尼妥珠单抗不同给药时间对人肺腺癌A549 、 Calu-6 细胞放射增敏作用的研究

第一作者：刘晓斌指导教师：袁智勇

天津医科大学附属肿瘤医院放疗科 / 肺癌诊治中心

研究背景★ 肺癌发病率高 ，非小细胞肺癌占 80% ， 总 5 年存活率低。★ 放疗疗效仍不理想 。★ 放射增敏剂可以提高放疗疗效。分子 靶向药物：低毒、高效，表皮生长因 子受体（ EGFR ）成为治疗肺癌靶点。

存在问题？ EGFR 抑制剂联合放疗的最佳给药时

间尚不明确。

？ EGFR 抑制剂联合放疗治疗相同类型

肿瘤时，疗效差别较大，具体原因不明，

尚缺乏预测放射增敏疗效的相关指标。

研究对象和目的★ 对象◆ 细胞系：人肺腺癌 A549 、 Calu-6 细胞系◆ 主要试剂：尼妥珠单抗◆ 主要仪器：医科达直线加速器★ 目的● 明确尼妥珠单抗联合放疗的最佳给药时间。● 两种细胞采用相同实验方案，观察结果是否相同，

并探讨产生差异的原因。

实验设计

放疗 细胞克隆

形成实验 SER

流式细胞术

Western blot

细胞周期细胞凋亡

AktpAkt

BaxBCL-2

P21

p-DNA-PK放射损伤

下游通路

凋亡指标

关卡蛋白

原因

MTT 实验计算

A549 、 Calu-6 各自的 IC20 /IC50值

同时加药

24h 后加药

24h 前加药

Western blot 检测 A549 、 Calu-6EGFR 表达

实验结果WESTERN BIOT 检测两种细胞 EGFR表达

A:A549 或者 Calu-6细胞 B: 阳性对照 C: 阴性对照

细胞系 IC20 IC50A549 1.15±0.18 24.78±1.16

Calu-6 2.45±0.32 51.15±1.58

MTT 检测尼妥珠单抗对两种细胞的增殖抑制作用

24hIC20

克隆形成曲线

A549 Calu-6

克隆形成结果

细胞及分组 D0 Dq N SER

A549

R 组 2.47 1.56 1.88 ---

N→R 组 1.22 0.34 1.32 2.02

NR 组 1.65 0.68 1.51 1.50

R→N 组 1.96 0.95 1.62 1.26

Calu-6

R 组 2.75 2.05 2.11 ---

N→R 组 1.46 0.42 1.33 1.88

NR 组 2.52 1.81 2.05 1.09

R→N 组 2.83 2.79 2.68 0.97

O N R

N→R NR R→N

A549 细胞周期图 O N R

N→R NR R→N N→R NR R→N N→R NR R→N

A549 细胞周期结果

组别A549

G0/G1（ % ） S （ % ） G2/M （ % ）

O 组 55.85±2.32 18.73±0.03 25.42±2.35

N 组 81.28±2.09* 8.32±0.76 10.22±1.54

R 组 43.40±3.36 15.55±2.28 41.05±1.84

N→R组 23.28±1.82 6.73±0.53 68.32±1.92*

NR 组 32.77±2.81 13.13±0.69 53.77±2.88

R→N组 35.20±1.01 13.51±0.80 51.28±1.69

* 表示与相同时相其它实验组比较 P 值均 <0.05

Calu-6 细胞周期图 O N R

N→R NR R→N

Calu-6 细胞周期结果

组别　 Calu-6 　

G0/G1 （ % ） S （ % ） G2/M （ % ）O 组 62.07±1.98 21.06±1.42 16.87±0.75

N 组 63.80±2.99 19.33±1.89 16.86±1.22

R 组 46.93±1.91 15.07±2.08 38.00±0.65

N→R组 41.30±1.03 11.84±1.88 46.87±1.07*

NR 组 45.81±3.12 12.29±1.70 41.90±1.68

R→N组 46.00±2.23 14.47±1.51 39.53±0.91* 表示与相同时相其它实验组比较 P 值均 <0.05

O N R

N→R NR R→N

A549 细胞各组凋亡图

N→R NR R→N

Calu-6 细胞各组凋亡图 O N R

N→R NR R→N

A549 、 Calu-6 细胞凋亡结果

组别 A549 （ % ） Calu-6 （ % ）O 组 1.30±0.43 1.62±0.68

N 组 10.85±0.35 5.17±0.40

R 组 17.49±0.84 18.63±0.43

N→R 组 57.78±1.08* 36.06±1.40*

NR 组 40.46±0.81 20.59±1.27

R→N 组 37.51±1.24 19.42±0.69* 表示与相同细胞系其它实验组比较 P 值均<0.05

WESTERN BLOT

各组 Akt 、 pAkt 灰度值

* 与各个实验组比较， p ＜0.05

组别

A549 Calu-6

Akt pAkt 　 Akt pAkt

O 组0.81612±0.00

0710.53735±0.000

280.88267±0.001

310.58383±0.000

90

N 组0.81563±0.00

0080.53576±0.001

030.88212±0.000

910.58156±0.000

45

R 组0.81541±0.00

0420.54701±0.000

520.88424±0.002

210.58818±0.000

54

N→R 组0.81581±0.00

0450.49458±0.000

58*0.87998±0.000

480.57863±0.000

95*

NR 组0.81613±0.00

0340.52547±0.000

610.88197±0.001

230.58624±0.001

30

R→N 组0.81668±0.00

0610.53632±0.000

27 　0.88196±0.001

720.58611±0.001

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小结㈠◆ 相同的结果

• 两种细胞 N→R 组的 SER 最高。

• 两种细胞 N→R 组的 G2/M 期比例和凋亡率最高 。

• 两种细胞 N→R 组的 Bax 、 P21 达最高值， Bcl-

2 、 phospho-DNA-PK 达最低值。各组 Akt 表达无差异。 pAkt 表达在 N→R 组表达减至最低 。

☆ 上述改变表明两种不同的细胞系，尼妥珠单抗放疗协同效应最佳顺序均为放疗前 24h 给药。

小结㈡◆ 不同的结果

• 尼妥珠单抗对 A549 细胞的抑制作用更强。

• 尼妥珠单抗无论何时给药均对 A549 细胞产生放射增敏作用，而Calu-6 细胞仅见于放疗前给药。

• Calu-6 细胞 N 组的 G0/G1 期阻滞不明显， NR 组、 R → N 组未见 G2/M 期比例和凋亡率升高。

• A549 细胞 EGFR 表达较高，而 Calu-6 细胞 Akt 、 pAkt 表达较高。

讨论⒈A549 、 Calu-6 细胞实验结果不同的潜在原因：

⑴ EGFR 单抗的放射增敏作用与肿瘤细胞表面的 EGFR 表达水平密切关系。

⑵Akt 、 pAkt 可能是抗 EGFR 疗法中的耐药因子。 ⒉ 推测 Calu-6 细胞系若要进一步增强放射增敏效应，是否应加

大药量或是延长作用时间。⒊尼妥珠单抗对 A549 、 Calu-6 细胞系的最佳给药时间均为放

疗前，不同细胞的最佳给药量需进一步明确。⒋尼妥珠单抗不同作用时间对放射增敏作用的影响机制尚有待

于更深入的研究。

谢 谢！谢 谢！