3.2.4. Уургийг гурван хлорт цууны хүчлээр уураг тунадасжуулах арга

Ажлын явц: Цэвэрлэсэн хуурай дээжээс 15 мг жигнэн авч 1.5 мл фосфатын буферт

(pH=7, 50mM) сайтар уусгана. Буферт ууссан дээжийг хатуу хольцоос нь салгахын

тулд 6000 RPM хурдтайгаар 5 минут центрифугдэнэ. Гарч ирсэн дээжний дээд шингэн

фазыг авч шинэ хуруу шилэнд хийнэ. Энэхүү дээд шингэн фаз дээр нь 150 мкл гурван

хлорт цууны хүчил нэмээд -20˚С-д 20 минут инкубацлана. Үүний дараагаар 10000g

хурдад 5 минут центрифугдэхэд уургийн тунадас буусан байна. Дээд шингэн фазыг

асган уургийн тунадас дээр этанол:эфир (1:1) хольцоос 500 мкл нэмэн сайтар хольж

дахин 10000g хурдад 5 минут центрифугдэнэ. Энэ шатыг 2-3 удаа давтан хийнэ.

Ингээд гарсан уургийн тунадасыг өрөөний температурт 10 минут байлган

этанол:эфирийн хольцийг ууршуулна (Bollag, et al.,1996).

3.2.5. SDS-Полиакриламид гель электрофорезын арга

Аргын үндэслэл: Уураг тодорхойлох SDS-полиакриламид гель электрофорезын

системийг 1970 онд Лэммли тодорхойлсон бөгөөд уураг пепидийн холимогийг ялгах,

тодорхойлох, уургийн молекул жинг илрүүлэхэд хамгийн өргөн хэрэглэгддэг сонгодог

арга юм.

Онол нь: уураг цэнэгтэй хавтгайд молекул массаараа тархахад үндэслэгдэнэ. Уургийн

хэмжээнээс хамаарч гелийнхээ концентрацийг сонгодог. Уургийг салгахад тухайн

уургийн молекул масс, цэнэг, бүтэц нь нөлөөлөхөөс гадна электрофорезыг явуулах

орчны рН болон хими физикийн шинж чанар нөлөөлдөг.

Ялгах гель

ТЕМЕD үйлдвэрээсээ тохирсон найрлагаараа гардаг.

100 мг аммонийн персульфатийг 5 мл усанд уусгана. Хэрэглэхийн өмнө бэлтгэнэ.

Гелийн буфер 90.9 г Tris Base-ыг 350 мл усанд уусгаад рН-ыг 8.8 хүртэл давсны

хүчил юмуу натрийн гидроксидоор тохируулна. Тохируулсны дараа 500 мл хүртэл

нэрсэн ус нэмнэ.

10% SDS уусмал бэлтгэх. 10 г SDS-ыг 90 мл усанд уусгаад 100 мл хүртэл ус нэмнэ.

Уусмалыг 250С-д хадгалж болно.

Хүснэгт 3. Гелийн концентрациас хамаарч уусмал найруулах харьцаа

Үндсэн уусмал Акриламидын концентраци

10% 12.5%

Акриламид / бисакриламид

40% (мл)

3.72 4.65

Ялгах гель буфер (мл) 3.15 3.15

Нэрмэл ус (мл) 7.98 6.92

10% SDS (мл) 0.15 0.15

Аммонийн персульфат (мл) 0.1 0.1

ТЕМЕD (мкл) 30 30

Бэлтгэсэн гелийнхээ аппаратанд тэмдэглэсэн хэсэг хүртэл цутгана.

Гель дээр 70% этанол 2 мл хэмжээгээр хийж гадаргыг нь нэгэн жигд болгоно.

Гелийг полимержиж дуустал хүлээнэ. Энэ хугацаа нь температураас хамаарах

бөгөөд 25°С-д 30 мин орчим байна.

Полимержиж дууссаны дараа нь гелийн дээд талыг усаар угааж фильтрийн цаасаар

шүүж авна.

Хүснэгт 4. Цуглуулах гель бэлтгэх

Урвалж бэлтгэх:

Гелийн буфер 15.2 г Tris base-ыг 200 мл усанд уусгаад рН 6.8 хүртэл давсны хүчлээр (НCl)

тохируулж 250 мл хүртэл усаар шингэлнэ.

Үндсэн уусмал Акриламидын концентраци

3%

Акриламид / бисакриламид (мл) 1.0

Цуглуулах гель буфер (мл) 2.5

Нэрмэл ус (мл) 6.3

10% SDS (мл) 0.2

Аммони персульфат (мл) 0.13

ТЕМЕD (мкл) 10

Салгах гелийг хатсаны дараа цуглуулах гелийг бэлтгэж 0.5 см хэмжээтэй

цуглуулах гелийг цутгана.

Цуглуулах гелийг цутгасны дараа самаа суулгана.

Полимержтэл нь 30 минут царцааж дараа нь самаа болгоомжтой сугалан авна.

Дээжний буфер бэлтгэх:

Урвалж бэлтгэх: дээжний буфер: 5 мл цуглуулах гель буфер, 8 мл 10% SDS уусмал, 1 мл

нэрмэл ус дээр 4 мл глицерол нэмээд 1-2 мл бромфенолын хөх нэмж холино. Дээжний

буферийг -70°С-д хадгална.

Электрофорез явуулах:

Урвалж бэлтгэх: электрофорезын буфер: 40 г Tris Base, 230.4 г глицин болон 16 г SDS

хольж 4 л хүртэл нэрсэн ус нэмээд 25°С-д хадгална. Хэрэглэхийн өмнө 4 дахин шингэлнэ.

электрофорезын буферээр танкаа дүүргэнэ.

Самны нүхнүүдэд дээжээ хийнэ.

Электрофорезын аппаратаа хүчдэлтэй залгаж электрофорезыг эхлүүлнэ.

Дээжний будаг нь гелийн доод хэсгээс 0.5 см байх үед электрофорезыг зогсооно.

Хүчдлийг салгаад гелийг салгаж авна.

Полиакриламидын гелийг Coomassie Blue-ээр будах:

Будагч уусмал бэлтгэх: 2 г Coomassie Blue R-250-ийг 500 мл метанолд уусгаад 100 мл

цууны хүчил нэмнэ. Дээр нь 400 мл нэрсэн ус хийж шүүлтүүрийн цаасаар шүүнэ.

Өнгөгүйжүүлэх уусмал бэлтгэх: 1.6 л метанолд 400 мл цууны хүчил нэмж 2 л нэрсэн усаар

шингэлнэ. Уусмалаа сайтар хутгаад 25°С-д хадгалж болно.

Электрофорез гүйж дууссаны дараа гелийг салгаж аваад цуглуулагч гель болон

салгах гелийг салгана.

Пластик саванд 200 мл будагч уусмалаа хийж гелийг хийж 250С-д 1 цаг зөөлөн

холино.

Өнгөгүйжүүлэх уусмалдаа гелиэ хийж өнгөгүй болтол нь байлгана (Laemmli, 1970).