. Эмбриоиды, перенесенные набезгормональную среду, дают проростки.

Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов являетсяаргументом в пользу точки зрения о том, что сам процесс изолированиярастительной клетки от организма стимулирует реализацию еетотипотентности, т.е. переход к морфогенезу.

Сохраниепроэмбрио

ПроросткиКаллус

Эксплант

Каллус спроэмбрио

Каллус сэмбриоидами

Среда с ауксином

60

БИОТЕХНОЛОГИИ НА ОСНОВЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК И

ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

6.1. Клеточные технологии для получения экономическиважных веществ растительного происхождения

Растения отличаются от бактерий и особенно животныхпоразительным многообразием синтетических процессов. Количествобиологически активных соединений, синтезируемых растениями,огромно. Все они, как правило, относятся к продуктам вторичного(специализированного) обмена. Вторичные метаболиты характеризуютсятаксономической специфичностью. Основное их назначение заключаетсяв обеспечении биохимической адаптации растений к существованию вбиоценозах. Так, среди вторичных метаболитов обнаружены соединенияс аллелопатическими, инсектицидными, фунгицидными,бактерицидными свойствами, а также фитоалексины и вещества,подобные гормонам животных.

Особый интерес для человека представляют те биологическиактивные соединения, которые могут быть использованы в медицине,технике, пищевой и парфюмерной промышленности, сельскомхозяйстве. Если для получения ценных БАВ традиционноиспользовались целые организмы (микроорганизмы, растения,животные), то современная биотехнология нацелена на клеточныетехнологии, основанные на культивировании свободных ииммобилизованных клеток.

Как альтернативные источники БАВ растительного происхожденияклеточные культуры обладают следующими преимуществами:

получение экологически чистых продуктов независимо от климата,сезона, погоды;

создание клеточных линий-сверхпродуцентов путем генетическихманипуляций;

сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов;

ГЛАВА 6

61

возможность оптимизировать и стандартизировать условиявыращивания;

возможность автоматизации процессов.На рис. 6.1. показаны основные аспекты применения культур клеток

растений в качестве продуцентов БАВ.

Рис. 6.1. Применение культуры клеток растений для получения экономическиважных продуктов

Благодаря усилиям многих исследователей накоплено немало ценнойинформации о способности культивируемых растительных клетоксинтезировать многие традиционные экономически важные продукты:терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла,необычные пептиды и специализированные белки, натуральныекрасители, стероиды, пряности, инсектициды, воски, витамины. Такжедоказана возможность культур клеток осуществлять биотрансформацию,то есть синтезировать некоторые БАВ из дешевых и доступных ихпредшественников. Эти «полупродукты» вторичных метаболитов немогут быть преобразованы химическим или микробиологическим путем,и только благодаря активности ферментов клеток растений в культурепроисходит их превращение в ценный конечный продукт.

Культивируемые клетки растений

Получение традиционныхрастительных продуктов

Биотрансформация

Синтез принципиальноновых активных веществ

Постферментационныепроцессы

Искомые продукты

62

Перевод клеток в условия in vitro может также приводить к синтезусовершенно новых соединений с принципиально другим механизмомдействия. Например, японские исследователи добились успехов вполучении таких новых БАВ, как необычные пептиды,антиканцерогенные соединения, убихинон-10 и др.

Популяциям культивируемых in vitro растительных клеток присущиопределенные особенности протекания процессов вторичногометаболизма. Важной их характеристикой является степеньстабильности в отношении синтеза, транспорта и депонированияфизиологически активных соединений. Высокая биосинтетическаяспособность может сохраняться в течение всего времени существованияпопуляции. Однако известны примеры постепенного (в течениенескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезомметаболитов. В случае полной «нестабильности» клетки в популяцииочень быстро теряют способность к синтезу вторичных метаболитов, чтосвязано с прекращением in vitro экспрессии генов, участвующих вобразовании БАВ.

В растительном организме синтез метаболитов, их транспорт иотложение в запас зачастую разделены во времени и осуществляются вразных органах растения. Например, алкалоид никотин, которыйсинтезируется в корнях табака, а уже оттуда поступает в листья, где инакапливается. В условиях in vitro все стадии вторичного метаболизма –от синтеза до депонирования – обычно проходят в одной клетке.Эпибласты и млечники, в которых может осуществляться отложениеразличных веществ, являются редкими структурами в каллусныхкультурах.

Одной из особенностей популяций культивируемых растительныхклеток является различная степень корреляции синтеза вторичныхметаболитов с процессами дифференцировки. В организме растениявторичный метаболизм присущ только дифференцированным клеткам,специализированным органам и протекает только на определенныхэтапах их развития. Каллусные культуры зачастую характеризуютсянизким содержанием искомого вещества, что, по-видимому, вызваноотсутствием дифференциации ткани. Однако это неабсолютное правило.Появляется все больше данных, что органогенез в культуре не являетсянеобходимым условием для биосинтеза вторичных метаболитов in vitro.Например, органогенез иногда сопровождается снижением содержанияпродуктов вторичного обмена веществ. Также неоднозначны данные овзаимосвязи их накопления с фазами ростового цикла клеточныхкультур. У многих видов при периодическом режиме выращивания

63

вторичные метаболиты накапливается в значительных количествах лишьпри замедлении или остановке роста. Предполагается, что механизмы иусловия, блокирующие деление клеток и активный рост, могутодновременно являться и механизмами активации, обеспечивающимисинтез ферментов вторичного метаболизма. Однако известны такиекультуры, у которых синтез продукта способствует росту клеток. Влюбом случае, на первом этапе культивирования стараются создатьоптимальные условия для роста, то есть накопления биомассы, а затемисследуют влияние этих условий на биосинтез вторичных метаболитов.

Накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растенийзависит от ряда факторов. Во-первых, выход продукта определяетсягенотипом донорного растения, правильным выбором его ткани илиоргана для введения в культуру. В большинстве случаев это главноеусловие, определяющее качество получаемого продукта. Как правило,высокий выход продукта наблюдается в культурах, инициированных извысокопродуктивных растений. Выбор органа также имеетнемаловажное значение. Например, содержание стероида диосгенина вкультуре клеток Dioscorea floribunda, полученной из клубня, было напорядок выше, чем в культуре клеток, полученной из побега.

Во-вторых, на выход продукта влияет гетерогенностькультивируемых клеток по способности к синтезу вторичныхметаболитов. Как отмечалось ранее, у культивируемых in vitro клетокмогут происходить значительные изменения вторичного метаболизма посравнению с интактными растениями. Одной из причин измененияинтенсивности вторичного метаболизма в культуре клеток выступаетгенетическая их гетерогенность. Вместе с тем гетерогенность клеточнойпопуляции может играть положительную роль, позволяя отбирать линииклеток с повышенным синтезом искомого продукта или синтезирующиесовершенно новые вещества.

В-третьих, в качестве факторов, оказывающих влияние на накоплениевторичных метаболитов в культуре клеток растений, выступают составпитательной среды и физические условия культивирования.Важнейшими компонентами питательных сред, эффективнорегулирующими и первичный, и вторичный обмен клеток, являютсяфитогормоны. Показано, что характер влияния фитогормонов зависит отвида растения, природы вторичного соединения, клеточного штамма ит.д. Поэтому результаты экспериментов по выяснению воздействияфитогормонов на синтез вторичных метаболитов крайне противоречивы.При изучении влияния 146 соединений с ауксиновой активностью нарост и образование антрахинонов в культуре клеток моринды

64

лимоннолистной было установлено, что многие регуляторыподдерживали хороший рост клеток, но только два: НУК и 2,3,6–трихлорбензойная кислота, наряду со стимуляцией роста,способствовали образованию антрахинонов.

Увеличение выхода вторичных метаболитов во многих случаяхнаблюдается при повышении концентрации сахарозы в питательнойсреде. Вместе с тем высокое ее содержание приводит к возрастаниюосмотического потенциала, что может оказывать неблагоприятноевлияние на метаболизм культивируемых клеток. Нельзя не учитывать,что увеличение содержания сахарозы в среде удорожает производство,поэтому поиск дешевых углеводных добавок остается актуальным.

Среди других компонентов питательной среды регулирующеевоздействие на накопление вторичных метаболитов могут оказыватьисточники азота, фосфора и калия. Однако характер их влияниязначительно различается в зависимости от вида растения исинтезируемого соединения. Так, если у одних культур присутствиеорганических форм азота в среде тормозит накопление вторичныхметаболитов, то у других – повышает их синтез. Установлено, чтонедостаток фосфора в среде стимулирует синтез многих БАВ, хотя оченьнизкие его концентрации будут подавлять процессы энергетическогометаболизма и, следовательно, снижать накопление вторичныхметаболитов.

Положительный эффект на биосинтез вторичных веществ оказываетналичие в среде некоторых предшественников самих искомыхсоединений. Это могут быть аминокислоты (глутамат, фенилаланин,лейцин, орнитин и др.) и органические кислоты (ацетат, сукцинат,шикимовая и др.). Однако не всегда их внесение вызывает увеличениевыхода продукта. Отсутствие желаемого эффекта можно объяснитьразными причинами: предшественники не поглощаются клетками,происходит их распад в процессе приготовления и стерилизации средили же они переходят в другие физиологически неактивные формы. Неисключено, что некоторые предшественники могут оказывать побочныеэффекты на рост культуры, в частности, ингибировать его.

Во многих случаях буферная емкость питательных сред являетсядостаточно низкой, поэтому величина исходного рН прикультивировании быстро сдвигается на несколько единиц, а это, в своюочередь, сказывается на биосинтетических свойствах культивируемыхклеток. Например, в культуре клеток Ipomea, котораябиотрансформирует триптофан в различные метаболиты индольнойприроды, выход такого продукта как триптанол значительно

65

увеличивается при рН 6,3 и полностью подавляется при рН 4,8. Поэтомуподдержние кислотности питательной среды на определеном уровнетакже является важным факторам, от которого зависит образование БАВв культуре. Следует отметить, что оптимизация состава питательнойсреды является ключевым условием для повышения выхода продукта. Врезультате подобных исследований разрабатываются так называемыепродукционные среды, на которых культивируемые клетки синтезируютзначительное количество вторичных метаболитов.

Физическими факторами, влияющими на накопление БАВ клетками,являются освещенность, температура, аэрация и режим перемешивания вслучае суспензии, а также состав газов в колбах. Стимулирующеедействие света на образование вторичных соединений в культуре клетокпоказано на примере каротиноидов, эфирных масел, коричных масел,флавоноидов, пластохинонов, антоцианов, катехинов, алкалоидов,витаминов. При этом имеет значение и качество света. Однако внекоторых случаях свет оказывал ингибирующее действие, подавляясинтез вторичных метаболитов.

Данных о влиянии температуры на рост и процессы биосинтеза вклеточных культурах очень мало, но поскольку температура влияет навторичный метаболизм интактных растений, исследования в этомнаправлении являются достаточно необходимыми. Тем более, чтооптимумы температуры для роста культуры клеток и процессовбиосинтеза БАВ не всегда совпадают.

Для получения вторичных метаболитов из суспензионных культурважны также аэрация и скорость перемешивания. Так, в культуре клетоктабака увеличение скорости перемешивания приводило к повышениювыхода никотина.

В целом следует отметить, что накопление клетками продуктоввторичного метаболизма является результатом динамическогоравновесия между биосинтетическим, биотрансформационным ибиодеградационным процессами. Влияние внешних и внутреннихфакторов на каждый из этих процессов имеет сложный характер, изачастую из-за отсутствия фундаментальных знаний с трудом поддаетсяпрогнозированию. Поэтому следует признать оправданным тотэмпирический подход при изучении влияния факторов культивированияна накопление вторичных веществ, который продолжает использоватьсяи в настоящее время.

Биотехнологическое производство вторичных метаболитов растенийосуществляется преимущественно при культивировании клеточныхсуспензий. Очень большое значение для их роста и образования целевых

66

продуктов имеют технические характеристики систем культивирования.Длительное время для создания технологий промышленноговыращивания суспензионных культур применялась аппаратура,разработанная для микробиологической промышленности. Однакоисследования последних лет показали, что растительные клетки в силусвоих специфических особенностей требуют особых сосудов длякультивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клетокбактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессеонтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие иплотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются вразмерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тембольше возрастает опасность ее механического повреждения. В то жевремя клетки растений крупные и тяжелые требуют эффективногоперемешивания.

В зависимости от принципа перемешивания культуральной жидкостибиореакторы подразделяются на два больших типа по своейконструкции. В биореакторах первого типа перемешиваниеосуществляется только путем аэрирования воздухом. При этом вбарботажных биореакторах – за счет поднимающихся пузырьковвоздуха, а в аэролифтных – с применением специальной конструкции свнутренним цилиндром, создающей градиент плотности суспензии (рис.6.2). Для биореакторов второго типа характерно наличие механическихперемешивающих устройств.

Рис. 6.2. Принципиальные схемы биореакторов, наиболее часто применяемых длякультивирования суспензионных культур:

1 – барботажный биореактор; 2 – аэролифтный биореактор; 3 – биореактор с вынесеннойциркуляционной петлей; 4 – биореактор с механическим перемешивающим устройством; В – воздух.

Воздух4

Воздух1

Воздух2

Воздух3

67

Использование биореакторов для исследования популяцийрастительных клеточных имеет следующие преимущества:

большой объем культивационного сосуда позволяет, не вносясущественных возмущений, отбирать пробы большого объема, что оченьважно при анализе вторичных метаболитов, часто содержащихся в оченьнизких концентрациях;

возможность управления процессом культивирования поопределенному алгоритму на основе показаний датчиков, установленныхв биореакторах.

Вместе с тем культивирование клеточных суспензий в биореакторахсвязано и с некоторыми проблемами:

оседанием клеток вследствие недостаточного перемешивания, чтоприводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходитбыстрое накопление и старение клеток;

увеличением вязкости суспензии вследствие роста биомассы,приводящим к адгезии – прилипанию клеток друг к другу, поверхностикультурального сосуда, погруженных в него мешалок и датчиков;

образованием в верхней части сосуда «корки» или «безе»,состоящей из полисахаридов, белков, слипшихся клеток и снижающейэффективность перемешивания, что в конце концов может привестикультуру к гибели.

В настоящее время наиболее приемлемым способом получениябольших количеств вторичных метаболитов растений являетсядвустадийное культивирование. Его первая стадия связана собразованием больших количеств биомассы культивируемой суспензии,а вторая предполагает создание условий для активного биосинтезанеобходимых продуктов. Обеспечив благоприятные условиякультивирования на обеих стадиях in vitro можно добиться получениявыхода вторичного метаболита в количестве, синтезируемом in vivo, аиногда и выше.

Большой интерес предствляет также развитие методовиммобилизации культивируемых клеток и биотрансформации имиметаболитов. Суть иммобилизации состоит в заключении живых клетокв определенный носитель. Затем через носитель с клетками пропускаютпитательную среду. При этом клетки прекращают рост, но могутдостаточно долго оставаться живыми и продуцировать необходимыевещества.

Клетки могут быть иммобилизованны 4 способами:

68

иммобилизация в инертном субстрате, т.е. обволакивание клетокодной из различных цементирующих сред (альгинат, агар,полиакриламид, коллаген или комбинация гелей);

адсорбция клеток на инертный субстрат; адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических

макромолекул; ковалентное связывание клеток с каким-либо инертным субстратом

типа карбоксилметилцеллюлозыВокруг физически неподвижных иммобилизованных клеток могут

циркулировать большие объемы питательной среды, регулируя составкоторой, замедляют рост клеток и тем самым повышают выходвторичных продуктов.

Поскольку клетки в иммобилизованном виде культивируютсядлительное время, то для этого используются клетки, которые сами,естественным путем, секретируют необходимые метаболиты впитательную среду или могут быть индуцированы к такой секрециикакими-либо приемами, например воздействием низких температур ирастворителей. Клетки, которые накапливают искомый продукт внутри,например, в вакуолях или пластидах, не пригодны для иммобилизации.

Иммобилизованные клетки могут быть использованы не только длясинтеза, но и для биотрансформации различных соединений. Оченьчасто растения или культуры клеток растений не доводят синтезметаболита до наиболее важного продукта, и тогда можно использоватьпроцесс биотрансформации. В качестве примера можно привестииспользование суспензии клеток наперстянки, синтезирующейдигитоксин, тогда как для медицинских целей нужен дигоксин.Сердечный гликозид дигоксин обладает большим терапевтическимэффектом по сравнению с дигитоксином, которого в растенияхсодержится значительно больше. Дигоксин отличается от дигитоксиналишь по наличию дополнительной гидроксильной группы.Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой необразуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определеннуюреакцию биотрансформации субстратов, добавленных в питательнуюсреду.

Биотрансформация необходима для гликозилирования фенольныхпродуктов корня женьшеня in vitro. Культура клеток женьшенякорневого происхождения активно трансформирует фенольные вещества(гликозилирует и гептозилирует), модифицирует ароматическиекарбокислоты. Другим примером служит биотранформациямонотерпеновых соединений (компонентов эфирных масел) культурами

69

клеток разных видов мяты. Путем биотранформации можно значительноизменить качественный состав компонентов эфирного масла мяты. Вчастности, эффективна биотранформация пулегона в более ценныекомпоненты (ментол) в культуре клеток Mentha canadensis.

Таким образом, использование суспензионных культур для синтезавторичных метаболитов в промышленных масштабах имеет большиеперспективы. Работа по созданию клеточных технологий для получениявторичных метаболитов в настоящее время включает следующие этапы:

1. Экономически обоснованный выбор объекта. Растения, выбранныедля введения в культуру, должны содержать значительные количестваэкономически важных вторичных соединений. Особенно это относится кисчезающим видам растений.

2. Первичное введение тканей в культуру. Для этих целей отбираютсяотдельные растения, обладающие наибольшим содержанием искомоговещества. Обычно вначале получают каллусы на твердой среде.

3. Биохимическое изучение биомассы по качественному иколичественному составу вторичных метаболитов. Определение оченьнизких концентраций метаболитов в медленно растущих клеткахпредставляет большую трудность. Поэтому в качестве экспресс-методовоценки продуктивности каллусных культур в последнее времяприменяют радиоиммунохимический и иммуноферментный методы.Последний имеет преимущества благодаря более высокой скоростипроведения анализов и возможности их автоматизации.

4. Оптимизация сред и параметров выращивания. Для реализациигенетической информации, детерминирующей вторичный обмен,требуются специфические условия. Поскольку нет твердой уверенностив том, что используемые питательные среды полностью отвечаютпотребностям клеток, в каждом конкретном случае приходитсяподбирать состав среды и определять влияние других факторов,опираясь на имеющийся опыт. Эта задача еще более усложняется припереводе культуры в жидкую среду, так как при этом следует учитыватьвлияние факторов аэрации и перемешивания.

5. Создание продуктивных штаммов клеток. Получение гомогеннойпопуляции клеток с высоким содержанием тех или иных вторичныхвеществ – сложная задача, так как популяции длительно культивируемыхклеток даже полученные клонированием одной высокопродуктивнойклетки, могут терять способность к синтезу ценного соединения. Дляподдержания на высоком уровне способности культуры квидоспецифическим биосинтезам, помимо оптимизации условийвыращивания, требуются значительные усилия, включая проведение с

70

ней генетических манипуляций и клеточную селекцию. Для организациирентабельного крупномасштабного производства на основе клеточнойтехнологии нужны мутанты, синтезирующие гормоны, нетребовательныек питательным средам, а также устойчивые к осмотическому имеханическому стрессу. Наиболее эффективным приемом созданияпродуктивных штаммов является искусственное конструирование клетокметодами клеточной и генной инженерии, которым принадлежитбудущее.

6. Первичное использование лучших штаммов в суспензионнойкультуре. Каллусные клетки, первоначально полученные на твердойсреде, переводят в жидкую среду. Изменение режима культивированияне должно приводить к потере штаммом своих положительных качеств,т. е. штамм должен быть устойчив к стрессовым условиямкультивирования. Особенно это касается момента переноса клеток изусловий лабораторного эксперимента в небольших колбах в ферментерыкрупных размеров.

7. Выращивание продуктивной и устойчивой культуры в условиях,приближающихся к производственным, в ферментерах с последующимувеличением их емкости. Если в таких полупромышленных условияхкультивируемые клетки сохраняют высокие скорости роста и биосинтезаискомого вещества, накапливают его без деградации и в значительныхколичествах выделяют в среду, то такой штамм пригоден дляорганизации крупномасштабного производства. Кроме того, важнымкачеством штамма является его генетическая стабильность.

8. Составление технического регламента на производство биомассыклеточной суспензии и его оценка. Производственная технологиятребует соответствующей аппаратуры, которой располагает, в частности,Япония. Так, в 20000-литровом ферментере в непрырывной культуре втечение трех месяцев выращивались клетки табака, продуцировавшиеубихинон с продуктивностью по биомассе 5,582 г/л в день. Там такженалажено крупномасштабное производство и других вторичныхметаболитов.

В настоящее время в разных странах для получения экономическиважных веществ используются культуры клеток около ста видоврастений, среди которых – женьшень, раувольфия змеиная, наперстянкашерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник,беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский,клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.

71

6.2. Клональное микроразмножение растений

Клональное микроразмножение – это использование техники invitro для быстрого получения неполовым путем растений, идентичныхисходному. По своей сути микроклональное размножение аналогичновегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, чтооно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клетокизолированных тканей в итоге можно получить достаточно большоеколичество растений. Асептические условия и соответствующиепитательные добавки позволяют в случае необходимости уменьшитьразмер экспланта до нескольких миллиметров.

В настоящее время число видов растений, которые можноклонировать «в пробирке» уже составляет около одной тысячи. Хотяметод микроклонального размножения растений является довольнотрудоемким и затратным, в ряде случаев на его основе уже сталовозможным создавать экономически рентабельные технологии.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующимитрадиционными способами размножения:

высокий коэффициент размножения (105–106 – для травянистых,цветочных растений, 104–105 – для кустарниковых древесных, 104 –для хвойных);

возможность проведения работ в течение года и экономияплощадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счет использования

меристемной культуры; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной

фазе развития; сокращение продолжительности селекционного процесса; получение растений, трудно размножаемых традиционными

способами; возможность автоматизации процесса выращивания.Области применения клонального микроразмножения разнообразны и

имеют тенденцию к расширению: в селекции для поддержания и размножения растений с

уникальными генотипами; для быстрого размножения новых и уже существующих сортов; массового получения оздоровленного посадочного материала у

растений, подверженных вирусным заболеваниям;

72

для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовыхкультур, обычно размножающихся семенами и расщепляющихся прискрещивании;

для быстрого клонального размножения in vitro лучших экземпляроввзрослых древесных растений, разведение и селекция которыхосуществляется медленно вследствие длительности процесса половогоразмножения;

для сохранения редких и исчезающих видов.Основное требование к объектам, которые используются для

микроклонального размножения, это сохранение генетическойстабильности на всех этапах онтогенеза. Этому требованиюудовлетворяют апексы и пазушные почки стеблевого происхождения.Для микроклонального размножения также могут быть использованымеристематические ткани и изолированные органы, способные даватьадвентивные почки. Такие почки могут развиваться на корнях, побегах илистьях. Например, африканская фиалка размножается с помощьюадвентивных почек, образующихся на листовых черешках. Разработанметод, с помощью которого in vitro в результате использования отрезковразмером 2 мм, можно получить до 20 000 проростков из каждогочерешка.

Существует много методов клонального микроразмножения, иразличными авторами предлагаются разные системы их классификации.Наиболее распространенной является классификация, согласно котороймикроклональное размножение может осуществляться за счет:

активации развития уже существующих в растении меристем(апекса стебля, пазушных и спящих почек, интеркалярных зон стебля);

индукции адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукции соматического эмбриогенеза; дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной

каллусной тканях (рис. 6.3).Основной метод, используемый при клональном микроразмножении

растений, – это активация развития уже существующих в растениимеристем. Он основан на снятии явления апикального доминирования,что может быть достигнуто следующими путями:

а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующиммикрочеренкованием побега на безгормональной среде;

б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типадействия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

73

1 2 3 4

а

б

в

г

Рис. 6.3. Схема клонального микроразмножения растений:1 – активация развития меристемы; 2 – образование адвентивных почекнепосредственно на первичном экспланте; 3 – индукция соматического эмбриогенеза вкаллусе и суспензионной культуре; 4 – образование адвентивных почек в каллуснойткани: а – получение стерильной культуры; б – формирование микропобегов иразвитие соматических эмбриоидов; в – укоренеие микропобегов и образованиеискусственных семян; г – перевод растений–регенерантов в тепличные условия споследующей высадкой в поле

Для этого используют БАП или кинетин, а также 2-изопентениладенин и зеатин. Полученные побеги отделяют от

74

первичного материнского экспланта и вновь культивируют насвежеприготовленной питательной среде, стимулирующейпролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов болеевысоких порядков.

В настоящее время этот метод широко используется в производствебезвирусного посадочного материала технических (сахарная свекла,хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощных культур (томаты,картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножениякультур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза,гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия,камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня,груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесныхрастений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельники др.).

Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких, как картофель,технология клонального микроразмножения поставлена напромышленную основу. Применение метода активации развитиясуществующих в растении меристем позволяет получать из одноймеристемы картофеля более 105 растений в год, причем технологияпредусматривает получение в пробирках микроклубней – ценногобезвирусного семенного материала.

Второй метод – это индукция возникновения адвентивных почекнепосредственно тканями экспланта. Он основан на способностиизолированных частей растения при благоприятных условияхпитательной среды восстанавливать недостающие органы и, такимобразом, регенерировать целые растения. Образования адвентивныхпочек можно добиться почти из любых органов и тканей растения(изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донцалуковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс, какправило, происходит на питательных средах, содержащих толькоцитокинины или цитокинины в сочетании с ауксинами в соотношении10:1 или 100:1. В качестве ауксина наиболее часто используют ИУК илиНУК.

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высшихрастений, которым были размножены многие луковичные цветочныерастения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) излуковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц,эксплантов листьев; представители рода Brassicа (капуста цветная,кочанная, брюссельская, листовая, брокколи – из сегментов гипокотиля,семядолей, листьев; лук, чеснок – из верхушечной меристемы, ткани

75

донца луковиц; томаты – из апикальных или пазушных меристем; салатцикорный – из сегментов листовых пластинок; петуния– изсегментов корней; глоксиния, фиалки – из сегментов листовыхпластинок, а также некоторые представители древесных растений –из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, –индукция соматического эмбриогенеза – основывается надифференциации зародышеподобных структур из соматических клеток,которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши.В настоящее время данное явление используется для размножениябольшинства растений из семейств орхидных и рутовых, некоторыхпредставителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса,винограда, а также некоторых видов древесных пород (осина,эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).

Как правило, соматический эмбриогенез является достаточнотрудоемкой операцией, так как не всегда удается реализоватьсвойственную клеткам тотипотентность. Однако этот методразмножения имеет свои преимущества, связанные с сокращениемпоследнего этапа клонального микроразмножения, требующегоподбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочныхрастений, т.к. соматические зародыши представляют собой полностьюсформировавшиеся растеньица. При использовании соответствующейтехники капсулирования из этих эмбриоидов можно получитьискусственные семена.

Четвертый метод клонального размножения – дифференциацияадвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани – малоиспользуется для получения посадочного материала in vitro. Это связанос тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани напитательную среду наблюдаются явления, нежелательные примикроразмножении: изменение плоидности клеток, структурныеперестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеряморфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Данныйметод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которыхпоказана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельностьмежду растениями-регенерантами не превышает уровня естественнойизменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, томаты,спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить нанесколько этапов:

76

1–й этап – выбор растения донора, изолирование и стерилизацияэкспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitrо;

2–й этап – собственно размножение, осушествляемое одним изчетырех перечисленных выше способов;

3–й этап – укоренение размноженных побегов;4–й этап – высадка растений–регенерантов в почву.На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей

стерильной культуры. При этом, как правило, используют среду,содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга, а такжеразличные биологически активные вещества и стимуляторы роста(ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости отобъекта. Продолжительность первого этапа – от 1 до 2 месяцев.

На втором этапе важно достигнуть получения максимальногоколичества мериклонов. Как и на первом этапе, используютпитательную среду по рецепту Мурасига и Скуга. Основную роль приподборе оптимальных условий культивирования эксплантов играютсоотношение и концентрация внесенных в питательную средуцитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используютБАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК вконцентрациях до 0,5 мг/л. При длительном культивированиирастительных тканей в питательных средах с повышеннымсодержанием цитокининов (10 мг/л) происходит постепенноенакопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня,что приводит к формированию растений с измененной морфологией.

Третий этап является наиболее трудоемким, поскольку от него вомногом зависит успех клонального микроразножения. На данном этапе,как правило, меняют основной состав среды. Уменьшают в два, а иногдаи в четыре раза концентрацию минеральных солей в среде Мурасига иСкуга, снижают концентрацию сахара до 0,5–1 % и полностьюисключают цитокинины, оставляя лишь ауксины. В качествестимулятора корнеобразования используют ИМК, ИУК или НУК.Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

выдерживание микропобегов в течение 2–24 ч в стерильномконцентрированном растворе ауксина (20–50 мг/л) с последующим ихкультивированием на агаризованной среде без гормонов илинепосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульснаяобработка);

культивирование микропобегов в течение 3–4 недельнепосредственно на питательной среде, содержащей ауксин вневысоких концентрациях (1–5 мг/л).

77

В последнее время предложен пока еще мало практикуемый методукоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот методпозволяет значительно упростить этап укоренения и одновременнополучать растения, адаптированные к естественным условиям.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственнымэтапом, завершающим процесс клонального микроразмножения.Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений –весна или начало лета. Растения с двумя–тремя листьями и хорошоразвитой корневой системой осторожно вынимают из колб илипробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком.Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенныйсубстрат, предварительно простерилизованный при 85–90 °С в течение1–2 ч. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемымтемпературным режимом (20–22 °С), освещенностью не более 5 тыс.лк и влажностью 65–90 %. Для лучшего роста растений создаютусловия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможностисоздать такие условия, горшочки с растениями накрывают стекляннымибанками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепеннооткрывают до полной адаптации растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиямявляется наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередкопосле пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте,опадение листьев и их гибель. Это связано, в первую очередь, с тем, чтоу пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата,вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во–вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходитобразования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, кнарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтомуцелесообразно на третьем и четвертом этапах клональногомикроразмножения применять искусственную микоризацию растений(для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжениирастений минеральными и органическими веществами, водой,биологически активными соединениями, а также в защите растений отпатогенов.

При разработке методов клонального микроразмножения растенийнеобходимо учитывать влияние генетических, физиологических,гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика,разработанная для определенного клона одного вида не всегда можетбыть применена для размножения других представителей этого вида итем более растений другого вида.

78

Экспериментально доказано, что двудольные травянистые растенияобладают большими морфогенетическими потенциями, т. е. имеютболее выраженную способность к индукции заложения адвентивныхпочек, росту побегов, укоренению и, в конечном итоге, получениюболее высокого коэффициента размножения, чем ткани и органыоднодольных травянистых и, тем более, древесных растений.

Виды растений, хорошо размножающиеся вегетативно, обычнопроявляют высокую регенерационную способность в культуре in vitro.Среди видов, обладающих значительным морфогенетическимпотенциалом, представители семейств пасленовые, крестоцветные,сложноцветные, трудно регенерируют растения из семейства злаковые.

Физиологический возраст исходного экспланта имеет несомненноезначение в проявлении способности к морфогенезу. Зрелые зародыши,20–30-дневные проростки или различные их части (ювенильныйматериал) обладают более высоким морфогенетическим потенциаломпо сравнению с тканями взрослых растений, и способны образовывать вбольшом количестве адвентивные почки, стимулировать развитиепазушных меристем, которые в дальнейшем формируют хорошорастущие побеги, способные к укоренению. В этом случае, например, изодного изолированного зародыша лиственных пород возможнополучить до 10–100 тыс. растений в год, в то время как прикультивировании пазушных или апикальных почек взрослых растенийкоэффициент размножения уменьшается на 1–2 порядка.

Возраст первичного экспланта оказывает существенное влияние и наукоренение микропобегов, размноженных in vitro. С увеличениемвозраста исходного материала, как правило, снижается способностьпобегов и черенков к укоренению.

К физиологическим факторам следует отнести и время (сезонность)изоляции экспланта. Ткани и органы, изолированные в моментвегетации растений, способны с высокой частотой образовыватьадвентивные почки, формировать побеги и укореняться, чем ткани,изолированные в период глубокого и вынужденного покоя.

Размер экспланта является еще одним условием, определяющимуспех микроразмножения: чем меньше размер экспланта, тем меньшейрегенерационной способностью он обладает, и наоборот. В эксплантебольшого размера увеличивается возможность появления в его клеткахвирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлениюразмноженных в культуре тканей растений. Оптимальная величинаэкспланта зависит от видовых особенностей растения-донора и свойстворгана, служащего источником первичного экспланта. Так, для малины

79

был установлен размер первичного экспланта 2 мм, при котором 60 %апикальных верхушек растения регенерировало на среде Мореля. Дляхмеля этот показатель колеблется от 0,1 до 0,2 мм.

Гормональный баланс питательной среды – немаловажный фактор,влияющий на успех клонального микроразмножения. При высокомсоотношении цитокининов к ауксинам происходит развитие пазушныхмеристем или образование адвентивных почек, при низком –индуцируется корнеобразование, при промежуточных значенияхнаблюдается образование и пролиферация каллуса.

На клональное микроразмножение и рост растений также влияеткислотность питательной среды, интенсивность освещения,спектральный состав света, температурный режим и др. Для повышениякоэффициентов размножения необходимо каждому виду с учетом егоестественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условиякультивирования.

В настоящее время клональное микроразмножение рассматриваетсякак новый перспективный метод вегетативного размножения растений.Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального размноженияпоставлена на промышленную основу и представлена десяткамиактивно функционирующих предприятий. Например, во Франции 94 %всей продукции цветочных культур получают методом культурыизолированных тканей. В США около 100 коммерческих предприятийполучают посадочный материал декоративных, овощных, полевых,плодовых и лесных культур методом клонального микроразмножения.Ведущим производителем оздоровленного посадочного материалацветочных растений является Голландия, а подвоев яблони, сливы иперсика — Италия.

6.3. Получение безвирусного посадочного материала

Небольшой размер экспланта, применяемого для клональногомикроразмножения, его поверхностная стерилизация, асептическийперенос на питательную среду и субкультивирование в условиях,исключающих инфицирование, приводят к оздоровлению полученныхрастений от нематод, грибных и бактериальныхх патогенов. Но этогонедостаточно для оздоровления созданного посадочного материала отвирусов, вироидов, микоплазм. Вместе с тем именно вирусные болезни –причина потери от 10 до 50 % урожая сельскохозяйственных культур,размножающихся вегетативно. Установлено, что соя и некоторые другиеважные бобовые растения передают вирусы потомству даже при

80

семенном размножении, в результате чего сорта постепенноотягащаются грузом вирусных инфекций.

Наиболее эффективный для оздоровления от вирусов, вироидов имикроплазм способ – культивирование меристем стебля или органовстеблевого происхождения. В основе используемого на практикеявления лежит специфика строения точки роста растений. Дистальнаяее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растенийимеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм.Расположенные ниже дифференцирующиеся клетки меристемыобразуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.Такая особенность строения апикальной меристемы исключаетпроникновение в нее вируса за счет быстрого транспортирования попроводящей системе, но допускает возможность медленногораспространения через плазмодесмы, соединяющиемеристематические клетки.

Размеры меристемных эксплантов, используемых для получениябезвирусных растений, могут значительно различаться. Предпочтительноиспользовать предельно малый размер экспланта (0,075–0,1 мм) иразработать оптимальные условия для получения жизнеспособныхпробирочных растений. Однако если это невозможно по тем или инымпричинам, то рекомендуется дополнять культуру меристем термо- ихемотерапией. В этом случае предварительная обработка исходныхрастений сухим горячим воздухом или химическими агентами позволяетдобиться оздоровления от вирусов при использовании меристемныхэксплантов размером 0,3–0,8 мм.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальныетермокамеры, где в течение первой недели повышают температуру до 37°С путем ежедневного ее увеличения на 2 °С. Продолжительностьтермотерапии всецело зависит от особенностей вирусов и ихтермочувствительности. Если, например, для получениябезвирусной гвоздики достаточно 12-недельного воздействия теплом,то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период болеепродолжителен.

Помимо эффекта термотерапии, приводящего к освобождениюрастений от вирусов, также выявлено положительное воздействиевысоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторыхцветочных культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro.Применение термотерапии позволяет увеличить коэффициент ихразмножения на 50—60 %, повысить адаптацию пробирочных

81

растений–регенерантов к почвенным условиям, а также получить болеевысокий процент безвирусных маточных растений.

Еще один способ, применяемый для освобождения растений отвирусов – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательнуюсреду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналогагуанозина (коммерческое название вирозол) в концентрации 20—50мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Прииспользовании вирозола процент безвирусных растений, полученныхметодом культуры меристем, увеличивался до 80–100 % по сравнению с0–41 % в контроле. Положительные результаты хемотерапии былиполучены при оздоровлении сливы, черешни, малины, некоторыхцветочных и других растений.

Оздоровленные применением меристемной культуры растенияразмножают далее обычными методами клонального микроразмножения.Важное место в этой работе принадлежит диагностике зараженныхрастений. Наиболее чувствительным методом тестирования являетсяиммуноферментный анализ, для которого требуется минимальноеколичество материала из любого органа растения.

Технология получения свободного от фитопатогенной инфекциипосадочного материала разработана для целого ряда овощных икормовых, плодово-ягодных, декоративных и древесных растений.

6.4. Культура изолированных клеток и тканей в селекциии генной инженерии растений

Селекционная практика основывается на двух принципиальныхподходах: создание генетического разнообразия и отбор желаемыхгенотипов. Клеточные технологии предлагают принципиально новыепути для увеличения генетического разнообразия и скрининга форм сискомыми признаками.

Существующие методы культивирования изолированных клеток итканей растений in vitro можно разделить на две группы по ихиспользованию с целью создания растений с новыми полезнымипризнаками (табл. 6.1). Первая группа методов – это технологии дляоблегчения и ускорения селекционного процесса. Они не подменяютобычную селекцию, а служат ей. Вторая группа – технологии,предназначенные для создания генетического разнообразия исходныхформ для селекции. Использование данных методов ведет ксамостоятельному, независимому от традиционных методов селекции,получению новых форм и сортов растений.

82

Таблица 6.1Клеточные технологии в селекции растений

Для облегчения и ускорения селекционногопроцесса

Для создания генетического разнообразия искрининга генотипов с важными признаками

Оплодотворение in vitroКультура незрелых зиготическихзародышейРегенерация растений из тканейлетальных гибридовЭкспериментальная гаплоидияКлональное микроразмножение новыхсортов, гибридов, линий (включаясоздание искусственных семян)

Использование сомаклональныхвариантовПолучение индуцированных мутантовна клеточном уровнеКлеточная селекцияГибридизация соматических клетокПеренос чужеродныхцитоплазматических геновАдресованный перенос ядерных генов

Особое место, как в селекции, так и в генетике занимает отдаленнаягибридизация. Скрещивание представителей культурных идикорастущих видов, позволяет не только улучшать существующиесорта, расширять ареал их возделывания, но и создавать совершенноновые, высокоценные формы, сорта и даже виды растений. Ни одиндругой метод не позволяет так обогащать генофонд культурных растенийкак отдаленная гибридизация. Однако при использовании данногометода экспериментатор сталкивается с проблемой нескрещиваемостииз-за прогамной и постгамной несовместимости.

Прогамная несовместимость – физиологическая несовместимостьпартнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе дооплодотворения. Она может быть обусловлена физиологическими(несоответствие во времени созревания пыльцы отцовского растения илиотсутствие секрета рыльца пестика материнского растения), а такжеморфологическими причинами (различие партнеров по длине столбикапестика и пыльцевой трубки; блокирование роста трубки на разныхэтапах ее пути от рыльца пестика до микропиле семяпочки вследствиетканевой несовместимости партнеров).

Основной способ преодоления прогамной несовместимости –оплодотворение in vitro. Метод заключается в совместномкультивировании пыльцы и неоплодотворенных семяпочек, котороеможет осуществляться двумя различными способами. В первом случаестолбик пестика срезается, завязь помещается на питательную среду, ина нее наносят готовую пыльцу. Второй вариант данного методапредполагает вскрывание завязи и перенос на питательную средукусочков плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно

83

на их поверности культивируется готовая пыльца. Визуально определитьпрошло ли оплодотворение in vitro можно по быстрому увеличениюразмеров семяпочек. Сформировавшийся зародыш, как правило, непереходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает началогибридному поколению. Опыление in vitro хорошо удается для растенийсемейства маковых, гвоздичных, пасленовых (табак, петуния), у которыхв завязях имеются многочисленные семяпочки.

Постгамная несовместимость – несовместимость таксономическиотдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, иприводит к образованию щуплых невсхожих семян.

Физиологические причины постгамной несовместимостизаключаются в несоответствии темпов развития зародыша и эндоспермалибо непригодности (токсичности) метаболитов тканей материнскогорастения для питания зародыша. Способ их преодоления –культивирование незрелых гибридных зародышей на питательной среде.

Постгамная несовместимость может быть обусловлена игенетическими причинами, которые выражаются в аномалиях развитияорганов зародыша или молодого проростка. Для их преодоленияиспользуется шунтирование нормального развития, его заменаполучением гибридной каллусной ткани из живых тканей проростка илизародыша и регенерация растений из каллусных клеток.

Выращивание зародышей на искусственной питательной среденазывается эмбриокультурой. В зависимости от стадии развития могутбыть изолированы недостаточно дифференцированные или вполнесформировавшиеся зародыши. Среда для выращивания зрелогозародыша может быть простой, без добавок физиологически активныхвеществ. Для культивирования недифференцированных зародышейтребуются более сложные питательные среды, содержащие не тольковитамины и стимуляторы роста, но и дополнительные трофическиефакторы (набор аминокислот, необходимые сахара, осмотики типасорбита и маннита, растительные экстракты неопределенного состава).

Преодоление постгамной несовместимости, обусловленнойгенетическими причинами, как уже отмечалось, осуществляется путемвведения промежуточного этапа получения гибридного каллуса ирастений–регенерантов на его основе. Этот подход впервые былприменен для получения гибридных растений табака при межвидовомскрещивании Nicotiana tabacum с диким видом Nicotiana occidentalis. Врезультате этого скрещивания удалось получить гибридные семена, нопроростки гибли на стадии семядолей из-за отмирания первичного корняи остановки роста. Индукция образования каллусной ткани из семядолей

84

и гипокотилей гибридных проростков, а затем и органогенеза в каллусахпозволила получить сотни гибридных растений.

Каллусная ткань из гибридных растений может также служить дляполучения вариантных форм. Так, из одного гибридного зародыша,возникшего при скрещивании ячменя и пшеницы, было получено болеесотни регенерантов. У половины из них отмечались различия поморфологии и окраске колоса, длине остей и другим признакам, что далооснования считать их сомаклональными вариантами.

Таким образом, практические аспекты использования методаэмбриокультуры заключаются в следующем:

возможности получения межвидовых и межродовых гибридов; сохранении важного для селекции материала путем

культивирования in vitro изолированных семяпочек и потерявшихвсхожесть семян;

сокращении длительного селекционного процесса путем ускоренияin vitro прохождения жизненного цикла растения;

получении из гибридной каллусной ткани сомаклональныхвариантов.

Экспериментальная гаплоидия. Роль гаплоидных растений вгенетических исследованиях очень велика. Применение их позволяетлегче обнаружить рецессивные мутации, редкие рекомбинации,экспрессию введенного извне генетического материала. Гаплоидияможет широко применяться при количественном генетическом анализесельскохозяйственных растений. Такой анализ включает изучениевзаимодействия генов и генетической изменчивости, определения группсцепления, установления числа генов, действующих на количественныепризнаки, установление локализации полигенов.

Гаплоиды также широко используются в селекционном процессе(рис. 6.4). Одно из важнейших направлений их применения заключаетсяв возможности получения из гаплоидных клеток путем их обработкмиколхицином полностью гомозиготных диплоидных растений. Такиеизогенные линии на основе удвоенных гаплоидов можно создать втечение года, тогда как метод имбридинга требует более 4–6 лет.Гомозиготность широко используется в селекционном процессе.Изогенные линии облегчают селекционеру оценку и отбор новыхпризнаков и позволяют ускорить процесс создания нового сорта в 2–3раза.

85

Рис. 6.4. Использование гаплоидов в селекционной работе

Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, ониобразуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом.Кроме селекции гаплоидны также применяются в генно-инженерныхисследованиях.

Получение сомаклональных вариантов. Уже в первыхцитогенетических исследованиях культивируемых клеток былообнаружено их удивительное кариотипическое разнообразие. Оченьзаманчивой оказалась задача попытаться вновь воссоздать из такихизмененных клеток полноценное растение. Были все основанияпредвидеть появление у них большого количества новых признаков. Сразработкой техники получения растений–регенерантов из каллуснойткани появилась возможность получать новые формы растений,отличающихся как по фенотипическим, так и по генетическим признакамот исходных растений. Полученные таким образом растения–регенеранты назвали сомаклональными вариантами.

Чистые линии

Удвоение числахромосом

Выделение рецессивныхмутаций

ГАПЛОИДЫ

Культура протопластови отдельных клеток

Мутагенез и селекцияin vitro

Регенерация растений

Выбор исходных формдля селекции

Мутагенез

Гетерозис (3×)

Моногаплоиды

Гибридизация сдиплоидами

86

Впервые сомаклональные варианты табака были получены в СССРЗагорской, Шаминой в 1970 г. Однако общий интерес к возможностиполучения сомаклональных вариантов возник позже, послеопубликования в 1984 г. статьи австралийских исследователей Larkin etal. Сомаклональную изменчивость стали рассматривать как источникгенетического разнообразия в создании новых форм растений. Числоработ, выполненных с разными видами растений, после этого оченьвозросло. В настоящее время получены сомаклональные варианты риса,пшеницы, кукурузы, люцерны, картофеля, льна, табака и другихрастений.

Действительно, гибридизация и экспериментальный мутагенезсегодня уже не в полной мере удовлетворяют потребности практическойселекции. Например, многие интересующие селекционера гены такойважной сельскохозяйственной культуры как пшеница даже при высокихдоза мутагенного воздействия «молчат», иными словами, мы не можем вэтих экспериментах обнаружить появления мутаций по многим генам.Наиболее вероятно предположить, что мутации по этим генам если ивозникают, то элиминируются на самых ранних этапах развитияпризнака (или растения). Вычленением из организма и переносом клеткив искусственно созданные условия культуры практически полностьюустраняется влияние тканевых, органных, организменных регуляторныхсистем, обеспечивающих стабильность генома. Уже само по себеотключение всей этой иерархии регуляторных систем приводит кпотрясающей цитогенетической вариабельности культивируемых клеток.Не привнося в среду никаких мутагенов, а только лишь переведя клеткив состояние культуры, можно получить широкую генетическуюизменчивость.

Сомаклональная вариабельность – это уникальное явление, игенетические изменения, присущие ему, сложны, комплексны и прошлиадаптацию к разным условиям культивирования. Частота возникновенияподобных измнений в популяции клеток превосходит на три порядкачастоту спонтанных мутаций. Изучение сомаклональных вариантовпоказало, что от прототипа они отличаются не только моногеннымикачественными признаками, но и (что более важно практически)количественными полигенными признаками (интенсивность роста,продуктивность, толерантность к неблагоприятным факторам среды).

Частота возникновения сомаклональных вариантов зависит отгенетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта,условий культивирования in vitro, прежде всего состава питательнойсреды и уровня концентрации солей и регуляторов роста растения, а

87

также типа морфогенеза – соматического эмбриогенеза илиорганогенеза. При соматическом эмбриогенезе время прохождения циклаклетка – растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтомустепень сходства получаемого материала и исходного родительскогогенотипа может быть значительно выше.

Следует учитывать, что не все генетические вариации, наблюдаемыена клеточном уровне, могут пройти сито морфогенеза. Часть из нихреализуется только на клеточном уровне, но не на уровне целогорастения. Однако сомаклональная вариабельность является оченьбогатым источником генетического разнообразия для создания новыхформ растений.

Клеточная селекция in vitro. Одна из наиболее сильных сторонкультуры клеток растений в создании технологий для сельскогохозяйства – это возможность на основе сомаклональных вариаций илииндуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условияхклетки, характеризующиеся искомыми признаками, т.е. осуществлятьклеточню селекцию in vitro.

В настоящее время наиболее активно развиваются такие направленияпроведения клеточной селекции как отбор клеток устойчивых кгербицидам, засолению, экстремальным температурам, патогенам,клеток, характеризующихся повышенным синтезом незаменимыхаминокислот и др.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях invitro в качестве объектов исследования используются каллусные,суспензионные культуры или изолированные протопласты. Наряду сперечисленными объектами, в качестве исходного материала дляселекции могут быть выступать культуры соматических илиандрогенных эмбриоидов, а также культура изолированных зародышей.Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей изсемян ячменя получены растения с улучшенным содержанием белка.При культивировании пыльников яровой пшеницы на питательныхсредах с повышенным содержанием солей хлорида натрия полученысоматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения–регенеранты,проявившие повышенную солеустойчивость. Однако удобнееиспользовать клеточные сусупензи или изолированные протопласты.Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры иравномерном действии селективного фактора на все клетки.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:1.Прямая (позитивная) селекция – наиболее простой способ отбора

мутантов, поскольку резистентные клетки могут быть отобраны в

88

большом количестве по их способности расти в присутствии ингибитора,в то время как чувствительные клетки гибнут.

2.Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательнойгибели неустойчивых делящихся клеток дикого типа и выживанияметаболически неактивных клеток, но требующая дополнительнойидентификации у них мутационных изменений.

3.Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются всеклеточные клоны.

4.Визуальная селекция и неселективный отбор – способы, прикоторых вариантная линия может быть идентифицирована визуально илис помощью биохимических методов.

Прямая селекция является наиболее распространенным методом ииспользуется для выделения клеток, устойчивых к гербицидам,антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другимантиметаболитам.

Получение устойчивых линий – процесс длительный. Он включаетмногочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды,содержащие селективный фактор. Например, при отборе суспензионнойкультуры моркови, устойчивой к глифосату, клеточные суспензиипоследовательно пересевались на среды, содержащие все возрастающиеконцентрации гербицида до тех пор, пока не была достигнута 52–кратнаяустойчивость.

Основная сложность, часто возникающая при работе с линиямиклеток растений, отобранных по принципу устойчивости к ингибиторамроста – нестабильность этого признака, которая проявляется после тогокак снимается давление отбора. Чтобы проверить стабильность признаканеобходимо получить, по крайней мере, две культуры для каждой изотобранных линий, одна из которых пассируется в присутствии, а другая– в отсутствии селективного фактора. И только после повторноговозвращения к селективным условиям отбирают стабильные клоны, изкоторых пытаются регенерировать растения. Получение растений–регенерантов, а также гибридологический анализ подтверждаютгенетическую природу признака, а не адаптационный его характер.

Устойчивость клетки и растения к селективному фактору можетсовпадать и не совпадать. В частности, клеточная устойчивость можетбыть только частью общего механизма, работающего в целом растении,как это наблюдается при создании устойчивости к засолению Прямаякорреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмеченалишь для таких факторов как низкие температуры, гербициды, высокиеконцентрации алюминия.

89

Соматическая гибридизация. Это метод получения гибридныхрастений в результате слияния протопластов, изолированных изсоматических клеток родительских форм. Поскольку для слиянияпротопластов не существует барьеров, то на уровне протопластов могутбыть объединены несовместимые при половом размножении видырастений. Причем такую искусственную гибридизацию можноосуществлять между соматическими клетками, принадлежащимидалеким в систематическом отношении организмам и даже междурастительными и животными клетками.

Принципиальное отличие соматических гибридов, полученныхметодом слияния протопластов, от гибридов, полученных половымпутем, состоит в том, что при половом скрещивании цитоплазматическиегены передаются в большинстве случаев только от материнскогорастения, а при соматической гибридизации – двуродительски. Т.е.слияние протопластов способствует объединению двух различныхцитоплазм, и в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более илименее равный цитоплазматический статус.

При слиянии двух протопластов истинная гибридная клеткаобразуется, если сливаются ядра. Клетка, в которой слияние ядер непроизошло, называется гетерокарионом. Гибрид, несущий гены ядратолько только одного родителя наряду с цитоплазматическими(внеядерными) генами от обоих либо одного из родителей, называетсяцитоплазматическим (цибридом).

Значение соматической гибридизации заключается в том, что онапозволяет обойти проблему половой несовместимости у растений,облегчает перенос между разными видами внеядерных генетическихэлементов (митохондриальных и хлоропластных ДНК), а такжеобеспечивает возможность получения необычных сочетаний ядерных ицитоплазматических генов.

Соматическая гибридизация включает 4 этапа: выделение протопластов; их слияние; отбор и регенерацию гибридов; анализ растений–регенерантов.Изолированные протопласты за то короткое время, за которое они не

образовали клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияниеможет быть спонтанным (особенно в случае использованияпротопластов, изолированных из молодых тканей или суспензионныхкультур). Эффективность слияния повышается под действием различных

90

индукторов. Для индукции слияния протопластов используютхимический и электрический методы.

Химический метод заключается в добавлении к суспензиипротопластов веществ, стимулирующих слияние. Исторически первымхимическим индуктором, использованным для слияния протопластов,был NaNO3. В настоящее время наиболее часто используют метод,включающий в качестве индуктора ПЭГ, а также среды с высокимуровнем рН и высокой концентрацией Са2+. Химическим индукторомслияния протопластов также является поливиниловый спирт.

Преимущества химического способа индукции слияния протопластовзаключаются в простоте исполнения. При этом могут сливатьсяпротопласты, различающиеся по форме и размерам. Однако метод имеети свои недостатки, которые заключаются в том, что в результатеобработки индукторами часть протопластов повреждается и погибает.Кроме того, зачастую сливаются не два, а большее количествопротопластов, образуя нежизнеспособные гибриды.

В начале 80-х годов был разработан метод электрослиянияпротопластов, привлекший внимание довольно высокой частотойслияния. Принцип метода заключается в том, что в специальную камеру,в которой создается неоднородное электрическое поле, помещаютпротопласты. В камеру вводят электроды и в этих условиях протопластывыстраиваются в цепочку между ними. Для слияния используют сильныйимпульс постоянного тока 1,2 кВ/см в течение 50 мкс.

Преимущества данного метода заключаются в его высокойэффективности, быстроте, возможности регуляции процесса слияния.Так, в последнее время был разработан его вариант, позволяющийсливать предварительно отобранные пары протопластов. Однако следуетотметить, что метод электрослияния требует дорогостоящегооборудования.

Слияние – это случайный процесс. Обычно в слияние вовлекаются от3 до 30 % протопластов. При использовании химических индукторов иобычного варианта метода электрослияния протопластов возможнаагрегация и слияние протопластов как разных видов, так и одного и тогоже вида, т.е. происходит образование как гетерокарионов, так игомокарионов. В связи с этим важным этапом получения соматическихгибридов является отбор продуктов гетероплазматического слияния отпротопластов родительских форм, а также продуктов слиянияпротопластов одного и того же вида.

Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне,либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими способами:

91

1. Физиологическая комплементация. Применяется в том случае,когда гибридные протопласты и исходные родительские формыразличаются по составу оптимальной для их роста питательной среды.Данный способ отбора был использован при получении межвидовыхгибридов, полученные при скрещивании Nicotiana glauca и Nicotianalangsdorfii.

2. Генетическая комплементация представляет собой такоевзаимодействие генов в гибридной клетке, вследствие котороговосстанавливаются функции дефектных генов. Для проведения отбора спомощью данного метода часто используют хлорофиллдефектность.Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызываетсветозависимую хлорофильную недостаточность. Растения,гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивномосвещении, обесцвечиваются и гибнут. Для осуществления отборагибридов после слияния протопластов клеточные колонии пересаживалина среду, индуцирующую органогенез, и культивировали на свету.

3. Отбор по морфологическим признакам. Проводится в том случае,когда продукты слияния хорошо отличаются визуально. В качествемаркеров при идентификации гетероплазматического продуктадостаточно часто используют пластиды. Например, при межродовомслиянии протопластов табака и моркови для отбора гибридов служилизеленые хлоропласты табака и красные хромопласты моркови.

4. Использование прижизненных красителей дает возможность отборапротопластов, полученных от слияния протопластов партнеров,имеющих разную флуоресценцию – или нативную, или возникшую приокраске флуорохромами. Важное достоинтсво данного методазаключается в возможности автоматизации процесса благодаряиспользованию проточного флуориметра.

Существуют и другие способы отбора.После слияния протопластов и отбора гибридных клеток в них

возможны нежелательные генетические изменения (полиплоидизация,хромосомные абберации, различные точковые мутации). Эти изменениямогут привести при морфогенезе к возникновению форм растений,которые представляют собой лишь фенокопии соматических гибридов.Чтобы исключить возможность таких ошибок гибридные формыподвергают анализу для изучения их генетической природы. Анализрастений–регенерантов, полученных в результате соматическойгибридизации, осуществляется по таким признакам как число хромосоми кариотип, изоэнзимный состав, состав полипептидов малой

92

субъединицы рибулозо–1,5–дифосфаткарбоксилазы, михондриальные ихлоропластные ДНК.

Помимо соматической гибридизации существует еще один близкий посвоей сути способ получения растений с новыми полезными признаками– это цибридизация. Цибридизация представляет собой способ введенияважных цитоплазматических генов. При этом цибридные растениясодержат цитоплазму обоих партнеров, ядро – одного. Разработаныследующие способы получения цибридов:

слияние изолированного протопласта с цитопластом; слияние протопласта реципиента с протопластом, ядро которого

инактивировано облучением и не способно к делению; микроинъекция; перенос с помощью липосом.Благодаря цибридизации был осуществлен перенос генов, несущих

признаки устойчивости к гербицидам, а также цитоплазматическоймужской стерильности.

Генетическая трансформация растений. Центральнымкомпонентом генно-инженерной технологии является набор приемов дляпереноса генов из одной биологической системы в другую. Несмотря насравнительно небольшой срок исследований в этом направлении, ужесозданы универсальные системы, позволяющие клонировать генымикроорганизмов, животных и растений, встраивать их в способную кпереносу конструкцию и эффективно вводить ее в клетки растений.

К наиболее важным проблемам, для решения которых осуществляетсягенетическая трансформация растений, относятся повышениеустойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам,улучшение качеств запасных белков зерна, повышение эффективностиазотфиксации и расширение круга культурных растений, способных ксимбиотической фиксации азота, а также создание сверхпродуцентовбиологически активных веществ.

Процесс трансформации начинается с выбора интересующегоисследователя гена. Выбранный ген ставится под контрольрегуляторного участка ДНК – промотора. В качестве промотора чащевсего используется регуляторный участок гена 35S белка из геномавируса мозаики цветной капусты. Большой интерес представляют такназываемые индуцибельные промоторы, которые актививруюттранскрипцию введенных генов в ответ на действие специфическогоиндуктора (свет, повышенная температура, действие патогена). Дляудобства контроля за процессом трансформации в переносимуюконструкцию обычно включают маркерные гены, по экспрессии которых

93

можно судить о том, произошло встраивание чужеродного гена в геномреципиента или нет. Маркерными часто являются гены устойчивости кразличным антибиотикам или гербицидам. В этом случае трансгенныеорганизмы отбирают на селективных средах, содержащих эти вещества влетальных концентрациях. Используют также репортерные гены,экспрессия которых не дает клетке селективных преимуществ, ноприводит к изменению фенотипа трансгенного растения. В настоящеевремя широко используемым репортерным геном является ген β–глюкуронидазы (GUS). Трансгенные клетки, экспрессирующие этот ген,при помещении на специфический субстрат окрашиваются в голубойцвет.

В настоящее время разработаны следующие методы введениягенетического материала в клетки растений (табл. 6.2).

Таблица 6.2.Методы введения генетического материала в клетки растений

Метод Комментарии

Использование Ti –плазмид Высокоэффективная система, но примениматолько для двудольных растений

Баллистический метод Используется для широкого круга растений итканей; достаточно простой метод

Использование векторов наоснове вирусов

Неэффективный способ доставки ДНК врастительные клетки

Прямое введение генов впротопласты растений

Может использоваться для введения геновтолько в протопласты растительных клеток

Введение ДНК с помощьюмикроинъекций

Имеет ограниченное применение, посколькуединовременно инъекцию можно сделать тольков одну клетку

Электропорация Применяется для введения генов только впротопласты, из которых могут бытьрегенерированы целые растения

Слияние липосом Применяется для введения генов только впротопласты, из которых могут бытьрегенерированы целые растения

Из приведенных в таблице данных видно, что многие методыоснованы на использовании протопластов. Действительно, чужероднуюгенетическую информацию легче всего ввести в изолированныепротопласты. Однако далее неизбежно возникает проблема регенерациирастений из трансформированных протопластов. Для некоторых видовона до сих пор остается непреодолимой.

94

При использовании агробактериальной трансформации,баллистического метода реципиентом чужеродных генов могут бытькаллусные или суспензионные клетки, меристематические зоны,незрелые зародыши. Хотя эффективность трансформации невысока,существует реальная возможность получения трансгенных растений.

В настоящее время у 120 видов растений существуют трансгенныеформы. Получены растения, устойчивые к гербицидам, насекомым-вредителям, вирусам, грибам и бактериям, окислительному, солевомустрессу, растения с измененными сроками созревания плодов,модифицированной окраской цветков, повышенной пищевой ценностью,а также способностью к синтезу вторичных метаболитов иосуществления биотрансформации. Разрешено использованиетрансгенной сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля, томатов, свеклы,тыквы, табака, льна и др. Однако уже сегодня существуют и активнообсуждаются некоторые проблемы, связанные с применениемтрансгенных растений, одной из которых является слабая экспрессия илиполное замолкание встроенных генов. Ее решение представляет интереси для фундаментальных исследований, поскольку способствуетглубокому проникновению в молекулярную биологию растительнойклетки. Необходимо также исследовать возможные побочные измененияу растений, подвергнувшихся генетической трансформации, установить,будут ли такие изменения влиять на организм животных и человека.

6.5. Использование метода культуры клеток, тканей иорганов растений для сохранения генофонда

Существует несколько способов сохранения генофонда высшихрастений: заповедники, национальные парки, банки семян. Наиболеепростым среди них является хранение семян. Однако данный методнеприменим к тем видам растений, чьи семена не выдерживаютдлительного хранения. В частности, к ним относятся древесныерастения, сохрание генофонда которых осуществляется в видеискусственных посадок, что требует значительных площадей ирегулярного ухода. У некоторых видов растений рекомбинации,возникающие при развитии семян, могут привести к разрушению ценныхкомплексов генов, накопленных в течение длительного времени. В связис этим возникает необходимость в длительном хранении живой ткани ввегетативной форме.

В настоящее время один из наиболее перспективных способовсохранения генофонда высших растений представляет собой

95

культивирование in vitro клеток, тканей и органов растений. Длясохранения генофонда могут быть использованы:

протопласты; суспензионные культуры клеток; каллусные культуры; пыльца и пыльники; культуры меристем побегов; зародыши; асептически выращиваемые целые растения.В течение многих лет для поддержния исходных культур

испльзовалось постоянное их выращивание при оптимальных условиях.Например, в Отделе биологии клетки и биотехнологии институтафизиологии растений РАН в виде растущих коллекций поддерживаются182 вида растений, из них в виде каллусов и суспензии – 85, растения впробирках – 97. Наиболее длительно сохраняемыми являются культурыраувольфии змеевидной и женьшеня настоящего, которые хранятся уже втечение 40 лет.

При работе с растущими коллекциями необходимо стабильноподдерживать условия выращивания (температуру, влажность,освещенность), состав питательной среды также не должен меняться.Периодическое субкультивирование трудоемко и значительно удорожаетсодержание коллекции. При субкультивировании возможныгенетические изменения коллекционных объектов, а также снижение ихспособности к регенерации. Поэтому сейчас достаточно интенсивноразрабатываются различные способы депонирования коллекций, т.е.приемы, позволяющие изменить кинетику роста культуры увеличитьвремя между пересадками.

Депонирование коллекций – сохранение коллекций без частыхпересадок. Существует несколько способов лимитирования ростовыхпроцессов. Среди них наиболее доступным и широко распространеннымприемом является снижение температуры, при которой происходиткультивирование. Выбор температуры определяется холодостойкостьювида растения. Так, для депонирования коллекции картофеляиспользовалась температура 9–10 °С, а как яблони 1 °С. Для культуробычно растущих при 20–25 °С рекомендуют использовать температуры4–10 °С, а для культур, нормально растущих при температуре около 30°С, – плюс 15–20 °С.

Другой прием заключается в добавлении к среде для культивированиясоединений, способных замедлять рост растений. В качестве такихрегуляторов могут выступать вещества, оказывающие осмотическое

96

действие на клетки (маннит, сорбит, сахароза в повышенныхконцентрациях) или вещества гормональной природы (абсцизоваякислота, гидразид малеиновой кислоты, диметилгидразид янтарнойкислоты, хлорхолинхлорид).

В редких случаях для депонирования коллекций используютснижение содержания кислорода – гипоксию. Например, условиягипоксии создают, применяя смесь 90 % азота и 10 % кислорода. Иногдауменьшают концентрацию кислорода и одновременно снижаютатмосферное давление (до 0,5 мм рт.ст).

Обычно время хранения культур с ограниченным ростом составляетоколо года. Возможности лимитирования роста имеют свои пределы.Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибеликультуры. Для того, чтобы полностью отказаться от пересаживаниякультуры, необходимо использовать такой способ хранения, при которомпроисходит полная остановка метаболизма. В микробиологии для этихцелей используют липофильную сушку. Но данный способ не приемлемдля культур тканей высших растений. Современные знания не позволяютперевести культуры в состояние покоя, наблюдаемое в обычных семенах.Единственным способом полного прекращения роста тканей высшихрастений является криосохранение, т.е. хранение при температурежидкого азота или других достаточно низких температурах. Лишь пристоль низких температурах гарантируется не только полное прекращениеметаболических процессов, но и полная сохранность образца и всех егоосновных свойств. Сверхнизкие температуры обеспечивают длительное(десятки и сотни тысяч лет) хранение биологических объектов, т.е.организацию криобанков, из которых исследователь в любое удобноевремя может получить необходимый материал: семена, пыльцу,меристемы, эмбриоиды и клетки. Нельзя не отметить то, что криобанкипозволяют значительно экономить затраты по сравнению сдепонированием, не говоря уже о постоянно растущих коллекциях.

В РАН криобанк был впервые организован в 1976 г. Для начала вкачестве модельного объекта была использована морковь в виде молодойсуспензии клеток. Был разработан метод замораживания специально поотношению к данному объекту, после чего клетки сохранялись в жидкомазоте при температуре –196 °С. Криосохрание обеспечивалостабильность всех генетических характеристик культуры, в том числе испосбности к регенерации целых растений после оттаивания. Этот успехдал возможность широко развернуть работы по сохранению различныхрастительных объектов в криобанках.

97

Трудности криосохранения растений связаны со спецификойрастительных клеток. Растительные клетки имеют большие размеры,большие вакуоли и много воды. Образование льда и дегидратацияявляются основными факторами, способными привести клетку к гибелипри замораживании. Обычно кристаллы льда вначале образуются вмежклеточном пространстве, а затем внутри клетки. Их рост оказываетмеханическое воздействие на клетки, разрушая клеточные мембраны.Кроме того, кристаллы льда играют водоотнимающую роль, чтоприводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели отосмотического стресса. Максимальная скорость роста кристаллов льданаходится в пределах от –20 °С до –60 °С. При температуре –140 °С росткристаллов льда совершенно прекращается. Следовательно, и призамораживании и при оттаивании клеткам важно с оптимальнойскоростью «проскочить» температуру образования льда.

Кристаллизация льда затрудняется в присутствии криопротекторов. Ккриопротекторам относится гетерогенная группа соединений, которыедействуют различными механизмами на повышение выживаемостиклеток при замораживании. Наиболее известны такие криопротекторы,как ДМСО, различные сахара, глицерин, этиленгликоль и ихпроизводные. Действие криопротекторов состоит в снижении точкизамерзания воды. Они способны связывать внутриклеточную воду,повышать вязкость раствора, защищая таким образом клетку отмеханического и осмотического стресса. Их можно разделить на двегруппы: проникающие (ДМСО) и непроникающие(поливинилпиролидон, декстран, полиэтиленгликоль). Это разделениедостаточно условно. Так, глицерин – первое вещество, определенное каккриопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять прикомнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение,если его добавлять при температуре 0°С.

Помимо состава и количества природных и искусственнодобавляемых криопротеторов выживаемость клеток растений прикриосохранении зависит от таких факторов как их способность кхолодовому закаливанию, скорости снижения температуры и условийоттаивания.

Работа по криосохранению культуры клеток состоит из следующихэтапов:

подготовки культуры клеток; добавления криопротектора; замораживания; хранения в жидком азоте;

98

оттаивания; удаления криопротектора; рекультивирования и регенерации растений (рис. 6.5).Для криосохранения разных объектов требуются различные подходы

и условия, начиная с самога начального этапа работы. Лучше всегометоды криосхранения разработаны для суспензионных культур.

Перед применением процедуры криосохранения необходимоосуществить выбор наиболее подходящей фазы развития культуры. Какуже отмечалось, одним из наиболее критических факторов, влияющих навыживаемость клеток в процессе замораживания до –196°С, являетсястепень их вакуолизации. Крупные вакуолизированные клетки погибаютгораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапеподготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях,способствующих образованию мелких клеток и синхронизации ихделения. Для отдельных культур положительное влияние нажизнеспособность клеток оказывает предварительное культивирование снекоторами аминоксилотами, благодаря увеличению уровня эндогенныхсахаров в клетках. Для суспензионных культур важным моментомподготовки является концентрирование. Так, на клетках морковипоказано, что увеличение плотности культуры в 2–3 раза значительноповышает выживаемость клеток.

На следующем этапе осуществляется предварительноекультивирование клеток с криопротектором. Подбор криопротекторапроводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности иоптимального эффекта. На практике используют как отдельныекриопротекторы, так и их смеси, в которых токсичность одного извеществ снижается за счет присутутвия другого. Обычно их вносят всреду для культивирования, которую затем доводят до стандартного рНи стерилизуют перед добавлением к культуре.

При использовании криопротекторов возникают определенныетрудности, связанные с их добавлением и удалением. За исключениемкрайне быстро проникающих соединений, таких как метанол, ДМСО,добавление криопротекторов первоначально вызывает сжатие клеток.Затем по мере проникновения криопротектора клетка постепенноприобретает свою первоначальную форму. При удалениикриопротектора процесс протекает в обратном направлении, и клетка,возвращаясь в изотонические условия, сначала разбухает, а затемпостепенно восстанавливает свои нормальные размеры. Есликонцентрация добавки, требуемой для криосохранения, высока, то такиеизменения объема могут повредить клетку.

99

1 2 3

5 4

6 7 8

11 10 9

Рис. 6.5. Схема криосохранения культуры растительных клеток:1 – подготовка культуры; 2 – концентрирование культуры; 3 – добавление

криопротетора;4 – перенос в ампулы; 5 – программное замораживание; 6 – помещение в жидкий

азот;7 – оттаивание; 8 – перенос на чашки Петри; 9 – удаление криопротектора;

10 – возобновление роста; 11 – рекультивирование.

100

Поэтому рекомендуют добавлять криопротектор в постепенновозрастающей концентрации, и удалять его в постепенно убывающейконцентрации. Стресс при разбавлении обычно оказывает на клеткуболее разрушающее воздействие.

Наряду с выбором криопротекторов очень важно найти оптимальнуюпрограмму замораживания. В настоящее время известны два способакриосохранения: программное (медленное) и сверхбыстроезамораживание. При медленном постепенном замораживаниитемпература в интервале от 0 до –40 °С снижается со скоростью 0,5–1 °Св минуту. При быстром замораживании объект в ампуле скриопротетором погружается сразу в жидкий азот. Программноезамораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широкоприменяется для сохранения растительных и животных объектов. Дляэтого требуются специальные конструкции с рабочей камерой,охлаждаемой с запрограммированной скоростью введение паровжидкого азота. Разработка свехбыстрого замораживания началасьсравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод современем станет наиболее перспективным.

Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано.Последним этапом технологии криосохранения является оттаивание ипроверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте. Этойфазе, как и фазе подготовки культуры до недавнего времени непридавалось серьезного значения, однако конечный результат во многомзависит от них.

Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, тооттаивание должно быть проведено как можно быстрее. При слишкоммедленном оттаивании клеток в них происходит повторное образованиельда, оказывающее повреждающее действие. Оттаивание производятпогружая ампулы в водяную баню с температурой 40°С, а иногда и 60°Си выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.Очень редко оттаивание образцов проводят на воздухе при комнатнойтемпературе.

Для поддержания жизнеспособности легко ранимых после оттаиванияобразцов и возобновления их роста требуется тщательный уход. Невсегда условия, используемые для культивирования передзамораживанием, пригодны для культивирования после оттаивания.Культуры пересажваются на восстанавливающую среду без промывки ссохранением в клетках криопротекторов. Зачастую криопротекторудаляется специальными условиями промывки. Для определения

101

жизнесопосбности клеток, тканей, органов и организмов посленизкотемпературного хранения существует много специальных методов.

Технология, связанная с криосохранением растительных объектов всевремя развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, этатехнология имеет будущее, т.к. уже сегодня криобанки могутзначительно облегчить работу селекционеров, предоставив имвозможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старойселекции и диких видов, а также исчезающих растений.

102

ЛИТЕРАТУРА

1. Биотехнология растений: культура клеток. М. : Агропромиздат, 1989. 280 с.2. Биотехнология сельскохозяйственных растений. М. : Агропромиздат, 1987. 302 с.3. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их

основе: учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. М. : ФБК–ПРЕСС, 1999. 160 с.4. Валиханова, Г.Ж. Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова. Алматы :

«Конжык», 1996. 272 с.5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж.

Пастернак. М. : Мир, 2002. 589 с.6. Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие / Т.А. Егорова, С.М. Клунова,

Е.А. Живухина. М. : Изд. Центр «Академия», 2003. 208 с.7. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /

Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980. 356 с.8. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев,

Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. М. : Агропромиздат, 1990. 384 с.9. Першина Л.А. Культивирование изолированных клеток и тканей высших

растений: учеб. пособие. Ч. 1. / Л.А. Першина. Новосибирск : НГУ, 2000. 46 с.10. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник / В.С. Шевелуха, Е.А.

Калашникова, Е.С. Воронин [и др.]. М. : Высш. шк., 2003. 469 с.11. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции и биотехнологии. Т.

1–2. М. : Агропромиздат, 1990.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ...

Documents

Transcript of КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ...