Материалы научно­ практической конференции СТАНОВЛЕНИЕ И ДОСТИЖЕНИЯ

БИОХИМИЧЕСКОЙ ШКОЛЫ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Научно­практическая конференция биохимиков, посвященная памяти проф. В.Г. Винтера (1939­2005)

12 ноября 2009

Казань

СОДЕРЖАНИЕПрограмма 5Тезисы 9Абдельрахман А.А., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф.К., Куприянова­Ашина Ф.Г.ВЛИЯНИЕ АМФОТЕРИЦИНА В НА РОСТ Aspergillus awamori

9

Агзамов Р.З., Рафаилова Э.А., Панкова А.В, Сироткин А.С., Алимова Ф.К. 

ДЕГРАДАЦИЯ  ПОЛИЭТИЛЕНОВЫХ  ПЛЕНОК  В  ЖИДКИХ  СРЕДАХ  И  ОЦЕНКА  ИХ ГРИБОСТОЙКОСТИ ПО СТЕПЕНИ РАЗВИТИЯ ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА

10

Аникеев О. Е., Кравцова О.А.ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДЕГРАДАЦИИ

13

Ахмадиева А.А., Сафин Р.И.ТРИТИКАЛЕ ­ КУЛЬТУРА БУДУЩЕГО

17

Бикмуллин А.Г., Фахруллин Р.Ф.ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МАГНИТНЫХ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МИКРОЧАСТИЦ РАЗЛИЧНОЙ МОРФОЛОГИИ

19

Биктагирова Э.М., Кравцова О.А., Сатарова Л.И., Вагапова Г.Р.АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОВ СTLA4 И PTPN22 С РИСКОМ  РАЗВИТИЯ АУТОИММУННОГО ТИРЕОИДИТА СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

21

Бирюлина М.Н., Кравцова О.А.РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АУТОСОМНЫХ  STR ­ ЛОКУСОВ

23

Вавилова Е.В., Кравцова О.А.АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ­308A/G ГЕНА TNF­  С РИСКОМ РАЗВИТИЯ АУТОИММУННОГОα  ТИРЕОИДИТА У НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

25

Валеева А.Ф., Зиннатов Ф.Ф. МОЛЕКУЛЯРНО­ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

27

Вафина Р.К., Фахруллин Р.Ф.МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ПОЛИМЕРАМИ

29

Габбасов Р.Т., Вавилова Е.В., Ризванова Ф.Ф., Ризванов А.А., Кравцова О.А.РАСПРЕДЕЛЕНИЕ  ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ  IL­4 И IL­6 В ПОПУЛЯЦИИ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

30

Габитова Л.Р. , Иксанова А.Г., Сабиров А.Г. ,Фаттахова А.Н., Штырлин Ю.Г. РАЗРАБОТКА НОВЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ В КЛЕТКИ ОПУХОЛИ

32

Гайфуллина Д.Ф., Панкова А.В., Тазетдинова Д.И. МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОУДОБРЕНИЙ И БИОПЕСТИЦИДОВ 

34

Галямутдинова Э. И., Невзорова Т.А.ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ БЛАГОРОДНЫХ МЕТАЛЛОВ НА КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК ПОЧКИ СОБАКИ IN VITRO

35

Губайдуллина Л.Р., Абрамова З.И.ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО СОСТАВА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ  АУТОИММУНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

39

Данилова Ю.В., Рудакова Н.Л., Михайлова Е.О., Маликова Л.А., Шарипова М.Р.ТРОМБОЛИТИЧЕСКИЕ И АНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗ У БАЦИЛЛ

42

Дойникова А.Н., Тюрин Ю.А.БЕЛКИ­МАРКЁРЫ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТА

43

Егоркина Ю.А.,  Часов А.В.КИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ДВУХ БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ КОРНЕЙ Triticum aestivum L.

47

Зайцева Т.В., Аглиева Г.Х., Кадырова Ф.З.ФИТОСАНИТАРНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОСЕВОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА АМИР В УСЛОВИЯХ ПРЕДКАМСКОЙ ЗОНЫ РТ в 2009 г.

49

Ибатуллина Р. П., Шишкин А.В.МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ – ЛЬТЕРНАТИВА ПЕСТИЦИДАМ И ХИМИЧЕСКИМ ФУНГИЦИДАМ

52

Иванова В.В., Храмова А.Ю., Сабирзянова А.З., Рябичко С.С.,Невзорова Т.А ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ КАРТЫ КАК НОВЫЙ ПОДХОД В ЛЕЧЕНИИ И ДИАГНОСТИ­КЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ АУТОИММУННОГО ХАРАКТЕРА

55

Иксанова А.Г., Габитова Л.Р., Малофеева Е.В., Фаттахова А.Н., Штырлин Ю.Г.БЛОКСОПОЛИМЕРЫ ЭТИЛЕН ОКСИДА И ПРОПИЛЕН ОКСИДА В НАНОМЕДИЦИНЕ

58

Исаева Э.В., Баташева С.Н.,Хамидуллина Л.А.,Саляхова Г.А., Чиков В.И.ИЗМЕНЕНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА УГЛЕРОДА ПОД ДЕЙСВТИЕМ ДОНОРА (NO) НИТРОПРУССИДА НАТРИЯ

61

КОВАЛЁВА Ю.А., ТУАЕВА Н.О., ХАСАНОВ А.А., АЛИМОВА Ф.К.ЗНАЧЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

63

Конюхова Е.В., Нгуен Фыонг Нга, Кравцова О.А.АНАЛИЗ  МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В ГРУППЕ КРЯШЕН РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

65

Козлова О.В., Абдельрахман А.А., Тазетдинова Д.И., Куприянова­Ашина Ф.Г., Алимова Ф.К.ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОГРИБКОВЫХ  ПРЕПАРАТОВ НА УРОВЕНЬ КАЛЬЦИЯ В ЦИТОЗОЛЕ ASPERGILLUS AWAMORI

67

2

Крякунова Е.В.,Гимадутдинов О.А., Хамидуллина Р.Г.КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕФЕРЕНС­ПЛАЗМИДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОПИЙНОСТИ ПЛАЗМИД, СОДЕРЖАЩИХ BLA­ГЕН

68

Купцова А.А.,Каменек Л.К.ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИЙ РОДА  ESCHERICHIA ПОД ДЕЙСТВИЕМ  ДЕЛЬТА­ЭНДОТОКСИНА ВАCILLUS THURINGIENSIS

71

Курбанов Р.А., Шахмаева И.И., Туаева Н.О., Алимова Ф.К., Абдуллин Т.И.РАЗРАБОТКА МЕТОДА РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ СЕРДЕЧНО­СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНОГО БИОСЕНСОРА

74

Мавлютова И.И., Часов А.В.ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КОРНЕЙ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

75

Маланин С.Ю., Никифорова В.Ю.РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА THIC  АРАБИДОПСИСА ПОСРЕДСТВОМ НОНСЕНС­ОПОСРЕДОВАННОГО РАЗРУШЕНИЯ МРНК (NMD)

77

Малофеева Е. В., Копоруллина М.О., Фаттахова А.Н.МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЛЕЙ АЛЕНДРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, КАК ПРОЛЕКАРСТВА ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА

78

Матвеева М.В., Фаттахова А.Н.СОЗДАНИЕ БАЗЫ ДАННЫХ ДЛЯ ПРОГНОЗА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

82

Минуллина Р.Т.,Фахруллин Р.Ф.СОЗДАНИЕ ГИБРИДНЫХ МИКРОКАПСУЛ ИЗ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ НА ОСНОВЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК

84

Морозова Ю.А., Скворцов Е.В.БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗ ГРИБАМИ РОДА TRICHODERMA ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЕ

85

Мустафин Р.А., Насыбуллина Н.М.ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ И МЕСТНОРАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МЕЛОКСИКАМА В ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХ

86

Мухаметзянова А.Д., Ахметова А.И., Шарипова М.Р.ФИТАЗЫ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ОСНОВА НОВЫХ БИОУДОБРЕНИЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ

88

Нго Тхи Бинь Минь, Арлеевская М.И.ЛИПИДНЫЙ БАЛАНС ПРИ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИИ

90

Нгуен Х.М., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф.К.ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАГЕННОСТИ TRICHODERMA ASPERELLUM 

91

Павлова Е.В., Анисимова Т.Е., Туаева Н.О.ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ У ДЕТЕЙ, ПЕРЕНЕСШИХ ХРОНИЧЕСКУЮ ВНУТРИУТРОБНУЮ ГИПОКСИЮ

92

Панкова А.В., Тухбатова Р.И.МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АРХЕОЛОГИЧЕСКИХ ПАМЯТНИКОВ ВОЛЖСКО­КАМСКОЙ ЛЕСОСТЕПИ

93

Петрова А.А., Горшкова Т.А., Мокшина Н.Е.УЧАСТИЕ  ­ГАЛАКТОЗИДАЗЫ В ФОРМИРОВАНИИ ВТОРИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ЛЬНЯНОГО  ВОЛОКНА

95

Рафаилова Э.А., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф.К., Нургалиев Д.К.БАКТЕРИАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСАДКА ОЗЕРА БОЛЬШОЕ ЯРОВОЕ АЛТАЙСКОГО КРАЯ

99

Халилуллин Р.Н., Рафаилова Э.А., Панкова А.В., Готлиб Е.М., Алимова Ф.К.ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИФИЦИРОВАННЫХ ДИАЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ПЛЕНОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ

101

Сабирзянова А.З., Иванова В.В.,Невзорова Т.А.ЭКСПРЕСС­ДИАГНОСТИКУМ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ ОЦЕНКИ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ КРОВИ

103

Сагитова А.В., Булатов Э.Р., Бондарь О.В., Штырлин Ю.Г.,  Абдуллин Т.И.РАЗРАБОТКА ПОЛИПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ БЛОК­СОПОЛИМЕРОВ И ИХ БИОКОНЪЮГАТОВ

105

Сайфуллина Д.В.,Абдуллин Т.И., Шахмаева И.И.ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ЭКСПРЕСС­АНАЛИЗА ДНК­ГИДРОЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ

106

Сахадиев И.А., Рябичко С.С., Иванова В.В., Алимова Ф.К., Григорьян Б.Р.НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ИНФЕКЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ПОЧВ

107

Сунгатуллина Л.М., Кравцова О.А. АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ   ­ 480 С/Т  и  +1075 А/С ГЕНА  HL С РИСКОМ РАЗВИТИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА У НАСЕЛЕНИЯ РТ

108

Тойменцева А.А., Шарипова М.Р. ИЗУЧЕНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ Bacillus intermedius

110

Усманова Р.Ш., Федина Е.О.ВЛИЯНИЕ 24­ЭПИБРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ МЕМБРАННО­СВЯЗАННЫХ БЕЛКОВ КОРНЕЙ ГОРОХА. Са2+­ЗАВИСИМЫЙ ЭФФЕКТ

112

Фирсова С.С., Фролова Л.Л.  114

3

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ЭКСПРЕСС­ОЦЕНКИ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫХабибуллина А.А., Гилязетдинова К.Б., Невзорова Т.А.ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИТЕЛ С ДНК

116

Хиляс И.В., Сафиуллина Л.Ф., Зиганшин А.М., Наумова Р.П.МИКРОБНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ЭКСПРЕСС­ДЕТЕКЦИИ ТОКСИЧНЫХ НИТРОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

118

Хоанг Л.Т., Ларская И.А.ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ НА ЭКСПЛАНТАХ КУКУРУЗЫ

119

Хорошева А.Е., Арлеевская М.И. ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ В СЫВОРОТКЕ И ВЗВЕСЯХ МОНОЦИТОВ БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

121

Храмова А.Ю., Сабирзянова А.З., Иванова В.В., Невзорова Т.А.ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ К ДНК НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОК ПОЧКИ СОБАКИ IN VITRO

124

Хрундин Д.В., Решетник О.А. ВЛИЯНИЕ ПИЩЕВЫХ КИСЛОТ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПЕКТИНОВ В ТЕХНОЛОГИИ ЖЕЛЕЙНЫХ ИЗДЕЛИЙ

127

Хусаинов И.Ш., Горшков В.Ю., Петрова О.Е., Сорокина Ю.В., Гоголев Ю.В.МЕЖКЛЕТОЧНАЯ КОММУНИКАЦИЯ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ОТВЕТА НА РАННИХ ЭТАПАХ ГОЛОДАНИЯ БАКТЕРИИ Pectobacterium atrosepticum

130

Шагимарданова Е.И., Гусев О.А., Сычев В.Н., Левинских М.А.,Сугимото М., Шарипова М.Р.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАСТЕНИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СИСТЕМ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ НА БОРТУ КОСМИЧЕСКИ КОРАБЛЕЙ

134

Шамсиева Р.Р., Рябичко С.С., Невзорова Т.А.НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

138

Шах Махмуд Р., Галиева Г.М., Нигматуллина Л.Ш., Филимонова М.Н.ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERRATIA MARCESCENS И ЕЕ БИОСИНТЕЗ В СУБОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

140

Шарипов А.А., Рафиков Р.И., Фаттахова А.Н., Степущенко Ю.Г. РАЗРАБОТКА ДНК­БАНКА ПО ПОВОЛЖСКОМУ ФЕДЕРАЛЬНОМУ ОКРУГУ. ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА НЕМАТИВИРОВАННОЙ АГРЕССИИ У ПОДСЛЕДСТВЕННЫХ

142

Шафигуллина А.К., Ялвач М.Э., Салафутдинов И.И., Блатт Н.Л., Ризванов А.А, Киясов А.П.ВЛИЯНИЕ ИММОРТАЛИЗАЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЗАЧАТКОВ ЗУБОВ МУДРОСТИ ЧЕЛОВЕКА НА ЭКСПРЕССИЮ МАРКЕРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

145

Шишкин А.В., Алимова Ф.К. КСИЛАНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ РОДА TRICHODERMA

147

Эль Али Ф.А., Насыбуллина Н.М.ОЦЕНКА ТОКСИЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ТЕНОКСИКАМА И НАПРОКСЕНА В  ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХ

150

Ямашев Т.А., Симонова Н.Н., Решетник О.А.СНИЖЕНИЕ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ПОЛУПРОДУКТОВ В ТЕХНОЛОГИИ ЭТИЛОВОГО СПИРТА

152

Валиуллина Р.Н., Хохлова Л.П.ХИМИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ МЕМБРАН РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ЯРОВОЙ  ШЕНИЦЫ ПРИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

157

Габитов Р.А., Закирова А.Р., Багаева Т.В.БИОФУНГИЦИДНОЕ СВОЙСТВО РИЗОСФЕРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ

161

Голиков А. В.,  Сабиров Р. М.ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КАРАКАТИЦ И СЕПИОЛИД (CEPHALOPODA: SEPIIDA, SEPIOLIDA)

164

Моров А.Р., Сабиров Р. М.ЗАКОНОМЕРНОСТИ СОЗРЕВАНИЯ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ И ПЛОДОВИТОСТЬ САМОК ROSSIA PALPEBROSA (CEPHALOPODA: SEPIOLIDA) НА ВОСТОЧНОМ ШЕЛЬФЕ АРХИПЕЛАГА ШПИЦБЕРГЕН

168

Халиуллин Т.О., Фатхутдинова Л.М.СОЗДАНИЕ СПРАВОЧНО­ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ ПО БЕЗОПАСНОСТИ НАНОТЕХНОЛОГИЙ

172

Шаева А.Ю.,Хазипов Н.З.ПДРФ­АНАЛИЗ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЛКРС)

173

ABD EL­RAHMAN, A.A.; EL­MORSI, E.A.; EL­SHAFEI, M.A., ABD El­NAEM, G.F.USING OF PHYTIC ACID AS AN IMPROVING AGENT IN BLOOD AND LIVER RATS TREATED WITH AFLATOXIN B1 (AFB1)

176

SALLY, M.A. EL­SHAFEI; EL­MORSI, E.A.; TURKE, S.A.,  ABD EL­ KADER, S.M.CHANGES IN WEIGHT OF SOME ORGANS IN ALBINO RATS TREATED WITH AFLATOXIN B1 (AFB1) AND CARBON TETRACHLORIDE (CCl4) AND THE EFFECT OF GREEN TEA EXTRACT ON THESE CHANGES

177

4

ПРОГРАММА 

Состав оргкомитета конференции:Председатель:Салахов   Мякзюм   Халимуллович  ­  ректор   Казанского   государственного  университета, д.ф­м.н., профессорЗаместители председателя:Зубаиров   Дилявер   Мирзабдуллович.  –  проф.   кафедры   биохимии  Казанского   государственного   медицинского   университета,   д.б.н.,   редактор  Казанского медицинского журнала;Алимова   Фарида   Кашифовна  –  зав.   кафедрой   биохимии  Казанского  государственного университета, проф., д.б.н.

Программный комитет:Тарчевский И.А., акад. РАН, КИББ РАН, г. Казань Нургалиев Д.К., д. г.­м. н., проф., проректор по НИР КГУ, г. КазаньГильмутдинов А.Х., д. ф.­м. н. , член­корр. АН РТ, г. КазаньГречкин А.Н., д.х.н., акад. РАН, директор КИББ, г. КазаньСабиров Р.М., к.б.н., декан биолого­почвенного факультета КГУ, г. Казань Абрамова З.И., проф., д.б.н., КГУ

Ответственный секретарьАкберова Н.И., доц. кафедры биохимии КГУРабочая группа:Темников  Д.А.,  Гаврилов  В.С.,  Жарких  А.В.,  Ишмухаметова  Д.Г.,  Фаттахова  А.Н., Невзорова  Т.А.,  Фахруллин  Р.Ф.,  Иксанова  А.Г.,  Тухбатова  Р.И.,  Анисимова  Т.Е., Замалеева  А.И.,  Конюхова  Е.В.,  Никитина  И.И.,  Рафаилова  Э.А.,  Сабирзянова  А.З., Тазетдинова Д.Г., Гилязетдинова К.Б.,  Тарасов Д.С.

ПРОГРАММА КОНФЕРЕНЦИИ

12 ноября 2009 г.

10.00­12.00Открытие конференции

Актовый зал КГУ (главный корпус, второй этаж)

Приветственное слово:ректора Салахова М.Х.министра образования РТ Гильмутдинова А.Х.декана биолого­почвенного факультета Сабирова Р.М.академика РАН Тарчевского И.А.

Выступление гостей: академик РАН Оводов Ю.С.,академик РАН  Синяшин О.Г., член­корр РАН Миронов В.Ф.,

5

член­корр. АН РТ Галкин В.И.,академик РАЕН Будников Г.К.,д.х.н, профессор Жданов Р.И.

Открытие мемориальной доски проф. Винтера Виктора Георгиевича(восточное крыло главного здания КГУ)

12.00­13.00

 Товарищеский обед

13.00­16.00Секционная работа

Секция 1. История и достижения казанской биохимической школы (аудитория 211В, главный корпус)Модераторы секции: Зубаиров Д.М., Алимова Ф.К.

Фиксированные выступления:

1. Зубаиров Д.М. КГМУ, академик АН РТ.История биохимии в Казани (20 мин).

2. Ишмухаметова Д.Г., Абрамова З.И.КГУШкола и научные направления,  созданные  Винтером  В.Г. (15 мин)

3. Алимова Ф.К. КГУПерспективы развития кафедры (15 мин)

4. Фахруллин Р.Ф, Абдуллин Т.И. (10 мин)КГУНаправление «Нанотехнология» на кафедре биохимии

5.Кравцова О.А., Газизова Р. (15 мин)КГУ Направление «Геном человека» в деятельности научной биохимической школы КГУ, созданное Аскаровой А.Н.

6.Темников Д.А. (15 мин.) КГУИнновационные подходы к организации обучения на кафедре биохимии КГУ

7. Тарасов Д.С., Акберова Н.И. ( 15  мин) КГУ

6

Биоинформационные подходы к преподаванию биохимии 

Кофе­брейк (25 минут)

Исторические очерки о  научной и общественной деятельности Винтера В.Г. 

Регламент 5 минут

5. Гречкин А.Н., КИББ РАН, академик РАН  Оксилипины: биосинтез и физиологическая роль

6. Хазипов Н.З., КГАВМ  Школа биохимии в Ветеринарной академии

7. Мустафин И.Г., КГМУ Школа биохимии Медуниверситета

8. Цибулькин А.П., КГМА Сотрудничество кафедры биохимии КГУ с КГМА

9. Гаврилов В.С., КГУ Дальневосточный период  деятельности кафедры биохимии

10. Хайбуллов А.И., КГУ Деятельность Винтера в Научно исследовательской части КГУ

11. Ильинская О.Н.,  Лещинская И.Б. КГУ  Проблемная лаборатория №7 – этап профессиональной биографии Винтера В.Г.

Воспоминание коллег

12. Офицеров Е.Н., РХТУ13. Газизов И.С., МО РТ14. Хохлова Л.П., КГУ 15. Багаева Т.В., КГУ16. Куприянова – Ашина Ф.Г. КГУ17. Юсупова Д.В. КГУ

 Выступления по желанию

10.00­16.00

Секция 2. Коммуникативная компетентность современного преподавателя высшей школы (тренинг для молодых преподавателей)

(аудитория 111ЦИТ, здание Центра информационных технологий КГУ)

7

Игротехники:  д.п.н., проф. Сидельникова Т.Т. к.б.н., доц. Темников Д.А.

16.00­18.00

Конкурс студенческих научных работ «Умник».(аудитория 211В, главный корпус КГУ)

18.00 (аудитория 211В, главный корпус КГУ) 

Закрытие конференции

8

Тезисы конференции

ВЛИЯНИЕ АМФОТЕРИЦИНА В НА РОСТ Aspergillus awamoriАбдельрахман А.А., Тазетдинова Д.И.Алимова Ф.К., д.б.н., проф.; Куприянова­Ашина Ф.Г. д.б.н., проф.Казанский Государственный  Университет, Россия

EFFECT OF AMPHOTERICIN B ON Aspergillus awamori GROWTHAbd EL­Rahman A.A., Tazetdinova D.I.Alimova F.K.; Kupriyanova­Ashina F.G.Kazan State University, Russia

Для  лечения  аспергиллеза  людей  получен  большой  опыт  применения Амфотерицина В. Однако смертность у тяжелых больных остается высокой – 80%.  Кроме   того,   почти   всегда   отмечается   нефротоксичность   при использовании обычных доз от 1 до 1,5 мг/кг/день, необходимых для лечения аспергиллеза.  Исходя   из   этого,   этот   препарат   в   настоящее   время   играет незначительную  роль  в  лечении  этой  инфекции,  а  стандартом  помощи  для всех больных, нуждающихся в использовании амфотерицина В при инвазивном аспергиллезе  становятся  липидассоциированные  формы  препарата.  К  тому же, некоторые виды Aspergillus, резистентные к амфотерицину В, особенно A. terreus, частота выявления которых по докладам из ряда медицинских центров постоянно растет, требуют назначения альтернативной терапии. В настоящее время   выпускают   три   липидассоциированные   формы   амфотерицина   В: Абелсет   (липидный   комплекс   амфотерицина   В),   Амбизом   (липосомальный амфотерицин   В)   и   Амфотек   (коллоидная   дисперсия   амфотерицина   В). Основное  преимущество  этих  форм  состоит  в  возможности  давать  высокие дозы  амфотерицина  В  при  низкой  токсичности.  Наиболее  часто  используют Абелсет и Амбизом и при их введении наблюдают незначительные побочные эффекты.  Побочные   эффекты   после   инфузий   Амфотека   подобны   тем, которые   наблюдают   при   введении   обычного   амфотерицина   В,   поэтому никакого резона его применять нет.

Целью работы явилось исследование влияния Амфотерицина В на рост модельного микромицета Aspergillus awamori.

Микромицет  культивировали  на  твердой  и  жидкой  питательной  среде Вогеля.   Споры  A.awamori  выдерживались   6   часов   в   присутетвии Амфотерицина  В  в  концентрациях:  5,  10,  20,  40  µМ.  Затем  суспензия  спор высевалась на плотную среду Вогеля, где замерялся диаметр колоний.  

Как  показали  результаты,  независимо  от  концентрации  фунгицида  в среде  интенсивность  набухания   спор  на   6   час   экспозиции   возрастает.  Не выявлено  достоверной  разницы  между  опытом  и  контролем.  При  изучении роста   микромицета   на   плотной   питательной   среде   наименьший   диаметр колонии отмечен при концентрациях Амфотерицина В 20 и 40 µМ на 2­е сутки культивирования.  Дальнейший  рост  колонии  не  зависел  от  концентрации фунгицида.

9

ДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИЭТИЛЕНОВЫХ ПЛЕНОК В ЖИДКИХ СРЕДАХ И ОЦЕНКА ИХ ГРИБОСТОЙКОСТИ ПО СТЕПЕНИ РАЗВИТИЯ ПЛЕСНЕВОГО ГРИБААгзамов Р.З.1, Рафаилова Э.А. 2, Панкова А.В. 2

Сироткин А.С.1 д.т.н., профессор; Алимова Ф.К. 2 д.б.н., профессорГОУ ВПО «Казанский Государственный Технологический Университет1», ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В. И.Ульянова­Ленина» 2, г. Казань

DEGRADATION OF POLYETHYLENE FILMS IN LIQUID ENVIRONMENTS AND THEIR  FUNGUS  RESISTANCE  ASSESSMENT  ON   DEGREE   OF   THE  MOLD FUNGUS DEVELOPMENT Agsamov R.Z.1, Rafailova E.A. 2, Pankova A.V. 2

Sirotkin A.S. 1; Alimova F.K. 2

Kazan State Technological University1, Kazan State University2, Kazan

В   современных   условиях,   в   связи   с   резким   усилением   техногенного воздействия на окружающую среду, во многих странах мира разрабатываются комплексные программы, включающие необходимые мероприятия для охраны и научно обоснованного рационального использования земли, водных ресурсов и   пр.   Одной   из   основных   экологических   проблем   является   снижение количества полимерных отходов [1].

Основные пути увеличения скорости деструкции полиэтилена сводятся к введению   в   структуру   цепи   звеньев,   чувствительных   к   действию деструктирующих агентов.

В   представленной   работе   исследовался   процесс   деградации композиционных пленок из полимера на основе полиэтилена, наполненного в различных   соотношениях   крахмалом   и   важнейшими   органическими   и неорганическими   биогенными   элементами.   Химический   состав   полимерных пленок представлен в таблице 1

Таблица 1 ­ Содержание модификаторов в полимерных пленкахОбразец Содержание крахмала, 

%Содержание биогенных 

добавок, %Исходный полимер ­ ­Биок 15 2 ­Биок 16 2 0,2Биок 17 2 0,6

Пленки полимерных материалов помещались в мясопептонный бульон для накопления   биомассы   на   поверхности   полимеров.   В   качестве   инокулята вводилась   смешанная   популяция   почвенных   микроорганизмов.   После накопления     на   поверхности   полимеров   биопленки   полимерные   образцы помещались   в   модифицированную   среду   Раймонда   для углеводородокисляющих   микроорганизмов   [2],   не   содержащую   источников органического   углерода.   Таким   образом,   единственным   источником 

10

органического   углерода   являлись   полиэтиленовые   пленки.   Контролем служили полимерные пленки, помещенные в дистиллированную воду.

Культивирование   микробного   сообщества   на   поверхности   пленок проводили в течение двух недель, затем производили замену жидких сред на вновь приготовленные и продолжали эксперимент еще две недели.

После   культивирования   микроорганизмов   на   поверхности   полимерных пленок в жидких средах производилось депонирование полимерных образцов при комнатной температуре в почвогрунт. Влажность грунта поддерживали в пределах 65­75%.

В  процессе  деградации  полимерных  образцов  исследованы  изменения характеристик  жидких   сред   и   грунта.  Наряду   с   этим,   изучены   изменения свойств самих полимерных материалов.

В результате проведенных исследований показано, что решающую роль в первоначальной   (быстрой)  деструкции  полимерных  пленок  играют  физико­химические   гидролитические   процессы,   что   приводит   к   уменьшению относительного  удлинения  при  разрыве  на  60­70% и  уменьшению  прочности при   растяжении   на   35­40%   по   сравнению   с   исходными   характеристиками полимерных пленок.

Для  смешанной  популяции,  культивируемой на  поверхности  полимерных материалов,   характерно   преобладание   грибов.   В   связи   с   этим,   наряду   с испытаниями  полиэтиленовых  пленок  в  жидких  средах,  проводилась  оценка грибостойкости полимерных образцов. Оценка грибостойкости оценивалась по ГОСТ  9.049.−91  [3],  по  методу  1.  Образцы  материалов  очищали  от  внешних загрязнений,  погружая  на   1  минуту  в  этиловый  спирт.  Готовили  суспензию гриба.

В   качестве   плесневых   грибов   использовался   штамм   гриба   рода Trichoderma.  Причиной  интереса   к  данному  роду   грибов   является  большая практическая  и  значимость  рода.  Виды  Trichoderma  являются  продуцентами ферментов   (целлюлаз,   хитиназ,   пектиназ,   ксиланаз,   серинзависимых протеиназ   и   др.),   используемых   в   целлюлозно­бумажной   и   пищевой промышленности,   в   производстве   моющих   средств,   в   получении   спирта,   в получении кормовых добавок [4] в преобразовании отходов [5].

Исследуемые   материалы   заражались   спорами   гриба   и   помещались   в эксикаторы, на дно которых налита вода. Продолжительность испытаний при оценке  грибостойкости  материалов  по  степени  развития  гриба  составила  30 дней, с промежуточным осмотром через 15 дней. Грибостойкость оценивали по интенсивности развития гриба на образцах по 5­бальной шкале ГОСТ 9.049 [3] и таблице настоящего стандарта.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

11

Таблица   2   ­  Оценка   грибостойкости   материала   по   степени   развития плесневых грибов

Вид полиэтилена Оценка материалаИсходный полиэтилен 1 (барьерный рост только 

по краю пленки) Биок 15 (полиэтилен+2%крахмала) 2,5 (рост на самой пленке)Биок 16 (полиэтилен+2%крахмала+0,1%минеральные и 0,1%органические добавки)

3,5 (обильный рост)

Биок 17 (полиэтилен+2%крахмала+0,3%минеральные и 0,3%органические добавки)

3,5 (обильный рост)

Исходный   полиэтилен   не   является   питательной   средой  для   развития плесневого  гриба  рода  Trichoderma.  Рост  гриба  наблюдался  только  по  краю пленки   в   виде   своеобразного   барьера.   При   изучении   другого   образца композиционной   полиэтиленовой   пленки   −   Биок   15   наблюдался незначительный рост гриба, что свидетельствует о том, что данный материал содержит питательные вещества, к которым относится крахмал. Образцы Биок 16   и   Биок   17,   которые   помимо   крахмала   еще   содержат   минеральные   и органические добавки, являются наиболее предпочтительным субстратом для благоприятного развития гриба.

Таким  образом,  можно  сделать  заключение  о  том,  что  композиционные полимерные  пленки  Биок   16  и  Биок   17   содержат  достаточное   количество питательных   веществ   для   развития   плесневого   гриба   рода  Trichoderma  и являются образцами перспективной модификации полиэтилена с повышенной биодеградируемостью.

1. Ольхов А. А. Способы утилизации отходов полимеров / А. А. Ольхов, С. В. Власов, А. Л. Иорданский // Пластические массы. 1998. №3. С. 14–18.

2. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов М.:Наука, 1989. – 288с. – ISBN 5­02­004020­7.

3. ГОСТ   9.049.−91.   Единая   система   защиты   от   коррозии   и   старения. Материалы   полимерные   и   их   компоненты.   Методы   лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов.

4. Скворцов, Е. В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma / Е. В. Скворцов,   Ф.К. Алимова, Д. М. Абузярова // Вестник Казанского технологического университета.– 2005.– №1.– С.251­255.

5. Селиванов,   А.   С.   Комплексная   переработка   целлюлозосодержащих отходов лесоперерабатывающих и сельскохозяйственных предприятий на основе биоконверсии / А.С. Селиванов // Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы. Киров.– 2001.– С. 89­91.

12

УМНИКВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДЕГРАДАЦИИАникеев О. Е., студент 5 курса, кафедра биохимии, биолого­почвенный факультетНаучный руководитель: Кравцова О.А., к.б.н., ст.преподаватель кафедры биохимии, биолого­почвенный факультетКазанский Государственный Университет, Экспертно­криминалистический центр МВД РФ по РТALLOCATION AND THE CHARACTERISTIC OF DNA FROM SAMPLES OF THE VARIOUS DEGREE OF DEGRADATIONAnikeev O.E., the student 5 rates, faculty of biochemistry, biology facultyThe supervisor of studies: Kravcsova O.A., PhD., the senior lecturer faculties of biochemistry, biology faculty

The Kazan State University, Expert­criminology center of the Ministry of Internal Affairs of the Russian Federation

1.ВведениеИзвестно, что ДНК любых двух людей отличаются на 0.1 %. Генетическое 

распознавание  использует  тот  факт, что  существуют  сильно  варьирующиеся повторяющиеся участки, называемые гипервариабельными ДНК. Число таких ДНК в одном и том же локусе у двух людей, не являющихся родственниками, с большой  вероятностью  различно.  За  исключением  однояйцовых  близнецов, генетические  профили  которых  одинаковы,  вероятность  ошибки,  вызванной случайным совпадением, крайне мала. 

Генетическое   распознавание   применяется   в   судебной   науке   для сравнения подозреваемых, пропавших без вести лиц по образцам крови, волос, слюны,  костному  и  мышечному  материалу  или  следов  спермы.  Эта  техника находит  также  применения  в  идентификации  человеческих  останков,  тестах на   отцовство,   подборе   органов   для   трансплантации,   популяционных исследованиях, и определении состава и компонентов еды. 

Однако   вопрос   выделения   ДНК   из   образцов   различной   степени деградации  и  с  различных  носителей  остается  открытым.  Новизна  и  малая изученность   проблемы   требовала   разработки   экспертного   методического комплекса,   начиная   с   первых   этапов   работы   с   экспертным   биологическим материалом. 

В  связи  с  этим  целью данной  курсовой  работы  является  оптимизация условий   выделения   ДНК   из   объектов   различного   биологического происхождения   для   проведения   генетической   судебно­медицинской экспертизы.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:1) отбор   объектов   биологического   происхождения,   поступивших   на генетическую  экспертизу в лабораторию генетического анализа ЭКЦ МВД г.Казани

13

2) сравнение   способов   выделения   ДНК   из   биологических   объектов, находящихся   на   различных   носителях   с   использованием   трех   основных методик (Chelex 100, DNA IQ System, фенол­хлороформная экстракция)3) определение  концентрации  ДНК  методом  RT­PCR  и  проведение  STR­типирования полученных препаратов ДНКРабота выполнена на базе Экспертно­криминалистического центра МВД РФ по РТ.

2.Материалы и методыВ  анализируемых  материалах  заведомо  находились  исследуемые  следы 

биологического   происхождения   (кровь,   сперма,   слюна,   пот   и   др.). Использование методов установления и соответствия не требовалось.

Следы крови. Для изучения сохранности ДНК в следах крови исследовали различные экспериментальные образцы: пятна, изготовленные в лаборатории из   крови  живых   лиц   (предмет­носитель:   синтетический   материал,   бумага, марля),  следы  трупной  крови,  кровь  живых  лиц,  искусственно  подвергшуюся воздействию пероксида водорода (H2O2). Изымали фрагмент ткани размером 3*3   мм.   Сделанные   наблюдения   позволили   выявить   характер   изменения состояния ДНК в различных типах образцов в зависимости от сроков, предмет­носителя и  действия агрессивных веществ.

Образцы волос. Исследовались волосы живых лиц, содержащие луковицу. На один опыт использовали 5 волос.

Следы   спермы.     Для   изучения   сохранности   ДНК   в   следах   спермы исследовали   экспериментальные   образцы   месячной   давности.   Предмет­носитель:  хлопчатобумажная  ткань.  Изымали  фрагмент  ткани  размером  3*3 мм.

Следы   слюны.   Для   изучения   сохранности   ДНК   в   следах   слюны исследовали   окурки   сигарет   и  жевательную   резинку.  Изымали  фрагмент материала размером 3*3 мм.

Ногтевые   пластины.   Для   изучения   сохранности   ДНК   в   этом биологическом материале изымали по три свежесрезанных ногтевых пластины на опыт.

Костный материал. Для изучения сохранности ДНК в костном материале исследовали образцы, подвергшиеся гнилостным изменениям.

Мышечный   материал.   Для   изучения   сохранности   ДНК   в   этом биологическом   материале   исследовали   замороженные   образцы   месячной давности. Выделение ДНК проводили по  методикам в Табл.1

Оценку  количества  выделенной  ДНК  проводили  методом  полимеразной цепной   реакции   в   реальном   времени   (Real  Time  PCR)   на   приборе   7500 RealTime  PCR  System  фирмы  Applied  Biosystems,  США   с   использованием коммерческого   набора  Quantifiler®   Human   DNA   Quantification   Kits   фирмы Promega, США.

14

Таблица 1Объекты исследования и методики выделения ДНК Биологические следы

Предмет­носитель Методика выделения ДНК

кровь

синтетика DNA IQ System, Chelex 100синтетика+перекись DNA IQ System, Chelex 100буамга DNA IQ System, Chelex 100бумага+перекись DNA IQ System, Chelex 100марля DNA IQ System, Chelex 100марля+перекись DNA IQ System, Chelex 100

кровь трупная марля DNA IQ System, Chelex 100сперма марля DNA IQ System, Chelex 100волосы DNA IQ System, Chelex 100ногти DNA IQ System, Chelex 100, фенолмышцы фенолкость фенол

слюнаокурок DNA IQ System, Chelex 100жевательная резинка DNA IQ System, Chelex 100

пот синтетика DNA IQ System, Chelex 100

Определив   концентрацию,   проводили   амплификацию   изучаемых полиморфных   последовательностей   ДНК   методом   ПЦР   на   приборе  PCR System  9700  GeneAmp  фирмы  Applied  Biosystems  с   использование коммерческого набора PowerPlex 1.2 System. Определение концентрации ДНК основано   на   использовании   специального   зонда  TaqMan.   Для   ПЦР использовали буфер, содержащий 67 mM трис­HCl, pH 8.8; 16.6 mM сульфата аммония;   0.01%   Tween   20;   0.1  М   2­меркаптоэтанола.  Концентрация   MgCl2 

составляла  1.5­2 mM. Taq­полимеразу  добавляли  из расчета  1 ед. на  25 мкл реакционной   смеси.   Циклы   амплификации:   94оС   ­   4   мин   (начальная денатурация); 94оС ­ 1 мин, 58оС ­ 1 мин, 72оС ­ 1 мин (30 циклов); 72оС ­ 5 мин (конечная ренатурация).

Фракционирование   и   детекцию   продуктов   ПЦР   проводили   в автоматизированной системе (секвенаторе) 3130 Genetic Analyzer фирм Applied Biosystems,  Hitachi,   США.   В   такой   системе   автоматизированы   этапы электрофореза, детекции  флуоресцентно меченых фрагментов ДНК и учета результатов   электрофореза.  Мы   проводили   электрофорез   в   капилляре   в среде  специального  полимера  при  денатурирующих  условиях   (капиллярный электрофорез).

Статистическую   обработку   данных   проводили   с   использованием программного   пакета  Microsoft  Excel  Service  Pack  2.   Статистическая достоверность данных составила 95%.

3.Выводы1.  Метод   выделения  ДНК   с   помощью   коммерческого   набора  DNA  IQ 

System наиболее подходит для выделения ДНК из следов крови на различных предмет­носителях, потожировых следов, волос с луковицей. Этот метод прост в использовании и позволяет получить высокомолекулярный, чистый препарат ДНК. 

2.  Метод  выделения  ДНК  с  помощью  коммерческого  набора  ReadyAmp Genomic  DNA  Purification  System  (Chelex  100)  позволяет  получать   хороший 

15

выход   ДНК   из   следов   слюны.   Этот   подход  пригоден   для   экспертного применения,   прост,   безопасен,   позволяет   проводить   эффективную экстракцию ДНК из различного биологического материала. 

3. Фенол­хлороформная  экстракция  незаменима при выделении ДНК из костного и мышечного материала. К недостаткам метода нужно отнести очень высокую токсичность и длительность процедуры выделения.

4.  Метод  RT­PCR  позволяет   точно   определить   концентрации  ДНК   в исследуемых   образцах   и   дать   заключение   об   уровне   деградации  ДНК   в объекте.

16

УМНИКТРИТИКАЛЕ­КУЛЬТУРА БУДУЩЕГО.Автор: Ахмадиева А.А.Руководитель: Сафин Р.И.Казанский государственный аграраный университетTRITICALE IS A CULTURE FUTUREAkhmadieva A.A., Safin R.I.The Kazan state agrarian university

Основой   сельскохозяйственного   производства   является   зерновое хозяйство,   от   успешного   развития   которого   зависит   обеспечение   все возрастающие   потребностей   населения   в   продуктах   питания   и животноводства в полноценных концентрированных кормах.

Основной   путь   наращивания   производства   зерна   ­   повсеместное повышение   урожайности   зерновых   культур   путем   интенсификации   всех процессов  возделывания,  уборки,  хранения  и  семеноводства,  рационального использования органических и минеральных удобрений, широкой мелиорации земель,  внедрения  в  производство  высокоурожайных  сортов  и  гибридов  на основе новейших достижений сельскохозяйственной науки.

Важную   роль   в   увеличении   производства   зерна   и   повышении   его качества   призвана   сыграть   селекция.   Традиционно   производство   зерна   в нашей   стране   и   за   рубежом   основывается   на   выращивании     древнейших зерновых   культур­   пшеницы,   ржи,   ячменя,   риса,   кукурузы,   овса   и   др. Совершенствование   этих   растений   методами   селекции   позволило   создать новые   высокопродуктивные   сорта   и   гибриды,   способные   в   разнообразных почвенно­климатических условиях давать высокие и стабильные урожаи.[1]

Крупнейшим открытием генетики и селекции последних десятилетий является создание новой  зерновой культуры – тритикале­ межродового гибрида пшеницы и ржи. Раньше тритикале  был термином, известным лишь немногим селекционерам растений и еще меньше зерновым химикам. Сегодня это слово звучит во всех разговорах, когда встречаются технологи и ученые, изучающие пищевые продукты.  

         Синтетическая  культура  тритикале  имеет  сравнительно  короткую историю, но уже успела занять заметное место среди других возделываемых растений.  Мировая  площадь  ее  посевов  более   2  млн.га.  Она  представляет интерес   как   для   прямого   использования   в   сельскохозяйственном   и промышленном  производстве,  так  и  в  качестве  источника  ценных  генов  для селекции  пшеницы.  Кроме  того,  тритикале­  является  удачным  объектом  для изучения генов двух родов в общей генетической среде.

         По  устойчивости  к  неблагоприятным  биотическим  и  абиотическим факторам   среды,   а   также     уровню   урожайности   тритикале   успешно конкурирует  с  пшеницей.  Для  дальнейшего  расширения  посевных  площадей данной   культуры   важно   существенно   улучшить   продовольственные характеристики и зерно. В связи с этим одним из важнейших направлений в селекции   тритикале   стало   создание   сортов,   пригодных   для   производства хлебобулочных изделий.

17

      В России и Татарстане тритикале является новой культурой, поскольку только начинает осваиваться в производстве. Между тем селекционная  работа с этой культурой проводится рядом научно­ исследовательских учреждений, начинается она и у нас в республике. Тритикале­ культура универсальная. Селекция этой культуры имеет три основных направления­ создание сортов на зеленый корм, селекция зернофуражных сортов, получение сортов для хлебопечения. Наиболее перспективным у нас в республике, как и в других странах, считается третье направление, но наибольшие достижения имеются по первым двум.

1.Сечник Л.К.,Сулима Ю.Г.Тритикале/Всесоюз.акад.с.­х.наук им.В,И,Ленина.­М,:Колос,1984.­317с

18

УМНИКПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МАГНИТНЫХ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МИКРОЧАСТИЦ РАЗЛИЧНОЙ МОРФОЛОГИИАвтор: Бикмуллин А. Г.Научный руководитель: Фахруллин Р. Ф., к.б.н., Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаSYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF MAGNETIC INORGANIC MICROPARTICLES WITH DIFFERENT MORPHOLOGYAuthor: Bikmullin A. G.Scientific adviser: Fakhrullin R. F., k.b.s., Kazan State University named V.I. Ulyanov­Lenin

Применение материалов с магнитными свойствами в биохимии позволяет осуществить   эффективное   разделение   биомолекул.   В   связи   с   этим, разработка   микрочастиц   заданной   формы,   обладающих   магнитными свойствами, представляет определённый практический интерес. В наше время учёными   активно   изучается   оксид  железа  Fe3O4  (магнетит),   обладающий свойствами   ферромагнетика,   и   карбонат   кальция   (CaCO3),   пористый полиморфный   биоминерал   с   хорошими   адсорбционными     качествами   по отношению к белкам и полисахаридам.

В данной  работе  мы  решили  объединить  полезные  качества  карбоната кальция и магнетита. В связи с этим нами была поставлена цель ­ получить неорганические   микрокристаллы,   обладающие   магнитными   свойствами,   и изучить их свойства. 

Магнитные  наночастицы  были  получены  методом  преципетации  ионов двухвалентного и трехвалентного железа в присутствии аммиака, обработаны ультразвуком   и   стабилизированы   цитрат­ионами.   Следующим   этапом,   в присутствии     магнитных   наночастиц,   были   синтезированы   микросферы   и кубические микрокристаллы (кальцит) карбоната кальция.

Мы изучили полученные магнитные микрочастицы с помощью светового, поляризационного, электронного сканирующего микроскопов и магнитометра, что   позволило   нам   убедиться   в   кристаллической   структуре   и   магнитных свойствах   микрокристаллов,   рассчитать   средний   размер   и   изучить зависимость магнитных свойств микрочастиц от температуры.

19

                Рис. 1.                                                                  Рис.2.Одиночный микрокристалл карбоната             Одиночный микрокристалл карбонатакальция кубической формы                              кальция сферической формы модифицированный магнетитом                       модифицированный магнетитом

Мы   предполагаем,   что   полученные   нами   микрокристаллы   карбоната кальция,   модифицированные   магнетитом,   могут   быть   использованы   в качестве магнитных  биосорбентов и носителей.

20

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОВ СTLA4 И PTPN22 С РИСКОМ  РАЗВИТИЯ АУТОИММУННОГО ТИРЕОИДИТА СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАНБиктагирова Э.М., Кравцова О.А., Сатарова Л.И., Вагапова Г.Р.Вагапова Г.Р., д.м.н., доцент, заведующая каф. эндокринологииГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия росздрава» г. КазаньASSOCIATION OF CTLA4 AND PTPN22 GENE POLYMORPHISMS WITH AUTOIMMUNE THYROID DISEASE AMONG THE POPULATION OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN Biktagirova E.M., Kravtsova O.A., Sattarova L.I., Vagapova G.R.Vagapova G.R., Dr. Sc. in Medicine, associate professorKazan State Medical Academy of Russian’s health, the department of endocrinology

Проблема   патогенеза   аутоиммунного   тиреоидита   (АИТ)   до   настоящего времени   остается   актуальной,   так   как   вопросы   этиологии,   патогенеза, морфологии,  классификации,  диагностики,  терапии  и  прогноза  заболевания не  получили  еще  своего  окончательного  решения.  АИТ  считается  одним  из наиболее   распространенных   заболеваний  щитовидной  железы   (ЩЖ)   после йоддефицитных   состояний.   Его   частота   среди   взрослого   населения колеблется   от   6   до   11%.  Он   занимает   значительное   место   в   структуре диффузного   нетоксического   зоба   и   является   наиболее   частой   причиной развития  первичного  гипотиреоза.  В  Республике  Татарстан   (РТ)  около  60% лиц   с   эндокринной   патологией   страдает   заболеваниями   ЩЖ   различной природы, из них около 30% женщин после 40 лет и 4,2% детей [1]. Генеалогические и близнецовые исследования показали, что АИТ относится к категории   мультифакторных   патологий   с   наследственной предрасположенностью. В последнее время во многих популяция мира ведутся активные   поиски   по   выявлению   ассоциации   генов­кандидатов   с   риском развития   аутоиммунных   заболеваний   ЩЖ.   Фенотипическое   проявление генетического  полиморфизма  в  значительной  мере  зависит  от  генофонда  и условий   жизни   каждой   конкретной   популяции.   Этим   и   объясняется противоречивость   данных   по   ассоциации   полиморфных   локусов   генов­кандидатов с риском развития АИТ [5].Предполагается,   что   патогенез     заболевания   обусловлен   частичным генетическим   дефектом   иммунной   системы,   а   именно,   генов   главного комплекса   гистосовместимости.   К   генам­кандидатам   риска   развития заболевания,   расположенным   в   данном   кластере,   относятся   и  гены поверхностного   антигена   цитотоксических   Т­   лимфоцитов   (CTLA4)   и протеинтирозинфосфатазы 22 (PTPN22), кодирующие белок­рецептор  CTLA4 и   цитоплазматическую   лимфоидспецифичную   тирозин   фосфатазу соответственно,   основной   функцией   которых   является   ингибирование активации Т­ лимфоцитов [2,4].В  связи  с  вышеизложенным,  целью  данного  исследования  явилось  провести анализ ассоциации полиморфизмов +49 А/G, ­318 С/Т и ­1661 А/G гена CTLA4 и 

21

полиморфного   локуса   1858   С/Т   гена   PTPN22с   риском   развития   АИТ   у населения РТ.Генотипирование  по  полиморфным  локусам  было  проведено  у   298  женщин (больных АИТ ­ 137, контроль – 161 человек). Образцы ДНК были получены из цельной   крови   методом   фенол­хлороформной   экстракции.   Анализ полиморфизмов генов осуществляли методом полимеразной цепной реакции с последующим  рестрикционным  анализом.  Статистическую  обработку  данных проводили с помощью критерия χ2, оценку ассоциаций полиморфизмов генов с помощью расчета относительного риска (ОШ) [3].Анализ  распределения  частот  аллелей  и  генотипов  полиморфных  маркеров +49 А/G, ­318 С/Т и ­1661 А/G  гена  CTLA4 и полиморфного  локуса  1858 С/Т гена PTPN22 показал увеличение доли гомозиготного генотипа GG и аллеля G по полиморфному локусу +49 А/G гена  CTLA4 в группе больных АИТ, а также гетерозиготного   генотипа   A/G   и   аллеля   G   полиморфизма   ­1661  А/G  гена CTLA4   (ОШ)=1,84   ДИ   2,31­1,4   и   1,52   ДИ   2,0­1,1   (соответственно)). Сравнительный  анализ  распределения  частот  сочетаний  генотипов  по  трем полиморфным   локусам   гена  CTLA4  показал,   что  максимальный   риск наблюдается  при  одновременном  присутствии  гетерозиготных  генотипов  по промоторной  области  и гомозиготного  по  полиморфному  аллелю  G  экзонной части  гена   (ОШ=7,87  ДИ   2,03­3,25),  а  сочетание   генотипов  по  нормальным аллелям   гена  обладает  протективным  действием   (ОШ=   0,25  ДИ   1,21­1,89). Тогда  как  полиморфный  вариант   1858С/Т   гена  PTPN22  не  ассоциирован  с риском   развития   АИТ   в   данной   выборке.  Анализ   полиморфных   локусов показал наличие ассоциации генотипа GG по полиморфному локусу ­1661 А/G гена  CTLA4   с   гипотиреозом,   и   увеличение   аллеля   Т   у   больных   с гипертиреозом; увеличение генотипов GG и AG по полиморфизмам +49 А/G и ­1661  А/G  гена  CTLA4  у  лиц  с  повышенным  уровнем  антител  к  тиреоидной пероксидазе и тиреоглобулину. Полученные данные могут служить основой для определения факторов риска развития АИТ у популяции РТ.

ЛИТЕРАТУРА1. Герасимов,  Г.А.  Заболевания  щитовидной  железы   /    Г.А.  Герасимов   // 

Здоровье. – 1999 ­ N9 – С.23­27. 2. Дедов,   И.И.   Диагностика,   лечение   и   профилактика   узловых   форм 

заболеваний  щитовидной  железы   /  И.И.  Дедов,   Е.А.   Трошина,   Г.Ф Александрова.// Руководство для врачей– «Берлин – Хеми АГ», 1999. –– С.96­102 

3. Животский, Л.А. Популяционная биометрия: учебник / Л.А, Животский  – М.: Наука, 1991. –270 С.

4. Magistrelli, G.A., Soluble form of CTLA­4 generated by alternative splicing is expressed  by  nonstimulated  human  T   cells   /  Magistrelli  G.A.,   Jeannin  P., Herbault N. // Eur. J. Immunol. – 1999. –Vol.29 (11). – P. 3596–602 

5. Kendji Sakai, Identification of susceptibility loci for autoimmune thyroid disease to 5q31­q33 and Hashimoto’s thyroiditis to 8q23 – q24 by multipoint affected sib­pair   linkage   analysis   in   Japanese   /   Kendji   Sakai,   Sendji   Shirasawa, Naofumi Ishikawa // Human molecular genetics. – 2001. –Vol.13. – P.1379­1386. 

22

УМНИКРАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АУТОСОМНЫХ STR ­ ЛОКУСОВБирюлина Марина Николаевна, Кравцова Ольга Александровна.к.б.н., ст.преп. каф.биохимии Кравцова Ольга Александровна.Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова­Ленина биолого­почвенный факультет  кафедра биохимииDEVELOPMENT OF MULTIPLEX SYSTEMS OF  AUTOSOMAL  STR ­ LOCIBirjulina Marina Nikolaevna, Kravtsova Olga Aleksandrovna.Cand.Biol.Sci., The assistant to faculty of biochemistry Kravtsova Olga Aleksandrovna.The Kazan state university it V.I.Ul'janova­Lenina Biological faculty Dept. of biochemistry

Исследование   анализа  ДНК   является   составной   частью   и   одним   из наиболее мощных методов исследования биологического материала в судебно­медицинских и криминалистических исследованиях. 

На сегодняшний день наибольшее распространение в криминалистике и судмедэкспертизе   получили   аутосомные  STR  локусы,   технология   изучения которых   сводится   к  одному  методу   –  методу  ПЦР.  За  последние   годы   за рубежом   было   разработано   большое   число   молекулярно­генетических индивидуализирующих   систем   на   основе   микросателлитов.   Компактный диапазон  аллельных  вариантов   (в  пределах  30­50 п.н.)  позволяет  создавать комплексные   диагностические   системы,   обеспечивающие   возможность одновременного  исследования   сразу  нескольких  локусов.  Все   эти   системы имеют   автоматизированные   системы   анализа   получаемых   данных,   что обеспечивает  высокую  пропускную   способность,  а   стандартизация   условий проведения   анализа   повышает   его   эффективность   и   воспроизводимость результатов.

Исследования   аутосомных  STR  локусов   в   популяциях   России представлены   не   так   обширно   и   носят   скорее   прикладной   характер,   чем систематическое изучение их популяционных характеристик. Так,   на данный момент изучено не более 15 микросателлитных и 5 минисателлитных локусов ядерной  ДНК.  Для  разрешения  вопросов  родства  в   современной  практике используются  микросателлитные  STR­локусы,   позволяющие   почти   со   100% достоверностью   определять   близких   родственников.   Известно,   что генотипирование   11  STR­локусов   позволяет   выявить   индивидуума   с уникальным   генотипом  из   1,5х1011  человек,  т.е.  вероятность  встречаемости данного   генотипа   в   популяции   составляет   1   на   150   млрд   человек,   что значительно превышает население земного шара. 

В   связи   с   вышесказанным,   целью   настоящей   работы   является разработка мультиплексных систем на основе 20 аутосомных  STR – локусов.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:1. Оптимизировать   условия   проведения  ПЦР  для   локусов  D1S1677, 

D2S441,D2S1338,  D482364,  D18S51,  D8S1179,  D19,  CSF1PO,  D13S317, генотипирование которые ранее не проводились для популяций РТ.

23

2. Подобрать оптимальную концентрацию содержания трис­HCl и  KCl для каждого из 20 аутосомных STR­локусов.

3. Подобрать   оптимальную   концентрацию  Mg2+  для   каждого   из   20 аутосомных STR­локусов. 

4. На   основе   полученных   данных   разработать   ряд   мультиплексных систем для анализа STR­локусов с детекцией азотнокислым серебром.

 Материалом для генотипирования служила ДНК с концентрацией 173 нг/мл, разведенная до конечной концентрации 86,5 нг/мл, 34,6 нг/мл, 17,3 нг/мл, 8,65 нг/мл и 4,325 нг/мл (разведения 1:2, 1:5, 1:10, 1:20 и 1:40 соответственно), выделенная из современной ДНК, стандартным методом фенол/хлороформной экстракции.

Реакции     генотипирования   проводили   в   10  мкл   реакционной   смеси, содержащей около 4­8 нг тотальной ДНК, 200 мМ каждого dNTP и 1 единицы термостабильной полимеразы Taq­SE в буфере, содержащем 30 мМ трис ­ HCl и 7,5 мМ KCl ­ (х 1,5); 22  мМ трис ­ HCl и 5,5 мМ KCl  ­ (х 1,1), 20 мМ трис ­ HCl и 5,0   мМ  KCl  ­ (х 1,0); 0,1 % Тритон Х­100, производства ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск).

Амплификацию  STR  локусов  проводили  с  использованием  праймеров, условия амплификации для каждой  пары подбирались экспериментально. 

Разделение   продуктов   амплификации   по   аутосомным  STR  локусам проводили с помощью электрофореза в 6­8% полиакриламидном геле. 

В   качестве   маркера   размеров   аллелей   для   каждого   локуса   была использована   «аллельная   лестница»,   содержащая   наиболее   часто встречающиеся аллельные варианты. 

Визуализацию   продуктов   амплификации   проводили   с   помощью окрашивания  бромистым  этидием  и  детекцией  в  УФ­излучении  при   254  нм (ЕtBr­флюоресценция)   и   окрашиванием   гелей   нитратом   серебра   (Budowle, 1991) с последующей фиксацией в 10% глицерине и высушиванием.

В   ходе   данной     работы   были   подобраны   оптимальные   условия проведения ПЦР для каждого из локусов:

1. Оптимизированы   условия   проведения  ПЦР   для   локусов  D1S1677, D2S441,  D2S1338,  D4S82364,  D18S51,  D8S1179,  D19,  CSF,  D13S317. Чувствительность амплификации для   D1S1677,  D2S441,D2S1338,  D4S82364, D18S51,D19  ­ 4,325 нг/мкл, CSF, D13S317,D8S1179  ­ 8,65 нг/мкл

2. Подобрана оптимальная концентрация   содержания трис­HCl и  KCl. Для  TPOX, TH01, CSF1PO, D8S1179, CD4,D2S1338, D5S818 20 mM трис­HCl + 50 mM KCL,  D2S441,LPL, D7S820,FGA,vWA – 22mM  трис­HC  l+ 5,5 mM KCl, D1S1677,D4S82364, D18S51, D3S1358, D19, D16S539, D21S11, D13S317 – 30 mMтрис HCl + 7,5 mM KCl

3. Подобрана  оптимальная  концентрация  Mg2+.  Для,  D8S1179D2S441, D2S1338, LPL, CD4, D3S1358, D1S1677,TPOX, D19 – 1,6 mM, D18S51, D5S818, CSF1PO,   vWA,   TH01,   D13S317   ­2,5   mM,   FGA,   D7S820,D4S82364, D16S539,D21S11 ­2,0 mM.

На основе полученных данных разработали ряд мультиплексных систем для анализа STR­локусов с детекцией азотнокислым серебром.

24

УМНИКАССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ­308A/G ГЕНА TNF­  С РИСКОМΑ  РАЗВИТИЯ АУТОИММУННОГО ТИРЕОИДИТА У НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАНВавилова Е.В., Кравцова О.А.Кравцова О.А., к.б.н., старший преподаватель каф. биохимииКазанский государственный университет им. В.И. Ульянова­Ленина, кафедра биохимииASSOCIATION OF TNF­Α GENE  ­308 A/G POLYMORPHISM WITH AUTOIMMUNE THYROID DISEASE AMONG THE POPULATION OF THE REPUBLIC OF TATARSTANVavilova E.V., Kravtsova O.A. Kravtsova O.A., Ph. D. in Biology, Senior lecturer 

Kazan State University, biological faculty, the department of biochemistryАутоиммунный   тиреоидит   (АИТ)   относится   к   одной   из   важнейших   и 

актуальных проблем современной эндокринологии с недостаточной ясностью патогенетических механизмов, отсутствием объективных и надежных методов диагностики. Данная патология встречается у 1—5% населения разных стран, являясь основной причиной развития спонтанного гипотиреоза. Соотношение числа болеющих мужчин и женщин составляет 1:4—1:10[1].

АИТ относится к категории мультифакторных патологий и развивается в результате комплексного воздействия генетических факторов и окружающей среды. Изучение генетической предрасположенности к данному заболеванию заключается в исследовании генов, продукты которых участвуют в иммунных процессах.   В   первую   очередь,   это   гены   про­   и   противовоспалительных цитокинов,  запускающих  каскад  реакций  аутоиммунной  природы.  Одним  из таких   генов  является   ген  лимфотоксина­   (фактора  некроза  опухолей   ­ ),α α  кодирующий провоспалительный цитокин, участвующий не только в защитных реакциях, но и в процессах деструкции и репарации [4].По  данным  ряда  исследователей,  полиморфизм  локуса  ­308A/G  гена  TNF­α является  маркером  генетической  предрасположенности  к  АИТ  в  различных европейских популяциях [2,3]. В Татарстане исследования по полиморфизму данного локуса ранее не проводились, поэтому целью данного исследования является анализ ассоциации полиморфного локуса ­308A/G гена TNF­ .αГенотипирование   по   полиморфному   локусу   ­308A/G  гена  TNF­ .   былоα  проведено у 284 человек (125 человек больных АИТ и 159 здоровых доноров). Образцы ДНК были получены из цельной крови методом фенол­хлороформной экстракции.   Анализ   полиморфизмов   генов   осуществляли   методом полимеразной   цепной   реакции   с   последующим   ПДРФ­анализом. Статистическую  обработку  данных  проводили  с  помощью  критерия  согласия (χ2),  оценку  ассоциации  полиморфизма   ­  с  помощью  расчета  относительного риска (ОШ) [5].

Анализ  распределения  частот  аллелей  и  генотипов  по  полиморфизму ­308A/G  гена  TNF­   показал  достоверное   увеличение  доли   полиморфногоα  аллеля  A  и  генотипов  A/G,  A/A  в  группе  больных   (ОШ= 1,64; ДИ  0,19­0,14 и ОШ=1,56;   ДИ   2,1­1,3(соответственно)).  Сравнительный   анализ   данного 

25

Рис.2

полиморфного варианта показал наличие ассоциации гомозиготно генотипа А/А у больных с гипертиреозом, а также у лиц с повышенным уровнем антител к тиреоидной пероксидазе и тиреоглобулину.Таким образом, исследования полиморфизма локуса ­308A/G  гена  TNF­α у 

населения  Республики  Татарстан  могут  служить  основой  для  определения факторов риска развития АИТ.

1. Вольт, Р. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы [текст] / Под ред. Браверман Л. И. ­ М.: Медицина, 2000. – С. 140­172. 

2. Wilson   A.G.,   Symons   J.A.,   McDowell   T.L.,   McDevitt   H.O.   Effects   of   a polymorphism   in   the   human   tumor   necrosis   factor   a   promoter   on transcriptional  activation  //   Immunology.  — 1997.  — Vol.  94.  — P. 3195–3199. 

3. Зефирова   Г.С.   Аутоиммунный   треоидит   и   методы  функциональной диагностики  // Проблемы эндокринологии. – 1999. ­ N12. – С. 16­21.

4. Недоспасов   С.А.   Фактор   некроза   опухолей   и   лимфотоксин: молекулярная   генетика,   регуляция   продукции   и   физиологическая роль // Генетика. —2003. — Т. 39, № 2. — С. 207–214. 

5. Животский Л.А. Популяционная биометрия  – М.: Наука, 1991. – С.270.

26

УМНИКМОЛЕКУЛЯРНО­ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.Валеева Алсу Фаритовна*Зиннатов Фарит Фатихович, к.б.н., научный сотрудник каф. биологической и неорганической химии***Казанский Государственный Университет им. В.И. Ульянова­Ленина** ФГОУ ВПО «КГАВМ им. Н. Э. Баумана»MOLECULAR­GENETICS ANALYSIS OF CATTLEValeeva Alsu Faritovna*Zinnatov Farit Fatichovich, Ph.D. in Biology, fellow of Biology and Inorganic Chemistry*Kazan State University** Kazan State Academy of Veterinary Medicine

Лейкоз   крупного   рогатого   скота   занимает   одно   из   важных  мест   в   общей структуре инфекционной патологии сельскохозяйственных животных.Лейкоз   крупного   рогатого   скота   наносит   животноводству   большой экономический  ущерб.  Больные  коровы  становятся  более  восприимчивыми  к инфекционным и незаразным заболеваниям.Целью работы являлось: выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции.В   соответствии   с   целью   были   сформулированы   следующие   задачи исследований:1. Освоение методики выделения ДНК из крови, молока коров.2.  Применение    метода  ПЦР  для   определения   наличия   провирусной  ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в крови;3. Обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в молоке коров на сельскохозяйственных предприятиях РТ.Материал     для   исследований   был   доставлен   из   следующих   районов Республики  Татарстан:  ОО   «Бахетле­Агро»   (Нижнекамский  район),  деревня «Нурлат» (Зеленодольский район), колхоз «Правда» (Высокогорский район).Всего было исследовано 87 проб  крови и молока коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств.Для   исследования   наличия   провирусной   ДНК   вируса   лейкоза   крупного рогатого скота были применены следующие методы:• Выделение и очистка ДНК;• Полимеразная цепная реакция;• Электрофорез (в агарозном и полиакриламидном гелях).В   результате   проведения   ПЦР   в   17   образцах   крови   коров     из   53 исследованных  была  обнаружена  провирусная  ДНК  вируса  лейкоза.  Среди исследованных нами  34 проб  молока в 10 случаях найден вирус лейкоза.Количество   инфицированных   коров   от   общего   числа   диагностированных составило 31%. Из них 53% больных коров имеют инфицированность по РИД.В   связи   с   распространением   вируса   лейкоза   крупного   рогатого   скота представляет интерес изучение вируса иммунодефицита  у больных лейкозом 

27

коров.   Из   литературы   известно,   что   вирус   иммунодефицита   часто сопровождается   ВЛКРС.  Результаты   по   обнаружению   вируса иммунодефицита крупного рогатого скота у больных  лейкозом коров требуют дальнейших  исследований  с  целью  изучения  патогенеза    лейкоза  крупного рогатого скота.

28

УМНИКМЕЖМОЛЕКУЛЯРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ПОЛИМЕРАМИВафина Регина КамилевнаНаучный руководитель:  Фахруллин Равиль Фаридович, к.б.н., старший преподавательКазанский Государственный Университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаINTERMOLECULAR INTERACTION BETWEEN DNA AND POLYMERSVafina Regina KamilevnaScientific Adviser: Dr. Rawil F. Fakhrullin, Ph.D.Kazan State University

АктуальностьОдной   из   важнейших   задач   молекулярной   биологии   является   изучение влияния  различных   соединений   на   свойства   и   структуру  ДНК.  Понимание механизмов   этого   взаимодействия   необходимо   для   разработки   более эффективных   лекарственных   препаратов,   для   конструирования   ДНК­сенсоров, для создания невирусных систем доставки генов. 

Цель работы:Изучение  взаимодействия  ДНК  с  ДНК   ­  связывающими  полимерами   (поли­L­лизин, спермин, спермидин, протамин сульфат,  полиаллиламин гидрохлорид).

Задачи:1. Оценить  взаимодействие  ДНК  с  ДНК   ­  связывающими  полимерами  в 

зависимости от концентрации данных полимеров.2. Выявить характер влияния исследуемых полимеров на связывание  ДНК 

с различными красителями.   Методика

В нашей работе мы оценивали эффективность связывания ДНК с полимерами по  ослаблению  флуоресценции  данных  красителей  после  электрофореза  в агарозном геле.Показатель интенсивности флуоресценции контрольного образца приняли как стопроцентный.  Исходя  из  этого,  вычислили    интенсивности  флуоресценции опытных образцов в относительных единицах.

Выводы:

1.При возрастании концентрации исследуемых полимеров повышается  их эффективность связывания с ДНК. При одних и тех же концентрациях наибольшая   эффективность   связывания   с   ДНК   характерна   для полиаллиламина     гидрохлорида,   наименьшая   –   для   спермина   и спермидина. 

2.В целом, действие полимеров на связывание разных красителей с ДНК имеет общий характер.  

29

УМНИКРАСПРЕДЕЛЕНИЕ  ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ IL­4 И IL­6 В ПОПУЛЯЦИИ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАНГаббасов   1   Р.Т.   , Вавилова1 Е.В., Ризванова2 Ф.Ф., Ризванов1,2 А.А., Кравцова1 

О.А.Научные руководители: А.А. Ризванов, доцент кафедры генетики КГУ биолого­почвенного факультета, к.б.н.; О.А. Кравцова, старший преподаватель кафедры биохимии КГУ, к.б.н.1 ГОУ ВПО Казанский государственный университет2 ГОУ ВПО Росздрава Казанский государственный медицинский университетDISRTRIBUTION FREQUENCY OF IL­4 AND IL­6 CYTKINE GENE POLYMORPHISMS IN THE GENERAL REPUBLIC OF TATARSTAN (RUSSIAN FEDERATION) POPULATIONR.T. Gabbasov, F.F.Rizvanova, E.V. Vavilova, A.A. Rizvanov, O.D. KravtsovaAcademic advisers: Rizvanov A.A., associate professor, Department of Genetics, PhD; O.D. Kravtsova, assistant professor, Department of Biochemistry, PhD.

При борьбе с различными патологиями большое внимание уделяют как разработке  новых  лечебных  технологий,  так  и  поискам  путей  эффективной профилактики и диагностики. В последние годы все большее распространение получает   исследование   генетической   детерминированности   к   различным заболеваниям.

Цитокины   ­   имунномодулирующие   белки   и   гликопротеины, контролирующие  Т­лимфоциты.  Синтез  цитокинов  осуществляют  в  основном макрофагами   и   лимфоцитами.  Связываясь   со   специфичными   рецепторами цитокины   могут     вызвать   активацию   генов,   приводящую   к   митотическому делению клеток, их росту, дифференцировке или апоптозу. Есть данные, что мутации в различных участках генов, кодирующих цитокины, могут приводить к модуляции   синтеза   данных   белков,   что   в   свою   очередь   повышает   риск проявления   того   или   иного   заболевания.   Цитокин  IL­4   служит   ростовым фактором   Т­лимфоцитов.   У   гена,   кодирующего   этот   белок,   известно   три полиморфных   аллеля.  Известно,     что   полиморфизм   ­590  С/Т   в   гене  IL­4 повышает   склонность   организма   к   артриту,   инфаркту   миокарда   и   другим заболеваниям.  Цитокин  IL­6  стимулирует  пролиферацию  Т­лимфоцитов.    У гена,   кодирующего   этот   белок,   известно   девять   полиморфных   аллелей. Полиморфизм   ­174  G/C,  по  некоторым  данным,  увеличивает  риск  сахарного диабета, заболеваний кровеносной ситемы.

Цель работы ­ оценить распределения частот аллелей полиморфизма ­590 С/Т гена IL­4 и полиморфизма ­174 G/C гена IL­6  в популяции Республики Татарстан (РТ).

Материалы и методы: из образцов крови 137 добровольцев   выделили ДНК   с  помощью  фенольной   экстракции.  Определение   генотипа  проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичными праймерами для  аллелей  ­590 С/Т  гена  IL­4 и   ­174  G/C  гена  IL­6. Внутренним  контролем служили гены  drb1 и  hgh. Анализ продуктов ПЦР амплификации проводили в 2%   агарозном   геле   с   окрашиванием   бромистым   этидием.   Результаты 

30

сравнивали   с   данными   международного   проекта  HapMap  по   европейской популяции (ЕП). Статистический анализ проводили методом хи­квадрат.

Результаты и обсуждение. Частоты аллелей С и Т полиморфизма ­590 C/T  гена   IL­4   для   популяций   РТ   и   ЕП   составили   66/34%   и   84/16% соответственно. Частоты аллелей С и G полиморфизма ­174 C/G гена IL­6 для популяций   РТ   и   ЕП   составили   66/34%   и   52/48%   соответсвенно.   Частоты распределения генотипов СС, СТ и ТТ полиморфизма ­590  C/T  гена IL­4 для популяций  РТ  составили   43,8,   42,5  и   11,0%,  а  для  ЕП   –  70,7,  29,5  и   3,4% соответсвенно.  Частота  аллеля  С  полиморфизма   ­590  C/T  гена   IL­4 в  обеих популяциях преобладает над частотой аллеля Т. В тоже время, в популяции РТ частота  аллеля Т  того  же  полиморфизма  значительно  превышает  таковую  в европейской популяции, а частота аллеля С заметно ниже (р< 0,01). Частота аллеля С полиморфизма ­174  C/G  гена IL­6 в популяциях РТ и Европы выше частоты аллеля  G; в популяции РТ частота аллеля С выше, а аллели G ниже, чем в европейской популяции (р< 0,03).

Полученные   данные   могут   быть   использованы   при   исследовании генетической   детерминированности   к   заболеваням     и   антропологических исследованиях.

31

УМНИКРАЗРАБОТКА НОВЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ В КЛЕТКИ ОПУХОЛИГабитова Л.Р. *, Иксанова А.Г. *

Сабиров А.Г. **, к.м.н., Фаттахова А.Н. *, к.б.н., доцент каф.биохимии, Штырлин Ю.Г. *, к.х.н.*Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова­Ленина,ул. Кремлёвская, д.18, г. Казань, 420008, Россия,**Республиканский Клинический Онкологический Диспансер МЗ РТ,Сибирский тракт, 29, г. Казань, 420029, РоссияDEVELOPMENT OF THE DRUG DELIVERY SYSTEM FOR ANTICANCER DRUGS TRANSPORT TO CANCER CELLSGabitova L.R.*, Iksanova A.G.*

Sabirov A.G.**, c.m.s., Fattachova A.N.*, c.m.s., associate professor, Shtyrlin Y.G.*, c.c.s.*Kazan State University named by V.I. Ulyanov­Lenin,Kremlevskaya str. 18, Kazan, 420008, Russia,**Republican Clinical Oncologic Health Centre DH TR,Siberian route 29, Kazan, 420029, Russia 

Одной  из  важнейших  проблем  современной  медицины  остаётся  низкая эффективность  химиотерапии онкологических  заболеваний.  В  этих  условиях всё более очевидной становится необходимость создания новых эффективных систем доставки лекарств в организм, которые позволили бы удлинить время действия  препаратов  на  ткани,  увеличить  их  биодоступность,  обеспечить  их направленный транспорт к очагу патологического процесса и уменьшить дозу и предотвратить побочные действия лекарств на организм. Одним из наиболее перспективных   примеров   систем   контролируемой   доставки   лекарственных средств является класс Плуроников. К сожалению, Плуроники удовлетворяют не всем требованиям, предъявляемым к современным лекарственным формам. Поэтому поиск новых наноструктурных полимерных носителей продолжается.

Представляемый нами полимерный носитель ПЭ­240, является продуктом алкоголятной полимеризации окиси пропилена и образует в водных растворах ассоциаты размером 5.3±0.5 нм. На фоне коммерческих импортных Плуроников полиэфир  ПЭ­240   обладает  рядом   преимуществ:   большей   активностью   по сравнению   с   плурониками,  меньшей   стоимостью   в   3­5   раз.  Полиэфир   в рассматриваемых   концентрациях   не   образует   мицеллы,   следовательно,   не будет вызывать фиброзных образований в организме. 

В  качестве  модельной  системы  для  изучения  действия  полиэфира  как перспективного полимерного носителя мы рассматривали процесс транспорта гидрофобного  флуоресцентного  красителя  родамина  6Ж  в  клетки  дрожжей Rhodotorula  glutinis  в   присутствии   полиэфира   в   динамике.   Наибольшие различия   с   контролем   наблюдались   после   30­и   минутной   инкубации   с флуорофором (рис.1). 

32

30 минут инкубации 60 минут инкубацииА Б В Г

Рис.1.  Флуоресценция  R6G,   поглощенного   клетками   дрожжей:   А,В   – контроль, Б,Г – предварительная инкубация с ПЭ­240

Кроме того, была сделана оценка влияния полиэфира на фоне Плуроника L­61 на скорость поглощения родамина клетками дрожжей после двухчасовой инкубации. В результате было показано, что ПЭ­240 достоверно увеличивает поглощение гидрофобного родамина 6Ж дрожжами с нарушенной клеточной стенкой.  В   то  же   время  L­61   оказался   эффективней   в   случае   интактной клеточной стенки. Плуроник  L­61 является двуфункциональным соединением, содержащим  две  гидроксильные  группы,  в  то  время  как  полиэфир  является полифункциональным   соединением,   что   и   объясняет   процесс   адсорбции полиэфира на полисахаридной капсуле дрожжей. 

Плуроники   используются   в   качестве   систем   доставки   для противоопухолевых препаратов. Это натолкнуло нас на мысль о возможности исследования   противоопухолевого   эффекта   полиэфира.   Работы   в   этой области   мы   начали   с   изучения   внутритканевого   процесса   накопления известного цитостатика рубомицина гидрохлорида опухолью пищевода. Было показано, что полиэфир достоверно увеличивает проникновение рубомицина гидрохлорида   в   опухоль   по   сравнению   с   контрольным   вариантом.  Однако связано   ли   это   с   воздействием   на   мембраны   клеток   опухоли   или   на транспортные системы клеток представляет собой область наших дальнейших исследований.

Кроме   того,   был   проведён   анализ   поглощения   флуоресцентного красителя   родамина   6Ж   в   клетки   опухоли   линии  HeLa  в   присутствии полиэфира.   Было   показано,   что   полиэфир   увеличивает   проникновение флуорофора в опухолевые клетки на 10 минуте инкубации (рис.2). 

А Б

Рис.2. ­  Флуоресценция  R6G, поглощённого опухолевыми клетками после 10 минут инкубации с флуорофором: А – контроль, Б – опыт с ПЭ­240

Таким  образом,  на  сегодняшний  день  показано,  что  полиэфир  ПЭ­240 достоверно увеличивает проницаемость мембран клеток различной этиологии, в том числе, опухолевых, а также опухолевых тканей. 

33

УМНИКМИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОУДОБРЕНИЙ И БИОПЕСТИЦИДОВ Гайфуллина Д.Ф., Панкова А.В. Тазетдинова Д.И. к.б.н.Казанский государственный технический университет им. А.Н. ТуполеваMICROBIAL   PREPARATION   FOR   BIOFERTILIZER   AND   BIOPESTICIDE PRODUCTION Gayfullina D.F., Pankova A.V. Tazetdinova D.I.Kazan State Technical University

Антропогенное воздействие на окружающую среду (токсичные выбросы химических   предприятий,   бесконтрольное   использование   в сельскохозяйственном   производстве   минеральных   удобрений)   приводит   к загрязнению почвы вредными химическими элементами, снижает доступность для растений необходимых питательных веществ. Это в свою очередь ведет к снижению количества и качества сельхозпродукции.

Решением   проблемы   является   использование   наукоемких, ресурсосберегающих, экологически чистых технологий, которые соответствуют основным   требованиям   к   построению   систем   земледелия   –   высокой экономической   эффективности   и   экологической   безопасности.   К   таким современным технологиям относится применение биоудобрений. 

Нами подобраны эффективные агрономически полезные микроорганизмы для получения биоудобрения со свойствами пестицида. Они производят легкоусвояемое дополнительное питание для растений и защищают их от болезней.

Для   производства   биоудобрения   в   промышленных   масштабах необходимо   дешевое   сырье.  Мы   предполагаем   использовать   органические отходы: растительные остатки (например, тепличных хозяйств) и/или куриный помет, который в больших количествах накапливается непосредственно вблизи птицеферм. Места хранения помета часто несанкционированны. Поступающий из   птичников   помет   в   значительных   количествах   содержит   возбудителей инфекционных болезней, в том числе опасных для человека.

Предполагаемое   удобрение   обогащает   почву   основными   элементами питания  (в  доступной  для  растений  форме,  оздоровливает  и  повышает  ее плодородие.   Биоудобрение   повышает   урожайность   овощных,   зерновых   и ягодных   культур   на   15­40%.   Увеличивает   устойчивость   растений   к неблагоприятным факторам  среды  и болезням, ускоряет  созревание  плодов, повышая количество и качество готовой продукции.

Биоудобрение является экологически чистым, нетоксичным, безопасным для человека и животных.

34

ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ БЛАГОРОДНЫХ МЕТАЛЛОВ НА КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК ПОЧКИ СОБАКИ IN VITROГалямутдинова Э. И. Научный руководитель ­ Невзорова Т.А., к. б. н., доцент кафедры биохимииКафедра биохимии, Казанский государственный университетINFLUENCE OF NOBLE METALS NANOPARTICLES ON THE CULTIVATION OF A DOG KIDNEY CELLS IN VITROGALYAMUTDINOVA E. I.Nevzorova T. A., Ph.D., Associate Professor, Department of Biochemistry, KSUKazan state university

Нанотехнологии на сегодняшний день являются одним из приоритетных направлений   развития   науки   и   техники.   Естественные   и   искусственные наночастицы, чьи  размеры  измеряются в  нм,  находят  широкое  применение  в фундаментальной и прикладной науке.

В биологии, медицине все большее значение приобретают наночастицы благородных металлов, которые могут быть использованы в качестве зондов, для   целенаправленной   доставки   лекарственных   препаратов,   покрытия инструментов,  шовных  материалов  и  в  других  целях.  Так   как  наночастицы получают   все   большее   распространение,   при   их   создании   и   расширении возможностей применения, необходимо оценивать их цитотоксичность.

Целью  работы  явилось:  исследование  влияния  золотых  и  серебряных наночастиц на жизнеспособность и метаболизм культуры клеток почки собаки in vitro.

В работе использовались наночастицы, любезно предоставленные к.б.н. Абдуллиным Т.И.:1. серебряные   наночастицы   диаметром   35­50   нм,   полученные восстановлением нитрата серебра цитратом натрия;2. золотые   наночастицы   диаметром   30   и   13   нм,   полученные восстановлением   золотохлористоводородной   кислоты  цитратом  натрия   [Liu, Atwatery еt al., 2006].

Для исследования влияния наночастиц на клетки почки собаки, клетки инкубировали в 96­луночном планшете при в течение 2, 4, 6, суток при 37 °С, 0,5 % СО₂.  К 180 мкл клеток (10 тыс. кл. /лунку), разведенных средой  RPMI­1640/DMEM,   содержащей   10%   эмбриональной   бычьей   сыворотки,  pH=7.4, добавляли наночастицы с различными конечными концентрациями.

Исследование общего количества и количества жизнеспособных клеток исследовали   методом   исключения   трипанового   синего.   Определение количества   потребления   глюкозы   проводили   колориметрическим глюкозооксидазным методом, степень повреждения ДНК оценивали методом флуоресцентной спектрофотомерии.

Многие   наночастицы,   создаваемые   с   последующей   перспективой   их применения   необходимо   проверять   на   цитотоксичность.   Первым   этапом оценки  цитотоксичности  новых  нанопрепаратов  является  их  исследование  в культуре клеток in vitro.

На рис. 1 и 2 представлены графики зависимости общего количества и 

35

образец

количества  жизнеспособных  клеток  после  их  инкубации  с  наночастицами.  В качестве  контроля  использовались  клетки  почки  собаки,  инкубированные  в присутствии H2O, так как наночастицы суспендированы в воде. 

Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность культуры клеток почки собаки

Как  видно  на  рис.  1,  в  целом  к  4  суткам  инкубации  цитотоксичность наночастиц   не   проявляется.   Отмечено   увеличение   количества   клеток, следовательно,   наблюдается   пролиферация   (деление   клеток)   к   4   суткам инкубации при использовании наночастиц с концентрацией от 0,01 до 0,05 нМ.

При использовании концентраций 0,1 – 0,2 нМ к 4 суткам наблюдается рост   и   деление   клеток,   так   как   количество   жизнеспособных   клеток увеличивается.   Таким   образом,   в   концентрации   до   100   нМ   серебряные наночастицы не обладают цитотоксичностью и в концентрации 0,01 – 0,05 нМ приводят к делению клеток почки собаки ко 2 суткам инкубации.

Рис.1.  Общее   количество   и  жизнеспособность   клеток   почки   собаки после инкубации in vitro в присутствии серебряных наночастиц

Влияние наночастиц золота на жизнеспособность культуры клеток почки собакиПри   исследовании   влияния   золотых   наночастиц   на   общее   количество   и жизнеспособность (рис. 2),  было  обнаружено,  что  независимо  от  диаметра,  в концентрации 0,01 нМ приводит к уменьшению количества клеток к 4 суткам инкубации.   В   концентрациях   0,05   –   0,2   нМ   результаты   приближаются   к контрольным значениям. Т.о., золотые наночастицы, независимо от размера, в концентрации  до  0,2  нМ  не  обладают  цитотоксичностью  в  культуре  клеток почки собаки in vitro.

36

образецконтроль 0,01 нМ 0,02 нМ 0,15 нМ 0,2 нМ 0,5 нМ

Общее количество

4­ые сутки инкубации Жизнеспособные клетки

Число клеток, тыс.

Рис.   2  Общее   количество   и  жизнеспособность   клеток   почки   собаки после инкубации in vitro в присутствии золотых наночастиц

При   изучении   потребления   клетками   глюкозы   из   среды   было обнаружено, что в контрольных образцах к 6 суткам наблюдается повышение концентрации   глюкозы   в   среде,   что  может   быть   связано   с   потреблением клетками  моносахарида   к   4   суткам,   что   является   стимулом   для   процесса глюконеогенеза  и  поддержанию  клетками  глюкозы  в  среде  на  оптимальном уровне. Влияние наночастиц серебра на метаболизм клеток почки собаки

Серебряные  наночастицы  в  концентрациях  0,01  – 0,05  нМ  к  4  суткам инкубации,  приводят  к  выделению  клетками   глюкозы  в  питательную  среду, которую  к  6 суткам  потребляют. Обнаруженный  факт  может  быть объяснен интенсивным делением клеток ко 2, 4 суткам инкубации (рис.1). Влияние золотых нч на метаболизм культуры клеток почки собаки in vitro

Потребление   глюкозы   из   питательной   среды   не   отличается   от контрольных  значений.  Можно  предположить,  что  золотые  наночастицы  не влияют на метаболизм клеток почки собаки. Влияние   серебряных   наночастиц   на   уровень   и   характер   повреждения ДНК клеток

Интеркалирующий   краситель   этидий   бромид   (ЭБ)   связывается   с двухнитевыми   молекулами   ДНК   и   РНК,   встраиваясь   между   парами нуклеотидов.  По   увеличению  флуоресценции   комплекса  ЭБ   –  ДНК  можно судить о наличии разрывов в молекулах ДНК.

При использовании серебряных наночастиц с концентрацией 0,01 – 0,1 нМ   интенсивность  флуоресценции   незначительно   повышается   к   4   суткам инкубации.  При  использовании   0,15   –   100  нМ  ко   2  суткам  флуоресценция значительно   повышается,   а   к   6   падает,   что   связано   со   значительными конформационными изменениями ДНК.

Полученные   данные   свидетельствуют   о   том,   что   серебряные наночастицы в концентрациях 0,01 – 100 нМ не приводят к гибели клеток, но, вероятно,   проникают   в   клетки,   вмешиваются   в   их   метаболизм   и 

37

4­ые сутки инкубацииЖизнеспособные клетки

Число клеток , тыс.

Общее количество

контроль 0,01нМ 0,02 нМ 0,1 нМ 0,15 нМ 0,2 нМобразец

пролиферацию.Влияние  золотых  наночастиц  на  уровень  и  характер  повреждения  ДНК клеток почки собаки in vitro

Интенсивность   флуоресценции   комплекса   ЭБ­ДНК   при   инкубации золотых   наночастиц   с   клетками   почки   собаки   увеличивается   к   4   суткам инкубации и, в основном, уменьшается к 6.

Отмечено, что изменение интенсивности флуоресценции не зависит от диаметра наночастиц, но изменение концентрации приводит к модификациям конформации   ДНК,   так   как   наблюдается   изменение   флуоресценции комплекса ЭБ­ДНК в течение всего времени инкубации клеток почки собаки с золотыми наночастицами. 

Полученные   данные   согласуются   с   литературными:   без цитотоксического   эффекта   серебряные   и   золотые   наночастицы   можно использовать золотые в концентрациях до 250 мкМ, серебряные до 50 мкМ [Li, 2008; Yen et al., 2009].

Литература1. Liu, X. Extinction coefficient of gold nanoparticles with different size and different capping ligands/ Х. Liu, M. Atawer, J. Wang, Q. Huo [Электонный ресурс]. – 2006. – Режим доступа: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=188050802. Yen, H. Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes/ H. Yen, S. Hsu, C. Tsai. [Электронный ресурс]. ­2009. ­ Режим доступа:  http://www3.interscience.wiley.com/journal/122279654/abstract?CRETRY=1&SRETRY=0

38

УМНИКХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО СОСТАВА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ  АУТОИММУНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ.Губайдуллина Л.Р., Абрамова З.И.Научный руководитель: Абрамова З.И., д.б.н., профессорКазанский государственный университет им.Ульянова­Ленина, ул.Кремлевская, 18, г. Казань, 420008, Россия Тел.(843)292­69­77, e­mail: goryanka   ­08@   mail   .  ru   

Serum protein electrophoresis: сharacteristic of disproteinemia during autoimmune diseases, including atopic bronchial asthma (ABA).Gubajdullina L.R., Abramova Z.I., Kazan state university

Summary Diagnostic differentiations are necessary for early prognosis of diseases. In our research   we   detected   early   heavy   of   diseases   people,   suffering   from autoimmune diseases,   including  atopic  bronchial  asthma  (ABA).  We studied high concentration  of   the gamma­globulin   in  blood:  people with  autoimmune disease  have  a  more  positive  charge,   then  people  suffering   from ABA.  We detected similar ethyology of ABA and other autoimmune disease.

Дифференциальная диагностика заболеваний необходима для раннего и точного прогнозирования развития и определения  тяжести заболевания пациента.  Разработка    методов  для  клинической  диагностики  является актуальной   проблемой   современных     медико­биологических исследований. Целью нашей работы явилось определение качественного и количественного белкового состава сыворотки крови больных людей с различными диагнозами и условно здоровых без клинически выявленного диагноза, а также сравнение особенностей белков сыворотки крови при различных аутоиммунных заболеваниях, таких как гипотериоз, системная красная волчанка(СКВ), ревматоидный артрит, тиреоидит. Концентрация белка   может   являться   клинической   характеристикой   при   различных заболеваниях в том числе аутоиммунных. Концентрацию белка измерили с помощью СФ.

зд зд зд зд зд зд зд зд инт. инт.Е280 0,22 0,32 0,31 0,48 0,30 0,29 0,41 0,43 0,45 0,52

инт. инт. инт. инт. л.т. л.т. л.т. л.т. т.т.0,65 0,70 0,41 0,36 0,34 0,31 0,35 0,66 0,28

Табл.1 Сравнение поглощения Е280

39

График1.  Корреляция  между   степенью   тяжести   атопии   и   количеством белка.

C мощью электрофореза в агарозном геле определили, что на начальных этапах   развития   атопической   бронхиальной   астмы(АБА)(интактная стадия)   наблюдается   резкое   увеличение   концентрации   альфа­глобуллинов в 1,8 раза, в то время как при дальнейшем развитии астмы, содержание фракций  альфа2­ и гамма­глобуллинов   падает(в 1,5 раза). При СКВ наблюдалось повышение уровня альфа2­глобуллинов в 1,7 раза. 

Рис.1. Электрофореграмма сыворотки при аутоиммунитете

40

Рис.6. Сравнение электрофореграмм при атопии и аутоиммуннитете

Гамма­глобуллины   сыворотки   крови   больных   аутоиммунными заболеваниями имеют больший положительный заряд (смещены в сторону катода), чем у больных АБА. Повышение альфа2­ и бета­глобулинов как при   АБА,   так   и   при   АИЗ,   позволяет   заключить   что,   этиология   этих заболеваний  сходна.

41

УМНИКТРОМБОЛИТИЧЕСКИЕ И АНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗ У БАЦИЛЛДанилова Ю.В., Рудакова Н.Л., Михайлова Е.О., Маликова Л.А., Шарипова М.Р.Шарипова М.Р., д.б.н., проф.Казанский Государственный Университет им. Ульянова­Ленина, биолого­почвенный факультет, кафедра микробиологииTHROMBOLYTIC AND ANTICOAGULANT PROPERTIES OF BACILLUS PROTEINASEDanilova J.V., Rudakova N.L., Mikhailova E.O., Malikova L.A., Sharipova M.R.Sharipova M.R., Dr.Sc. in Biology, Professor Kazan State Univercity, biology and soil science faculty, department of microbiology 

В   связи   с   тем,   что   ряд   опасных   заболеваний,   таких,   как   инсульты, инфаркты, тромбофлебиты и др. связан с возникновением тромбов, в фокусе современной  медицины  – разработка  новых эффективных  тромболитических препаратов,   в   том   числе  на   основе   ферментов   бактериального происхождения.  Мы  исследовали  способность  сериновых  протеиназ  Bacillus amyloliquefaciens,  B.pumilus  и  B.subtilis  лизировать  предобразованный  тромб (тромболитическую   активность)   и   препятствовать   формированию   тромба (антикоагулянтную активность). 

Тромболитические и антикоагулянтные свойства протеиназ изучали в условиях in vitro на плазме кролика с 3,8% цитратом натрия. Для определения тромболитической активности протеиназы 0,2 мл плазмы смешивали с 0,05 мл тромбина (2 мг/мл) в физиологическом растворе, инкубировали при 37º в течение 5 мин. К образовавшемуся сгустку добавляли 0,1 мл раствора фермента в концентрациях 0,01­1 мг/мл (в контрольную пробирку вносили 0,1 мл физиологического раствора). Отмечали время полного растворения тромба. Для оценки антикоагулянтных свойств протеиназы 0,2 мл плазмы инкубировали при 37 с 0,1 мл раствора фермента в концентрациях 0,1 и 0,25 мг/мл и отмечали время образования тромба в контрольной и опытных пробирках.

Показано,   что   в   высокой   концентрации   (1   мг/мл)   все   исследуемые протеиназы   эффективно   лизировали   тромб.   При   этом   наибольшей активностью   обладала   субтилизиноподобная   протеиназа  B.pumilus:   лизис тромба   происходил   в   течение   70  мин.  Наименьшей   активностью   обладали глутамилэндопептидаза  B.amyloliquefaciens  (лизировала  тромб  за  180 мин)  и металлопротеиназа  B.subtilis    (лизировала   тромб   за   240   мин). Субтилизиноподобная   протеиназа  B.pumilus  лизировала   тромб   даже   в небольших концентрациях; в присутствии раствора фермента в концентрации 0,025мг/мл   тромб   лизировался   за   24   ч.   Все   исследуемые   протеиназы   в концентрациях   0,1,   0,5  и   1  мг/мл  оказывали  выраженное  антикоагулянтное действие:  в  течение   24  ч  инкубации  не  наблюдалось  образование  тромба, тогда как в контрольном варианте он образовывался за 3­5 мин. 

Таким  образом,  сериновые  протеиназы  B.amyloliquefaciens,  B.pumilus  и B.subtilis  обладают тромболитическими и антикоагулянтными свойствами.

42

УМНИКБЕЛКИ­МАРКЁРЫ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТАДойникова А.Н., Тюрин Ю.А.Научный руководитель: Тюрин Ю.А., канд. мед. наук, кафедра биологической химии ГОУ ВПО КГМУ, ст. научн. сотрудник ФГУН КНИИЭМ.Казанский государственный университет, кафедра биохимии; ГОУ  ВПО  Казанский   государственный  медицинский   университет,   кафедра биологической химии; ФГУН КНИИЭМ Роспотребнадзора; PROTEINS AS MARKERS OF ALLERGIC RHINITDoynikova A.N., Turin Iu.A.Scientific collaborator: manager of immunology’s laboratory Turin Iu.A.Kazan State Univercity,  Kazan State Medical University, Kazan scientific research institute of epidemiology and microbiology.

Аллергический   ринит   (АР)   –   заболевание   слизистой   оболочки   носа, характеризующееся   IgE­опосредованным   воспалением   слизистых   оболочек носовой полости. Есть литературные данные о том, что в назальном секрете может   продуцироваться   по   крайней   мере   большая   часть   специфических иммуноглобулинов Е у людей с АР [3]. При активации клеток иммунной системы в  сыворотке  крови  и  биологических  секретах  появляются  белки,  служащие маркерами воспаления, в частности, белки, секретируемые эозинофилами. 

Предполагается, что хитиназы человека выполняют определённую роль в   защите   от   хитин­содержащих   патогенных   организмов   [2].   Хитиназа продуцируется  не Th1, а Th2­клетками – это указывает на возможное участие хитинового   полимера   в   индукции   фермента.   Было   показано,   что   кислая хитиназа не играет роли в продукции Th2 цитокинов, но выступает в качестве медиатора   ИЛ­13,   участвуя   в   Th2­опосредованном   иммунном   ответе. Профилактическое   оральное   введение   хитиновых   частиц   приводило   к значительно меньшему содержанию сывороточного IgE у мышей, подвергнутых действию   аллергена,   по   сравнению   с   контрольной   группой   и   повышению уровеня IgG2a, напротив, был более высоким при использовании микрочастиц, что   также   служит   свидетельством   Th1  опосредованного  иммунного  ответа [7,8]. Подобно кислой хитиназе, индукция синтеза хитиназо­подобных   белков происходит при содействии Th2­клеток и происходит при инвазии гельминтами и действии аллергенов [6]. Индукция человеческого хитиназо­подобного белка YKL­40   также   происходит   при   Th2­опосредованном   иммунном   ответе   [4]. Образование  YKL­40 у  человека  наблюдается  при  астме.  Уровень  YKL­40 в сыворотке крови и тканях лёгких больных астмой выше, чем у здоровых людей. Концентрация YKL­40 в сыворотке и субэпителиальном слое лёгких зависит от степени тяжести заболевания и максимальна при тяжёлой форме болезни.

Повышенное   содержание   гемоглобина   является   также   одним   из характерных   симптомов   обострения   персистирующего   АР,   отражающий тяжесть клинического течения [1]. Основной механизм появления свободного гемоглобина в назальном секрете – экссудация и трансэпителиальный перенос его   из   плазмы   крови   вследствие   повышенной   проницаемости   сосудов, нарастания отечности и рыхлости слизистой оболочки. Именно этот механизм 

43

действует   при   аллергическом   воспалении,   когда   свободный   гемоглобин накапливается  в  назальном  секрете  под  влиянием   гистамина,  брадикинина, хемокинов и иммунных комплексов на эндотелии капилляров [1].Цель работы: Определить   содержание   некоторых   белков   –   «маркеров»   воспаления   и нарушения целостности слизистой в назальном секрете при различных формах аллергического ринита (АР).Задачи:1. Определить концентрацию общего белка назального секрета.2. Провести   оценку   содержания   гемоглобина   в   назальных   секретах больных аллергическим ринитом и в норме (мкг/мкг общего белка).3. Определить  концентрацию  хитиназо­подобного  белка  YKL­40 (в  нг/мкг белка   назального   секрета)   и   его   диагностическую   значимость   у   больных аллергическим ринитом.Методы исследования:1. Определение низких концентраций гемоглобина бензидиновым методом с   использованием   в   качестве   окислителя  H2O2  (0,03%).   Готовили   2   мл. ацетатного  буфера   (0,01М),  1  мл.  раствора  бензидина   (0,1%) и  1мл  H2O2.  В течение 1­2 минут вносили 20 мкл гемоглобина  регистрировали результаты на спектрофотометре. В контрольной пробе вместо гемоглобина вносили воду. 2. Определение общего количества белка в назальном секрете (мкг/мл) по методу   Бредфорда.   Использовался   краситель   Кумасси  G­250   ярко­синий, способный по­разному связываться с сульфогруппами и аминогруппами белка. В качестве калибратора применялся БСА человека с концентрацией 0,5 мг/мл. В исследуемых образцах содержалось 200 мкл среды 199М, 1300 мкл   dH2O и 1500мкл реактива Бредфорда.3. Определение хитиназо­подобного белка в назальном секрете проводили количественным  иммуноферментным  анализом   (тест   система   Metra   YLK­40, Qudel, USA).4. Статистическая  обработка  данных  осуществлялась  непараметрическим анализом с использованием критерия Манн­Уитни.Результаты:

Используя критерий Манна­Уитни, подтвердили, что  общее количество белка в назальном секрете у больных АР достоверно выше, чем   у здоровых людей. Uф<Uкр (Uф=16, Uкр=35, n1=10, n2=13).

44

637

393

0

100

200

300

400500

600

700

800

900

Общее количество белка вназальном секрете

АР Контроль

Получены   данные   о   том,   что   уровень   свободного   гемоглобина   в назальном секрете не достоверно превышает норму  в несколько раз.

Было   показано   увеличение   концентрации   хитиназо­подобного   белка YKL­40  в  назальном  секрете  при  АР  по  сравнению  со  здоровыми  людьми. Данные  различия  между   группами   сравнения   были  проверены   с   помощью критерия Манна­Уитни (Uф<Uкр, n1=n2=8, Uф=1, Uкр=9 ).

88,63

21,63

0

20

40

60

80

100

120

140

Количество YKL­40 в назальном секрете

АР контроль

Выводы:В   работе   показана   диагностическая   значимость   определения 

концентрации  общего  и  хитиназо­подобного  белка  в  назальном  секрете  при аллергическом  рините  у  пациентов,  как  младшей,  так  и  старшей  возрастной групп.

Список литературы:1) Кочетова  Ю.И.,  Мац  А.Н.,  Мокроносова  М.А.  Свободный  гемоглобин  в назальном   секрете   как   диагностический   маркер   аллергического   ринита. Российский Аллергологический Журнал, 2009.2) Куликов   С.Н.,   Долбин   Д.А.,   Тюрин   Ю.А.   Хитин   и   хитиназы   при аллергических реакциях. Российский Аллергологический Журнал, 2008.

45

3) A. KleinJan, J.G. Vinke, L.W.F.M. Severijnen, W.J. Fokkens. Local production and detection of (specific) IgE in nasal B­cells and plasma cells of allergic rhinitis patients. European Respiratory Journal 2000, v.15, p.491­497.4) Lee C.G., Homer R.J., Lee G.R., Flavell R.A., Elias J.A. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007. V.175. A.253.5) Reese T.A.,  Liang H.E.,  Tager  A.M.,  et  al.  Chitin   induces accumulation   in tissue of innate immune cells assotiated with allergy. Nature, 2007, v. 447, p. 92­96.6) Shibata Y., Foster L.A., Bradfield J.F., Myrvik Q.N. Oral administration of chitin down­regulates  serum  IgE  levels  and   lung  eosinophilia   in   the  allergic  mouse.   J. Immunol., 2000, v. 164, p. 1314­1321.7) Shibata Y., Honda I., Justice J.P., et al. Th1 adjuvant N­acetyl­D­glucosamine polymer   up­regulates   Th1   immunity   but   down­regulates   Th2   immunity   against   a mycobacterial protein (MPB­59) in interleukin­10­knockout and wild­type mice. Infect. Immun., 2001, v. 69, p. 6123­6130.

46

УМНИККИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ДВУХ БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ КОРНЕЙ TRITICUM AESTIVUM L.Автор: Ю. А. Егоркина, КГУНауч.рук. к.б.н., н.с. А. В. ЧасовКИББ КазНЦ РАНKINETICS   OF   CO­OXIDATION   OF   THE   TWO   RAPIDLY   OXIDIZED  SUBSTRATES 

EXTRACELLULAR PEROXIDASE ROOTS OF TRITICUM AESTIVUM L.Author: Y. А. Egorkina, KSU Scientific instructor c.b.s., s.c. А. V. ChasovKIBB KazSC RАS

Животные   и   растения   испытывают   на   себе   влияние   различных антропогенных  факторов  и  экстремальных  воздействий  окружающей  среды. Важной   проблемой   в   физиологии   растений   является   их   устойчивость   к различным   стрессовым   условиям.   В   настоящее   время   установлено,   что действие   любого   стрессового   фактора   сопровождается   образованием активных   форм   кислорода   (АФК,   супероксид   анион,   гидроксил   анион, перекись   водорода),   которые   повреждают   белки,   нуклеиновые   кислоты, липиды мембран и приводят к гибели клетки. Проводимые нами исследования посвящены экстраклеточному раствору, так как высвобождение пероксидазы с клеточной поверхности имеет функциональное значение в плане устойчивости растений   к   стрессору.   Дальнейшие   исследования   помогут   нам   понять механизм этого процесса. Основной упор в нашей работе сделан на изучение кинетики окисления субстратов экстраклеточной пероксидазы. Целью работы является  кинетический   анализ   совместного   окисления   бензидина   и  о­дианизидина экстраклеточной пероксидазой корней проростков пшеницы.Задача   исследования   ­   исследовать   кинетику   окисления  о­дианизидина 

экстраклеточной пероксидазой при различных концентрациях бензидина.В   качестве   объекта   исследования   были   использованы   проростки 

яровой   пшеницы   сорта   Люба   (Triticum  aestivum  L.).   В   экспериментах проростки   выращивали   на   растворе  CaCl2  0,25   мМ   (без   доведения  pH)   в течение пяти дней. Такая методика позволяет избежать анаэробиоза, так как корни стелются на поверхности марли, не погружаясь полностью в воду или соответствующий раствор, закрепляются в ней, не испытывают недостатка во влаге и воздухе. Кроме того, при подготовке к опыту растения с корнями легко извлекается   из   марли   без   повреждений   и   разрывов.  Все   реактивы, использованные  для  инкубации  корней,  готовили  на  растворе  CaCl2  0,25 мМ. Отсеченные корни проростков помещали в бюксы с 3,5 мл раствора CaCl2 и инкубировали при температуре +30 C с умеренным встряхиванием в Shaker­357   (ПНР).   Время   инкубации   рассчитывалось   от   момента   помещения отсеченных   корней   в  CaCl2  до  момента  извлечения   отсеченных   корней  из раствора  CaCl2.   Время   инкубации   составляло   1   ч.   Для   обнаружения активности   пероксидазы   пользуются   приготовленным   раствором  о–дианизидина   и   бензидина.   Метод   определения   активности   пероксидазы 

47

основан   на   измерении   оптической   плотности   продукта   реакции, образовавшегося  при  окислении  о­дианизидина  за  исследуемый  промежуток времени.  Кинетику  окисления  двух  субстратов  определяли  в  ЭКР.  Реакцию начинали   внесением  H2О2.   Оптическую   плотность   измеряли   при   460   нм (коэффициент  экстинкции  о­дианизидина 30 мМ­1  х см­1) в момент линейного изменения   скорости   реакции.   Контролем   для   измерений   служила дистиллированная вода.В результате работы   показано, что при низких концентрациях  бензидина 

реакция   окисления  о­дианизидина   активируется;   обнаружено,   что ингибирование   окисления  о­дианизидина   наблюдается   при   высоких концентрациях   бензидина;  показано,   что   максимум   спектра   поглощения продукта окисления бензидина пероксидазой при рН 5,0,t = +25 C и [Н2О2] = 1 мМ составляет 595 нм.

48

УМНИКФИТОСАНИТАРНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОСЕВОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА АМИР В УСЛОВИЯХ ПРЕДКАМСКОЙ ЗОНЫ РТ в 2009 г.Зайцева Т.В., ассистент Аглиева Г.Х.Кадырова Ф.З., д. с. н, член ­ корреспондент АН РТКазанский Государственный аграрный университетPHYTOSANITARY CONDITION OF THE SPRING WHEAT CROPS (SORT AMIR) IN THE BEFORE KAMA RIVER AREA IN THE REPUBLIC OF TATARSTAN IN 2009Zaytseva T.V., ass. Aglieva G.H.Kadirova F.Z., d.a. s. member ­ correspondent SA RT Kazan State agrarian university

Яровая  пшеница  −  одна  из  основных  зерновых  культур  в  РТ  с  ценными продовольственными   и   кормовыми   качествами.   Но   валовые   сборы   ее снижаются в связи с потерями от болезней, вредителей и сорных растений. 

Полевые опыты проводились на территории стационарного опытного поля отдела агрохимии и адаптивных технологий ГНУ ТатНИИСХ в 2009 г. Почва − серая   лесная   среднесуглинистая   со   следующими   агрохимическими показателями   пахотного   слоя   (0   ­   22   см):   гумуса   3,26   %;   азота щелочногидролизуемого 84 мг/кг; подвижного фосфора 335,0 мг/кг; обменного калия     92,0   мг/кг;   гидролитическая   кислотность   3,63   ммоль/100   г,   сумма поглощенных  оснований  14,75  ммоль/100  г  почвы.  Предшественник   ­  озимая рожь,  основная  обработка  почвы   –  рыхление  на   глубину   14­15   см.  Общая площадь   опыта   15120   кв.  м,   учетная   площадь  делянки   60   кв.  м,   площадь защитных  полос   7560  кв.м.  Повторность  в  опыте   трехкратная.  Размещение делянок  −  рендомизированное.  До  посева  было  произведено  боронование  в два   следа,   предпосевная   культивация.  Предпосевное   внесение   удобрений проводилось   поделяночно   вручную.  Протравливание   семян   осуществлялось вручную  препаратом  Тебу   60,МЭ   (0,5  л/т).  Посев  был  произведен   9.05.2009 сеялкой СЗ ­ 3,6 . В фазе кущения проводилось   однократное опрыскивание баковой смесью гербицидов: Секатор, ВДГ (0,15 кг/га) + Пума ­ Супер 7.5,ЭМВ (0,6 л/га).

Учет   вредителей  проводили   с  помощью  наложения  рамок   50х50   см  и путем осмотра колосьев, болезни учитывались на 21 делянке по 4 растения с каждой,   сорные   растения   −   наложением   рамки   50х50   см   в   4   −   кратной повторности. Далее были выведены средние показатели по опыту. 

В   2009  году  на  посевах  яровой  пшеницы  наибольшее  распространение имели полосатая хлебная блошка и пшеничный трипс (таблица 1). 

Таблица 1Количество   вредителей   на   посевах   яровой   пшеницы   сорта   Амир 

(ТатНИИСХ 2009 г.)

Название вредителя

Полосатая   хлебная блошка

Пшеничный  трипс

Злаковая тля

49

Численность на 1 м2 (колос) 

55,2 14,2 1

ЭПВ 25 10 10

Как видно из таблицы 1 численность полосатой хлебной блошки в фазу кущения культуры превысила ЭПВ, численность пшеничного трипса на 1 колос в  фазу  конца  выхода  в  трубку    также  была  выше  ЭПВ,  а  численность  же злаковой тли не превысила пороговой. 

Таблица 2Учет болезней на посевах яровой пшеницы сорта Амир (ТатНИИСХ 2009 

г.)

Название болезни

Настоящая мучнистая  роса (Erysiphe graminis   f. sp.tritici Em.)

Бурая листовая ржавчина (Puccinia recondita   f. sp.tritici D.M.)

Септориоз листьев (Septoria tritici Desm.)

Распространенность, %

52,5 30,95 57,7

Развитие,% 3,5 0,46 19,5

Как   видно   из   таблицы   2   в  фазу   конца   цветения   культуры   среднее развитие мучнистой росы составило 3,5%, что не превышает ЭПВ (15 ­ 20%), но распространенность болезни на всех вариантах опыта составила 52,5%. Также четко выражено нарастание % пораженности поверхности листа от верхнего яруса листьев к нижнему. Среднее развитие бурой листовой ржавчины (0,46%) не  превысило  ЭПВ   в  фазу  молочной   спелости   (40%).  Распространенность болезни составила в среднем по опыту 30,95%. Среднее развитие септориоза листьев   (19,5%) превысило  ЭПВ,  и  ожидаемые  потери  урожая  составят  5   ­ 20%. Распространенность  болезни  составила  в  среднем по  опыту  57,7% при пороговом  значении  3 −  5 %. Наиболее  сильное  распространение  в  посевах получили настоящая мучнистая роса и септориоз листьев. 

Таким образом, метеоусловия 2009 г, высокий фон минерального питания, завышенные   нормы   высева   способствовали   снижению   эффективности обработок посевов фунгицидами.

Таблица 3Количество сорных растений на посевах яровой пшеницы сорта Амир 

(ТатНИИСХ 2009 г.)Группа   сорных 

растенийОднолетние 

двудольныеМноголетн

ие двудольныеЧисленность  на  1 

м2 до опрыскивания77 16

После  23 5

50

опрыскивания

Как   видно   из   таблицы   3   степень   засоренности   до   опрыскивания однолетними   двудольными   была   сильной   (77  шт.   на     м   2),   многолетними двудольными   ­  очень  сильной   (16 шт.  на    м  2), после  опрыскивания  степень засоренности   однолетними   двудольными   стала   средней   (23  шт.   на     м   2), многолетними двудольными ­ средней (5 шт. на м 2).

Таким   образом,   участок,   отведенный   для   опытов,   характеризовался высокой   степенью   засоренности   как   многолетними,   так   и   малолетними сорными   растениями.   Обработка   посева   гербицидами   способствовала снижению засоренности в 3,3 раза. 

Исходя из результатов исследований, можно сделать следующие выводы: в  условиях  2009 года  наиболее  распространенными  вредителями  на  яровой пшенице являлись пшеничный трипс, полосатая хлебная блошка, злаковая тля; наиболее  распространенным  микозом  был  септориоз  и  настоящая  мучнистая роса; преобладающий тип засорения − однолетний двудольный. 

Для   создания   благоприятных   условий   развития   растений   необходимо: сбалансировать элементы питания растений с учетом почвенного плодородия, нормы высева семян устанавливать с учетом потенциальной кустистости сорта (рекомендованных  норм),  проводить   своевременные   защитные  мероприятия высокоэффективными средствами защиты растений: в фазе всходов − второго листа   посевы   рекомендуется   обработать   инсектицидом,   согласно   «Списка пестицидов   и   агрохимикатов»,   в  фазу   выхода  флагового   листа   −   начала колошения при появлении первых симптомов болезней или заблаговременно − баковой смесью фунгицида и инсектицида.

1. Отчет Зайцевой Т.В. о прохождении производственной практики в ГНУ ТатНИИСХ, 2009 г. с. 4, 9 ­ 15. 

2. Хохряков М.К. Определитель болезней растений. ­ С.­П.:Лань, 2003 г. с.7

51

УМНИКМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ – ЛЬТЕРНАТИВА ПЕСТИЦИДАМ И ХИМИЧЕСКИМ ФУНГИЦИДАМИбатуллина Р. П., Шишкин А. В.ООО НПИ «БИОПРЕПАРАТЫ», г. КазаньBIOPREPARATES – AS THE ALTERNATIVE TO PESTICIDES AND CHEMICAL FUNGICIDESIbatullina R.P., Shishkin A.V.SLL SPI«BIOPREPARATES», Kazan

Как известно, биологизация земледелия и энергоемкость производства продукции  растениеводства  – два  параллельных  взаимосвязанных  процесса. Интенсификация   и   чрезмерное   увлечение   постоянным   наращиванием производства   за   счет   промышленных   средств   и   недооценка   естественных, природных факторов развития агрофитоценоза приводят, в конечном итоге, к ухудшению   экологических   и   экономических   результатов   производства. Современные   технологии   возделывания   сельхозхозяйственных   культур затратны и энергоемки.

Все   большую  популярность   в   мире   получают   идеи   биоорганического земледелия, где применение химических удобрении и пестицидов минимально, либо вовсе не допускается. Важнейшее место в подобных системах земледелия принадлежит микробиологическим препаратам.

Микробиологические  препараты   регулируют   нормальное функционирование  почвенной  и  ризосферной  микрофлоры,  режим  питания растений, защиту растений от болезней и вредителей. Оценка эффективности препаратов   позволила   оценить   роль   микробиологических   препаратов,   их прямые и побочные эффекты.

Для   количественного   определения   микроорганизмов   в   1   г   почвы использовали метод посева на плотные питательные среды. Метод основан на учете выросших колоний на выложенных комочках почвы. При этом исходили из   того,   что   каждая   колония   развивается   из   одной   колониеобразующей единицы   (КОЕ)   или   пропагулы.   В   итоге   получаем   данные   о   количестве жизнеспособных   пропагул   на   1   г   почвы.  Все   микробиологические   посевы проводились  в  3х  повторностях.  Образцы  почвы   (тип  дерново­подзолистая), отобранные  с  полей  ООО  «Яна  тормыш»,  где  выращивается  яровой  ячмень сорта «Нур», Балтасинского района, РТ:

• Образец   1   –     почва,   обработанная  микробиологическим   препаратом «Мизорин», производства ООО НПИ «Биопрепараты»;

• Образец 2 – контроль, почва без обработки «Мизорином»Микробиологические   среды:   среда   Гаузе,   среда   Гетчинсона, 

картофельно­глюкозный   агар   (КГА),   мясо­пептонный   агар   (МПА),   бедная питательная среда («Голодный агар» ­ ГА), среда Чапека, среда Эшби.

В   лабораторных   опытах   для   морфологического   анализа   почвенной микрофлоры использовался метод прямого микроскопирования, а также метод выделения   и   учета   микроорганизмов   путем   высева   образцов   почвы   на 

52

селективные среды. Учет микромицетов в почвенных образцах представлен в таблице 1

Таблица 1

Учет микромицетов в почвенных образцах

микромицетыЧастота встречаемости в почве, %Образец № 1 Образец № 2

р. Penicillium 100 100р. Aspergillus 100 100р. Mucor 47 75р. Alternaria 19 35р. Trichoderma 51 32

Результаты   прямого   микроскопирования   позволили   выявить   наличие мицелиальной стадии микромицетов в почвенном образце № 1, что указывает на активно метаболизирующую фазу развития. В опытном образце № 2 грибы были   представлены   покоящимися  формами.   Учет   микроорганизмов   почвы методом посева на твердые питательные представлен в таблице 2.

Таблица 2

Учет микроорганизмов почвы методом посева на твердые питательные среды

среда

Образец № 1 Образец № 2

Повтор­ность 1

Повтор­ность 2

Повтор­ность 3

Повтор­ность 1

Повтор­ность 2

Повтор­ность 3

МПА

Общее 28,9х105 14,4х105

Из них спорообразующие

13,2х104 6,4х104 17,8х10

432,5х103

44,1х103

27,3х103

КГА(бактерии)

45,7х107

63,5х107

51,0х107

29,9х107

32,4х107

44,7х107

Гаузе(актиномицеты)

4,9х104 12,8х104 3,5х104 73,2х10

485,6х104

76,8х104

Чапека(грибы)

26,9х106

19,8х106

22,7х106

38,2х105

40,9х105

34,7х105

Эшби(р. Azotobacter)

3,9х104 8,4х104 5,5х104 20,7х103

17,3х103

24,7х103

Гетчинсона (целлюлолитики)

51,2х104

37,7х104

45,1х104

87,3х103

69,0х103

71,4х103

ГА 11,2х10 9,3х103 4,9х103 29,4х10 24,1х10 19,2х10

53

(олигокарбофилы)

3 3 3 3

Среди всех видов спорообразующих бактерий в наибольшем количестве выявляются  B.  mesentericus. Это кожисто­складчатые и слизисто­складчатые формы.   Плоско­морщинистые,   диффузные   и   гладкие   формы   выявляются редко.  B.  mesentericus  (кожисто­складчатых   форм)   обладает   сильно выраженными   антагонистическими   свойствами   по   отношению   к   другим споровым   формам   бактерий.  B.  mesentericus,   обнаруженный   в   наших исследованиях,  относится   к  бациллярному  населению,  размножающемуся  в почвах с высоким содержанием азота. Заметное снижение численности этого микроорганизма  свидетельствует  о  снижении  содержания  доступных  форм азота в почве.

Об   активной   минерализации   органических   веществ   в   почве свидетельствует   и   наличие   более   разнообразного   состава   актиномицетов групп Chromogenus, Griseus. Снижение концентрации и обеднение группового состава   актиномицетов   связано   с   угнетением   биологической   активности, ослаблением мобилизации азота в ней.

Наибольшая численность р. Azotobacter в образце почвы № 1 указывает на  наличие  достаточного  количества  влаги,  уровня  pH,  доступного  для  его роста органического вещества, отсутствие грибов­антагонистов. Рассматривая распространение  р.  Azotobacter  в  изучаемых  образцах,  можно  сказать,  что наибольшее количество его было выявлено в образце почвы № 1.

Нами  было  отмечено  снижение  всхожести  семян,  торможение  роста  и развития   проростков   с   различной   степенью   обработанных   почвенным раствором  №  2.  Причинами  накопления  токсических  соединений  могут  быть снижение   влажности   и   биологической   активности,   накопление   продуктов жизнедеятельности  корневой  системы,  как  при  жизни,  так  и  в  процессе  ее разложения,   возрастание   содержания   актиномицетов   и   грибов   – токсинобразователей.

Все   это   свидетельствует   о   значительном   благоприятном   эффекте, который  оказывает  микробиологический  препарат  «Мизорин»,  производства ООО НПИ «Биопрепараты», на структуру и активность почвенного микробного сообщества. Многообразие активных форм микроорганизмов, присутствующих в  образце  почвы  №  1, безусловно,  положительно  влияет  на  качественный  и количественный  состав  почвы,  содержание  в  ней  легкоусвояемых  растением минеральных и органических веществ, гуминовых кислот, кислорода.

54

УМНИКФЕРМЕНТАТИВНЫЕ КАРТЫ КАК НОВЫЙ ПОДХОД В ЛЕЧЕНИИ И ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ АУТОИММУННОГО ХАРАКТЕРАИванова В.В., Храмова А.Ю., Сабирзянова А.З., Рябичко С.С.Невзорова Т.А., к.б.н., доцент кафедры биохимии Казанский Государственный Университет имени В.И. Ульянова­ЛенинаTHE ENZYMATIC CARDS AS THE NEW APPROACH IN TREATMENT AND DIAGNOSTICS OF AUTOIMMUNE DISEASESIvanova V.V., Chramova A.Yu., Sabirzyanova A.Z., Ryabichko S.S.Nevzorova, T.A., PhD, Associate Professor of biochemistry departmentKazan State University named V.I. Ulyanov­Lenin

Энзимодиагностика  заключается   в   постановке  диагноза   заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях  человека   [Goi  G.,  1998]. Энзимодиагностика  развивается  по  двум путям.

Один   путь   –   использование   ферментов   в   качестве   избирательных реагентов   для   открытия   и   количественного   определения   нормальных   или аномальных  химических  веществ  в  сыворотке  крови, моче,  желудочном  соке, клеточных   экстрактах   и   др.   Другой   путь   –   открытие   и   количественное определение   самих  ферментов  в  биологических  жидкостях  при  патологии. Оказалось,  что  ряд  ферментов  появляется  в  сыворотке  крови  при  распаде клеток   (отсюда   их   название   «некротические   ферменты»)   или   их перерождении   в   опухолевые   клетки   [Liao   C.H.,   2009].   Для   диагностики органических   и   функциональных   поражений   органов   и   тканей   широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических   диагностических   тестов,   используемых   в   клинике,   высокой чувствительностью и специфичностью 

Нами предложен новый подход в диагностике и лечении заболеваний, в том   числе   аутоиммунного   характера,   который   заключается   в   составлении ферментативных карт пациентов, наиболее характеризуемых при данном типе заболевания. Преимущество подхода можно продемонстрировать на примере современной   диагностике   атеросклероза,   заболевания   аутоиммунного характера:   при  диагностике  данного   заболевания   пользуются  данными   по содержанию липопротеинов низкой и высокой плотности в плазме крови. В то время   как,   по   данным   литературы   известно,   что   немаловажную   роль   в патогенезе   заболевания   играет   ангиотензин­превращающий   фермент   в регуляции   ренин­ангиотензиновой   системы,   ответственной   за   сохранение сосудистого   тонуса   и,   таким   образом,   являющегося   одним   из   важных показателей  при развитии или возможном  развитии атеросклероза,  а также NO­синтазы и ферменты перекисного окисления липидов. Но активность этих ферментов не учитывается при постановке диагноза.

Известно, что при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ) происходит «сбой» в  системе  распознавания  «своё  – чужое» и  клетки  организма  подвергаются постоянной   атаке   клеток   иммунной   системы,   гиперпродукцирующих аутоантитела (ААТ), которые в комплексе с антигеном циркулируют в кровяном 

55

русле,   вызывая   хроническое   воспаление,   характеризующееся   клиническими проявлениями данного заболевания [Nevinsky et al., 2001; Abramov et al., 2002]. Некоторые   ААТ   обладают  ферментативной   активностью   по   отношению   к антигену [Невзорова, 2005] и могут, взаимодействовать с клеткой организма, проникая в нее и вызывая необратимые изменения, приводящие  к патологии [Madaio  et  al.,  1997].  При  атеросклерозе  также  обнаруживается  повышенное содержание ААТ. Но первопричина возникновения АИЗ до сих пор не ясна. 

Существует  предположение,  что  нарушение  ферментативного  баланса клетки и организма в целом, системы клеточной сигнализации может вызывать изменения в системе узнавания собственных клеток и индуцировать появление ААТ [Avalle et аl., 2000].

Для  выявления  изменений  ферментативной    активности  исследуемых клеток  нами  были  проведены  исследования,  с  целью  выявления  корреляции между   изменением   метаболизма,  жизнеспособности   и   конформации  ДНК клеток после инкубации с сыворотками и препаратами ААТ к ДНК, приводящих к клиническим проявлениям паталогии. 

Известно,  что  при  АИЗ,  таком  как  системная  красная  волчанка   (СКВ) наиболее часто поражаются почки, поэтому в качестве модели использовалась культура  MDCK.  В   зависимости   от   вида   клетки,   т.е.   ее   воспринимающей системы ААТ могут взаимодействовать с клеткой с помощью разных доменов и структурных элементов молекулы. Исследовалось влияние иммунореактивных областей  молекул  антител   класса  IgG  на  жизнеспособность  и  метаболизм клеток   почки   собаки   (Madin  Darby  kidney  cells  ­  MDCK).  В   опытах  in  vitro сравнивались   очищенные   антитела   к  ДНК   сывороток   здоровых  доноров   и больных   системной   красной   волчанкой   (СКВ).   Для   определения иммунореактивности областей молекул антител блокировались вариабельные Fab­   и   константные  Fc­области   (антигеном   –   ДНК   и   стафилококковым протеином А соответственно). 

   Обнаружено,  что  Fab­  и  Fc­области  молекул  ААТ  задействованы  во влиянии   на   жизнеспособность   и   метаболизм  MDCK.   Однако   влияние   их проявляется   по­разному:   блокирование  Fab  –   отменяет   цитотоксический эффект  ААТ,  т.е.   снижает   гибель  клеток  и  в  некоторых  случаях  вызывая пролиферацию,  возможно  благодаря  ингибированию  ДНКазы;  блокирование Fc – приводит к отмене изменения метаболизма, но цитотоксический эффект остается. Таким образом, в зависимости от вида клетки и ААТ задействуются разные регуляторные и в том числе ферментные системы клетки.

  Одним   из   показателей  АИЗ   является   анормальный   нейтрофильный ответ  –повышенная   фагоцитарная   активность,   как   характерная   способность элиминировать чужеродный антиген и повышенное выделение активных форм кислорода.   Исследовалось   влияние   высокоочищенных   аутоантител   к  ДНК класса  IgG сывороток крови здоровых доноров и больных системной красной волчанкой  (СКВ)  на  жизнеспособность  и метаболизм  нейтрофилов  донора  и больного ревматоидным артритом (РА) in vitro. 

Обнаружено, что потребление глюкозы нейтрофилов донора in vitro при добавлении уже низких концентраций ААТ больных СКВ в питательную среду увеличено, относительно их активной гибели, по отношению к контролю. ААТ 

56

больных  СКВ  по  отношению   к  АТ  доноров   заметно  изменяют  метаболизм, увеличивая   потребление   глюкозы   и   выделение   перекиси   водорода,   что возможно   связано   с   дисфункцией   супероксиддисмутазы   и   каталазы   и усиливают   фагоцитарную   активность   нейтрофилов   донора. Жизнеспособность   клеток   после   инкубации   с   антителами   больных   СКВ значительно  снижается,  что  может  быть  связано  с  изменением  акитивности ферментов апоптоза. Влияние препаратов ААТ донора и при активной стадии СКВ   на   нейтрофилы   больного   РА   выражено   слабее,   но   происходит увеличение   продукции   перекиси   водорода,   относительно   нейтрофилов донора, возможно из­за того, что нейтрофилы больного уже активированы. 

Таким   образом,   можно   предположить,   что   какое­либо   значимое изменение   в   клетке,   в   том   числе   и   изменение  ферментативного   баланса, может   индуцировать   избыточный   лейкоцитарный   ответ   и   гиперпродукцию ААТ,   некоторые,   из   которых   обладают  ферментативной   активностью.  Эти абзимы   способны,   взаимодействуя  и  проникая   в  другие   клетки  организма, модулировать  их  метаболизм  через  изменение  активности  внутриклеточных ферментов.   Следовательно,   изменение   ферментативной   и   сигнальной активности   клеток   может   являться   ранним   показателем   развивающейся патологии и на разных этапах патогенеза этот показатель также изменяется.

В работе предлагается новый подход в диагностике и индивидуальном лечении   заболеваний   (в   т.ч.   атеросклероза)   с   использованием ферментативных  карт. Данный  подход позволит  комплексно  и своевременно выявить изменения, происходящие в организме, приводящие к патологии, или изменяющие клиническую картину заболевания.

1. Невзорова,   Т.А.  Исследование  ДНК­гидролизующей   активности антител  к  ДНК   /  Т.А.  Невзорова,  В.Г.  Винтер   //  Ученые  записки  Казанского государственного   университета.   –   2005.   –   Т.147.   –   Книга   2,   Серия «Естественные науки» [Текст]. – С. 136­148.

2. Невинский,   Г.А.   Каталитические   активные   антитела индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний / Г.А. Невинский, Д.В. Семенов, В.Н. Бунева // Журнал Биохимия – 2000а. – Т.65. ­ №11. – С. 1459­1472.

3. Avalle, В. Enzymes and abzymes relationships / В. Avalle, А. Friboulet, D. Thomas // J. Mol. Catal. В: Enzymati. – 2000. – V.10. – Р. 39­45.

4. Madaio,   M.P.   Nuclear   localizing   of   antibodies.   Novel   insights   into protein traslocation and cellular function / M.P. Madaio, K. Yanase, M.H. Foster [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1998. – V.815. – P. 263­266.

5. Goi G.  Lysosomal enzymes in preterm infants with bronchopulmonary dysplasia:  a  potential  diagnostic  marker  /  G.  Goi,  Acta  C.C.,  Bairati  C.   [et  all]   // Volume 278, Issue 1, 1 November 1998, Pages 23­34

6. Liao  C.H.  Diagnostic  performance  of   an  enzyme­linked   immunospot assay for interferon­   γ   in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of    disease  /  C.H.  Liao, C.H.  Chou,  C.C.  Lai,  Y.T.  Huang,  C.K.  Tan,  H.L.  Hsu,  P.R. Hsueh//Journal   of   Infection,  Available   online   9   October   2009

57

УМНИКБЛОКСОПОЛИМЕРЫ ЭТИЛЕН ОКСИДА И ПРОПИЛЕН ОКСИДА В НАНОМЕДИЦИНЕИксанова А.Г., Габитова Л.Р., Малофеева Е.В.Фаттахова А.Н*., к.б.н., доцент; Штырлин Ю.Г.**, к.х.н.Казанский государственный университет

420008, Казань  ул.  Кремлевская,  18.* Каф.  Биохимии,  **Химический  институт  им. А.М. Бутлерова

E­mail: alfijonish@yandex.ru. тел: (843) 2337845

BLOCK   COPOLYMERS   OF   ETHYLENE   OXIDE   AND   PROPYLENE   OXIDE   IN NANOMEDICINE

Iksanova A.G., Gabitova L.R., Malofeeva E.V.Fattakhova A.N*. – PhD in Biology, Asc. Professor, Styrlin Y.G.** – PhD in ChemistryKazan State University

420008, Kazan, 18 Kremlyovskaya St., Department of Biochemistry*, A.M. Butlerov  Institute of Chemistry**

E­mail: alfijonish@yandex.ru. Phone:: (843) 2337845

Многие активные вещества плохо преодолевают такие защитные барьеры организма,  как  межклеточный  жировой  слой  кожи  или  липидные  мембраны клеток.  Накоплению  активных   веществ   в   устойчивых   к  ним   (резистентных) клетках,  таких  как  опухолевые  клетки  и  патогенные  микроорганизмы,  также препятствует  высокая  активность  в  этих  клетках  мембранных  транспортных белков, которые осуществляют выброс веществ из цитоплазмы. Традиционным подходом в данном случае является увеличение дозы вещества в организме. Однако это в свою очередь ведет к увеличению побочных реакций со стороны организма,   которые   порой   превосходят   по   последствиям   положительный терапевтический эффект самого лекарства.

В  связи  с  этим,  перспективным  подходом  к  увеличению  проницаемости биологических   барьеров   для   активных   веществ   является   создание эффективных   и   безопасных   систем   их   внутриклеточного   транспорта. Использование   систем   доставки   (транспортной   системы)   направлено   на уменьшение   неблагоприятных   побочных   эффектов   лекарственных   средств. Несмотря на высокий потенциал эффективности, системы доставки активных веществ   в   органы   и   ткани­мишени   сами   характеризуются   побочными реакциями.  Фармацевтические  компании  Novartis   (Швейцария),  концерн  Ciba (Швейцария)   после   анализа   данных   по   безопасности   различных   систем доставки   приняли  решение   сосредоточиться   на  разработке   лекарственных средств   (ЛС)   с   расщепляемыми   наноносителями,   поскольку   безопасность 

58

стабильных   наночастиц   вызывает   сомнения   и   нужны   дополнительные исследования для ее подтверждения. 

На сегодняшний день инновационными  носителями  для внутриклеточной доставки  активных  веществ  являются  синтетические  полимеры.  "Полимерная терапия" возникла в 90­х годах прошлого века и является одним из наиболее перспективных   подходов   к   лечению   самых   серьезных   заболеваний.   В настоящее   время   большое   количество   "нанолекарств"   применяются   в клинической  практике  или  находятся  на  стадии  клинических  испытаний  для лечения рака, СПИДа, гепатита С, ревматоидного артрита, склероза и др. К настоящему   времени   практически   исчерпан   арсенал   биодеградируемых нетоксичных   полимеров,   а   также  методов   и   подходов   к   конструированию "нанолекарств"   (синтез   монодисперсных   высокомолекулярных   полимеров, сополимеров   или   блок­сополимеров   с   требуемыми   физико­химическими характеристиками).  Поиск  альтернативных   систем  продолжается.  Наряду  с совершенствованием  известных  систем  доставки  разрабатываются  новые  — соединения   полимеров   с   активными   веществами,   полимерные   мицеллы, неорганические наночастицы, твердые липидные наночастицы, фуллерены. 

На сегодняшний день наиболее эффективно использование полимерных носителей   на   основе   блоксополимеров   окиси   этилена   и   окиси   пропилена (Pluronics®  ,  BASF).   Разработка   и   тестирование   Плуроников   ведутся   в исследовательских   группах   в   штате   Невада   (США)   под   руководством профессора Кабанова А.В., ряда исследовательских групп в Москве (МГУ) под руководством  Батраковой  Е.В.,  Пущино   (ФИБХ  РАН)   и  фармацевтической компании   –   патентообладателя   СУПРАТЕК   ФАРМА,   ИНК.   (США).   На сегодняшний день синтезировано свыше 20 Плуроников. Изменяя соотношения этиленоксидных   и   пропиленоксидных   единиц,   разработчики   Плуроников варьируют   их   молекулярный   вес,   гидрофильность   и   липофильность, определяющих   важный   физико­химический   параметр   –   гидрофильно­липофильный   баланс.   В   водных   растворах   при   концентрациях   выше критической   концентрации   мицеллообразования   (ККМ)   эти   сополимеры самоорганизуются   в   мицеллы.   Ядро   мицелл   состоит   из   гидрофобных полипропиленоксидных   блоков.   Гидрофильная   оболочка   из полиэтиленоксидных   цепей   экспонирована   во   внешнюю   водную   среду. Мицеллы Плуроников используются в доставке лекарств, плохо растворимых в воде,   генов   и  др.  При   концентрациях   ниже  ККМ  Плуроники   выступают   в качестве мощных модификаторов биологических ответов и способны повышать чувствительность устойчивых к лекарствам (MDR) опухолевых клеток, а также увеличивать   транспорт   лекарств   через   клеточные   барьеры,   такие   как гематоэнцефалический   барьер.   В   присутствии   плюроников   увеличивается проницаемость   биологических   мембран,   при   этом   их  действие   не   связано напрямую  со  способностью  к  мицеллообразованию,  а  определяется  физико­химическими   параметрами   мономеров.   Токсикологические   исследования показали, что диапазон эффективных доз Плуроников узок – 800­1000 мг/кг. Кроме   того,   мицеллообразующие   вещества   воспринимаются   иммунной системой  организма   как  аллергены  и   способны  провоцировать  фиброзные образования.   Часть   Плуроников   проходит   стадии   доклинических   и клинических испытаний. Общепризнано, что после прохождения этой стадии и 

59

внедрения   в   практику,   лекарственные   препараты   на   их   основе   станут фундаментом наномедицинских препаратов XXI века. 

Переход   на   качественно   новый   конкурентоспособный   уровень  смогут обеспечить   сконструированные   на   принципах   супрамолекулярной   химии многофункциональные   полиэфирполиолы.  Опытная   партия   (600   кг,   2005г.) выпущена   ОАО   «Нижнекамскнефтехим».   Начальный   этап   экспертизы проводится    на  базе  ООО  «НПП  Казан  Юниверсити  Вивариум». Выявляется специфическая  фармакологическая  активность,  изучаются  общетоксические свойства,   устанавливается   мишень   воздействия   в   организме   и   диапазон эффективных  доз.  На  основании  проведенных  исследований  получено,  что тестируемый   в   настоящем   проекте   полиэфир   имеет   ряд   конкурентных преимуществ  в  сравнении  с  Плурониками:  1)  высокая  эффективность,  2)  не накапливается в организме, 3) низкая себестоимость (как минимум в 3 раза).

Оценка   эффективности   доставки   биологически   активных   веществ   в живые   клетки   через   биологические   барьеры   (клеточные   мембраны, окружающие  ткани)  проведена  in  vitro  на  культурах  клеток  и  ткани  опухоли пищевода.   В   качестве   модельных   химически   и   биологически   активных соединений   использовались   новые   сульфаниловые   препараты, противоопухолевые   антибиотики   (доксорубицин   и   рубомицин),   а   также флуоресцентный   краситель.  In  vivo  на   стоковых   мышах   CFW   проведено фармакологическое   тестирование   образцов   мазей   НПВС   на   модели формалинового   отёка.   Введение   1%   ПЭ­240   в   состав   мазей   наружного применения позволяет снизить концентрацию активной субстанции более чем на   порядок,   при   сохранении   противовоспалительной   и   анальгетической активности.

Показано,  что  во  всех  случаях  новый  олигоэфирполиол  обладает  более высокой  эффективностью  доставки  активных  веществ  через  биологические барьеры in vitro и in vivo по сравнению с плюрониками L­61, L­121. При этом, по сравнению   с   последними   олигомерный   носитель   ПЭ­240   является   менее токсичным.

60

УМНИКИЗМЕНЕНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА УГЛЕРОДА ПОД ДЕЙСВТИЕМ ДОНОРА (NO) НИТРОПРУССИДА НАТРИЯИсаева Э.В., Баташева С.Н.,Хамидуллина Л.А.,Саляхова Г.А.В.И.Чиков, д.б.н., профессорКазанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

THE ALTERATION OF PHOTOSYNTHETIC CARBON METABOLISM BY NITRIC OXIDE ( NO) DONOR SODIUM NITROPRUSSID Isaeva E.V.,Batasheva S.N.,Hamidullina L.A.,Salahova G.A.V.I.Chikov, Ph.D.,professorKazan institute of biochemistry and biophysics KSC RAS

Повышенное   нитратное   питание   растений   приводит   к   торможению оттока  ассимилятов  из  листьев,  но  механизм  этого  ингибирования  пока  не установлен,   хотя   известно,   что   он   включает   в   себя   усиление   гидролиза сахарозы  в  апопласте.  Апопласт   –  это  сложное  по  строению  внеклеточное пространство   растения,   содержащее   различные   по   функции   белковые молекулы,   причем   большое   значение   имеет   расположение   этих   молекул относительно друг  друга. Наиболее вероятными мишенями действия нитрата являются апопластная инвертаза и переносчики сахарозы. Мы предположили, что   нитрат   может   действовать   через   образование   оксида   азота   (NO)   – сигнальной   молекулы,   как   у   животных,   так   и   у   растений,   способной модифицировать   белки,   превращая   их   в   нитрозо­производные,   что   в результате может приводить к изменению активности этих белков. 

В  модельных  опытах  показано,  что  при  прямом  введении  в  апопласт растения   солей,   содержащих   нитрат­анион,   наблюдается   уменьшение интенсивности фиксации СО2, транспорта фотоассимилятов из листа, а также изменение   фотосинтетического   метаболизма   углерода   и   ультраструктуры сопровождающих   клеток  флоэмы.  Избыток   невосстановленного   нитрата   в элементах   флоэмы,   в   условиях   избыточного   нитратного   питания,   может приводить к образованию NO. Поэтому  в наших экспериментах мы проверяли, окажет  ли  нитропруссид  натрия     (донор  оксида  азота)  такой  же  эффект  в растении   пшеницы,   как   и   избыточное   нитратное   питание.   Для   оценки воздействия   окиси   азота   на   фотосинтетический   метаболизм   углерода исследовали действие двух концентраций нитропруссида натрия (50 мкМ и 100 мкМ).  Подавление  интенсивности  фотосинтеза   сопровождалось   снижением углеводной  направленности  фотосинтетического  метаболизма  углерода,  что имеет   сходство   с   результатами,   полученными   при   введении   в   растение нитратов (снижение включения 14С в сахарозу и относительное увеличение ­ в неуглеводные  продукты  фотосинтеза,  особенно  в  малат  и  аспартат).  Было сделано  предположение,  что  действие  нитратов  может  быть  опосредовано через  NO­сигнальную систему. И, как показали опыты с нитропруссидом,   эта система может быть тем пусковым механизмом, который включает процессы, приводящие к закупориванию пор в ситовидных трубках (предположительно с помощью  каллозы),  которые  и  приводят  к  торможению  оттока  сахарозы  из 

61

листа.     Запуск   самой  NO­сигнальной   системы   может   происходить   под действием  повышения   концентрации   нитратов   в  апопласте.  Но   существует вероятность того, что  выделение  NO может  быть связано с поранением  при введение   растворов   (введение   растворов   осуществлялось   инсулиновым шприцем   в   под­флаговое   колено   соломины).   Интересными   оказались результаты   и   при   введение   в   соломину   пшеницы  дистиллированной   воды, когда   торможение   оттока   ассимилятов   наблюдалось   на   уровне   влагалища флаг­листа.  Мы  предполагаем,  что  подобный  эффект  может  быть  связан  с повышением   тургорного   давления   в   зоне   влагалища,   более   плотному прилеганию элементов плазмалеммы к клеточной стенке, а следовательно, к деформации переносчиков в проводящей системе, осуществляющих транспорт сахарозы.  Для  проверки  данного  предположения  в  этом  году  сравнивалось действие   нитропруссида   натрия,   нитратов,   дистиллированной   воды   с нативным  растением  и  растением,  которому  был  сделан  укол  иглой  шприца (эффект поранения). 

Первично  полученные  данные,  в  которых  сравнивалась  интенсивность фотосинтеза   в   данных   вариантах,   показали,   что   наибольшее   снижение фотосинтеза наблюдается в варианте с введением нитропруссида натрия, что логично,  поскольку  в  литературе  имеется  множество  данных,  описывающих негативное влияние  NO на  фотосинтез  (закрытие устьиц и др.). Укалывание растения  шприцем  не  оказывало  влияния  на  интенсивность  фотосинтеза  по сравнению   с   контролем.   Кроме   того,   при   укалывании   не   наблюдалось накопления метки во влагалище листа, как при введении воды. 

Дополнительные   сведения   будут   получены   при   сравнении   влияния указанных веществ на углеродный метаболизм, которое ведется в настоящее время.

62

УМНИКЗНАЧЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ.Ковалёва Ю.А., Туаева Н.О.Хасанов А.А., д.м.н., профессор, зав. каф.Кафедра акушерства и гинекологии №1 КГМУ;Алимова Ф.К., д.б.н., профессор, зав. каф. Кафедра биохимии КГУ г. Казань.SIGNIFICANCE CELL­FREE DNA FOR NONINVASIVE PRENATAL DIADNOSIS.Kovaleva J.А., Тuaevа N.О.Hasanov А.А., Dr.Sci.Med., the professor.Departament of Obstetrics and Gynaecology №1, KazanStateMedizinischeUniversity;Alimova F.K., Dr.Sci.Biol., the professor.Department of Biochemistry, КazanStateUniversity, Каzan.       Пренатальная   диагностика   направлена   на   раннее   выявление   и предотвращение   рождения   больного   ребёнка.   В   настоящее   время продолжается   поиск   новых   информативных   неинвазивных   маркёров   для выявления  различных  нарушений  развития  плода.  Одним  из  перспективных направлений в этой области является определение содержания внеклеточной ДНК матери и плода в сыворотке или плазме крови беременных женщин.  Уже проводятся исследования по использованию внеклеточной ДНК (внДНК) в   качестве   прогностического   и   диагностического   критерия   при   различных заболеваниях взрослых (онкологических, аутоиммунных и др.), при генетически детерминированных заболеваниях плода и мониторинге беременных из группы риска   по   преэклампсии   и   преждевременным   родам.   Возможность использования внДНК в медицине обусловлено изменениями её концентрации, структуры   и   размеров   молекул   внДНК,   появлением   различных   мутаций. ВнДНК плода возможно обнаружить в плазме крови беременной женщины, где она  появляется  в  результате  апоптоза  трофобласта,  уже  начиная  с   3   –   5 недель  гестации,  причем  количество  ее  линейно  возрастает  с  увеличением срока   беременности..   При   преэклампсии   обнаружено   почти   5­ти   кратное повышение   внеклеточной   ДНК   плода   в   крови   беременных   женщин, страдающих этим заболеванием по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью. Увеличение как фетальной, так и материнской внДНК соответствовало степени тяжести заболевания, причём концентрация внДНК   плода   возрастает   задолго   до   появления   первых   клинических симптомов   преэклампсии.  Максимальные   концентрации  фетальной   внДНК наблюдаются   перед   родами,   и   часто   резкий   скачок   концентрации   внДНК предвещает   преждевременные   роды.   Не   исключено,   что   наличие апоптотической   ДНК   может   быть   признаком   начавшейся   внутриутробной гипоксии   плода   и   плацентарной   недостаточности,   начальные   признаки которой не выявляются общедоступными клиническими методами.      Целью   нашего   исследования   явилось   определение   количественного соотношения   суммарной   внДНК   во   втором   периоде  родов   в   плазме   крови новорождённых, в плазме крови их матерей и в околоплодных водах.

63

   Были   поставлены   следующие   задачи:   1)  Подобрать   оптимальный  метод выделения   и   определения   концентрации   внДНК   в   плазме   крови   и   в амниотической жидкости.                      2) Определить концентрации внДНК в плазме крови новорожденных детей, их матерей и в амниотической жидкости. 3) Провести сравнительный  и корреляционный  анализ  полученных  данных, с учётом патологии беременности и родов.   Проведено обследование  100 рожениц и их новорожденных. Все  учтенные роды   завершились   рождением  живых   детей   через   естественные   родовые пути. Сразу после рождения плода производилось взятие 5 мл околоплодных вод,   5  мл  венозной   крови  матери  и   5  мл  пуповинной   крови  в   стерильные пробирки  с 1% р­ром ЭДТА­Na2 в  соотношении 9:1. Центрифугирование при комнатной  температуре  с  последующей  заморозкой  жидкой  фракции  при  – 18*С.  Выделение   внДНК   из   подготовленных   образцов   проводилось   двумя методами – модифицированным методом Кибри (с использованием фенола) и с применением   набора   для   выделения  ДНК   из   биопроб   «Литех»   (Россия). Измерение   концентраций   выделенных   внДНК   проводилось   также   двумя методами   –  флуоресцентный   метод   с   использованием   спектрофотометра Hitachi  MPF­4   и   спектрофотометрическим   методом   на   спектрофотометре NanoDROP  1000.   В   зависимости   от   модификации   метода   исследования, значения концентрации внДНК могут значительно различаться, но результаты показали, что во всех случаях показатели в амниотической жидкости близки по   значению   к   показателям   в   плазме   крови   как   матери,   так   и   ребёнка, измеренных     соответствующими   методами.   В   результате   исследования выявлено,  что  оптимальным  методом  оценки  концентрации  внДНК  является выделение   ДНК   с   помощью   набора   «Литех»   и   последующая спектрофотометрия  на  приборе  NanoDROP  1000.  Именно   этот  метод  дает значения   концентраций   внДНК,   наиболее   соответствующие   современным данным   литературы.    При   использовании   этого  метода   получены   средние значения внДНК в плазме новорожденных 9,64нг/мкл, в плазме матерей 9,02нг/мкл, в амниотической жидкости 9,79нг/мкл.   В  результате  проведенного  анализа  выявлена  зависимость  концентрации внДНК   в  плазме   крови   новорожденного   с   внДНК   в   плазме   крови  матери (r=0,659,  р   <   0,1)  и   с   внДНК   в  амниотической  жидкости   (r=0,593,  p  <0,1). Значения   внДНК   значительно   увеличиваются   при   высокой   пренатальной степени риска, оцененной при доношенной беременности в баллах (r=0,318 , p < 0,1); при хронической внутриутробной гипоксии плода (r=0,277 , p <0,1); при гестозе   (r=0,363,  p  <   0,1);   при   хронической   фетоплацентарной недостаточности (r=0,274, p < 0,1); при острой внутриутробной гипоксии плода с   низкой   оценкой   по   Апгар   при   рождении   и   с   наличием   мекония   в околоплодных водах (r=0,413 , p < 0,1).   Проведённые   исследования   показали,   что   околоплодные   воды   и   кровь матери   могут   использоваться   как   доступный   биологический   материал   для исследования внДНК с целью диагностики патологии беременности, родов и оценки   состояния   плода   для   своевременного   назначения   лечения,   что позволит снизить перинатальную заболеваемость.

64

АНАЛИЗ  МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В ГРУППЕ КРЯШЕН РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАНКонюхова Е.В., Нгуен Фыонг Нга, Кравцова О.А., к.б.н., стар. преподаватель каф. биохимииКазанский государственный университет им. В.И. Ульянова­Ленина,биолого­почвенный факультет, кафедра биохимииANALYSIS OF MITOCHONDRIAL GENOME IN KRYASHEN GROUP OF THE REPUBLIC OF TATARSTANKonjuhova E.V., Nguyen Phuong NgaO.A. Kravtsova, Ph.D. in Biology, Senior LecturerKazan State University, biological faculty, the department of biochemistry

Вопросы   происхождения   любого   народа   в   силу   многогранности процесса являются в науке достаточно трудной проблемой. Для решения этой проблем   необходимо   исследовать   множество   признаков   в   большом   числе популяций и этнотерриториальных групп. В качестве таких признаков можно использовать  вариабельность  структуры  биополимеров   (белки,  нуклеиновые кислоты).   Раньше   основное   внимание   уделяли   полиморфным   белкам.  На сегодняшний   день  произошел   подлинный   переворот   в   исследованиях   при появлении нового типа маркеров, основанных на геномных ДНК. Не смотря на то, что  полиморфные  участки ядерной и митохондриальной  ДНК изучены во многих  популяциях  мира,  население  России   (в  частности,  популяция   татар Республики Татарстан) остается малоизученным с точки зрения генетического полиморфизма.   Наиболее   полно,   с   этой   точки   зрения,   исследован полиморфизм   мтДНК,   это   связано   с   особенностями   ее   структурной организации и характером наследования, облегчающими работу.

Целью   данной   работы   являлось   исследование   рестрикционного полиморфизма кодирующей области митохондриальной ДНК в группе кряшен (крещеных татар) популяции татар Республики Татарстан.

В   результате   исследования   было   выявлено   5   полиморфным   сайтов рестрикции, которые принадлежали к основным европеоидным митотипам (H, U,  J,  K,  W).  В  то  же  время,  в  исследованной  группе  крещеных  татар  стоит отметить   отсутствие  митотипов,  распространенных   у   населения  Восточной Европы  и  Азии,  и  входящих  в  макрогруппу  М.  Из  распределения  митотипов можно отметить максимум частоты встречаемости для митотипа H и минимум – для митотипа W.

Отсутствие азиатских митотипов в группе крещеных татар может быть связано   с   тем,   что  история,   культура,   вера  и,   отчасти,   язык   этой   группы являются «конгломератом» двух народностей  и культур: татар  и русских.    В науке   о   крещеных   татарах   (кряшенах)   имеются   самые   противоречивые сведения.  Одни  историки  считают,  что   «кряшены  являются  одной  из   групп казанских татар, отличающихся от них некоторым своеобразием материальной культуры»,   другие   же   полагают,   что   нельзя   относить   кряшен   к этногеографической   группе   татар   и   необходимо   обратить   внимание   на наличие   в   культуре   кряшен   слоя,   связанного   с   христианством   и   русской культурой, что придает специфичность этой группе и подтверждается данным 

65

исследованием.    Однако  для  полного  понимания  процессов  формирования этноса  и  места  этнической   группы  кряшен  в  системе  мировых   генофондов необходимо расширять исследуемую выборку.

66

ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОГРИБКОВЫХ  ПРЕПАРАТОВ НА УРОВЕНЬ КАЛЬЦИЯ В ЦИТОЗОЛЕ ASPERGILLUS AWAMORIКозлова О.В., Абдельрахман А.А., Тазетдинова Д.И.Куприянова­Ашина Ф.Г., д.б.н., проф.; Алимова Ф.К., д.б.н., проф Казанский Государственный  Университет, РоссияINFLUENCE OF ANTIFUNGAL PREPARATION ON CALCIUM LEVEL IN ASPERGILLUS AWAMORI CYTOSOL Kozlova O.V., Abd EL­Rahman A.A., Tazetdinova D.I.Kupriyanova­Ashina F.G.; Alimova F.K.Kazan State University, Russia

Известно,   что   кальций   играет   универсальную   роль   в   качестве мессенджера  при формировании клеточного ответа  на  воздействие внешних условий.  В настоящее  время  большое  внимание  уделяется  изучению  роста  и развития   микромицетов   при   действии   на   них   биопестицидов   (фунгициды) микробного  происхождения,  способных  даже  в  очень  низких  концентрациях вызывать изменения содержания кальция в цитозоле. Качественный скачок  в изучении   кальциевого   обмена   у   микромицетов   был   сделан   с   внедрением метода рекомбинантного экворина. 

Целью   настоящей   работы   было   определение   содержание   кальция методом рекомбинантного экворина в цитозоле клеток Аspergillus awamori 66А с   клонированным   геном   белка   экворина,   любезно   предоставленных лабораторией   исследования   микромицетов   Эдинбургского   университета. Экворин  в  клетке  при  взаимодействии  с  Са2+  распадается  на  апоэкворин  и селентрамид с выделением энергии в виде света голубой части спектра. При этом  интенсивность  люминесценции    пропорциональна  концентрации  Са2+  в цитозоле. 

Мутантный штамм Аspergillus awamori 66А подвергали действию пермеабилизирующего фунгицида ­ Амфотерицина Б, синтезируемого культурой Streptomyces spp. Оказалось, что кальциевый ответ развивался сразу же после действия на клетки больших доз фунгицида и формировался медленнее при низких его концентрациях. Когда колонии микромицета подвергались воздействию амфотерицина в высоких концентрациях, исходный уровень внутриклеточного кальция в гифах не восстанавливался, на основании чего сделано заключение о нарушении гомеостаза Са2+ и, возможно, других ионов в клетках микромицета.

Таким образом, метод рекомбинантного экворина может служить эффективным инструментом при изучении физиологических изменений в гифах микромицетов под действием  противогрибковых препаратов.

67

УМНИККОНСТРУИРОВАНИЕ РЕФЕРЕНС­ПЛАЗМИДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОПИЙНОСТИ ПЛАЗМИД, СОДЕРЖАЩИХ BLA­ГЕНКрякунова Е.В.Научные руководители: к.б.н., доцент Гимадутдинов О.А.,к.б.н., доцент Хамидуллина Р.Г.Казанский государственный университет, биологический факультет, кафедра генетики

CONSTRUCTION OF REFERENCE­PLASMID FOR DETERMINATION OF COPY NUMBER OF PLASMIDS, CONTAINING BLA­GENEKryakounova E.V.Supervisors: Candidate of biological science, docent Gimadutdinow O.A.,Candidate of biological science, docent Khamidullina R.G.Kazan State University, Faculty of Biology, Department of Genetics

В   настоящее   время   одним   из   развивающихся   направлений   генной инженерии  является  создание  векторов  для  экспрессии   генов,  кодирующих биополимеры,   которые   могут   быть   токсичными   для   клеток­хозяев.   Такие векторы   должны   обладать   способностью   как   к   регуляции   экспрессии клонированных   генов,   так   и   способностью   изменять   свою   копийность   в зависимости от состава питательной среды

Одним   из   таких   векторов   является   плазмида  pETcocoCm,   копийность которой  может  меняться в  зависимости от содержания в  среде  углеводного субстрата, инициирующего репликацию с участка oriS или oriV (рис. 1) [Friehs, 2004]. 

Так,  при  наличии  в  питательной  среде  глюкозы  в  клетке  содержится  1 копия   плазмиды,   репликация   которой   инициируется   с   участка   oriS   и контролируется   генами   repE,   parA,   parB  и   parC.  Продукт   гена   araC,  белок­репрессор AraC, блокирует репликацию плазмиды с участка oriV. Увеличение числа  копий  плазмиды  осуществляется  с  помощью  индуктора   –  арабинозы, которая  инактивирует  белок­репрессор  AraC,  что,  в  свою  очередь,  ведет  к 

68

Рис. 1. Генетическая карта плазмиды pETcocoCm.

снятию  блока  репликации  с участка  oriV и экспрессии гена­репликатора trfA. Если   бы   такая   плазмида   содержала   ген   ­лактамазы   (β bla),   для   которого существует   прямая   корреляция   между   дозой   гена   и   количеством синтезируемого клеткой фермента [Ely et  al., 1981], то такая плазмида могла бы   использоваться   в   качестве   референс­плазмиды   для   косвенного определения копийности других плазмид.

Целью настоящей работы явилось создание вектора, который можно было бы использовать в качестве референс­плазмиды для косвенного определения копийности плазмид, содержащих bla­ген.

Для этого мы провели клонирование с помощью ПЦР bla­гена из плазмиды pBSK  в  плазмиду  pETcocoCm  по  сайту  Bstz  121  (рис.2).  В  результате  был получен вектор pETcocoAmpCm, который был трансформирован в клетки E.coli DH5α.

69

ampR (857 bp)

PCR­продукт bla­гена

Рис. 2. Схема получения плазмиды pETcocoAmpCm

PCR

Поскольку  bla­ген  отвечает  за  устойчивость  клеток  к  ампициллину,  мы установили,  что  минимальная  ингибирующая  концентрация  антибиотика  при выращивании рекомбинантных штаммов E.coli DH5  α pETcocoAmpCm на среде с глюкозой   составляла   100   мкг/мл,   а   при   наличии   в   среде   арабинозы   – превышала 2500 мкг/мл. Такое повышение устойчивости клеток к ампициллину можно  объяснить  тем,  что  в  присутствии  арабинозы  происходит  увеличение числа  плазмидных  и,   соответственно,   копий  bla­гена,  находящегося   в   этой плазмиде.

Так   как   устойчивость   к   ампициллину   зависит   от   количества синтезируемого   фермента   ­лактамазы,   то   нами   были   проведеныβ  эксперименты   по   определению   количества   ­лактамазы   в   зависимости   отβ  наличия   различного   углеводного   субстрата   в   среде.   Для   этого   мы использовали   метод   йодометрического   титрования,   который   основан   на способности продуктов гидролиза  ­лактамных антибиотиков восстанавливатьβ  йод   до   йодида,   вызывая   обесцвечивание   йодокрахмального   комплекса [Livermore, 1991]. В результате проведенных экспериментов было установлено, что  количество   ­лактамазы  при  выращивании  клеток  на  среде  с  глюкозойβ  составляет   7   единиц.   При   выращивании   на   среде   с   арабинозой   клетки синтезируют 210 единиц фермента, что соответствует увеличению копийности плазмиды от 1 до 30.

На   основании   полученных   результатов   можно   заключить,   что сконструированный  нами  вектор  можно  использовать  в  качестве  референс­плазмиды для определения числа копий любых плазмид, содержащих ген bla.

Список литературы:1. Friehs. Plasmid Copy Number and Plasmid Stability/ Karl Friehs// Adv Biochem 

Engin / Biotechnol. – 2004. – Vol. 86. – p. 47–82 2. Ely S. Regulation of plasmid DNA synthesis: isolation and characterization of 

copy   number   mutant   of   mini   RG­5   and   mini   F   plasmids   /   S.   Ely,   W.L. Staudenbaner // Mol. Gen. Genet. – 1981. – Vol. 181. – p. 29­35.

3. Livermore D.M. Mechanisms of resistance to  ­lactam antibiotics  //  Scand. J. Infect. Dis. – 1991. – Vol. 78. – p. 7­16.

70

УМНИКИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИЙ РОДА ESCHERICHIA ПОД ДЕЙСТВИЕМ  ДЕЛЬТА­ЭНДОТОКСИНА ВАCILLUS THURINGIENSISКупцова А.А.Научный руководитель д.б.н., профессор Каменек Л.К.Ульяновский государственный университетА SCIENTIFIC LEADER IS A D.B.S.,  PROFESSOR KAMENEK L.K.Kuptsova A.A.Uljanovsk State University

Известно,   что  микроэкологическая   система   организма   ­   очень   сложный филогенетически   сложившийся,  динамичный   комплекс,   включающий   в   себя разнообразные   по   количественному   и   качественному   составу   ассоциации микроорганизмов  и  продукты  их  биохимической  активности   (метаболиты)  в определенных  условиях среды  обитания. Состав  микрофлоры  толстой кишки может   меняться   под   влиянием   различных   факторов   и   неблагоприятных воздействий,   ослабляющих   защитные   механизмы   организма   (стрессы, экстремальные   климатические   условия,   загрязнение   биосферы промышленными   отходами   и   различными   химическими   веществами, инфекционные   заболевания,  болезни  органов  пищеварения,  неполноценное питание, ионизирующая радиация). В развитии дисбактериоза толстой кишки большую   роль   играют   ятрогенные  факторы:   применение   антибиотиков   и сульфаниламидов,   иммунодепрессантов,   стероидных   гормонов, рентгенотерапия, хирургические вмешательства.

  В   последнее   время   особо   остро   встал   вопрос   о   безопасности микробиологических   препаратов,   применяемых   в   сельском   хозяйстве   в качестве средств защиты растений от болезней и вредителей. Известно, что эти   биопрепараты   содержат   как   живые   клетки   и   споры     различных микроорганизмов, так и продукты их метаболизма. При их использовании часть препарата   может   сохраняться   на   растениях   и   попадать   в   желудочно­кишечный тракт человека и животных при поедании. 

В настоящее время основным инструментом микробиологического контроля численности   беспозвоночных   вредителей   растений     является   почвенная бактерия  B.  thuringiensis,  которая    способна    формировать  при  споруляции кристаллические включения   ­ белковые дельта–эндотоксины. 

Целью   нашего   исследования   явилось   установить   действие     дельта­эндотоксина   Ваcillus  thuringiensis  на     состав   микрофлоры   кишечника теплокровных животных и  биохимические свойства бактерий.

 В лабораторном опыте  in vivo использовались белые беспородные мыши в количестве  360 штук.    Дельта­эндотоксин  вводился  животным  перрорально при  кормлении  вместе  с  пищей.  Микроорганизмы  выделялись  из  фекалий  с использованием классических бактериологических методик. Выделение чистой культуры   и   идентификация   проводились   а   аэробных,  анаэробных   и 

71

микроаэрофильных условиях в термостате при температуре 37 °С в течение 24­48 часов.

Для  комплексного  изучения  аэробной  и  анаэробной  микрофлоры  посевы производили   на   отечественные   питательные   среды,  Идентификация выделенных  микроорганизмов  проводилась  на  основании  морфологических, культуральных,   биохимических   и   антигенных   свойств   в   соответствии   с классификацией Берджи (1980).

Статистическую   обработку   результатов   проводили   с   использованием программы  Microsoft  Excel  2000. Статистически  значимыми  считали  различия при доверительном интервале 95% (р <0,05). 

В результате проведенных нами исследований было установлено, что при перроральном введении дельта­эндотоксина в высоких дозах от 50  до 100 мг/ кг веса  препарат подавляет  рост нормальной микрофлоры в толстой кишке  ­ количество  лактобактерий  и  бифидобактерий    на   14  сутки  после      начала эксперимента   уменьшается   (таблица   1).    Различия   в   количестве   лакто­   и бифидобактерий между контрольной и экспериментальной группой при дозе введения токсина 50 мг/мл оказались статистически достоверны, также, как и различия в количестве лактобактерий при дозе токсина 100 мг/мл.

Применение   дельта­эндотоксина   не   оказало   влияния   на   изменение количества   КОЕ   эшерихий   с   нормальной    ферментативной   активностью, результаты   оказались   статистически   не   достоверны,   хотя   и   наблюдалась явная тенденция к ее  снижению. 

 Таблица 1Изменение состава микрофлоры кишечника при перроральном введении дельта­

эндотоксина  В. thuringiensis на 14 сутки  (lgКОЕ/г, M±m)

Виды микроорганизмов

Контрольная группа

Доза дельта­

эндотоксина 50 мг/кг

Контрольная группа

Доза дельта­

эндотоксина 100 мг/кг

Бифидобактерии 7,70±0,26 6,92±0,33* 7,86±0,36 7,21±0,59Лактобактерии 7,34±0,28 6,41±0,35* 6,93±0,34 6,10±0,23*Бактероиды 6,43±0,24 6,16±0,34 6,54±0,53 6,19±0,53Энтерококки 6,46±0,28 6,03±0,41 5,72±0,50 6,17±0,31E. coli с нормальной ферментативной активностью

3,67±0,61 3,28±0,58 3,71±0,79 3,08±0,89

Klebsiella spp. 0,76±0,35 1,93±0,47* 1,41±0,35 2,12±0,41*Citrobacter spp. 0,83±0,43 0,50±0,27 1,08±0,63 1,03±0,70Enterobacter spp. 1,47±0,18 1,75±0,15* 3,88±0,84 5,57±0,54Стафилококки 1,57±0,33 2,31±0,38* 1,11±0,50 1,88±0,50*St. Aureus 0,31±0,22 0,95±0,29* 0,82±0,20 0,36±0,15*Грибы рода Candida 0,62±0,23 1,36±0,34* 1,39±0,28 1,99±0,29*

* ­ различия статистически достоверны, р<0,05, n = 10

   В  результате  размножаются  микробы,  попавшие  извне  или  эндогенные виды, устойчивые к лекарственным препаратам ­ стафилококки, в том числе и самый патогенный  вид  ­  S.aureus, а  также  клебсиэллы  и  дрожжевые  грибы. Различий     в   количестве  КОЕ   бактероидов,   энтерококков  и  цитробактерий 

72

между контрольной и экспериментальной группой при дозах введения токсина как 50, так и 100  мг/мл также не наблюдалось. 

             При инкубации  in  vitro клеток  Escherichia  coli с дельта­эндотоксином наблюдалось  изменение    ферментативной  активностью  кишечных  палочек  в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. 

Таким образом,  высокие дозы токсина, попав в желудочно­кишечный тракт теплокровных животных, могут вызвать дисбиотические нарушения и привести к возникновению различных заболеваний. 

73

УМНИКРАЗРАБОТКА МЕТОДА РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ СЕРДЕЧНО­СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНОГО БИОСЕНСОРАКурбанов Р.А., Шахмаева И.И., Туаева Н.О., Алимова Ф.К.Научный руководитель: к.б.н. Абдуллин Т.И.Казанский государственный университет DEVELOPMENT OF A CELLULAR BIOSENSOR FOR EARLY DIAGNOSTICS OF CARDIOVASCULAR DISEASES Kurbanov R.A., Schakhmaeva I.I., Tuaeva N.O., Alimova F.K Scientific adviser: PhD Abdullin T.I. Kazan State University

В  последние   годы  все  большее  значение  в  диагностике  заболеваний человека  приобретают  методы,  основанные  на  исследовании  живых  клеток человека.  Одним   из   главных   объектов   подобного   исследования   являются циркулирующие  клетки  крови,  эритроциты  и  лейкоциты,  выделение  которых малоинвазивно.   Анализ   форменных   элементов   позволяет   проводить диагностику   многих   социально­значимых   заболеваний,   в   частности, заболеваний  сердечно­сосудистой системы  (инфаркт  миокарда, ишемическая болезнь) [1]. 

В   нашей   лаборатории   разработаны   электрохимические   сенсоры   на основе углеродных нанотрубок, обладающие воспроизводимыми свойствами и проявляющие высокую чувствительность и селективность к биомолекулам [2]. Мы  установили,  что  клетки  млекопитающих  на  поверхности  таких  сенсоров генерируют   специфичный   электрохимический   сигнал,   обусловленный окислением   антиоксидантов   и   энергетических   молекул.   Данный   сигнал, отражающий   энергетический   статус   и   жизнеспособность   клетки,   может изменяться   при   патологии.   Известно,   что   при   сердечно­сосудистых заболеваниях   нарушается   проницаемость   мембран   форменных   элементов крови,   работа   мембранных  ферментов   (АТФазы)   и   изменяется   продукция клетками крови естественных антиоксидантов [1]. 

На   основе   проведенных   исследований   мы   планируем   разработать экспресс­метод   диагностики   по   изменению   электрохимического   сигнала клеток  крови  человека  на  поверхности  сенсора.  Разрабатываемые  методы  и сенсоры позволят диагностировать ряд сердечно­сосудистых заболеваний на ранних стадиях и будут характеризоваться низкой стоимостью и простотой в использовании.  Потенциальные  потребители  разрабатываемой  продукции   – клинико­диагностические   лаборатории   на   базе   медицинских   учреждений разного уровня.1. Терехина,   Н.   А.   Прогностическое   значение   параметров   антиоксидантной защиты  при  инфаркте  миокарда   /  Клиническая  лабораторная  диагностика   //  Н.А. Терехина, О. Г. Горячева, М. А. Зубарев. 2007. – №9. – С.28b­28.2. Абдуллин,   Т.И.   Конструирование   и   тестирование   электродов   на   основе многостенных углеродных нанотрубок / Т.И. Абдуллин, И.И. Никитина, О.В. Бондарь, Д.Г. Ишмухаметова, О.А. Коновалова, М.Х. Салахов // Рос. нанотехнологии. – 2007. – Т.2. – № 7–8. – С.156–160.

74

УМНИКОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КОРНЕЙ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫМавлютова И. И.Часов А. В. к.б.н., н.сКазанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАНDETECTION AND IDENTIFICATION EXTRACELLULAR CATALASE  ACTIVITY OF ROOTS OF WHEAT SPROUTSMavlyutova I. I.Chasov A. V. PhDKazan Institute of biochemistry and biophysics Kazan Scientific Centre Russian Academy of Sciece

Важной проблемой в физиологии растений является их устойчивость к различным   стрессовым   условиям.   Стресс   сопровождается   чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК), что может приводить к гибели организма. Поэтому для нормальной жизнедеятельности клетки важен баланс таких   молекул.   Каталаза   один   из   основных   ферментов   участвующих   в метаболизме АФК. Она является защитным белком – антиоксидантом. 

Сведения   об   активности   каталазы,   регулирующей   содержание перекиси   водорода   на   клеточной   поверхности   в   условиях   стресса,  может внести   существенный   вклад   в   расшифровку   механизмов   адаптационных реакций.

Цель работыОбнаружение   и   идентификация   экстраклеточной   каталазной 

активности корней проростков пшеницы после раневого стресса.Задачи исследования1.   Исследовать   активность   каталазы   в   экстраклеточном   растворе 

после отсечения корней от проростков пшеницы. 2.   Изучить   чувствительность   каталазы   к   ингибиторам   цианистому 

калию и 3­амино­1,2,4­триазолу в реакционной среде.3.  Определить  оптимальное  значение  pH  и  кинетические  параметры 

реакции разложения перекиси водорода экстраклеточной каталазой пшеницы.Методы исследования

Определение активности ферментовАктивность   пероксидазы   определяли   реакцией   окисления  о­

дианизидина,   каталазы   –   путём   внесения   в   реакционную   среду  H2O2. Измерения   проводили   в   экстраклеточном   растворе,   который   получали икубацией корней проростков пшеницы в растворе CaCl2 в течение 1 час. 

ВЫВОДЫ1.   Впервые   показано,   что   экстраклеточный   раствор   обладает 

каталазной активностью. 2.  По   предварительным  данным   оптимум  pH  каталазы   находится   в 

области 7,0. 

75

3.   Показано,   что   кинетические   параметры   реакции   разложения перекиси водорода каталазой при pH 7,0 и температуре 25ºС составляют: КМ = 0,24 мМ и Vmax = 0,074 мкМ/мин.

4.   Обнаружено,   что   сорта   пшеницы   различаются   по   активности каталазы,   наибольшей   активностью   обладает  Казанская   юбилейная, выращенная из семян урожая 2008 года.

76

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА THIC  АРАБИДОПСИСА ПОСРЕДСТВОМ НОНСЕНС­ОПОСРЕДОВАННОГО РАЗРУШЕНИЯ МРНК (NMD).Маланин С.Ю.,1 Никифорова В.Ю.1,2

1Институт молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка, Потсдам, Германия, 2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН , Москва, РоссияREGULATION OF EXPRESSION OF THE GENE THIC ARABIDOPSISBY NONSENSE­MEDIATED DECAY (NMD)Malanin S.Y.,1 Nikiforova V.Y.1,2

1 Max­Planck­Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam, Germany, 2Institute Phisiology of Plant, Moscow

Регуляция   экспрессии   генов,   которая   происходит   на   всех   уровнях транскрипции   и   трансляции,   играет   важнейшую   роль   в   живых   клетках. Экспрессия гена ThiC арабидопсиса, который принимает участие в биосинтезе тиамина,   контролируется   с   помощью   тиаминпирофосфатного   (ТПФ) рибосвича, который контролирует альтернативный сплайсинг этого гена. При увеличении концентрации ТПФ в растительной клетке рибосвич способствует образованию   изоформы   с   более   длинной   3‘   нетранслируемой   областью (3‘UTR),   которая   является   нестабильным   транскриптом.   Переключение альтернативного сплайсинга на синтез нестабильной изоформы способствует уменьшению   экспрессии  всего   гена  ThiC  (его   кодирующей  части).  Быстрое разрушение  одной из изоформ является основой  регуляции гена биосинтеза тиамина.  Этот  нестабильный  транскрипт  характеризуется  наличием  длинной 3’UTR, в  котором  на  расстоянии  более  55 нуклеотидов  после  стор­кодона  в пре­мРНК   находится   интрон.   Это   указывает   на   возможность   участия   в деградации   нонсенс­опосредованного   разрушения   мРНК   (NMD).   Целью данного  исследования  являлась  проверка  данного  предположения.  Так  как детектирование и деградация транскриптов посредством  NMD происходит во время   трансляции,   мы   использовали   ингибитор   синтеза   белков,   чтобы экспериментально   блокировать   процесс   разрушения.   Было   показано,   что обработка   суспензионной   клеточной   культуры   арабидопсиса   ингибитором действительно   ведет   к   стабилизации   исследуемой   изоформы.   Для дальнейшего  определения  роли  NMD  в  деградации  использовались  Т­ДНК мутанты   по   гену  UPF1,   который   является   ключевым   в   данном  механизме разрушения   мРНК.  Мутантные   растения   были   обработаны   тиамином,   что вызывает,   посредством  регулируемого   альтернативного   сплайсинга,   синтез только нестабильной изоформы с длинным 3’UTR. Результаты ПЦР в реальном времени   показывают,   что,   в   отличие   от  растений  дикого   типа,   обработка тиамином   приводит   к   накоплению   нестабильного   транскрипта   в   мутантах. Кроме  того,  в  upf1­мутантах  наблюдалось  нарушение  регуляции  экспрессии всего   гена  ThiC  при   увеличении   концентрации   ТПФ.  Полученные   данные указывают   на   вовлечение  NMD  в   деградацию   нестабильной   сплайсинг­изоформы,   что   обуславливает   регуляцию   гена  ThiC  в   арабидопсисе   при увеличении концентрации ТПФ в клетке.

77

УМНИКМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЛЕЙ АЛЕНДРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, КАК ПРОЛЕКАРСТВА ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНАМалофеева Е. В., Копоруллина М.О.Фаттахова А.Н., к.б.н., доцент кафедры биохимии КГУКазанский Государственный университет им. В.И. Ульянова – Ленина 420032, Россия, Казань, ул. Университетская 18E­mail:Katrin537@yandex.ru

MOLECULAR MECHANISM OF ORGANIC SALT OF ALENDRONATE ACID AS A PRODRUG OF THE CHOLESTEROL’S SYNTHESISMalofeeva E.V., Koporullina M.O.Fattakhova A.N., PhD, associate professorKazan State University, Russia, Kazan, Universitetskaya str. 18

Изучение механизмов развития и прогрессирования такого заболевания, как   акне,   представляет   актуальную   задачу   в   современной   молекулярной фармакологии,   так   как   открывает   перспективу   новых   методов предотвращения  развитие  хронической  формы  заболевания.  Недавно  была установлена  зависимость  между  скоростью  окисления  сквалена  в  клетках кожи и индукции воспаления сальных желех (комедогенеза) с последующим развитием   акне.   Метаболиты   пути   от   сквалена   до   десмохолестерина обеспечивают   нормальный   уровень   холестерина   как   индуктора пролиферации клеток. Экзогенные стероиды приводят накоплению сквалена и его окисленных форм, что привлекает Propionibacterium acne.

В   опытах   исследовалось   действие   алендроната   натрия,   который является  бифосфонатом,  на  синтез  эргостерола  у  красных  дрожжей  вида Rhodotorula   glutinis,  как   первичной   модели   для   выявления   молекулярной мишени   лекарственного   препарата.   В   качестве   первичной   модели   для выявления  молекулярной  мишени  лекарственного  препарата,  подавляющего синтез холестерина и пролиферацию сальных желез были выбраны дрожжи Rhodotorula   glutinis,   так   как  ферменты   синтеза   эргостерола   у   дрожжей выполняют   аналогичную   функцию   в   синтезе   холестерина   в   организме человека.  Было  показано,  что  алендронат  натрия  приводит  к  подавлению роста красных дрожжей (рис. 1.), а также его синтетические соли снижают скорость роста дрожжей по сравнению с контролем (рис. 2.).                                                       

78

Дрожжи Rhodotorula glutinis, выросшие на среде Сабуро с добавлением АН в дозе 10­3М

Дрожжи  Rhodotorula  glutinis,   выросшие   на среде   Сабуро   с добавлением   ДГК   в дозе 10­3М

Дрожжи  Rhodotorula  glutinis,  выросшие  на  среде Сабуро без добавления АН и ДГК 

Рис. 1. ­  Красные дрожжи Rhodotorula glutinis, выросшие на среде Сабуро

Рис.   2.   ­   Влияние   солей   алендроновой   кислоты   на   скорость   роста дрожжей Rhodotorula glutinis

С  целью  определения  образования  продуктов  реакции  в  присутствии алендроната   натрия   провели   опыт,   в   котором   было   показано,   что скваленэпоксид   образуется   после   20   минут   от   начала   реакции,   а   также проявляется   сквален,   который   не   потребовался   в   реакции.   При   этом алендронат   натрия   приводил   к   появлению  метаболитов,   отсутствующих   в контроле (рис. 3.). 

Рис.   3.   ­   Образование   продуктов   реакции   и   сквалена   в   реакции   с алендронатом натрия в дозе 10­3  М

79

-0,1

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0

0,02

Lарг1

:1

Lарг1

:2

глю

коза

мин

ГА

МК

ImP

rNH

3

Ale

Na+3H

2O

АН

Контр

оль

варианты солей алендроновой кислоты

скорость

роста

, м

ин-1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Rf

5 мин 10 мин 20 мин 30 мин 40 мин контроль

время инкубации, мин

АН скваленэпоксид сквален

Также  с  помощью  тонкослойной  хроматографии  было  изучено  влияние солей  алендроновой   кислоты  на  пигментообразование  Rhodotorula  glutinis. Соли алендроновой кислоты в дозах 10­3  М ингибируют синтез астаксантина, главного пигмента красных дрожжей.   

С   помощью   протеомный   анализ   белковых  фракций   клеток  дрожжей, выросших на среде с алендронатом натрия  выявил резкое снижение белков в области   10­80   кДа.   Возможно,   такое   сильное   воздействие   алендроната натрия  выражено  ингибированием  на  уровне  трансляции  или  транскрипции (рис. 4.).  

Рис.  4.   ­  Электрофореграмма  белков  клеточных  экстрактов  дрожжей, выросших на средах с алендронатом натрия и дигидрокверцетином

Пигментообразование   у   красных   дрожжей  Rhodotorula  является адаптивным признаком, защищающим клетки от УФ. Изменение пигментации дрожжей   сопровождается   нарушением   синтеза   сквалена.   Данную зависимость  можно  использовать  как  простой  диагностический  маркер  для предварительного   скрининга   лекарственных   препаратов,   влияющих   на уровень сквалена. Корреляция между пигментообразованием и подавлением эпоксидирования   сквалена   позволяют   предложить   тест­систему   для первичного   скрининга   ингибиторов   синтеза   холестерина,   основанную   на визуальном   контроле.   Так   как   на   сегодняшний   день  фармакологический рынок   испытывает   дефицит   препараторов,   являющихся   ингибиторами синтеза   холестерина,   а   все   известные   препараты   находятся   на   стадии преклинических   исследований,   поэтому   создание   тест­системы     действия ингибиторов   этого   типа   позволит   сократить   затраты   на   доклинические исследования.

66.2кДа  

45кДа овальбумин

 25 кДа  

14.4   

55кДа сквален эпоксидаза

контроль алендронат натрия дигидрокверцетин маркер

80

          

Рис.   5.     Тест­ситема   превичного   скрининга   ингибиторов   синтеза холестерина

 Таким образом, алендронат натрия и его органические соли ингибируют 

синтез астаксантина путем подавления, по­видимому, синтеза холестерина на уровне   сквалена,   а   также   подавляют   рост   путем   регуляции   сквален эпоксидазы  на  уровне  трансляции  или  транскрипции.  Поэтому  алендронат натрия   целесообразно   использовать   в   качестве   одного   из   действующих веществ препарата для лечения акне.

81

СОЗДАНИЕ БАЗЫ ДАННЫХ ДЛЯ ПРОГНОЗА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВМатвеева М.В., Фаттахова А.Н.Научный   руководитель:  Фаттахова  А.Н.,   к.б.н.,  доцент   кафедры   биохимии Казанского Государственного Университета Казанский Государственный Университет DATABASE GENERATION FOR DRUGS INTERACTION PROGNOSISM. V. Matveeva, A.N. Fattakhova.Supervisor: A.N. Fattakhova, PhD, Kazan State University biochemistry department associate professor.Kazan State University

На сегодняшний день взаимодействие лекарственных соединений (ЛС) в живых   организмах   является   одной   из   ключевых   проблем   в   современной биохимии и медицине. Процесс взаимодействия представляет собой комплекс событий  и  зависит  от  таких  факторов,  как  индивидуальный  пул  ферментов, возраст, пол, патологии, окружающая среда и т.д. 

Известно, что метаболизм ЛС состоит из двух фаз. Результатом первой фазы (несинтетические реакции) является активный метаболит. Вторая фаза (реакции   конъюгации)   представляет   собой   детоксикацию   активного метаболита первой фазы путем присоединения к нему полярного радикала.

Цитохромы  P450   (CYP450)   составляют   ~75%   от   пула   ферментов, ответственных   за   трансформацию  ЛС   в   первой  фазе   и   влияет   на  общую скорость выведения лекарственного соединения. 

В настоящее время активно исследуются такие параметры лекарственных соединений как спектральные константы (Ks) первого и второго порядка.  Ks первого   порядка   (Ks1)   показывает   скорость   образования   фермент­субстратного  комплекса   «CYP450­ЛС»  и  степень  сродства  ЛС  к  активному центру   цитохрома  P450.  Ks  второго   порядка   (Ks2)   показывает   скорость распада фермент­субстратного комплекса. Однако механизмы взаимодействия лекарственных   средств   в   организме   и   влияние   различных   эндогенных   и экзогенных факторов на данный процесс недостаточно изучены.

В соответствии с вышеуказанным составление баз данных спектральных констант   и   создание   программного   обеспечения,   прогнозирующего взаимодействия   ЛС,   является   актуальным   направлением   в   области биоинформатики и фармакологии. 

Целью  данной  работы  является  создание  базы  спектральных  констант лекарственных   соединений   и   разработка   программного   обеспечения, прогнозирующего их взаимодействие, для фармакологов. 

По ранее полученным данным, в нейронах и астроцитах головного мозга присутствуют   тканеспецифичные  CYP450,   катализирующие   метаболизм нейролептиков.  Диазепам,   хлорпромазин,  амитриптилин,   как  нейролептики, наиболее   часто   применяемые   при   лекарственной   терапии   психических заболеваний,   и   кордиамин   (стимулятор   центральной   нервной   системы) использовались при постановке эксперимента в качестве субстрата CYP450, а галоперидол  (ингибитор  CYP2D6) и кетоконазол  и эритромицин   (ингибиторы 

82

CYP3A4)   использовались   для   изучения   взаимодействия   лекарственных соединений.   Результаты   исследований   показали,   что   вышеназванные препараты являются субстратами I типа CYP450 мозга, в частности клинически значимых изозимов CYP2D6 и 3А4, имеют максимум поглощения при  =380­390λ  нм   и   минимум   при   =400­420   и,   согласно   современным   представлениям,λ  взаимодействуют   с  активным  центром,  расположенным  на  апоферменте,  и гемом.  Также  для данных  препаратов  были рассчитаны  Ks1. Было  показано, что  Ks1   пациентов   с   диагнозом   «органический   психоз»   при   одинаковой лекарственной   нагрузке   (хлорпромазин,   галоперидол)   была   выше,   чем   у условно­здоровых (контроль) и пациентов с диагнозом «шизофрения», в 52.7 раз (хлорпромазин), в 30 раз (кордиамин), в 42.7 раз (диазепам) и в 60.6 раз (амитриптилин),   что   указывает   на   более   высокую   специфичность  CYP450. Ингибиторный  анализ  показал,  что  введение  галоперидола,  кетоконазола  и эритромицина  снижает  скорость  метаболизма  на  86­88%. Рассчитанные  Ks1 были внесены в пополняемую базу данных.

Прототип   программного   обеспечения   (любезно   предоставлено   группой биоинформатики) позволяет составить базу данных вида «название препарата ­  Ks1  (норма)   ­  Ks1  (пациент  1)   ­  Ks1(пациент  2)».  На  данный  момент  идет работа  по  пополнению  базы  данных,  изменению  принципа  ее  построения  и модификации  графического  интерфейса  программы  для удобства  конечного пользователя.

83

УМНИКСОЗДАНИЕ ГИБРИДНЫХ МИКРОКАПСУЛ ИЗ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ НА ОСНОВЕ ЖИВЫХ КЛЕТОКМинуллина Р.Т.Научный руководитель – к.б.н., старший преподаватель кафедры биохимии КГУ Фахруллин Р.Ф.Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаTHE FABRICATION OF CALCIUM CARBONATE MICROCAPSULES TEMPLATED ON LIVING CELLSRenata T. Minullina  Supervisor – Dr Rawil F. Fakhrullin, Senior Lecturer, Department of BiochemistryKazan State University

В   природе   существуют   микроорганизмы,   которые   имеют   раковину, состоящую из карбоната кальция. Такие раковины имеют важное значение для выживания этих организмов в неблагоприятных условиях окружающей среды и служат  в  качестве  природного  защитного  барьера.  В  связи  с  этим,  ученых заинтересовал   процесс   биоминерализации.   Сравнительно   недавно   стало популярно   такое   направление   в   биологической   науке,   как   биомиметика. Биомиметика – это использование биологических объектов в качестве матриц и   прототипов   для   создания   различных   материалов   и   искусственных биологических систем.

В  данной  работе  мы  показали   возможность   создания  искусственных микрокапсул   из   карбоната   кальця,   включающих   в   себя   единичные   клетки микромицетов и одноклеточных водорослей. В качестве модельных объектов мы   использовали   клетки   пекарских   дрожжей   (Saccharomyces  cerevisiae), конидии  микроскопического   гриба  Trichoderma  asperellum  и   одноклеточной зеленой  водоросли  Dunadiella  martima.  С  помощью  метода  флуоресцентной микроскопии   было   обнаружено,   что  инкапсулированные   клетки   остаются жизнеспособными в течение нескольких недель хранения. 

Комбинация   свойств   живых   клеток   и   неорганического   карбоната кальция открывает широкие возможности в разработке новых материалов [1].

1. Fakhrullin,   R.   F.   Hybrid   cellular−inorganic   core−shell   microparticles: encapsulation   of   individual   living   cells   in   calcium   carbonate   microshells   /   R.   F. Fakhrullin and R. T. Minullina // Langmuir – 2009. – Vol. 25, № 12. – P. 6617–6621.

84

БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗ ГРИБАМИ РОДА TRICHODERMA ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЕМорозова Ю.А.Скворцов Е.В., к.б.н. Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова XYLANASE BIOSYNTETHESIS BY FUNGI TRICHODERMA DURING CULTIVATION ON SPIRIT WASTES Morozova J.A.Skvortsov E.V.Institute of organic and physic chemistry name of A.E. Arbyzov 

Одним из наиболее изучаемых грибов в настоящее время является род Trichoderma.   Причиной   этого   интереса   является   большая   практическая   и значимость   рода.   Виды  Trichoderma  являются   продуцентами   ферментов (целлюлаз,   хитиназ,  пектиназ,   ксиланаз,   серинзависимых  протеиназ  и  др.), используемых   в   целлюлозно­бумажной   и   пищевой   промышленности,   в производстве  моющих  средств,  в  получении  спирта,  в  получении  кормовых добавок [1] в преобразовании отходов, содержащих целлюлозу в глюкозу [2]. 

При   производстве   спирта   из   зерна   получается   довольно   большое количество отработанной массы прошедшего ферментацию сырья, из которого путем   дистилляции   был   извлечен   алкоголь   [3].   Послеспиртовая   барда содержит   много   питательных   веществ   и   является   дешёвым   отходом спиртового производства. 

Целью нашей работы было исследование возможностей использования послеспиртовой  барды  в   качестве   культуральной   среды  для   грибов    рода Trichoderma  в  процессе  синтеза  ксиланаз.  В  настоящее  время  для  синтеза ксиланаз  грибами  Trichoderma используют искусственные  среды, полученные на   основе   гидролизатов   зерна   [1].  Эти   среды   отличаются   трудоёмкостью приготовления и дороговизной.

Исследования   проводились   на   двух   видах   барды:   осажденной   и неосажденной. Так же  исследовалось влияние добавок солей на  активность получаемого препарата ксиланаз. 

Проведённые   исследования   показали   возможность   получения высокоактивного   препарата   ксиланаз   ­   25  IU/ml  при   культивировании Trichoderma на осаждённой барде с добавкой необходимых солей.

1. Скворцов, Е. В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами  Trichoderma  /  Е. В.   Скворцов,    Ф.К.   Алимова,   Д.   М.   Абузярова   //  Вестник   Казанского технологического университета.– 2005.– №1.– С.251­255.

2. Селиванов,  А.  С.  Комплексная  переработка  целлюлозосодержащих  отходов лесоперерабатывающих   и   сельскохозяйственных   предприятий   на   основе биоконверсии / А.С. Селиванов // Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы. Киров.– 2001.– С. 89­91.

3. Шишкин   А.В.   Новый   биопрепарат   для   переработки   отходов   спиртового производства  Республики   Татарстан   /  А.В.  Шишкин,  Э.А.  Рафаилова,  Е.В. Скворцов; Казанск. Гос. Ун­т. – Казань, 2007. – 17 с.: 4 ил.­ Библиогр.: 8 назв. – Рус. – Деп. В ВИНИТИ 24.10.07 № 991­В2007 УДК 630:576.8

85

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ И МЕСТНОРАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МЕЛОКСИКАМА В ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХМустафин Р.А., Насыбуллина Н.М.Науч. руководитель­ Насыбуллина Н.М., д.ф.н., доцентКазанский государственный медицинский университетESTIMATION OF TOXICITY AND  LOCAL IRRITATING ACTION OF ME­LOXICAM IN EXPERIENCES ON ANIMALSMustafin R.A., Nasibullina N.M.Scientific adviser­ Nasibullina N.M., a Doctor of Pharmaceutical Science, docent Kazan Medical University

На   сегодня   наиболее   востребованным   и   часто   приме­няемым лекарственным   средством  в  лечении  ревма­тических   заболеваний  является мелоксикам (МК) – производное 1,2­бензотиазина [1].Создание лекарственных форм   (ЛФ)  с  МК  для  наружного  применения  предусматривает  определение диапазона  адекватных  доз.  Поэтому  на  этапе  фармакологического  изучения МК в его ЛФ необходимым является оценка обще­токсического действия МК [2]. Все эксперименты по оценке токсичности проводили на лабораторных жи­вотных   в   2   этапа.  На   1­м   этапе   изучение   токсичности  МК   при   накожном нанесении   проводили   на   20   белых   крысах   массой   180­220   г   и   10   белых кроликах массой 2,8 кг, открытым способом при комнатной темпера­туре +20 °С. За 1­2 дня до эксперимента выстригали волосы на спине по обе стороны от позвоночника раз­мером 3x3 см. Правый бок служил для аппликации суспензии МК   (на   2   %   крахмальной   слизи),   а   левый   для   контроля.  Суспензию  МК наносили 1 раз в день в течение 20 дней в объеме 1­2 мл на правый бок, на левый   –   крахмальную   слизь   без  МК.   За   подопыт­ными  животными   вели наблюдение   в   течение   все­го   эксперимента.   Наличие   у   препаратов раздражающих свойств определяли визуально. При аппликации сус­пензии с МК  на  кожу  крыс  и  кроликов  видимых  из­менений  не  наблюдалось.  Кожная складка до начала аппликаций была равна у крыс ­1,5 мм, и у кроликов ­ 2,0 мм. В последующие 10 дней кожная складка не утолщалась и соответствовала тем же значениям, что и в начале опыта. Признаков воспаления или разд­ражения (покраснение, расчёсы и т.д.) не наблю­дались. Следовательно, при накожном применении  МК  не  наблюдается  изменение  со  стороны  кожи  и  волосяного покрова животных.

На   2­м   этапе   эксперимента   проводили   изучение  ме­стно­раздражающего действия  МК  на  слизистую  оболо­чку  глаз.  Опыты  проводили  на  10 кроликах обоего пола (5 самца и 5 самки) массой 2,5­3 кг. МК вводили в виде суспензии (с 2% крахмальной слизью) в пропорции 1:2 в конъюнктивальный мешок правого глаза   кролика   по   1­2   капли.   Слизистая   оболочка   левого   глаза   служила контролем   (слизистая  умеренно  увлажнённая,  розового  цвета,  без  признаков воспаления).  Опыты  проводили  в  3­х  повторениях.  После  введения  суспензии МК  в  тече­ние  одной  минуты  прижимали  слезно­носовой  канал  у  внутреннего угла   глаза.  Наблюдение   за   подопытными  животными   вели   в   течение   двух недель  и  при  этом  учи­тывали  появление  выраженной  гиперемии,  отечности, 

86

инъекции  сосудов  склеры  и  роговицы,  диаметр  зрачка  и  состояние  век.  При введении МК в конъюнктивальный мешок видимых изменений не наблюдалось. Слизистые   глаз   были   розового   цвета,   умеренно   увлажнённые,   при­знаки воспаления отсутствовали как у самцов, так и у самок кроликов.

Тем  самым,  применение  суспензии  из  МК  на  сли­зистые  оболочки  глаз  и кожу животных не вызывает раздражающего и кожно­резорбтивного действия, что   говорит   о   том,   что   МК  не   обладает   токсическими   свой­ствами   при нанесении на кожу и слизистые оболочки и по ГОСТу – 2.14.95 его токсичность может   быть   клас­сифицирована   как   невыраженная.   Полученные   данные позволяют   говорить   о   безвредности  МК   и   отсутствии     раздражающего   и кумулятивного действия.                     

Библиографический список1. Годзенко А.А. Перспективы применения мелоксика­ма в лечении суставных синдромов /Русский мед. журн. 2006.– Т. 14.– № 25.– С. 1846–1848.2. Фисенко В.П.  Руководство  по  экспериментальному  (до­клиническому) изучению новых фармакологических  веще­ств. – М., 2000. – 238 с.

87

УМНИКФИТАЗЫ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ОСНОВА НОВЫХ БИОУДОБРЕНИЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙМухаметзянова А.Д., Ахметова А.И. Шарипова М.Р., д.б.н., профессорКазанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаPHYTASES OF MICROORGANISMS  ­  THE BASIS OF NEW BIOFERTILIZERS FOR PLANTS’ GROWTH PROMOTIONMukhametzyanova A.D., Akhmetova A.I.Sharipova M.R., Doctor of Science, professorKazan state university

Поддержание   высоких   урожаев   сельскохозяйственных   культур, необходимое для обеспечения продовольствием растущего населения Земли, возможно  благодаря  массированному  применению  минеральных   удобрений. Фосфорные   удобрения   получают,   разрабатывая   залежи   горных   пород, богатых  фосфатами.  Однако  запасы  фосфатов,  имеющиеся  на  Земле   ­  это фактически  невозобновляемые,  исчерпаемые  ресурсы   [Gilbert,  2009].  Именно поэтому   необходимо   искать   альтернативные   использованию   фосфорных удобрений пути обеспечения сельскохозяйственных растений фосфором.

В почве органическая форма фосфора представлена в основном в виде фитиновой  кислоты  и  ее   солей   ­  фитатов.  Они   составляют  почти   50%  от общего  органического  фосфора  и  более  80% от  общего  фосфора  в  кормах растительного происхождения [Richardson et al., 2005].

Существует особая группа фосфатаз ­ фитазы, способных гидролизовать нерастворимые  фитаты  почв  с  образованием  инозитола  и  доступных  солей фосфорной  кислоты.  Из­за  отсутствия  внеклеточной  фитазной  активности, растения   не   могут  самостоятельно   гидролизовать  фитаты   почвы.  Однако внеклеточные   фитазы   микроорганизмов   способны   расщеплять   фитаты   и переводить  фосфор  в  доступное  для  растений  состояние   [Makarewicz  et  al., 2006]. 

Фитазы  бацилл  отличаются  от  фитаз  почвенных  грибов  нуклеотидной последовательностью   гена,   характеристиками   фермента   и   способом гидролиза  субстрата. В связи с чем, бациллярные ферменты  имеют  высокий потенциал   для   использования   в   качестве   биоудобрений   для сельскохозяйственных   растений.   Проводили   сравнительный   анализ   генов фитаз бактерий рода  Bacillus, представленных в базе  данных  сервера  NCBI. Структурная   гомология   генов  фитаз  Bacillus  subtilis  и  B.  amyloliquefaciens составляет   100%,  Bacillus  subtilis  и  B.  licheniformis    ­   73%.  Сравнительный анализ структуры гена phyC Bacillus subtilis с генами фитаз грибов (Aspergillus sp.)   и   грам­отрицательных   бактерий   (Pseudomonas   sp.,   Klebsiella   sp.,  Echerichia) не выявил гомологии, тогда как внутри рода грибов гомология генов фитаз    Aspergillus   niger,    Aspergillus   ficuum    (phy   A)   и  Aspergillus   awamori составляет 92%.

Для  выяснения  роли  фитазы  Bacillus  subtilis  168  в  жизнедеятельности бацилл,   включая   стрессовые   состояния,   а   также   влияния   фитаз   на 

88

координированное   потребление   фосфатов   сельскохозяйственными растениями,   проводили   инактивацию   гена,   кодирующего  фитазу   (phyC)  в геноме B. subtilis. Для этого проводили трансформацию линейного фрагмента ДНК, включающего ген устойчивости к эритромицину (em) и фланкированного 5’  и   3’  областями   гена  фитазы  (phyC),  в  компетентные  клетки  B.  subtilis.В результате гомологичной рекомбинации по участкам гомологии с хромосомной ДНК   бактерии   происходило   встраивание   в   геном   гена   устойчивости   к антибиотику. 

Мутантный   штамм  B.subtilis  dPHY,   устойчивый   к   эритромицину,   не проявлял активности по отношению к специфическому субстрату, в отличие от контрольного  штамма. Как показали  результаты микроскопирования штамм с инактивированным   геном  фитазы  не  имеет  существенных  морфологических отличий по сравнению с исходным.

В лабораторных опытах изучили влияние мутантного и дикого штаммов B. subtilis  на  прорастание  семян  кукурузы   (Zea  mays).  На  питательных  средах, содержащих  фитат  натрия  в   качестве  единственного  источника  фосфора, положительный  эффект  на  прорастание  семян  отмечался  при  их  обработке суспензией  дикого  штамма  B.  subtilis,   тогда   как   dPHY  штамм  не  оказывал стимулирующего эффекта. 

Из данных литературы известно, что рост проростков кукурузы на жидких питательных   средах   в   условиях  фосфатного   голодания,   но   в  присутствии фитата,   заметно   улучшается,   при  добавлении   спор   бациллярных  штаммов, обладающих   высокой   фитазной   активностью.   Происходит   заметная стимуляция развития корневой системы растения [Borriss et al., 2002]. 

Эти данные позволяют сделать вывод, что фитаза относится к факторам, способствующим  улучшению  роста  и  физиологических  параметров  растений. Положительный   результат   действия   бактериальной  фитазы   в   ризосфере растений   состоит   в   гидролизе   хелатообразующих   фитатных   комплексов, которые связывают и делают недоступными для растений важные минералы и микроэлементы.   Таким   образом,   применение  фитаз   позволит   существенно сэкономить   энергетическое   пространство   в   рационе,   сократить   степень обогащения   почвы   минеральными   добавками   и   представляет   новый качественный   этап  совершенствования   эффективности  агропроизводства  и сокращения затрат удобрений на единицу сельскохозяйственной продукции.

1. Borriss   R.   Extracellular   phytase   activity   of  Bacillus   amyloliquefaciens  FZB45 contributes to its plant­growth­promoting effect / Idriss  E., Makarewicz  O., Farouk A., Rosner K., Greiner R., Bochow H., Richter T., Borriss R. // Microbiology. – 2002. – V. 148. – P. 2097­2109.

2. Gilbert N. The disappearing nutrient // Nature. – 2009. – V. 461. – P. 716–718.3. Makarewicz   O.   Dual   role   of   the   PhoP­P   response   regulator:  Bacillus  

amyloliquefaciens  FZB45 phytase gene  transcription   is  directed by positive and negative interactions with the phyC promoter / Makarewicz O., Dubrac S., Msadek T., Borriss R. // Journal of Bacteriology. – 2006. – V.188. – P. 6953­6965.

4. Richardson   A.E.   Expression   of   a   fungal   phytase   gene   in  Nicotiana   tabacum improves phosphorus nutrition  of  plant  growth   in  amended soils   /  George T.S., Simpson R.J., Hadobas P.A., Richardson A.E. // Plant Biotechnol J. – 2005. – V. 3(1). – P. 129­140.

89

ЛИПИДНЫЙ БАЛАНС ПРИ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИИНго Тхи Бинь Минь1

Арлеевская Марина Игоревна2, к.м.н, с.н.с.ЦНИЛ КГМА 2, Казанский государственный университет имени в.и. Ульянова­Ленина, кафедра биохимии1

LIPID  BALANCE  IN PATIENTS WITH SYSTEMIC  SCLEROSISNgo Thi Binh Minh1

Arleevckaya Marina Igorevna2

Reseach laboratory of  Kazan State Medical Academy2

Kazan State University  , Department of biochemistry1

       В   основе   системной   склеродермии   (ССД)   лежит   нарушение функционирования эндотелия мелких сосудов с развитием фиброза, а также хроническое   аутоиммунное   воспаление   в   них  .  Эти   процессы   приводят   к избыточному   образованию   коллагена   и   развитию   фиброза   с   нарушением микроциркуляторного     кровоснабжения.   Работа   направлена   на   решение важной  проблемы  – исследованию  механизмов  нарушения липидного  обмена, приводящих   к   раннему   развитию   атеросклероза   и   его   осложнений,   при аутоиммунных заболеваниях.       Целью  работы  было  исследование  лабораторных  признаков  нарушения липидного обмена у больных системной склеродермией.    Задачи исследования:1.  Изучение   уровней   общего   холестерина   и     липопротеинов   в   сыворотке больных системной склеродермией. 2.Определения   уровня   триглицеридов     в   сыворотке   больных   системной склеродермией. 3.  Определения  концентрации  продуктов  перекисного  окисления  липидов    в сыворотке больных системной склеродермией.        В  ЦНИЛ  КГМА  получены  результаты,  свидетельствующие  о  изменении содержания липидов в сывороткеТаблица  1. Концентрация  сывороточных липидов  у больных  ССД  и здоровых доноров.

Показатели   / Группы

ТГ,  ммоль/л

ОХ,  ммоль/л

ХС­ЛПНП, ммоль/л

ХС­ЛПВП, ммоль/л

ССД (n=12) 1,33 4,9 3,33 1,09Доноры (n=15) 1,25 4,7 2,98 1,21

 Выводы:1.У   больных   ССД   повышен   уровень   продуктов   перекисного   окисления сывороточных   липидов.   Как   известно,   перекисное   окисление   липидов провоцируется  радикалами  кислорода.  Можно  предположить,  что  у  больных ссд,   либо   повышена   продукция   радикалов   кислорода   ,   либо   эти   продукты недостаточно эффективно удаляются макрофагами. 2. Получены предварительные данные о наличии при ССД изменения состава сывороточных липидов – увеличение  уровней ОХ и ТГ в сыворотке. 

90

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАГЕННОСТИ TRICHODERMA ASPERELLUM Нгуен Х.М.Тазетдинова Д.И., к.б.н.; Алимова Ф.К., д.б.н., проф.Казанский Государственный  Университет, РоссияDETECTION OF TRICHODERMA ASPERELLUM MUTAGENITY Nguyen CH.M.Tazetdinova D.I.; Alimova F.K.Kazan State University, Russia

Одной  из  важнейших  задач   гигиены  окружающей  среды  в  условиях быстрого   загрязнения   биосферы   антропогенными   факторами   различной природы  является  предотвращение  его   генетических  последствий,   то  есть ущерба для здоровья настоящего и будущих поколений людей, обусловленного влиянием факторов окружающей среды на наследственность.

В   сельском   хозяйстве   используется   широкий   спектр   химических соединении, в том числе биологического происхождения, которые прямо или косвенно попадают в организм человека, в связи с чем возникает  опасность мутагенного   повреждения   генетической   программы.  Поэтому   производство биопрепаратов   должно   основываться   не   только   на   высокой   активности микромицета­антагониста, но и на его полной биологической безопасности для человека и окружающей среды.

Микромицеты рода Trichoderma – одни из наиболее изучаемых грибов в настоящее время. На основе антибиотиков, токсинов, ферментов грибов этого рода   получают   препараты   для   биологического   контроля   болезней   и стимуляции роста растений, получения трансгенных растений. 

В   связи   с   вышесказанным,   целью   работы   явилось   определение мутагенности Trichoderma asperellum.

Анализ   мутагенного   потенциала   биологически   активных   веществ T.asperellum  проводился   с   помощью   теста   Эймса/Salmonella  без метаболической активации  in vitro и с метаболической активацией  in vivo, для чего  был  использован  сток  мышей  SPF­категории.  При  постановке  данного теста  мышам   внутримышечно   вносили   100  мкл   исследуемой   культуральной жидкости  и  1  мл  суспензии  клеток  Salmonella   typhimurium  BA13.  Инкубация проводилась   в   течение   1,5   часа.   Через   двое   суток   проводили   подсчёт ревертантов.

При анализе мутагенного потенциала биологически активных веществ T.asperellum   in   vitro  количество   ревертантов  Salmonella   His+  в   опыте   и   в контроле достоверно не отличалось. 

Анализ   мутагенного   потенциала   метаболитов   микромицета   с метаболической активацией in vivo выявил генотоксичность среднего уровня.

91

ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ У ДЕТЕЙ, ПЕРЕНЕСШИХ ХРОНИЧЕСКУЮ ВНУТРИУТРОБНУЮ ГИПОКСИЮПавлова Е.В., Анисимова Т.Е.,  Туаева Н. О., к.б.н.Казанский   государственный   университет,   биолого­почвенный   факультет, Казань, РоссияPERMEABILITY   OF   ERYTHROCYTE   MEMBRANES   FROM   CHILDREN SUFFERING OF THE CHRONIC HYPOXIAPavlova E.V., Anisimova T.E.,Tuaeva N.O.Kazan State University, Kazan, Russia

Ежегодно   в   мире   умирает   более   5   млн   новорожденных.   В   России причиной   40   %   летальных   исходов   является   внутриматочная   гипоксия   и асфиксия  в  родах   [Шабалов,  2006].    Именно  гипоксическое  поражение  ЦНС плода   и   новорожденного,   определяет   состояние   напряженности   и адекватности   адаптационных   процессов   в   раннем   постнатальном   периоде. При   этом   создаются   предпосылки   для   высокой   заболеваемости новорожденного, а в перспективе у детей раннего возраста. 

Показано,   что   при   критических   состояниях   в   условиях   недостатка кислорода  у новорожденного развивается оксидативный стресс, нарушаются метаболизм и функции клеток. Эффективным механизмом как стрессовой, так и строго специфической регуляции самых разнообразных процессов в норме и при   патогенезе   различной   этиологии   являются   структурные   перестройки клеточных   мембран.   В   частности,   важная   роль   в   адаптации   организма человека и животных к условиям внешней среды принадлежит эритроцитам. 

Одной  из  задач,  поставленных  в  данной  работе  явилось  определение скорости   протонного   обмена   через   мембрану   эритроцита   в   суспензии эритроцитов  методом  ЯМР   с  ИГМП,   что   позволяет   судить   об   изменениях проницаемости   мембран   [V.  V.  Morariu,   1981].   Вторая   задача:   установка возможной  взаимосвязи  между  проницаемостью  мембран  и  патологическим состоянием   новорожденных   детей   после   перенесенной   хронической внутриутробной гипоксии.

В   работе   использовались   эритроциты   периферической   крови новорожденных детей (n = 15) реанимационного отделения детской городской клинической  больницы  №  1 г.Казани.  Контрольную  группу  (n  = 4) составили новорожденные из отделения патологии новорожденных, состояние которых не   требовало   реанимационных   мероприятий.   Возраст   детей   на   момент обследования составлял в среднем 2 недели.

Выявлено  два   типа  изменений  проницаемости  мембран  эритроцитов после   воздействия   хронической   внутриутробной   гипоксии:   повышение проницаемости (  = 0,043) и снижение проницаемости (  = 0,091) по сравнениюτ τ  с данным показателем в контрольной группе (  = 0,057). τ

1. Шабалов, Н.П. Асфиксия новорожденных. // Н. П. Шабалов, В. А. Любименко, А. Д. Пальчик. Москва, 2003.2. Morariu V. V. Nuclear magnetic resonance investigations of the water exchange through eritrocyte membrane // Rev. Roum. Phys. – 1981, ­ V. 26. N. 6, ­ P.617­625.

92

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АРХЕОЛОГИЧЕСКИХ ПАМЯТНИКОВ ВОЛЖСКО­КАМСКОЙ ЛЕСОСТЕПИПанкова А.В., Тухбатова Р.И., к.б.н.ГОУ   ВПО   «Казанский   государственный   университет   им.   В.И.  Ульянова­Ленина»MICROBIOLOGICAL RESEARCHES OF ARCHAEOLOGICAL MONUMENTS OF VOLZHSKO­KAMSKY FOREST­STEPPEPankova A.V., Tuhbatova R.I.Kazan State University

В последние десятилетия происходит значительное усиление процессов техногенной  деградации  естественных  экосистем,  которые  сопровождаются изменениями   и   разрушением   почв,   а   вместе   с   тем   трансформацией   или потерей  выполняемых  ими  биосферных  и  биогеоценотических  функций,  что может привести к труднопрогнозируемым последствиям [3].

Чтобы оценить масштабы и спрогнозировать последствия современных форм деградации  естественных  экосистем, необходимо изучать процессы  их восстановления   –   как   в   целом,   так   и   отдельных   их   компонентов.  Среди компонентов экосистем почвенная составляющая является одной из наиболее важных,  будучи  связующим  звеном  их  функционирования.  В  зависимости  от способности  почв  восстанавливать  свой  исходный  облик,  и,  следовательно, выполнять   свои   функции,   будет   зависеть   регенерационная   способность экосистем в целом [1].

Для   изучения   восстановительной   способности   почв   за   длительные промежутки   времени   археологические   памятники   оказались   наиболее подходящим   объектом.   Они   могут   служить   моделями   при   изучении формирования   новообразованных   почв   на   обнаженных   почвообразующих породах для выявления всего хода процесса почвообразования.

Известно,   что   почвенные   микроорганизмы   являются   неотъемлемой составной частью почвы и участвуют в той или иной степени практически во всех   процессах,   протекающих   в   ней.  Поэтому   характеристика   микробного сообщества   является   диагностическим   показателем   условий почвообразования. Палеопочвы археологических памятников, в зависимости от степени  консервации,  сохраняют  ряд  свойств  с  момента  погребения   [2],  а, следовательно, это должно быть отражено в соответствующих параметрах их микробного сообщества.

В   связи   с   этим   цель   нашей   работы:   оценка   степени   изменения биологической  активности  почвы  через  1000­3000 лет  после  их нарушений  в результате  деятельности  древнего   человека   в   условиях  лесостепной   зоны Волжско­Камской лесостепи.

Численность  микроорганизмов  различных  физиологических  и  эколого­трофических   групп   определяли   методом   люминесцентной   микроскопии   и посева  на  твердые  и  жидкие  питательные  среды  из  различных  разведений почвенной   суспензии.   Структуру   микромицетного   сообщества   определяли методом   почвенных   комочков   [4]   на   среде   Чапека.  Определяли   скорость базального и субстрат­индуцированного дыхания почвы. Высчитывали углерод 

93

микробной   биомассы,   метаболический   коэффициент.   Определяли потенциальную активность азотфиксации.

Биологическая   активность   современного   выщелоченного   чернозема Камско–Устьинского   района   характеризуется   большей   напряженностью   и функциональной   активностью   микроорганизмов,   что   коррелирует   с содержанием гумуса по сравнению с Алексеевским районом.

В   ряду   от   погребенных   гидроморфных   и   автоморфных   до новообразованных   гидроморфных   и   автоморфных   горизонтов   отмечена тенденция к увеличению биологической активности и содержания гумуса

В  антропогенно­нарушенных  археологических  почвах  отмечено  полное восстановление биологической активности и содержания гумуса за период 3 тыс. лет.

Полученные   результаты   по   почвенному   мониторингу   могут   быть использованы   в   учебном   процессе,   для   реконструкции   динамики палеоэкологических условий лесостепной зоны Волжско­Камской лесостепи за последние 3000 лет, для прогнозирования изменения микробных сообществ в природном и антропогенном трендах развития почв.

1. Валдайских,  В.В.  Экологические  особенности  формирования  почв  на местах   древних   антропогенных   нарушений   (на   примере   лесостепной   зоны Западной  Сибири):  автореф.  канд.  биол.  наук   /  В.В.  Валдайских;  Уральский гос. ун­т. – Екатеринбург, 2007. – 24 л.2. Демкин  В.А.  Палеопочвоведение  и  археология:  интеграция  в  изучении истории природы и общества. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997. 213 с.3. Соколов  И.А.   Теоретические   проблемы   генетического   почвоведения. Новосибирск: Гуманитарные технологии, 2004. 288 с.4. CBS Course of Mycology. Fourth edition. Edited by W. Gams, E.S. Hoeksna and  A. Aptroot.  Printed  by  Ponsen  &  Looyen  BV,  Wagenigen,  The  Netherlands. 1998. 165 p.

94

УЧАСТИЕ β­ГАЛАКТОЗИДАЗЫ В ФОРМИРОВАНИИ ВТОРИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ЛЬНЯНОГО ВОЛОКНАА. А. Петровапроф. д.б.н. Т. А. Горшкова, м.н.с. Н. Е. МокшинаУРАН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАНPARTICIPATION OF β­GALACTOSIDASE IN SECONDARY CELL WALL FORMATION OF FLAX FIBRES A. A. PetrovaProf. Dr. T. A. Gorshkova, scientific assistant N. E. Mokshina   Kazan Institute of biochemistry and biophysics Kazan Scientific Centre Russian Academy of Science

Флоэмные   волокна   льна   формируют   вторичную   клеточную   стенку особого,   так   называемого   «желатинозного»,   типа.  Для   клеточной   стенки желатинозного  типа  характерно  аксиальное  расположением  микрофибрилл целлюлозы, низкое содержание ксилана и почти полное отсутствие лигнина – характерных   полимеров   вторичной   клеточной   стенки  наиболее   известного, ксиланового,  типа   [Gorshkova, Morvan, 2006].  Как было  показано  на  примере флоэмных волокон льна и конопли, для клеточной стенки желатинозного типа присуща   неоднородность   ее   слоев,   а   также   их   постсинтетическая модификация, в которой принимает участие тканеспецифичный полисахарид – 

­(1,4)­галактан   [Сальников,   2005;  Чернова,   2007].β   По­видимому,   клеточная стенка  желатинозного  типа  требует  особых  механизмов  формирования,  для понимания  которых    необходимо  выявление  ключевых  участников  процесса. Это  делает  актуальным  анализ  белков,  присутствующих  в  клеточной  стенке желатинозного  типа.  Одним  из  подходов  при  этом  может  служить  анализ белков,  элюирующих  совместно  с  тканеспецифичным   галактаном  клеточной стенки флоэмных волокон льна. 

Целью  данной   работы   было   изучение   роли  ­галактозидазы   в формировании вторичной клеточной стенки льняного волокна.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:1. провести идентификацию доминантного белка, содержащегося во фракции высокомолекулярного галактана;2. оценить  ­галактозидазную активность в участках стебля льна;β3. сопоставить содержание свободной галактозы в различных участках стебля льна;4. определить   динамику   изменения   толщины   слоев   вторичной   клеточной стенки в ходе развития льняного волокна.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫОбъектом   исследований  служили   растения   льна­долгунца   (Linum 

usitatissimum   L),   сорта  Могилевский.  Для   определения   ­галактозидазнойβ  активности и получения срезов с целью измерения толщины участки по 2 см выше  и  ниже  «точки  слома» фиксировали  в  жидком  азоте.  Для  выделения белка фиксировали волокнистую часть 10 см участков ниже «точки слома».

  Выделение  высокомолекулярного   галактана  состояло  из  получения буферорастворимой  фракции   экстракта  флоэмы   льна   и   осаждения   96% 

95

этанолом   с   последующей   хроматографией   на  Sepharose  CL­4B.  В   рамках данного опыта применяли электрофорез в 10% ПААГ с SDS (додецилсульфат натрия) по Лэмли [Остерман, 1985]. 

Определение   ­галактозидазной   активности.  β ­Галактозидазнуюβ  активность  определяли  в  экстрактах  из  2  см  участков  стебля  льна  выше  и ниже  «точки  слома».  Участки  стебля  растирали  в  ступке  с  жидким  азотом, гомогенизировали  в  10 мМ  Na­ацетатном  буфере  1:5 (рН  5,5). В  полученном гомогенате  анализировали   ­галактозидазную  активность. Для измерения  ­β βгалактозидазной   активности   в   качестве   субстрата   использовали   о­нитрофенил­ ­β D­галактопиранозид   (о­NPG,   “Sigma”,   США).  Для   анализа   к гомогенату образца добавляли равный объем субстратной смеси (4,15 мкМ  о­NPG, 1мМ  MgCl2, 0,1 М   ­меркаптоэтанол вβ  0,1 М  Na­фосфатном буфере, рН 7,0).   Контроль   –   к   гомогенату     добавляли   равный   объем   1  М  Na2CO3  и субстратной   смеси.  После  инкубации  при   30  в   течение   30  мин  реакцию останавливали  добавлением равного  объема 1 М  Na2CO3. Высвобождение  о­NP фиксировали при 420 нм на спектрофотометре (“Perkin Elmer”, США).

Моносахаридный анализ. Для моносахаридного анализа отбирали 10 мг из 2 см участков стебля льна выше и ниже «точки слома», растертых в жидком азоте.  Добавляли  50  мкл  CH3COONa  буфера   (CH3COONa  10  мM,  pH  5.5). Кипятили   пять   минут,   центрифугировали,   отбирали   супернатант.   Анализ проводили   с   помощью   метода   высокоэффективной   анионообменной хроматографии (НРАЕС) на колонке CarboPac PA­1 (4 x 250 мм, “Dionex”, США), используя   импульсный   амперометрический   детектор  PAD  (“Dionex”). Результаты анализировали с помощью программного обеспечения PeakNet.

РЕЗУЛЬТАТЫ­галактозидазная  активность  преимущественно  была  локализована  воβ  

флоэмных  волокнах,  формирующих  вторичную  клеточную  стенку,  именно  на этом   этапе   в   волокнах   начинает   активно   синтезироваться высокомолекулярный   полисахарид   ­1,4­галактан   [β Gorshkova  et  al.,   1996]. Значительную   часть   ­галактозидазной   активности   фиксировали   вβ  высокомолекулярной   фракции,   содержащей   тканеспецифичный   галактан, полисахарид,  который    может  служить  нативным  субстратом  для  фермента. При   встраивании   галактана   в   клеточную   стенку   происходят  модификации данного  полисахарида,   так   как  в   клеточной   стенке  он  обнаруживается  во фракции   прочно   связанных   с   целлюлозой   полисахаридов   с   меньшей   на порядок молекулярной массой и меньшим содержанием галактозы [Gurjanov et al., 2008], что может быть связано с ферментативным гидролизом галактозных цепочек полимера. В растениях не обнаружено эндогалактаназной активности [Brummell, Harpster, 2001], поэтому тримминг боковых цепочек галактана может осуществляться только за счет действия экзофермента ­ галактозидазы.  При анализе   данной   фракции   методом   одномерного   денатурирующего электрофореза,   был   выявлен   доминантный   белок   с   молекулярной   массой около   70   кД.   С   помощью   масс­спектрометрии   проведена   идентификация данного белка и установлено наличие в нем последовательности аминокислот, гомологичной  ­галактозидазе.β

Для   того,   чтобы   приблизиться   к   пониманию   функциональной   роли данного фермента мы провели анализ галактозидазной активности в участках 

96

стебля   льна   на   разных   стадиях   развития   волокна.  Оказалось,   что   после резкого увеличения  ­галактозидазной активности в участках стебля в районеβ  «точки   слома»,   она   продолжает   увеличиваться   и   достигает   максимума приблизительно в средней части стебля, а затем снижается. Та же тенденция наблюдалась   и   при   анализе   содержания   свободной   галактозы   в   участках стебля   льна.  Интересно,   что   максимальная   ­галактозидазная   активностьβ  наблюдалась   в   тех   участках   стебля,   в   которых  отмечали  и  максимальную толщину  внутреннего  слоя  вторичной  клеточной  стенки  флоэмных  волокон, при этом общая толщина клеточной стенки волокон постепенно увеличивалась в процессе его развития.

Известно,   что   в   ходе  формирования   вторичной   клеточной   стенки   с аксиальным   расположением   микрофибрилл   происходит   интенсивная модификация   ее   слоев:   вновь   откладываемый   (менее   зрелый   и   более оводненный) слой постепенно трансформируется в светлый, внешний слой, за счет   чего   толщина   светлого   слоя   в   ходе   развития   волокна   постоянно увеличивается.  В  то  же  время  менее  зрелый   (внутренний)  слой  продолжает постоянно   откладываться   со   стороны   плазмалеммы.   В   зрелых   волокнах внутренний  слой  полностью  исчезает,  целиком  трансформируясь  в  светлый слой   [Сальников,   2005].  Мы  предполагаем,  что   ­галактозидаза  принимаетβ  участие в трансформации слоев вторичной клеточной стенки из более рыхлых в   более   плотные.   По   всей   видимости,   фермент   гидролизует   боковые галактозные   цепочки   галактана,   что   дает   возможность   микрофибриллам целлюлозы   латерально   взаимодействовать   друг   с   другом   и  формировать более плотный слой клеточной стенки. 

  Мы   считаем,   что   функции   ­галактозидаз   в   растущих   растенияхβ  проявляются не только в росте, происходящим за счет деления и растяжения клеток,  как  следует  из  данных  литературы,  но  и  в  процессе  формирования вторичной  клеточной  стенки.  Данный  фермент  обнаружен  также  и  в  слоях клеточной  стенки  желатинозного  типа  клеток  других  растений:  в  волокнах конопли и древесины напряжения тополя, что указывает на наличие сходных механизмов  формирования  клеточных  стенок  данного  типа  и  существенную роль в них  ­галактозидазы.β

ВЫВОДЫ1. Методами   протеомики   показано,   что   доминантным   белком высокомолекулярной   галактан­содержащей   фракции   является     ­βгалактозидаза.2. С   помощью   хромогенного   субстрата     выявлен   рост   ­галактозидазнойβ  активности,   который   начинается   в   районе   «точки   слома»   и   достигает максимума в средней части стебля льна.3. Содержание  свободной  галактозы увеличивается в участках стебля льна, где   волокна   формируют   вторичную   клеточную   стенку   и   достигает максимального   значения   в   тех   же   участках,   для   которых   отмечена максимальная   ­галактозидазная активность.β4. Толщина   внутреннего   слоя   вторичной   клеточной   стенки   волокон максимальна   в   тех   участках   стебля,   где   наблюдается   максимальная   ­βгалактозидазная   активность,   а   также   наибольшее   содержание   свободной 

97

галактозы; выдвинута гипотеза об участии  ­галактозидазы в трансформацииβ  слоев вторичной клеточной стенки.

1. Остерман,  Л.А.  Хроматография  белков  и  нуклеиновых  кислот   /  Л.  А. Остерман. ­ М.: Наука, 1985. ­ 109­140 с.

2. Сальников,   В.   В.   Структорно­функциональная   функциональная характеристика   клеточных   стенок   в   растительных   тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы: Автореф. дис. … д­ра биол. наук. / Спб., 2005. – 47 с.

3. Чернова,  Т.Е.  Биогенез  растительных   волокон   /  Т.Е.  Чернова,  Т.А. Горшкова // Онтогенез. ­ 2007. ­ Т. 38. ­ С. 1­14.

4. Brummel,  D.A.  Cell  wall  metabolism  in   fruit  softening and quality  and  its manipulation in  transgenic plants / D.A. Brummel, M.H. Harpster // Plant Mol. Biol. – 2001. – V. 47. – P. 311­340.

5. Gorshkova, T.A. Cell­wall  polysaccharides of developing flax plants / T.A. Gorshkova, S.E. Wyatt, V.V. Salnikov, D.M. Gibeaut, M.R. Ibragimov, V.V. Lozovaya, N.C. Carpita // Plant. Physiol. ­ 1996. ­ V. 110. ­ № 2. ­ P. 721­729.

6. Gorshkova, T. A. Secondary cell­wall assembly in flax phloem fibers: role of galactans / T. A. Gorshkova, C. Morvan // Planta. ­ 2006.

7. Gurjanov, O. P. Polysaccharides, tightly bound to cellulose in cell wall of flax bast   fibre:   Isolation  and   identification   /  O.  P.  Gurjanov,  N.  N.   Ibragimova,  O.  T. Gnezdilov, T. A. Gorshkova // Carbohydrate Polymers. ­ 2008. ­ V. 72. ­ P. 719­729. 

98

БАКТЕРИАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСАДКА ОЗЕРА БОЛЬШОЕ ЯРОВОЕ АЛТАЙСКОГО КРАЯРафаилова Э.А., Тазетдинова Д.И.Алимова Ф.К. д.б.н., доцент; Нургалиев Д.К., д.г.н., профессорГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова­Ленина», г. Казань

BACTERIAL   DESCRIPTION   OF   SEDIMENT   FROM   THE   LAKE   BOLSHOE YAROVOYE OF ALTAY TERRITORYRafailova E.A., Tazetdinova D.I.Alimova F.K., Nurgaliev D.K.Kazan State University, Kazan

Осадки   современных   озер   являются   великолепными палеогеофизическими архивами. В них, как правило, с хорошим разрешением записаны изменения климата,  геомагнитного поля, других событий и в целом эволюции окружающей среды за последние тысячелетия [1]. Огромную роль в этих   записях   играют   широко   распространенные   в   осадках   и   осадочных породах   биогенные   магнитные   минералы,   которые   являются   результатами жизнедеятельности   бактерий   использующих   в   своем   жизненном   цикле железо.  Такие  бактерии  называются  магнитотактическими  бактериями   (МБ), т.к. способны перемещаться  вдоль силовых линий геомагнитного поля Земли. Бактерии   выращивают   кристаллы   (магнитосомы)   магнитных   минералов (магнетит  –  Fe3O4  или  грейгит  –  Fe3S4)  внутри  клетки  и  используют  их  для различных целей [2].

За  последние  35  лет  после  обнаружения  широкого  распространения  в современных осадках и водоемах остатков магнитотактических бактерий [3] их исследование продвинулось далеко вперед [2].

Магнитотактические бактерии являются гетерогенной группой прокариот с   различными   морфологическими   типами,   такими   как   кокки,   палочки, вибрионы,  спириллы  и  вероятно  многоклеточными  формами  [4].  В некоторых экосистемах МБ являются доминирующими видами бактериальной популяции и играют в них существенную экологическую роль [5].

Для исследования микробиоты нами были использованы образцы донных отложений   глубочайшего   озера   Кулундинской   степи   Большого   Ярового. Б.Яровое  озеро  – бессточное  горько­солёное  озеро в Славгородском  районе Алтайского края, расположено в западной части Кулундинской равнины, в 6 км к  юго­западу   города  Славгород.  Площадь   озера  –  53   км,   длина   11,5   км, максимальная   ширина   8   км,   глубина   7­8   метров.   Дно   сложено   илом   с прослойками мирабилита. Берега озера высокие, южная и юго­западная части изрезаны оврагами. 

Рапа   Б.Ярового   озера   близка   по   химическому   составу   к   рапе   озёр Сакское (Крым) и Тамбукан (Кавказские Минеральные Воды). Зрелая иловая грязь озера состоит из мелких частичек, мазеподобной консистенции, чёрного цвета, однородная, с запахом сероводорода. При высыхании она приобретает серо­пепельный цвет. По химическому составу грязь Б.Ярового озера сходна с озерами  Сакским  и  Тижаки.  В   то  же   время   в   ней   содержится  несколько 

99

большее количество сероводорода и брома и меньшее – гипса. Вода в озере по своему составу аналогична составу воды Мёртвого моря в Израиле и обладает ярко выраженными лечебными свойствами.

Для исследования были отобраны образцы донных отложений с глубины воды 8,5 метров и 0,12 метров в осадке. Пробы разбавляли стерильной водой в пропорции 1:2 и помещали в стерильные стеклянные сосуды на 1,5 месяца в темноту при комнатной температуре [6].

Выделение  и  морфологическое  описание  колоний  бактерий  проводили методом   посева   на   селективные   питательные   среды,   путем   разведения донного  осадка.  В   качестве   селективной  питательной  среды  использовали темно­серый агар (ACA) [Schultheiss, 2003] и среду FSM [7].

Как   показали   результаты   прямого   микроскопирования,   выделенные штаммы  бактерий  обладали   гетерогенностью.  И  были  представлены  двумя морфологическими типами: кокки и палочки. Для дальнейшей идентификации выделенных бактерий будут использованы молекулярно­генетические методы.

1. Evans   M.  Environmental   Magnetism.   Principles   and   Applications   of Enviromagnetics  /  Evans M.,  Heller  F.  //  San Diego: Academic Press. 2003. P.2992. Kopp R.E.  The  identification and biogeochemical   interpretation of   fossil magnetotactic   bacteria   /   Kopp   R.E.,   Kirschvink   J.L.   //   Earth­Science Reviews.2008. V.86. P.42–61.3. Blakemore  R.  Magnetotactic  bacteria   /  Blakemore  R.   //  Science.  1975. V.190. P.377–379.4. Schuler  D. Bacterial magnetosomes: microbiology, biomineralization and biotechnological applications   / Schuler D. // Appl Microbiol Biotechnol (1999) 52: 464­4735. Spring S. Dominating role of an unusual magnetotactic bacterium in the microaerobic zone of a freshwater sediment / Spring S., Amann R., Ludwig W., Schleifer  K.H.,  Gemerden Hv.,  Petersen N.   //  Appl  Environ  Microbiol.  1993. V.59. P.2397­24036. Flies  B.  C.  Diversity   and   vertical   distribution  of  magnetotactic   bacteria along chemical gradients in freshwater microcosms / Flies B.C., Jonkers H.M., Beer   D.,   Bosselmann   K.,   Bottcher   M.E.,   Schuler   D.  //   FEMS   Microbiology Ecology. 2005. V.52. P.185­195.7. Schultheiss  D.   Development   of   a   genetic   system   for   Magnetospirillum gryphiswaldense / Schultheiss D.,  Schuler D.  //  Arch Microbiol.  2003. V.179. P.89­948. Heyen  U.  Growth   and   magnetosome   formation  by   microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen­controlled fermentor / Heyen U., Schuler D. // Appl Microbiol Biotechnol. 2003 V.61 P.536­544

100

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИФИЦИРОВАННЫХ ДИАЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ПЛЕНОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВХалилуллин Р.Н.1, Рафаилова Э.А. 2, Панкова А.В. 2

Готлиб Е. М.1, д.т.н., профессор; Алимова Ф.К. 2 д.б.н., профессорКазанский   Государственный   Технологический   Университет1,   ГОУ   ВПО «Казанский   государственный   университет   им.  В.  И.Ульянова­Ленина»  2,  г. КазаньSTUDY   OF   BIODEGRADATION   OF   PLASTICIZED   DIACETATE   CELLULOSE FILM MATERIALSKhalilullin R.N. 1, Rafailova E.A. 2, Pankova A.V. 2

Gotlib E.M. 1; Alimova F.K. 2

Kazan State Technological University1, Kazan State University2, Kazan

В   связи   с   проблемами   загрязнения   окружающей   среды   «полимерным мусором»   актуальным   является   разработка   биоразлагаемых   упаковочных материалов на основе промышленных полимеров [1].

Основной   вклад   в   биодеградацию   отработанных   полимерных   пленок вносят,  как  известно  бактерии,  грибы  и  актиномицеты   [2].  Причем  наиболее эффективными   агентами   микробиологической   деструкции   являются микроскопические  грибы,  что  связано  с  наличием  у  них  хорошо  развитого  и мобильного ферментного комплекса [3, 4].

Одним  из  наиболее  широко  распространенных  и  особенно  агрессивных классов микроскопических грибов являются плесневые грибы [3].

Устойчивость   оценивалась   гравиметрическим   методом   по   изменению массы  образцов  в  зависимости  от  времени  экспозиции  в  агрессивной  среде. Биоразложение пленки изучалось в термовакуумном шкафу при температуре 37º в  универсальной  почве  с  влажностью  87% в  чашках  Петри  по  методике ASTN­D  5247­92   в   аэробных   и   анаэробных   условиях   (при   закапывании образцов на глубину 5 и 10см соответственно).

Исследования  показали,  что  пленки  на  основе   гомогенного  диацетата целлюлозы (ДАЦ) лучше усваиваются в качестве питательной среды грибами рода  Trichoderma,   чем   грибами   рода  Penicillium  (табл. 1).   Причем,   при применении в качестве пластификатора ТА, выражен более интенсивный рост Penicillium,  чем  при  использовании  ЭДОСа.  При  осмотре  опытных  образцов колонизация   грибами   рода  Trichoderma  составляет   25%   поверхности исследуемого материала с обоими типами исследуемых пластификаторов.

Таблица 1Грибостойкость пластифицированных диацетатцеллюлозных пленок

Тип ДАЦТип 

пластификатораГомогенный Гетерогенный

ТА 4/3 3/0ЭДОС 4/2 1/2

101

Примечание:   в   числителе   даны   показатели   оценки   грибостойкости материала по 5 бальной шкале по степени развития грибов рода Trichoderma, а в знаменателе – грибов рода Penicillium .

Пленка   на   основе   гетерогенного  ДАЦ   лучше   усваивается   в   качестве субстрата   грибами   рода  Trichoderma,   при   использовании   в   качестве пластификатора  ТА  и  хуже  при  использовании  ЭДОСа.  А  для  грибов  рода Penicillium  наилучшим   субстратом   явилась   пленка   на   основе   ЭДОСа. Биодеградация ДАЦ происходит как в результате механического разрушения разрастающимся  мицелием,  так  и   за   счет  действия  метаболитов   грибов,  в первую очередь – органических кислот.

Обобщая   полученные   экспериментальные   данные,   можно   сделать заключение,   что   тип   биодеструктанта   (биодеструктора   –   исследуемые микромицеты   и   микрофлора   универсальной   почвы,   их   метаболиты)   (класс микроскопических   грибов   или   комплексное   воздействие   кислорода, влажности,  микроорганизмов   и   продуктов   их  метаболизма   и   т.д.   в   почве) определяет влияние способа получения диацетата целлюлозы и химического строения применяемого пластификатора на деградацию пленок.

Например, ДАЦ, полученный гомогенным способом обеспечивает лучшую биологическую  деградацию  под  действием  актиномицетов.  В  то  же  время  в почве в аэробных условиях быстрее разлагаются пленки на основе диацетата целлюлозы,  полученного  гетерогенным  методом.  Причем  за  счет  протекания окислительных  процессов  лучшее  биоразложение  обеспечивает  ЭДОС,  чем ТА. 

1. Фомин  В.А., Гузеев  В.В. Биоразлагаемые полимеры, состояние и перспективы использования // Пластические массы. ­ 2001. ­ № 2. ­ С. 42–46.2. Соломатов В.И., Ерофеев В.Г., Смирнов Г.Ф. и др. Биологическон сопротивление материалов Саранск, 2001, 194 с.3. Билай В.И. Основы общей микологии, Киев, Высшая школа, 1986, 395с.4.Takce  E.T.,   Abuzic   A.A.  On   the   mode   action  of   fungel   celluloses   /   Arch. Microbiol., 1962, №2, p.36­40.

102

УМНИКЭКСПРЕСС­ДИАГНОСТИКУМ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ ОЦЕНКИ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ КРОВИСабирзянова А.З., Иванова В.В.Научный руководитель: Невзорова Т.А.Кафедра   биохимии,   биолого­почвенный   факультет,   Казанский государственный университетEXPRESS­DIAGNOSTICUM OF AUTOIMMUNE DISEASES BASED ON ASSESSMENT OF PROPERTIES OF MOLECULAR BLOOD MARKERS Sabirzanova A.Z., Ivanova V.V.Research supervisor: Nevzorova T.A.Department of  Biochemistry   ,  Faculty  of  Biology and Soil  Science  ,  Kazan State University.

Основной   задачей   здравоохранения   на   сегодняшний   день   является повышение   качества   и   продолжительности  жизни   населения.  Доступность доклинической диагностики и выбор правильной тактики лечения заболевания позволяет   принять   своевременные   меры   для   предотвращения   развития патологических процессов.

Причиной  развития  многих  заболеваний  человека  является  нарушение работы   иммунной   системы.   Аутоиммунные   заболевания   (АИЗ)   –   это заболевания,   при   которых   иммунная   система   утрачивает   толерантность   к молекулам собственного организма и с помощью антител атакует и разрушает здоровые  ткани.  К  аутоиммунным  заболеваниям  относятся   –  ревматоидный артрит, бронхиальная астма, рассеянный склероз, системная красная волчанка (СКВ) и многие другие.

Антитела   (АТ)  к  ДНК  являются  естественным  компонентом  иммунной системы,  но  в  ряде  случаев  увеличиваются  их  количество  и  патологические возможности, что приводит к развитию очагов воспалений в организме. 

На   сегодняшний   день   определение   концентрации   антител   к  ДНК   в сыворотке крови является одним из критериев, необходимых для постановки диагноза   –   аутоиммунное   заболевание.   Но   не   всегда   повышение   уровня антител   доказывает   наличие   патологии:   в   частности,   повышенное   их содержание  в  крови  наблюдается  при  беременности,  стрессах,  применении определенных   лекарственных   препаратов   и   других   состояниях,   не сопровождающихся   клиническими  проявлениями  аутоиммунных  процессов  в организме.

При патологии происходит изменение свойств АТ к ДНК, что, вероятно, и является основной причиной повышения их патологических возможностей и развития   воспалительных   реакций.   Поэтому   в   данном   проекте   основой разрабатываемого подхода к диагностике АИЗ является оценка свойств АТ к ДНК в культуре клеток. 

Идея   проекта   базируется   на   проведенных  исследованиях   влияния антител к ДНК на культивирование моноцитов крови человека и клеток почки собаки. 

Для  исследования  свойств  АТ  к  ДНК  из  сывороток  крови  клинически 

103

здоровых людей и больных СКВ были выделены АТ, свободные от иммунных комплексов.

Исследования   проводили   на   2е   и   4е   сутки   инкубации   антител   с клетками.

Полученные  данные  свидетельствует  о  том,  что  негативное  действие СКВ­антител в период обострения заболевания более выражено по сравнению с  антителами  клинически  здорового  человека,  что,  вероятно,  связано  с  их ДНК­гидролизующей   активностью   –   СКВ­антитела   ингибируют пролиферацию,   понижают  жизнеспособность   и   изменяют   метаболическую активность   клеток   эукариот.  Повышение  флуоресценции   комплекса   этидий бромид­ДНК   под   воздействием   СКВ­антител   свидетельствует   о конформационных изменениях клеточной ДНК после воздействия антител на клетки. 

Антитела к ДНК больного СКВ в период ремиссии после гормонального лечения значимого влияния на клетки in vitro не оказывают. 

Таким   образом,   в   зависимости   от   состояния   организма   изменяются свойства   антител   к  ДНК,   которые   отражаются   в   различном   воздействии антител на клетки.

104

УМНИКРАЗРАБОТКА ПОЛИПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ БЛОК­СОПОЛИМЕРОВ И ИХ БИОКОНЪЮГАТОВСагитова А.В., Булатов Э.Р., Бондарь О.В.Научные руководители: Штырлин Ю.Г., к.х.н.; Абдуллин Т.И., к.б.н.Казанский государственный университет DEVELOPMENT OF POLYPLEXES BASED ON AMPHIPHILIC BLOCK­COPOLYMERS AND THEIR BIOCONJUGATESSagitova A.V., Bulatov E.R., Bondar' O.V.Scientific advisers: Shtyrlin Yu.G, Abdullin T.I.Kazan State University

Нуклеиновые   кислоты   являются   одними   из   наиболее   перспективных лекарственных   агентов,   разрабатываемых   для   терапии   широкого   круга заболеваний  человека   [1].  Ключевой  проблемой  в   генной  терапии  является создание  безопасных  и   эффективных   векторов  для  доставки  нуклеиновых кислот  в  клетки,  которые  создаются  на  основе  природных  и  синтетических полимеров   и   являются   перспективной   альтернативой   вирусным   формам доставки.      

Целью   настоящей   работы   является   конструирование высокоэффективных   полиплексов   –   трансфекционных   комплексов нуклеиновых кислот и полимерных носителей. В качестве структурной основы для   создания   новых   полиплексов   выбраны   доступные   и   безопасные   для человека   амфифильные   блок­сополимеры   окисей   этилена   и   пропилена   – плюроники  и  полоксамины.  Биологические  и  транспортные  свойства  данных полимеров  определяются  их  физико­химическими  характеристиками   [2],  что служит основой создания полиплексов с контролируемыми свойствами.     

В  настоящей  работе  осуществлен  первый  этап  создания  полиплексов, заключающийся в химической модификации блок­сополимеров для увеличения их   способности   к   комплексообразованию  ДНК.   В   частности,   разработана методика   алкилирования   третичных   атомов   азота   дипроксамина   с образованием  аммониевых  солей.  Проведена  функционализация  плюроника L121   введением   концевых   карбоксильных   групп,   способных   к  образованию аддуктов с ДНК посредством сшивающих агентов. 

Синтезированные соединения будут использованы для создания группы полиплексов,  обеспечивающих   высокоэффективную  и  безопасную  доставку генетически активных нуклеиновых кислот в клетки человека in vitro и in vivo.

1. Parker,  A.L.  Nonviral  gene delivery:   techniques and  implications  for  molecular medicine   /  A.L.  Parker,  C.  Newman,  S.  Briggs,  L.  Seymour,  P.J.  Sheridan   // Expert Reviews in Molecular Medicine. – 2003. – №5(22). – P.1–15.

2. Kabanov, A.V. Polymer genomics: An insight into pharmacology and toxicology of nanomedicines / A.V. Kabanov //  Advanced Drug Delivery Reviews. – 2006. – №58. – P.1597–1621.

105

УМНИКПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ЭКСПРЕСС­АНАЛИЗА ДНК­ГИДРОЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИСайфуллина Д.В.Научные руководители: к.б.н. Абдуллин Т.И., Шахмаева И.И.Казанский Государственный Университет APPLICATION OF ELECTROCHEMICAL METHOD FOR RAPID ANALYSIS OF DNA­HYDROLYZING ACTIVITY OF BLOOD SERUMSaifullina D.V.Scientific advisers: PhD Abdullin T.I., Schakhmaeva I.I. Kazan State University 

Активность   ДНК­гидролизующих   ферментов   является   важным диагностическим   признаком,   и   может   изменяться   при   различных заболеваниях:   онкологических,   аутоиммунных,   сердечно­сосудистых   [1]. Актуальной задачей является разработка эффективного метода определения ДНК­гидролизующей активности на основе новых инструментов ­ биосенсоров. Нами   разработаны   чувствительные   биосенсоры   на   основе   углеродных нанотрубок   (УНТ),   которые   позволяют   напрямую   детектировать   ДНК благодаря каталитическому действию УНТ [2].

С   помощью   различных   электрохимических   методов   мы   исследовали окисление ДНК на электроде, модифицированном УНТ, после гидролиза ДНК сыворотками   крови.  Уменьшение  молекулярной  массы  ДНК   под  действием ДНК­гидролизующих белков сыворотки приводило к увеличению сигнала ДНК на  модифицированном  электроде  вследствие  изменения  адсорбции  ДНК  на УНТ.  Соответствующие  вольтамперограммы  ДНК  содержали  2 пика:  первый при  потенциале   +0.8  В  соответствует   сывороточным  белкам,  а  второй  при потенциале +1.1 В – фрагментам ДНК, образовавшимся в процессе гидролиза. Мы сравнили активность сыворотки  до и после ее температурной  обработки при  57°С  по  изменению  сигнала  биосенсора.  Такая  обработка  приводила  к частичному   уменьшению   сигнала   ДНК   вследствие   инактивации   ДНК­аз. Остаточная   активность   предположительно   соответствует   сывороточным фосфодиэстеразам  и антителам к ДНК.  Оптимизированы  условия гидролиза ДНК сывороткой крови для получения воспроизводимого сигнала биосенсора. Оценена   ДНК­гидролизующая   активность   сывороток   крови   25   условно здоровых доноров ­ женщин возрастом 25­50 лет. Значения сигнала окисления ДНК в норме для исследуемой выборки лежат в интервале от 0.357 до 1.161 мкА с 95% достоверностью.

Разработанный метод пригоден в медицинской практике для экспресс­диагностики   заболеваний,   сопровождающихся   изменением   ДНК­гидролизующей активности сыворотки крови и ее компонентов. 

1. Барановский, А.Г. Дезоксирибонуклеазы человека (обзор) / А.Г. Барановский, В.Н. Буиева, Г.А. Невинский // Биохимия. – 2004. – Т. 69. – Вып. 6. – С. 720­741.

2. Абдуллин,   Т.И.   Биосенсоры   на   основе   углеродных   нанотрубок   для характеристики структуры ДНК / Т.И. Абдуллин, О.В. Бондарь, А.А. Ризванов, И.И.Никитина   //  Прикл.  Биохимия  и  микробиология.  –  2009.  –  Т.45.  –  №2.  – С.252­256.

106

НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ИНФЕКЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ПОЧВСахадиев И.А., Рябичко С.С., Иванова В.В.Научный руководитель: Алимова Ф.К., д.б.н., профессор, Григорьян Б.Р., д.б.н., профессорКазанский Государственный Университет им. В.И. Ульянова­Ленина

A new approach to reduction grave infection of soilSahadiev I.A., Ryabichko S.S., Ivanova V.V.The supervisor of studies: Alimova F.K., PhD, Professor,Grigoriyan B.R., PhD, ProfessorKazan State University named V.I. Uliyanov­Lenin

Уровень   инфекционной   нагрузки   почвы   напрямую   влияет   на урожайность   возделываемых   культур.   Такие   грибы   –   фитопатогены   как Fusarium и  Alternaria при развитии и распространении способны приводить к потере  урожая зерновых  до  20­50%. Кроме  того, рост  патогенов  приводит  к накоплению  токсических  метаболитов   (микотоксинов),  вызывающих  тяжёлые отравления  и  негативно  влияющих  на  многие  органы  человека  и  животных. Действие многих из них до конца не изучено.

Новый   подход   к   снижению   инфекционного   фона   заключается   в применении   комплексного   изучения   влияния   вносимых   в   почву   изменений: фунгицидов, биологических препаратов, естественных метаболитов растений. Для   оценки   изменений   структуры   почвенной   микробиоты   проводится картирование  сообщества  микроорганизмов  плодородных  почв.  Зависимость баланса видов – патогенов и их антагонистов также строится и на данных по типам почв и их физико­химическим свойствам.

В   работе   впервые   демонстрируется   использование   космических аэрофотосъёмок  для   сельскохозяйственных   нужд.  Таким   образом,   каждой территории   соответствует   микробиологическая   карта,   почвенная   карта   и данные   по   севообороту   и   применяемым   агротехническим   методам   за последние 5 лет.

Одновременно   картирование   микробиоты   проводится   несколькими методами:   классическими   микробиологическими   (разложение   почв   на различные   питательные   среды   и   количественный   учёт   методом   посева разведений)  и  более  новыми  методами  биохимии  и  молекулярной  биологии (иммуноферментный   анализ   и  ПЦР).   Результат   сравнения:   выбор   метода, характеризующегося   приемлемым   оптимумом   между   экономической эффективностью и научной значимостью.

Продуктом совместной работы почвоведов, биохимиков и микробиологов будет таблица рекомендаций  по обработке семян и посеву в зависимости от состояния   почвы:   структуры   почвы,   микробиологического   состава   и инфекционного   фона,   окислительно­восстановительного   потенциала   и ферментативного пула. Предлагаемая таблица увеличит севооборот и снизит инфекционную   нагрузку   почв   за   счёт   комплексного   и   рационального воздействия,   что   является   большим   преимуществом   по   сравнению   с имеющейся  системой  воздействия  на  определённый  патоген,  экологическую нишу которого может занять другой.

107

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ   ­ 480 С/Т  и  +1075 А/С ГЕНА  HL С РИСКОМ РАЗВИТИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА У НАСЕЛЕНИЯ РТСунгатуллина Л.М.Кравцова О.А., к.б.н, ст. преподавательКазанский государственный университет, кафедра биохимииASSOCIATION BETWEEN ­ 480 С/Т  AND  +1075 А/С POLYMORPHISMS OF THE HL GENE AND ATHEROSCLEROSIS IN THE POPULATION  OF THE REPUBLIC OF TATARSTANSungatullina L.M.Kravtsova O.A., Ph.D. in biology,  senior teacherKazan State University, the department of biochemistry

Атеросклероз   (АТ)  является    одной    из    наиболее    частых    болезней современности. Ежегодно в России от сердечно­сосудистых заболеваний ССЗ умирают   более   1   млн.   человек.   Среди   них   ведущее   место   занимает ишемическая   болезнь   сердца,   преимущественно   обусловленная атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

Сложный механизм формирования клинического фенотипа заболевания обусловлен большим количеством генов, вовлеченных в патогенез АТ.Современная концепция этиопатогенеза АТ включает в себя общие положения о  мультифакторности  и  полигенности   этой  патологии,  а  также  о  сложном характере   взаимодействия   генетических  факторов   с  факторами   среды   в процессе развития заболевания.

На   сегодняшний  день   генная   сеть,   участвующая  в  развитии  данного заболевания,   включает  свыше 200 генов. Известно, что ключевым моментом патогенеза  АТ  является  накопление  липидов  в  сосудистой  стенке,  поэтому гены ферментов липидного обмена рассматриваются как одни из кандидатных генов АТ. Среди них хорошо изученным является ген липазы печени (HL).Имеющиеся   в   литературе  данные  о   связи  АТ   с  полиморфизмами   гена   HL противоречивы.   Хотя   является   доказанным   факт   влияния   данного полиморфизма   на   активность   липазы   печени   в   плазме   крови,   существуют противоречия  в  отношении  ассоциации,  проведенных  во  многих  популяциях мира   данного   полиморфизма   с   другими   ССЗ   [2­9].   Возможно, противоречивость   данных   объясняется   этническим   составом   обследуемых групп.

 В связи с выше изложенным, целью настоящего исследования явилось выявление ассоциации точечных мутаций в промоторной и экзонной областях гена   липазы   печени   с   риском   развития   АТ   коронарных   артерий   в   двух популяциях, русских и татар, Республики Татарстан.

Генотипирование   по   полиморфным   локусам   было   проведено   у   107 больных АТ и 119 человек контрольной группы. Геномную ДНК из лейкоцитов венозной   крови   выделяли   методом   фенол­хлороформной   экстракции   с некоторыми  модификациями.  Анализ   генетических  полиморфизмов   гена  HL осуществляли   методом   полимеразной   цепной   реакции   с   последующим рестрикционным  анализом.  Статистическую  обработку  данных  проводили   с 

108

помощью  критерия   2,  оценку  ассоциаций  полиморфизмов  генов  с  помощьюχ  расчета относительного риска (ОR) [1].Согласно результатам исследования, полиморфный вариант ­480С/Т гена   HL вовлечен   в   развитие   атеросклероза   в   Республики   Татарстан.   Показана ассоциация данного полиморфного локуса с риском развития атеросклероза у мужчин  в  этнической   группе  татар   (ОR  для   генотипа  СС  составил   4,09).В популяции русских не обнаружено достоверной связи данного полиморфизма с риском развития атеросклероза. Повышенный уровень общего  холестерина (>5,2 ммоль/л)  в  популяции  татар  ассоциирован  с  генотипом  СС  гена  HL(ОR =2,63). В обеих исследованных популяциях показано отсутствие достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфизма +1075А/С между больными АТ и лицами группы контроля. Результаты  исследования  могут  служить  основой  для  формирования   групп повышенного   риска   атеросклероза   и   разработки   дифференцированных программ   профилактики   заболевания   у   конкретного   человека   с   учетом данных генотипирования в популяциях русских и татар Республики Татарстан. 

ЛИТЕРАТУРА1. Животовский, Л.А. Популяционная биометрия / Л.А. Животовский. – М.: Наука, 

1991. – 270 с. 2. Austin,   M.A.,   Atherogenic   lipoprotein   phenotype.   A   proposed   genetic   marker   for 

coronary   heart   disease   risk   /   M.A.   Austin,   M­C.  King,   K.M.   Vranizan,   et   al.   // Circulation. ­  1990.  – Vol.82 – P.495–506.

3. Deeb, S. Common variants in the promoter of the hepatic lipase gene are associated with   lower   levels   of   hepatic   lipase   activity,   buoyant   LDL,   and   higher   HDL2 cholesterol / S. Deeb, A. Zambon, J. Hokanson et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 1998. – Vol.18. – P.1723­1729.

4. Gehrisch, S. Mutations of the human hepatic lipase gene in patients with combined hypertriglyceridemia/hyperalphalipoproteinemia and in patients with familial combined hyperlipidemia /  S. Gehrisch, H. Kostka, M. Tiebel et al.   //  J Mol Med. – 1999. – Vol.77. – P.728­734.

5. Gundoglu,  F.  Association  between   ­514C­­>T  polymorphism of   the  hepatic   lipase gene and coronary artery disease in a Turkish population / F. Gundoglu, Y. Gurlertop, I. Pirim et al. // Acta Cardiol. – 2008. – Vol.63 (2). – P.197­202.

6. Hokanson, J. A Common Promoter Polymorphism in the Hepatic Lipase Gene (LIPC­480C>T)   Is   Associated   With   an   Increase   in   Coronary   Calcification   in   Type   1 Diabetes / J. Hokanson, S. Cheng, J. Snell­Bergeon et al.  //  Diabetes.   – 2002. – Vol.51. – P.1208­1213.

7. Jansen H. Common C­to­T substitution at position ­480 of the hepatic lipase promoter associated  with  a   lowered   lipase  activity   in  coronary  artery  disease  patients   /  H. Jansen, A.J. Verhoeven, L. Weeks et al. //  Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 1997. – Vol.17. – P.2837­2842.

8. McCaskie, P.A. The C­480T hepatic lipase polymorphism is associated with HDL­C but not with risk of coronary heart disease  / P.A. McCaskie, G. Cadby, J. Hung et al. / Clin.Genet. – 2006. – Vol.70. – P.114­121.

9. Murtomaki,   S.   Hepatis   lipase   gene   polymorphisma   influence   plasma   HDL   levels. Results   from   Finnish   EARS   participants   /   S.   Murtomaki,   E.   Tahvanainen,   M. Antikainen et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 1997. – Vol.17. – P.1879­1884.

109

ИЗУЧЕНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ BACILLUS INTERMEDIUSТойменцева А. А., Шарипова М.Р. д.б.н., проф.Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаINVESTIGATION OF PROMOTERS’ REGIONS OF SERINE PROTEASES BACILLUS INTERMEDIUSToymentseva A.A.,Sharipova M.R. Doctor of Biology, Prof.Kazan State University

Протеазы   микробного   происхождения   становятся   всё   более популярными  объектами  исследований.  Одной  из  основных  причин  является практическая  важность  протеаз   ­  способность  к  ферментативному  синтезу пептидов.   В   тромболитической   терапии   бациллы   являются   наиболее перспективными   продуцентами   фибринолитических   ферментов   из­за   их доступности  и  возможности  легкого  контроля  нежелательных  последствий. Показано,   что   бактерии  Bacillus  intermedius  секретируют   внеклеточные сериновые   протеиназы,   которые   обладают   фибринолитическими   и тромболитическими   свойствами.   Т.о.,   поиск   новых   продуцентов   протеаз является   сегодня   перспективным   с   целью   увеличения   выхода   целевых ферментов.

Изучение   сериновых   протеаз   имеет   к   тому   же   фундаментальное направление, т.к. они представляют собой удобную модель для исследования молекулярных механизмов координации метаболических путей бактериальной клетки.

Субтилизиноподобная   протеиназа  AprBi  доминирует   в   клетках B.intermedius  и  является  одним  из  важнейших  ферментов  обеспечивающих пролиферацию   клеток   в   стрессовых   условиях,   способствует   созреванию эндоспор  и  освобождению  их  в  среду.  В  основе  формирования  адаптивных ответов   лежит   механизм   сигнальной   трансдукции   ­   это   сборная   группа процессов,   приводящих   к   экспрессии   генов   стрессорных   белков,   включая ферменты  деградации.  Последовательность   этого   гена   секвенирована   (AY 754946)  и  занесена  в  базу  данных.  Интересно  также,  что  синтез  протеазы AprBi   начинается   с   нестандартного   кодона   GTG.   Другая   протеаза B.intermedius  ­ глутамилэндопептидаза, продукт гена  gseBi, обладает высокой специфичностью   к   остаткам   глутаминовой   и   аспарагиновой   кислотам. Фермент   выделен   из   культуральной  жидкости,     ген   белка   клонирован   и секвенирован   (AN   Y15136).     Фермент   представляет   интерес   для направленного синтеза олигопептидов. Известно, что в промоторах генов aprBi и  gseBi  тандемно   расположены   потенциальные   сайты   для   связывания   с регуляторными белками двухкомпонентных систем трансдукции сигнала DegS­DegU,  Spo0A,   а   также   для   связывания   с   белком   системы   катаболитной репрессии  CcpA,  плейотропным  регулятором   ­  AbrBi.  Однако  на  настоящий момент   механизмы   регуляции   биосинтеза   данных   ферментов   изучены недостаточно.

Для изучения промоторов генов и оценки их роли в процессе активации ферментов,   самым   распространенным   инструментом   является   технология 

110

создания  fusion­конструкций   на   основе   репортёрного   гена   и   изучаемого промотора.  Были созданы  генетические  конструкции  на  основе  промоторных регионов   сериновых   протеаз  B.intermedius  и   репортёрного   гена  lac­Z  с использованием векторов  pAC6 и  pDG1661. Для этого были сконструированы праймеры   ограничивающие   области   регуляции   обеих   протеаз.   Проведено секвенирование   конструкций.   Планируется   исследование   полученных конструкций   в   рекомбинантных   клетках  B.subtilis  c  целью   выяснения промоторспецифичности  каждого  из  генов  ферментов,  а  также  объяснения участия обеих протеаз в физиологии клеток бацилл.

Авторы   выражают   благодарность   проф.   Физико­химического   Института города Париж, Франция (Patrick Stragier), проф. Технологического Института города Карлсруэ, Германия  (Thorsthen Mascher) за любезно предоставленные для работы векторы экспрессии.

111

ВЛИЯНИЕ 24­ЭПИБРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ МЕМБРАННО­СВЯЗАННЫХ БЕЛКОВ КОРНЕЙ ГОРОХА. Са2+­ЗАВИСИМЫЙ ЭФФЕКТУсманова Р. Ш.*Научный  руководитель:  Федина  Е.  О.**  к.б.н.,  н.с.  лаборатории  сигнальных системУчреждение   Казанского   института   биохимии   и   биофизики   Казанского научного   центра   РАН**,   кафедра   биохимии   Казанского   государственного университета*24­EPIBRASSINOLIDE   INFLUENCE   ON   TYROSINE   PHOSPHORYLATION   OF MEMBRANE­BINDING PROTEINS OF PEA ROOTS. Са2+­DEPENDENT EFFECTUsmanova R. Sh.*The scientific adviser: Fedina E.O.** PhD, laboratory of signal systemsKazan   institute   of   biochemistry   and   biophysics   of  Кazan   Scientific   Centre,   the Russian   Academy   of   Sciences   **,   biochemistry   department   of   Kazan   State University*

Цель   исследований   заключалась   в   изучении   влияния   24­эпибрассинолида   (ЭПБ),  одного  из  активных  представителей  фитогормонов стероидной   природы,   на   тирозиновое   фосфорилирование   мембранно­связанных  белков  корней  гороха.  Поскольку  известно,  что  Са2+  участвует  в регуляции пост­трансляционных модификаций белков, мы также исследовали роль   этого   вторичного   мессенджера   в   ЭПБ­индуцированном   тирозиновом фосфорилировании мембранно­связанных белков. 

Участие   Са2+  в   регуляции   фосфорилирования   белков   оценивали   с помощью   растений,   выращенных   на   оптимальной   среде   роста   и   на  Са2+­дефицитной   среде.   Тирозиновое  фосфорилирование   мембранно­связанных белков   корней   гороха   определяли   с   использованием   одномерного электрофореза   с   последующим   Вестерн­блот   анализом   с   применением моноклональных антител к фосфотирозиновым белкам PY20. 

Было  выявлено,  что  в  корнях  растений,  выращенных  на  оптимальной среде   роста,   ЭПБ   в   концентрации   0,1   мкМ   за   20   мин   снижал   уровень тирозинового фосфорилирования белков с молекулярной массой 45 и 47 кДа по  сравнению  с  контролем,  что  может  быть  связано  с  «запуском» событий, активирующих   тирозиновые   протеинфосфатазы   либо   ингибирующих тирозиновые   протеинкиназы.  Повышенное   содержание  фосфотирозиновых белков  контрольного  варианта  у растений,  выросших  на  оптимальной  среде, может   указывать   на   активацию   протеинкиназ,   в   том   числе   МАП­киназ. Показано,   что   эти   протеинкиназы   активируются   в   первые   минуты   после действия  стрессора   (в  нашем  случае   ­  это  отделение  корня  от  побега)  и  к часовым   промежуткам   их   активность   падает.   Подобный   эффект   мы наблюдали   в   нашем   эксперименте:   к   2   часам   уровень   тирозинового фосфорилирования   белков   контрольных   растений,   выращенных   на оптимальной среде, снижался по сравнению с контрольным вариантом за 20 мин. ЭПБ за 2 часа также приводил к снижению интенсивности тирозинового 

112

фосфорилирования  выявленных  белков,  которую  мы  наблюдали  за   20  мин действия  фитогормона.  В  корнях  Са2+­дефицитных  растений  была  выявлена повышенная интенсивность тирозинового фосфорилирования белков 45 и 47 кДа,   которое  не  изменялось  во  времени  ни   в   контрольном,  ни  в  опытном варианте. 

Таким  образом,  можно  заключить,  что  регуляция  уровня  тирозинового фосфорилирования мембранно­связанных белков 45 и 47 кДа является Са2+­зависимым процессом. Более того, эффект фитогормона эпибрассинолида на изменение   интенсивности   тирозинового   фосфорилирования   этих   белков также зависит от  Са2+. 

113

УМНИКРАЗРАБОТКА СПОСОБА ЭКСПРЕСС­ОЦЕНКИ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫАвтор: Фирсова Светлана СтаниславовнаНаучный руководитель: Фролова Людмила Леонидовна, к.т.н., доц. ГОУВПО "Казанский государственный университет им.В.И. Ульянова­Ленина"DEVELOPMENT OF EXPRESS METHOD FOR ENVIRONMENT ECOLOGICAL ESTIMATION Author: Firsova Svetlana Stanislavovna Scientific adviser: Frolova Ludmila Leonidovna, Ph.D., Associate ProfessorKazan State University

В   результате   хозяйственной   деятельности   человека   нарушается экологический баланс природной среды, что негативно влияет на здоровье и качество  жизни  людей.  Известно, что  водоемы  и  реки,  собирая  стоки  талых вод и атмосферных осадков, объективно отражают экологическое состояние окружающей среды.

Биотическая часть водной экосистемы организована в виде трофической пирамиды, по состоянию нижних уровней которой, оценивают состояние всего водоема. Являясь основой трофической пирамиды, планктон быстро реагирует на   загрязнители   любого   типа   через   изменение   видового   состава.   Это позволяет   выявить   различные   стадии   негативного   воздействия   на окружающую  среду,  и выяснить  периодичность загрязнения  [1,2].  Известные способы   биоиндикации   водоемов   часто   не   позволяют  быстро   получить достоверную   информацию   об   экологическом   состоянии   среды   и   принять адекватные   природоохранные   меры.   К   тому   же,   нет   единства   взглядов специалистов   при   выборе   видов   гидробионтов,   используемых   в   качестве индикаторных.  Многочисленные   попытки   создания   единой   системы биоиндикации   так   и   не   привели   к   созданию   общепринятой   простой   и эффективной в использовании системы.

По   результатам   исследований   созданы   предпосылки   и   обоснована возможность   создания   СПОСОБА   биологической   индикации   на   основе мультигенного анализа планктонных организмов, повышающего достоверность диагностики  экологического  состояния окружающей  среды,  В исследованиях использованы   нуклеотидные   последовательности   из   международной   базы данных   GenBank.   Поиск   гомологов   проведен   компьютерной   программой BLASTn,   множественное   выравнивание   ­   программой   ClustalW, филогенетические   деревья   построены   программой   Phylip   методом максимальной экономии.

Разрабатываемый   способ  базируется   на   современных   методах молекулярной   генетики  и  биоинформатики,   позволяет   использовать инструментальный   анализ   2­х   генов   –   вместо   визуального   анализа   600 индикаторных   организмов   по   стандартной   методике.  Технология инструментальной   оценки  генных   изменений   планктона   водоемов универсальна, быстра и удобна в применении, позволит получать объективную достоверную   информацию   о   состоянии   водоемов,   освобождая   от 

114

субъективности экспертной оценки.Патентные  исследования  показали  наличие  новизны  разрабатываемого 

способа.

1. Sladechek,   V.   System   of   water   quality   from   the   biological   point   of view; / V.Sladechek,  Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol., 1973. ­С. 179­191.

2. Баринова,   С.С.   Биоразнообразие   водорослей­индикаторов окружающей среды / С.С. Баринова, Л.А. Медведева, О.В. Анисимова. ­ Тель­Авив: Pilies Studio, 2006.­498 с.

115

ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИТЕЛ С ДНКХабибуллина А.А., Гилязетдинова К.Б.Невзорова Т.А., к.б.н., доцентКазанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаINFLUENCE   OF   REACTIVE   OXYGEN   SPECIES   ON   INTERACTION   OF ANTIBODIES WITH DNAKhabibullina A.A., Gilyazetdinova K.B.Nevzorova T.A., с.b.s., associate professorKazan State University named V.I. Ulyanov­Lenin

В   основе   большинства   заболеваний   человека   лежат   аутоиммунные процессы,   при   которых   иммунная   система   атакует   собственные   антигены. Среди   аутоиммунных   заболеваний   человека   наиболее   распространена системная красная волчанка (СКВ), которая представляет собой хроническое заболевание  соединительной  ткани  и  сосудов.  Характерным  признаком  СКВ является  высокий  уровень  в  сыворотках  крови  больных  аутоантител  (ААТ)  к нативной   ДНК   класса   IgG,   которые   предположительно   ответственны   за развитие патологического процесса.

С   другой   стороны   известно,   что   эти   патологические   состояния сопровождаются повышением образования активных форм кислорода (АФК), которые могут приводить к изменению нуклеиновых кислот, белков, липидов, тем самым, вносить вклад в развитие  патологии, в  том числе  вмешиваясь во взаимодействие антител с нуклеиновыми кислотами. Появившиеся в организме модифицированные   нуклеиновые   кислоты   могут   стимулировать   выработку большого   количества   ААТ,   реагирующих   с   ДНК,   причем   антитела   к нуклеиновым   кислотам   могут   проявлять   ферментативную   активность   ­ гидролизовать   ДНК,   РНК.   Однако   механизмы   появления,   возникновение ферментативной  активности,  биологическая  роль  ААТ  не  изучены  как  ДНК­связывающих, так и ДНК­гидролизующих. Изучение специфичности антител к ДНК   даст   возможность   приблизиться   к   пониманию   механизмов взаимодействия  с  антигеном,  биологической  роли  и  причин  гиперпродукции ААТ в организме. Целью   работы   явилось   изучение   влияния   активных   форм   кислорода   на взаимодействие антител с ДНК.В   качестве   объектов   исследования     были   использованы   сыворотки   крови здоровых  доноров,  больных  СКВ,  РА,  а   также   заболеваниями  щитовидной железы (АИТ, ТПО). Оказалось, что флуоресценция белков сывороток крови здоровых   доноров,   больных   СКВ,   заболеваний   щитовидной   железы приблизительно одинакова, а у больного РА и больного АИТ флуоресценция белков   увеличивается,   что   свидетельствует   о   высоком   содержании ароматических  остатков.  В  дальнейшем  АТ  сывороток  крови  инкубировали  с препаратами ДНК. В работе использовали ДНК крови здорового донора и при СКВ.  В  качестве  экзогенных  ДНК  использовали  ДНК  эритроцитов  цыплят  и ДНК   тимуса   теленка   и   в   качестве   дополнительных   контролей   в   работе использовали   ДНК   эритроцитов   цыплят   и   ДНК   тимуса   теленка, 

116

модифицированные   гидроксильным   радикалом.  Для   изучения   возможного влияния   АФК   в   инкубационную   смесь   добавляли   перекись   водорода. Оказалось, что перекись приводит к изменению флуоресценции антител, что свидетельствует   о   влиянии   перекиси   на   процесс   образования   иммунных комплексов.Изменение   флуоресценции   антител   с   экзогенными   ДНК   отличается   от флуоресценции   антител   с   ДНК   крови   человека,   следовательно,   можно предположить о специфичности антител к ДНК различных видов. Так же было показано,   что   АТ   по­разному   взаимодействуют   с   АФК­модифицированной экзогенной  ДНК,  и  таким  образом,    у  антител  сывороток  крови  человека  в норме   и   при   патологии   по­разному   изменяется   флуоресценция   при взаимодействии с ДНК и свидетельствует о различных свойствах АТ в норме и при патологии.Различное   изменение   флуоресценции   антител   после   инкубации   с   ДНК человека свидетельствует о различиях во взаимодействии антител с ДНК, что может быть связано и с изменением структуры самого антигена.По  результатам  измерения  флуоресценции  комплекса  этидиум  бромид­ДНК после   инкубации   без   АТ,   оказалось,   что   перекись   водорода   приводит   в основном   к   увеличению   флуоресценции   комплекса,   а   увеличение флуоресценции  АФК­модифицированной  ДНК  связано  с конформационными изменениями   молекулы   ДНК   за   счет   одноцепочечных   разрывов.   По результатам   электрофореза   было   показано,   что   после   инкубации   с   АТ изменения   флуоресценции   АФК­модифицированных   ДНК   незначительны, следовательно,   можно   предположить,   что   АТ   обладают   минимальным сродством   в  АФК­ДНК.  Наибольшее   изменение  флуоресценции   комплекса этидиум   бромид   ДНК   наблюдается   после   инкубации   с   патологическими антителами больных СКВ, РА, заболеваниями щитовидной железы.Таким   образом,   можно   предположить,   что   при   аутоиммунных   патологиях изменяются   свойства  АТ   и   их   специфичность,   что  может   быть   связано   с наличием ДНК­гидролизующей активности у АТ.

117

УМНИКМИКРОБНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ЭКСПРЕСС­ДЕТЕКЦИИ ТОКСИЧНЫХ НИТРОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙХиляс И.В., Сафиуллина Л.Ф., Зиганшин А.М.,профессор, д.б.н. Наумова Р.П.Казанский Государственный Университет им. В.И. Ульянова ­ Ленина420008, г. Казань, ул. Кремлевская 18MICROBIAL BIOSENSORS FOR EXPRESS­DETECTION OF TOXICAL NITROAROMATIC COMPOUNDS Khilyas I.V., Safiullina L.F., Ziganshin A.M.professor, sc.d. Naumova R.P.

Актуальной проблемой экологического контроля является обнаружение поллютантов   в   сточных   водах   промышленных   предприятий.   К   числу распространенных   групп   ксенобиотиков   относятся   нитроароматические соединения,   которые   присутствуют   в   стоках   химических   предприятий, производящих  взрывчатые  вещества,  красители, пестициды.  Представителем данной  категории  ксенобиотиков  является   2,4,6­тринитротолуол   (ТНТ).  Для снижения   техногенного   влияния   ТНТ   и   его   производных   на   объекты природной   среды   необходимо   создание   эффективного   экспресс­метода определения содержания данного поллютанта в сточных водах.

Нитротолуолы,   в   частности,   2,4,6­тринитротолуол,   могут   быть определены   методами   УФ­видимой   спектрофотометрии   и   хроматографии. Данные методы являются высокочувствительными, но в то же время дорогими, в   связи   с   чем   актуальным   является   разработка   биосенсорного   подхода. Биосенсорная   детекция   токсичных   нитроароматических   соединений   может быть  использована  для  оценки  состояния  объектов  окружающей  среды  на стадии   экологического   мониторинга,   а   также   при   использовании биотехнологических подходов ремедиации загрязненных объектов. 

Клетки   микроорганизмов     обеспечивают   широкие   возможности   по созданию биосенсорных аналитических устройств. Использование в качестве рецепторного   элемента   клеток   микроорганизмов,   которые   обладают специфическими   ферментными   системами   деградации   ксенобиотиков, является   одним   из   наиболее   распространенных   подходов   при   создании биосенсорных  анализаторов,  предназначенных  для  экологического  контроля. Аэробные   дрожжи  Yarrowia  lipolytica,   способные   осуществлять   полную минерализацию   ТНТ,   были   выбраны  для   создания   рецепторного   элемента биосенсора   для   детекции   нитроароматических   соединений.   Уникальность данного   экспресс­метода   основана   на   способности   штамма   дрожжей Y.lipolytica  трансформировать   исходный   ксенобиотик   с   образованием окрашeнных  моно­  и  дигидридных  комплексов,    что  является  альтернативой использование   дорогих   и   трудоемких   методов   определения   данного поллютанта. 

Результаты   данного   исследования     означают   прогресс   в   области оперативной и чувствительной детекции экологически опасных ксенобиотиков в экологическом мониторинге, контроле очистки сточных вод и самоочищении химически загрязненных почв. 

118

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ НА ЭКСПЛАНТАХ КУКУРУЗЫХоанг Л. Т.1

Ларская И. А.² к.б.н., н.с.«Казанский   государственный   университет   им.  В.  И.Ульянова­Ленина»  1,   г. Казань«Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН» ², г. Казань

STUDY OF ROOT FORMATION IN MAIZE EXPLANTSHoang L.T. 1

Larskaia I. A.2 

«Kazan State University» 1, Kazan«Kazan institute of biochemistry and biophysics  of KazSRC of RAS» ², Kazan

Ризогенез   –  сложный  и  до  конца  не  изученный  процесс,  несмотря  на большое   количество   работ   в   этой   области  [1].   В   качестве   объекта исследования используются кусочки («cuttings»)  [2], вырезанные из различных органов  растений  и  тонкослойные  экспланты   («thin­layer   explants»   ­  ТСЭ)   – разрезанные   вдоль кусочек на две половинки. На сегодняшний день ни одна из   используемых   модельных   систем   не   может   претендовать   на универсальность, и вопрос выбора  решается в зависимости от поставленных задач.  Кроме  того,  следует  отметить,  что  наиболее  часто  в  исследованиях процесса   ризогенеза   использовались   экспланты   из   растений   класса двудольных и практически не было работ по приготовлению модельных систем из однодольных культур, которые, широко используются в практике сельского хозяйства.

Поэтому  целью  данной  работы  являлся  подбор  оптимальных  условий культивирования   эксплантов   из   проростков   однодольную   обыкновенную  кукуруру   (Zea  mays)  сорта  Краснодарского.  Растения  выращивали  в  чашках Петри   с   агаризованной   средой  MS/2   (Murashige,  Skoog).  После   48   часов вырезали   из   эпикотиля   или   корня   тонкослойные   экспланты   и   кусочки, помешали   их   в   чашки   Петри   с   различными   средами   культивирования   и различными  фитогормонами  в  зависимости  от  поставленной  задачи.  Чашки Петри заклеивали плёнкой Parafilm и ставили в термостат при температуре 25 ºС.  Подсчёт  корней  проводили  визуально  начиная  с   5­6  дня  после  начала культивирования и продолжали в течение двух неделей, после чего подсчёт затруднялся из­за развития корней.

Было показано, что1. Оптимальной   концентрацией   ИУК   (3­идулилуксусная   кислота)   для 

корнеобразования эксплантов из корней кукурузы является 3мкМ.2. ИУК   является   наиболее   эффективным   среди   всех   протестированных 

гормонов   ауксинового   типа   (нафталилуксусная     кислота   и   2,4­дихлорфеноксиуксусная кислота).

3. Для   исследования   процесса   ризогенеза   кусочки   имееют   преимущества перед тонкослойными эксплантами, приготовленными из той же ткани. 

119

4. Среда  MS/2  подходит  для  формирования  корней  на  кусочках  из  корней кукурузы.  На   среде  В5  (Gamborg  et   al.)  при   тех  же   условиях   корни  не формируются. 

5. При приготовлении эксплантов из эпикотилей, корней проростков кукурузы следует использовать растения с длиной верхней и нижней части не менее 2­3см.

6. Наибольшей способностью формировать корни обладает средний участок (1см выше и ниже семени) как эпикотиля, так и корня.

7. Кусочки   корня   образовывают   большее   количество   адвентивных   корней, кусочки эпикотиля при равных условиях культивирования.

120

ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ В СЫВОРОТКЕ И ВЗВЕСЯХ МОНОЦИТОВ БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМАвтор  Хорошева Анастасия Евгеньевна Студентка III курса Группа 160Научный руководитель к.м.н., с.н.с. ЦНИЛ КГМА  Арлеевская Марина Игоревна Центральная научная исследовательская лаборатория Казанской государственной медицинской академииLIPID PEROXIDATION IN SERUM AND SUSPENSIONS OF MONOCYTES IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITISAuthor Horosheva Anastas Evgenevna the Student of III rate Group 160The supervisor of studies к.м.н., с.н.с. ЦНИЛ КГМА Arleevskaja Marina Igorevna The central scientific research laboratory of the Kazan state medical academyВ  развитии  и  РА,  и  атеросклероза  важное  место  занимает  интенсификация процессов перекисного окисления липидов.  В   ЦНИЛ   КГМА   получены результаты,   свидетельствующие   о   существовании   особенностей   структуры липидного   слоя   клеточных   мембран   моноцитов,   оказывающие   влияние   на функционирование   клеток.   Мы   предположили,   что   эти   структурные особенности   могут   изменить   динамику   или   интенсивность   процесса перекисного   окисления   липидов   клеточных  мембран  моноцитов.  В   связи   с вышеизложенным, целью работы было исследование интенсивности процессов перекисного   окисления   липидов   в   сыворотке   и   взвесях   моноцитов, активированных   опсонизированным   зимозаном   (по   содержанию   ТБК   – активных продуктов) у больных РА. Задачи исследования:  1. Сравнение уровней активных продуктов ПОЛ в сыворотке крови     больных РА и здоровых женщин.                   2.   Подбор   условий   эксперимента   по исследованию   интенсивности   перекисного   окисления   липидов   в  моноцитах сосудистого русла в динамике после активации опсонизированным зимозаном. Методы   исследования Выделение  моноцитов крови. Получение сыворотки крови. Определение ТБК­активных продуктов в сыворотке крови. ТБК ­ Активные продукты в моноцитах. Результаты   исследований Уровень   продуктов   перекисного   окисления   липидов   в   сыворотке   крови больных ревматоидным артритом исследования, проведенные в сравнимых по возрасту группах здоровых женщин и пациенток с РА  не выявили повышенный уровень сывороточных   ТБК – активных продуктов в опытной группе. В обеих группах уровни ТБК­активных  продуктов не зависели от возраста. Обращает на   себя   внимание   тот  факт,   что  при  РА   наиболее   высокие   концентрации продуктов   ПОЛ   отмечались   у   2   пациенток   с   минимальной   активностью воспалительного   процесса   в   суставах.   При   высокой   активности   процесса исследованные показатели также превышали таковые у доноров, но в меньшей степени.  Необходимо  проанализировать  взаимосвязь  уровней  ТБК­активных продуктов в сыворотке с различными параметрами заболевания (давность РА, отдельные  лабораторные  параметры  активности  воспалительного  процесса, уровни   сывороточных   липопротеидов).         У   отдельных   доноров   также обнаружены повышенные уровни ТБК – активных продуктов. Несмотря на тот 

121

факт,   что   все   доноры   проходили   клиническое   обследование   на   предмет выявления   инфекционных   процессов,   болезней   суставов,   атеросклероза, каких   –   либо   причин   для   активации   ПОЛ   выявить   не   удалось.   Можно предположить,   что   у   данные   лица   с   достаточно   эффективной противоинфекционной   защитой   переносили   протекавшую   субклинически какую  – либо  острую  инфекции.  Во  избежание  таких  случайных  влияний  на нормальные  показатели  сывороточных  уровней  ПОЛ  необходимо  увеличить число   наблюдений   в   группе. Подбор  условий  эксперимента  по  исследованию  интенсивности  перекисного окисления   липидов   в   моноцитах   сосудистого   русла   в   динамике   после активации   опсонизированным   зимозаном.   Используемый   нами   метод исследования   уровней   ТБК­активных   продуктов   адаптирован   для исследования   сывороток.   Для   нас   наибольший   интерес   представляло исследование  динамики  ПОЛ  в  клетках  после  их  активации.  В  связи  с  этим была   необходима   адаптация   метода. Задачи. 1.   Выяснить   необходимое   количество   клеток,   которого   достаточно   для определения   ТБК   –   активных   продуктов. 2.  Определить   влияние   некоторых   вынужденных   этапов   эксперимента   на содержание   ТБК­активных   продуктов   в   образцах 3.   Выяснить   наличие   совпадений   спектрофотометрических   характеристик зимозана и ТБК­активных продуктов Обнаружилось,   что   термостатирование   клеток   в   процессе   их   активации опсонизированный   зимозан   не   влияет   на   образование   продуктов   ПОЛ. Спектрофотометрические характеристики ОЗ не совпадают с таковыми у ТБК­активных продуктов.               Одна  из   технологических  особенностей   эксперимента   состояла   в следующем.   При   определенном   оптимальном   соотношении   клеток   и   ОЗ (количество   частиц   на   клетку),   на   эффективность   активации   фагоцитов влияет также концентрация ОЗ во взвеси. В связи с этим инкубация клеток и ОЗ проводилась в объеме 0,250 мл, существенно превышающем оптимальный объем образцов для определения уровней ТБК­активных продуктов. В связи с этим   приходилось   переосаждать   клетки   после   активации   их   с   ОЗ. Центрифугирование могло привести к разрушению клеток   потере продуктов ПОЛ. Однако проверка показала, что эти опасения не обоснованы. Единственным   лимитирующим   условием,   как   и   ожидалось,   оказалось количество  клеток  в  образце.  При  использовании  от  2х106 до  7х106 клеток ТБК­зависимые   продукты   в   образцах   практически   не   определялись.  Для получения значимых результатов необходимо не менее 9х106 клеток в пробе. Таким  образом,  выделяемых  из   40  мл  крови  моноцитов  не  достаточно  для исследования  динамики  образования  продуктов  ПОЛ  во   всех   5   временных точках (45х106 клеток).           Как известно, основными стимулами ПОЛ мембран фагоцитов являются радикалы   кислорода,   продуцируемые   мембранной   НАДФР2­оксидазой активированных  клеток.  При  этом  пики  образования  АФК  и  продуктов  ПОЛ практически   совпадают.  Поэтому,  мы   связываем  определенные  надежды   с проводимыми   в   настоящее   время   в   лаборатории   экспериментами   по 

122

исследованию   люминол   –   зависимой   хемилюминесценции   во   взвесях моноцитов   больных   РА   при   активации   их   ОЗ.   Возможно,   опираясь   на результаты  этой  серии,  мы  сможем  уменьшить  количество  временных  точек при исследовании динамики образования продуктов ПОЛ. В противном случае придется   отказаться   от   мысли   получения   полной   временной   зависимости результатов в каждом отдельном случае и за счет значительного увеличения числа наблюдений строить усредненную кривую за счет данных, полученных от   исследования   клеток   разных,   относительно   близких   по   возрасту   и состоянию людей.             Выводы:У больных РА намечена тенденция к повышенному содержанию сывороточных продуктов перекисного окисления липидов.Для   оценки   динамики   перекисного   окисления   во   взвесях   моноцитов, активированных ОЗ необходимо либо уменьшить число временных точек, либо при   сохранении   количества   временных   точек,   не   прописывая   в   каждом конкретном   случае   полную   кривую   временной   зависимости   образования продуктов   ПОЛ,   строить   усредненную   кривую   на   основании   данных, полученных от разных лиц.

123

ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ К ДНК НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОК ПОЧКИ СОБАКИ IN VITROХрамова А.Ю., Сабирзянова А.З., Иванова В.В.Научный руководитель: Невзорова Т.А.Кафедра биохимии, биолого­почвенный факультет, Казанский государственный университет, Россия, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18INFLUENCE OF ANTIBODIES TO DNA ON THE VIABILITY AND METABOLISM OF DOG KIDNEY CELLS IN VITROKhramova A.Yu., Sabirzanova A.Z., Ivanova V.V.Research supervisor: Nevzorova T.A.Department of Biochemistry , Faculty of Biology and Soil Science , Kazan State University, 420008 Kremlevskaya str., 18, Kazan, Russia

Системная   красная   волчанка   (СКВ)   относится   к   группе   хронических аутоиммунных   заболеваний   соединительной   ткани,   при   которых   организм утрачивает   толерантность   к   собственным   тканевым   антигенам. Распространенность СКВ составляет 50 больных на 100 000 населения, чаще болеют  дети  с   9  летнего  возраста,  с  максимумом  в   12­14  лет,  в  основном девочки [1]. Социальная значимость данной проблемы определяется, прежде всего,   тяжелым   характером   течения   заболевания   и   высоким   процентом инвалидности.  Несмотря  на  распространенность  аутоиммунных  заболеваний, механизм их развития до сих пор не ясен.

Объектом  исследования  явились  АТ  класса  IgG  к  нДНК,  повышенное содержание  в  крови  которых  предположительно  является  одной  из  причин развития СКВ. Но на сегодняшний день причины генерации и истинная роль как ДНК­связывающих, так и ДНК­ гидролизующих ААТ в организме здоровых людей и аутоиммунных больных до конца не выяснена.

Недавние исследования показали, что некоторые антитела (АТ) класса IgG  способны  проникать  в  различные  клетки  и  ядра,  вызывая  при  этом  их морфологические   и  функциональные   изменения.   Влияние   ААТ   на   клетки организма   неоднозначно,   определяется   как   типом   клеток,   так   и  физико­химическими  свойствами  АТ.  ААТ  входят  в  нормальный  пул  АТ,  но  в  крови здоровых   людей   и  животных   их   содержание   значительно   ниже,   чем   при патологии. 

Антитела  класса  IgG  к нДНК  из  сывороток  крови  здоровых  доноров  и больных СКВ в период обострения заболевания выделяли согласно методике, оптимизированной   в   нашей   лаборатории   [2].   Было   получено   несколько субфракций АТ, различающихся по физико­ и иммунохимическим свойствам. 

Поскольку при СКВ чаще всего наблюдается повреждения ткани почек, целью работы явилось исследование влияния антител класса  IgG к нДНК на культивирование клеток почек собаки (КПС) in vitro.

Для исследования влияния полученных высокоочищенных АТ класса IgG на клетки почек собаки проводили их инкубацию  в 96­ луночном планшете  в течении 48 и 96 часов при +37 ºС. Концентрации АТ были одинаковы как для здоровых доноров, так и для пациентов СКВ.

124

После   инкубации   КПС   с   АТ   оценивали   общее   количество   и жизнеспособность   клеток,   колориметрически   определяли   потребление глюкозы   и   количество   белка   в   клетках,   проводили   оценку   повреждения ядерной ДНК методом флуоресцентной спектрофотометрии. 

При   исследовании   влияния   полученных   АТ   к   нДНК   на   КПС   было показано, что в присутствии АТ клинически здорового человека ко вторым и, что еще более заметно, к четвертым суткам инкубации снижается количество, жизнеспособность,  и,  соответственно,  потребление  глюкозы  КПС. Отмечено, что  АТ  больного  СКВ  на   стадии  обострения   ко   вторым   суткам  инкубации вызывают   значительную   пролиферацию  КПС,   но   по   содержанию   глюкозы видно,  что  метаболизм  клеток  в  данных  образцах  замедлен  по  сравнению  с отрицательным контролем. На четвертые сутки СКВ­АТ оказывают сходное с АТ   донора   влияние   на   клетки,   но   их   воздействие   более   выражено. Предположительно, патологические СКВ­АТ к нДНК отличаются структурой и функциями от АТ здорового человека. 

Вероятно, СКВ­АТ позже нормальных проникают в КПС, но оказывают более   заметное   негативное   воздействие   на   репродуктивный   аппарат   и метаболизм клеток, что,  вероятно, является  следствием наличия у них ДНК­гидролизующей   активности.  В   присутствии  АТ   больного  СКВ,   обладающих ДНК­гидролизующей активностью, отмечено повышение концентрации белка в клетках, в отличие от АТ донора. Следовательно, можно  предположить, что АТ нарушают метаболизм белка в клетках. 

Высокая интенсивность флуоресценции комплекса EtBr­ДНК в образцах, инкубированных   с   АТ   клинически   здорового   донора,   свидетельствует   об изменении  конформации  ДНК  КПС,  так  как  флуоресценции  комплекса  EtBr­ДНК   изменяется   при   индукции   фрагментации   ДНК   либо   однонитевых повреждениях   [3].  Вероятно  АТ  донора,  преодолевая  клеточную  и  ядерную мембрану,   опсонизируют  ДНК   КПС,   способствуя,   тем   самым,   связыванию молекул EtBr с ДНК и, соответственно, увеличению флуоресценции EtBr­ДНК.

Замечено, что АТ здорового донора и больного СКВ в активной стадии заболевания проявляют сходное влияние на КПС. Из полученных результатов сходного влияния на КПС АТ класса IgG к нДНК здорового донора и больного СКВ  in  vitro  можно   заключить,   что   патологические   ААТ   к   нДНК   могут происходить от натуральных ААТ, но вопрос о причинах такого переключения остается  открытым.  Данные  результаты  согласуются  с  ранее  полученными данными о сходном негативном влиянии антител доноров и пациентов СКВ на клетки   эукариот   [4].   Это   свидетельствует   том,   что   АТ   к   ДНК   могут способствовать развитию и усилению патологического процесса. 

Литература1. Фаворова,   О.О.   Аутоиммунные   заболевания   как   следствие   утраты иммунной   системой   способности   отличать   «свое»   от   «чужого»/   О.О. Фаворова // Соровский образовательный журнал. – 1998.­ №12.­ С. 19­24.2. Невзорова,   Т.А.  ДНК­   гидролизующая   активность   антител   к  ДНК   при системной  красной  волчанке:  Дис.  … канд.  Биол.  наук:   03.00.04:  защищена 24.03.05: утв. 03.06.05 / Невзорова Татьяна Александровна. – Казань, 2005. – 170 с.

125

3. Анисимов,   А.Г.   Обработка   синхронизированных   клеток   К562 тетрафторалюминатом  не  модулирует  флуоресценцию  бромистого  этидия  и 4,6­диамидино­2­фенилиндола   при   связывании   с   нуклеоидной  ДНК   /   А.Г. Анисимов, И.А. Болотников // Цитология ­ 1999. – Т. 41. ­ №8.­ С. 680­684.4. Сабирзянова,   А.З.   Влияние   антител   класса   IgG   к   нативной   ДНК   на моноциты   человека  in   vitro  /  А.З.  Сабирзянова,   Т.А.  Невзорова  //  Ученые записки Казанского государственного университета. – 2008. – Т.150. – Книга 2. – С.186­200.

126

УМНИКВЛИЯНИЕ ПИЩЕВЫХ КИСЛОТ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПЕКТИНОВ В ТЕХНОЛОГИИ ЖЕЛЕЙНЫХ ИЗДЕЛИЙХрундин Д.В.Решетник О.А. д.т.н., профессорКазанский государственный технологический университетINFLUENCE OF FOOD ACIDS ON FUNCTIONAL PROPERTIES OFPECTINS IN TECHNOLOGY JELLING PRODUCTSKhrundin D.V.Reshetnik O.A., Dr.Sci.Tech., ProfessorKazan state technological university

На   сегодняшний   день,   несмотря   на   высокий   уровень   развития достижений   в   области   биотехнологии,   остается   нерешенным   целый   ряд проблем,   связанных   со   здоровьем   человека,   наиболее   актуальных   для индустриально   развитых   стран.   Поэтому   основное   направление   развития перерабатывающей   промышленности   на   современном   этапе   –   обеспечение населения   качественно   новыми   функциональными   пищевыми   продуктами, способствующими сохранению и улучшению здоровья.

Применение   пектина   при   производстве  желейных   изделий   позволяет получить продукты с профилактическими свойствами, благодаря способности пектина   связывать   и   выводить   ионы   тяжелых   металлов,   токсинов, радионуклидов из организма человека.

Известно, что сорбционная способность пектинов сильно зависит от рН­среды.   Оптимальное   значение   рН­среды   для   каждого   типа   пектина индивидуальное   и   зависит   от   вида   пектинсодержащего   сырья.   Высокая сорбционная способность у всех пектинов наблюдается в интервале рН = 4­12, причем, максимальные значения достигаются для многих пектинов при рН 5 и рН 9. 

Технологией   производства   желейных   изделий   с   применением высокоэтерифицированных   пектинов   предусматривается   обязательное использование пищевой кислоты (чаще всего лимонной или винной), при этом оптимальным  для  образования  студня  значением  рН  является   3,0.  Поэтому сорбционные свойства пектинов могут изменяться.

Кроме  того,  применение  лимонной  кислоты  способствует  «вымыванию» кальция   из   организма   человека,   что   приводит   к   нарушению   обменных процессов,  а  также  работе  почек.  Винная  кислота  приводит  к  образованию «винного камня» ­ трудновыводимого, устойчивого соединения.

Альтернативой винной и лимонной кислотам может послужить янтарная кислота.  Поскольку  янтарная  кислота  является  естественным  метаболитом, распадающимся в организме до углекислого газа и воды, она принципиально не может оказывать токсичного влияния на организм, и абсолютно безопасна. Это подтверждено нормативными документами экспертов ФАО/ВОЗ.

Таким  образом,  целью  данной  работы   явилось  изучение   возможности замены винной и лимонной кислот в производстве желеобразных изделий на 

127

янтарную   кислоту,   а   также   исследование   влияния   янтарной   кислоты   на технологические и функциональные свойства пектинов.

При  изучении   влияния   пищевых   кислот  на   сорбционную   способность пектинов   нами   было   установлено,   что   кислоты   по­разному   влияют   на взаимодействие пектинов и металлов.

Результаты  исследования  влияния  янтарной  кислоты  на  связывающую способность   цитрусового   пектина   по   отношению   к   ионам   меди   и   никеля свидетельствуют о том, что связывающая способность цитрусового пектина по отношению   к   ионам   меди   возрастает   с   увеличением   концентрации   смеси (наибольшее количество связанных ионов меди наблюдали при концентрации смеси 0,20 %). Кроме того, при увеличении доли пектина в смеси (от 1:1 до 6:1) количество поглощенных ионов меди также возрастало.

Из   полученных   данных   исследования   изменения   связывающей способности цитрусового пектина по отношению к ионам никеля следует, что в присутствии   янтарной   кислоты   доля   связанных   ионов   никеля   также возрастает с увеличением концентрации смеси и количества в ней пектина.

При  изучении  влияния  янтарной  кислоты  на  сорбционную  способность яблочного   пектина   по   отношению   к   ионам  меди   и   никеля   были   получены аналогичные  результаты:  с  увеличением  концентрации  смеси  и  повышением содержания в ней пектина количество связанных ионов никеля возрастает.

Таким  образом,  в  присутствии  янтарной   кислоты  пектины   сохраняют способность связывать ионы меди и никеля.

Количество связанных ионов меди цитрусовым пектином в присутствии винной кислоты в соотношении 1:1, составило в среднем 2,5 %, ионов никеля – 2,2 %.

В  случае  использования  яблочного  пектина,  сорбционная  способность увеличивалась   пропорционально   содержанию   пектина   в   системе.  Следует отметить, что связывания ионов никеля яблочным пектином при соотношении 1:1  не  наблюдалось.  Резкое  снижение  сорбционной  способности  яблочного пектина (как и в случае цитрусового пектина) было вызвано действием винной кислоты. 

В   случае   использования   лимонной   кислоты   изменение   сорбционной способности   пектинов   носило   аналогичный   характер.   Однако   количество связанных   ионов   металлов   было   выше   по   сравнению   с   системами, содержащими винную кислоту.

Снижение   сорбционной   способности   пектинов   в   присутствии   винной кислоты   было   вызвано,   по­видимому,   уменьшением   диссоциации карбоксильных   групп   молекул   пектина,   что   способствовало   снижению отрицательного   заряда   молекул   полимера   и   ослабляло   действие   сил электростатического   притяжения   между   ионами   металлов   и   анионами пектина. 

Кроме того, диссоциированные остатки винной кислоты способствовали сближению   молекул   пектина.   Возникшие   пространственные   изменения   в расположении   карбоксильных   групп   пектина   затрудняли   подход   ионов металлов   к   карбоксильным   группам   пектина,   что   приводило   к   снижению связывания ионов металлов.

128

Количество   поглощенных   ионов   никеля   также   увеличивалось пропорционально содержанию пектина в смеси. Следует отметить, что ионы никеля связывались в большем количестве по сравнению с ионами меди. Это объясняется меньшими размерами ионов никеля, что облегчало подход ионов никеля к молекулам пектина. 

В   случае   использования   лимонной   кислоты   изменение   сорбционной способности   пектинов   носило   аналогичный   характер.   Однако   количество связанных   ионов   металлов   было   выше   по   сравнению   с   системами, содержащими  винную  кислоту.  Это  объясняется  тем,  что  лимонная  кислота является   более   слабой   по   сравнению   с   винной   (константа   диссоциации лимонной   кислоты   –   8,4∙10­4,   винной   кислоты   –   1,30∙10­3).   Поэтому   в присутствии   лимонной   кислоты   молекулы   пектина   сохраняли   свою первоначальную  конформацию,  а, следовательно, и сорбционные  свойства  в большей степени.

При   использовании   янтарной   кислоты   связывающая   способность пектина была наибольшей, по сравнению с растворами, содержащими винную и лимонную кислоты. 

Янтарная кислота является самой слабой из данных кислот (константа диссоциации   1,6∙10­5).  Слабодиссоциированные   кислотные   остатки   молекул янтарной   кислоты   в   водной   среде   в   меньшей   степени   способствуют сближению  молекул  пектина,  поэтому  отрицательно   заряженные  молекулы пектинов   реагируют   с   ионами   металлов   лучше,   чем   в   присутствии   более сильных кислот (винной и лимонной).

Следует   отметить   высокую   сорбционную   способность   пектинов   в присутствии   янтарной   кислоты   даже   при   ее   относительно   высоком содержании в смеси с пектином (1:1).

Таким   образом,   наибольшее   количество   поглощенных   металлов наблюдалось в присутствии янтарной кислоты.

Нами   было   изучено   влияние   различных   пищевых   кислот   (винной, лимонной   и   янтарной)   на   студнеобразующую   способность   пектинов   и прочность образованных ими гелей.

При   использовании   янтарной   кислоты,   процесс   студнеобразования протекал аналогичным образом, как и в случае применения винной и лимонной кислотой:   по   мере   увеличения   содержания   кислоты   в   смеси,   прочность студней возрастала до максимального значения, затем наблюдалось снижение прочности гелей.

Таким образом, применение янтарной кислоты позволяет получать гели на основе пектинов и сохранять структурную организацию молекул в гелях в более   свободной  форме,   приближенной   к   нативной,   что   позволит   лучше сохранить свойства пектинов, в первую очередь, сорбционную способность по отношению   к   ионам   тяжелых   металлов   и   повысить,   в   конечном   итоге, функциональные свойства продуктов, содержащих пектин.

129

МЕЖКЛЕТОЧНАЯ КОММУНИКАЦИЯ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ОТВЕТА НА РАННИХ ЭТАПАХ ГОЛОДАНИЯ БАКТЕРИИ PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUMХусаинов И.Ш.1, Горшков В.Ю.2, Петрова О.Е.2, Сорокина Ю.В.1, Гоголев Ю.В.2

Научный руководитель: Гоголев Ю.В., к.б.н.1Казанский   государственный   университет;  2Казанский  институт   биохимии  и биофизики КазНЦ РАНROLE   OF   CELL­CELL   COMMUNICATION   IN  PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUM  DURING   THE   INITIAL   STAGES   OF   RESPONSE   TO STARVATIONKhusainov I.S.1, Gorshkov V.Y.2, Petrova O.E.2, Sorokina Y.V.1, Gogolev Y.V.2

Scientific supervisor: Gogolev Y.V., PhD1Kazan State University; 2Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics

Способность бактерий переживать условия, неблагоприятные для роста, является   их   важным   адаптивным   свойством.   Неспорообразующие микроорганизмы в ответ на стресс образуют специализированные клеточные формы,   которые   характеризуются   сниженной   пролиферативной   и метаболической   активностью,   модифицированной   клеточной ультраструктурой.   В   литературе   такие   клетки   часто   называют жизнеспособными, но некультивируемыми. Сотрудниками нашей лаборатории показано, что при высокой исходной плотности популяции в культурах клеток фитопатогенной   бактерии  Pectobacterium  atrosepticum  с   первых   суток культивирования на безуглеродной среде снижается титр колониеобразующих единиц   (КОЕ),  который  доходит  до  нулевых  значений   [Горшков  и  др.,  2009, неопубликованные   данные].  При   этом   значительное   количество   клеток сохраняют   жизнеспособность   и   восстанавливают   пролиферативную активность   после   процедуры   оживления,   а   следовательно,   представляют собой жизнеспособные, но некультивируемые формы. 

Реализация   физиологической   программы   переживания   стрессовых условий   сопряжена   с   существенными   изменениями   в   экспрессии   генов. Регуляция транскрипции генов, необходимых для формирования стрессового ответа,   контролируется   альтернативным   сигма   фактором  RpoS.   В   свою очередь,   транскрипция   гена  rpoS  регулируется   низкомолекулярными бактериальными аутоиндукторами – ацилгомосерин лактонами (АГЛ) [Huisman, Kolter,   1994].   Эти   небольшие   молекулы   являются   главными   сигнальными молекулами   системы   межклеточной   коммуникации   большинства   грам­отрицательных бактерий. Эта регуляторная система контролирует продукцию факторов  вирулентности  и  токсинов  в  зависимости  от  плотности  популяции [Whitehead  et  al., 2001]. Помимо этого, она участвует в активации экспрессии генов,  необходимых  при  реализации  физиологической  программы  ответа  на стресс.

Для оценки роли межклеточной коммуникации в формировании ответа на условия  голодания   мы   проанализировали   стратегию   поведения   клеток P. atrosepticum  при культивировании  на  безуглеродной  среде  АВ  при  низком 

130

исходном   титре   клеток.   Существующие   модели   не   предусматривают существования   межклеточной   коммуникации   в   таких   популяциях   из­за незначительной плотности клеток и низких концентраций сигнальных молекул. Нами   показано,   что   в   условиях   голодания   по   углероду   и  фосфору,   титр культур  P. atrosepticum,   инокулированных   с   титром   ниже   105  клеток/мл, повышался до значений 5×105–1×106 КОЕ/мл в течение первых трех дней (рис. 1). Чем ниже был титр клеток исходной культуры, тем значительнее было его увеличение в ходе культивирования. В культурах с начальным титром 106–107 

клеток/мл титр КОЕ существенно не изменялся. При более высоком исходном титре   клеток,   наблюдали   снижение   показателей   КОЕ.  Динамика   КОЕ   в голодающих   культурах   соответствовала   динамике   титра   геномных   копий, определяемых при помощи ПЦР в реальном времени (рис. 2). Следовательно, увеличение количества культивируемых клеток было сопряжено с процессами репликации ДНК.

Клетки, инкубированные на безуглеродной среде, имели более округлую форму   и   меньший   размер   по   сравнению   с   вегетативными   клетками.   В голодающих   культурах,   инокулированных   с   титром   108  клеток/мл, присутствовали  лизированные  клетки  и  отсутствовали  делящиеся  клетки.  В культурах, инокулированных с низким титром КОЕ (104  клеток/мл), наблюдали делящиеся клетки, в то время как клетки, подвергающиеся лизису, выявлены не были.

Наблюдаемые нами эффекты сходны с процессом деления на обедненной питательным   субстратом   среде,   описанным   ранее   для   бактерий  Vibrio  и Pseudomonas  [Kjelleberg   et   al.,   1983],   при   котором   происходит   увеличение количества  клеток,  сопряженное  с  уменьшением  их  размера.  Однако  у  этих бактерий   уменьшение   размера   клеток   и   увеличение   их   количества происходило   уже   в   первые   часы   инкубации   и   при   сравнительно   высоком исходном   титре   клеток.   В   нашей   экспериментальной   системе   наблюдали стабилизацию   показателей   КОЕ/мл   примерно   на   уровне   106  КОЕ/мл независимо от исходного титра (рис. 1). В связи с этим, мы предположили, что в голодающих культурах с низким тиром КОЕ происходят процессы деления на 

131

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 1 2 3 8

Время, сутки

Численность

  клеток

,  КОЕ

/ мл

12345678

Рис. 1.   Динамика   титра   КОЕ   в   культурах P. atrosepticum  с  различным  начальным  титром клеток:   101(1),   102(2),   103(3),   104(4),   105(5), 106(6), 107(7), 108(8) кл/мл

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

0 1 2 8

Время, сутки

Численность

  клеток

,  геномные

 

копии

/ мл

1

2

3

Рис. 2.   Динамика   титра   геномных   копий  в культурах  P. atrosepticum  с   различным начальным  титром  клеток:  104(1),  106(2),  108(3) геномных копии/мл

безуглеродной   среде,  в   ходе   которых   численность  популяции   значительно увеличивается.   Это,   по­видимому,   позволяет   «включать»   регуляторную систему  межклеточной   коммуникации   и   запускать   программу   переживания условий, неблагоприятных для роста.

Для   проверки   данного   предположения   мы   определили   динамику экспрессии   гена  expI,   продукт   которого   –   АГЛ­синтаза   –   синтезирует сигнальные аутоиндукторы (АГЛ) и, таким образом, является ключевым звеном при активации системы кворума. Уровень экспрессии оценивали в сравнении с уровнем стабильно экспрессирующегося гена основного сигма фактора  rpoD. Нами  показано,  что  при  достаточно  высокой  численности  популяции  клеток (107 КОЕ/мл) происходило увеличение относительного уровня экспрессии  expI в  течение  первых  суток  инкубирования   (рис.  4), при  низкой  же  численности популяции индукции экспрессии гена expI не наблюдалось. Однако через двое суток уровень экспрессии expI значительно увеличивался в культурах с низким начальным   титром   и   снижался   в   популяциях   с   высокой   начальной численностью.   Индукция   гена   АГЛ­синтазы   сопряжена   с   достижением максимальных значений титра КОЕ, что следует из рис. 3. В связи с этим, мы предполагаем, что  процесс  деления  клеток при низкой  плотности  популяции клеток происходит до достижения «кворума»,  необходимого для обеспечения межклеточной коммуникации и запуска программы стрессового ответа.Поскольку  остановка  процесса  деления  клеток  сопряжена  с  индукцией  гена АГЛ­синтазы  и,  следовательно,  с  накоплением  АГЛ,  мы  предположили,  что экзогенное   внесение   в   голодающие   культуры   этих   сигнальных   молекул приостановит данный процесс. Однако  внесение 50 мкМ АГЛ не повлияло на количество клеток в  голодающих  культурах (рис. 4). Таким образом, процесс деления ингибируется, по­видимому, не только АГЛ, но и другими факторами. Для  проверки  этого   клетки  P. atrosepticum  инкубировали  на  безуглеродной среде  в  течение  трех  суток,  после  чего  клетки  удаляли  фильтрованием,  а полученный   фильтрат   использовали   в   качестве   инкубационной   среды. Фильтрат  клеток  низкого  титра  ингибировал  процесс  деления  в  отличие  от фильтрата клеток высокого титра. Таким образом, сигналы клеток различных 

132

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

0 1 2 3Время, сутки

Чис

ленн

ость

кле

ток,

КО

Е/м

л

1

2

3

4

Рис. 4.   Динамика   титра   КОЕ   в   культурах P.atrosepticum,  культивируемых  в  среде  АВ   (1);  в среде  АВ   в  присутствии   50  мкМ   ацилгомосерин лактона (2); в фильтрате клеток низкого титра (3); в фильтрате клеток высокого титра (4)

0,00E+00

2,00E+00

4,00E+00

6,00E+00

8,00E+00

1,00E+01

1,20E+01

1,40E+01

0 6 24 48 72

Время, часы

Относительный

  уровень

 

экспрессии

  гена

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

Численность

  клеток

,  КОЕ

/ мл

Рис. 3. Динамика экспрессии гена АГЛ­синтазы и   изменения   титра  КОЕ   на   начальном   этапе голодания   в   культурах  P.atrosepticum  с различным  исходным титром  клеток:     ­105  и   ­ 107 КОЕ/мл

титров   не   компенсируют   друг   друга,   что   позволяет   предположить,   что механизмы переживания клетками стрессовых условий могут быть различны. 

Полученные   нами   данные   свидетельствуют   о   том,   что   в   процессе голодания   при   низкой   плотности   популяции   в   культурах  P. atrosepticum происходит  деление   клеток  до   плотности   5×105  –   1×106  кл/мл.  Остановка деления   сопряжена   с   индукцией   гена  АГЛ­синтазы,   хотя   внесение  АГЛ   в культуру   не   влияет   на   процессы   деления.   Существенное   ингибирование увеличения  уровня  КОЕ  оказывают  компоненты,  находящиеся  в  фильтратах голодающих   культур   низкой   плотности.  Вероятно,  определенную  роль   при терминации  процесса  деления   клеток  играют  низкомолекулярные  пептиды, являющиеся  медиаторами  второй  системы  кворума  P. atrosepticum,  а  также аутоиндукторы,  способные  определять  компетентность  клеток  к  различным внешним сигналам. 

1. Huisman  G.W.,  Kolter  R.,  Sensing  starvation:  a  homoserine   lactone signaling pathway in Escherichia coli // Science, 1994, V. 265, P.537­539.

2. Kjelleberg S.,  Beverley A.  Humphrey K.,Marshall  C.  Initial  phases of starvation and activity of bacteria at surfaces // Appl. Environ. Microbiol., 1983. V. 46. P. 978­984.

3. Srinivasan   S.,   Ostling   J.,   Charlton   T.   et   al.  Extracellular   signal molecule(s) involved in the carbon starvation response of marine  Vibrio  sp. Strain S14 // J. Bacteriol., 1998, V. 180. P. 201­209.

4. Whitehead N.A., Slater A.M.L., Simpson N.J.L. et al. Quorum­sensing in Gram­negative bacteria // FEMS Microbiol. Rev., 2001, V. 25, P. 365­404.

133

УМНИКИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАСТЕНИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СИСТЕМ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ НА БОРТУ КОСМИЧЕСКИ КОРАБЛЕЙШагимарданова Е.И.1, Гусев О.А.1, Сычев В.Н.2, Левинских М.А.2,Сугимото М.3

Шарипова М.Р.1д.б.н., профессор1Казанский Государственный Университет2Институт медико­биологических проблем РАН, Москва3Исследовательский институт биоресурсов, Окаямский университет, ЯпонияUTILIZATION OF PLANTS FOR LIFE SUPPORT SYSTEMS ONBOARD SPACE CRAFTSShagimardanova E.I.1, Gusev O.A.1, Sychev V.N.2, Levinskich M.A.2, Sugimoto M.3

Sharipova M.R., phd, professor1Kazan State University2Institute for Biomedical Problems, Moscow 

4Research Institute for Biorecourses, Okayama University, Kurashiki, Japan

Культивирование высших растений в условиях космоса остается приоритетным направлением   астробиологии.   Логическим   обоснованием   этого   служит взаимодополняющий характер отношений между растительными и животными организмами:   растения   способны   использовать   отходы   человека (органические   и   углекислый   газ),   в   то   время   как   человек   потребляет растительные   организмы   в   качестве   продуктов   питания.   Обеспечение человека  в  космосе  едой,  кислородом,  чистой  водой  весьма  дорогостоящая процедура,   требующая   постоянной   связи   с  Землей.  Поскольку   дистанции, покрываемые  космическими  миссиями,  и  время,  необходимое  для  их  полного завершения постоянно увеличивается, вопрос о создании биорегенеративных систем   для   обеспечения   команды   продовольствием   становится   все   более актуальным. Растения могут быть важной частью систем жизнеобеспечения, а также  являться  необходимыми  компонентами  будущих  экосистем  внеземных объектов.Первые  попытки  по  созданию  систем  жизнеобеспечения  фокусировались  на использовании   водорослей   в   качестве   составных   компонентов.  Однако,   их использование   затруднено  необходимостью  поддержания   водной   среды  и, кроме  того,  для  европейского  человека  блюда  из  водорослей  не  являются традиционными.  Исследования  последних  лет  склоняются  к  использованию высших растений, в частности, зерновых культур. Условия  космического  полета  являются  крайне  нетипичными  для  растений. Множество   факторов   как   собственно   космического   полета   (невесомость, повышенный   уровень   радиации   различного   спектра,   измененное электромагнитное   поле),   так   и   свойственных   замкнутому   гермообъему (температура,   влажность,   загрязненность   атмосферы),   могут   негативно влиять  на  живые  организмы.  За  последние   15  лет  на  борту  орбитального комплекса (ОК) «Мир» и на борту Международной космической станции (МКС) было   проведено   более   20   экспериментов   по   изучению   роста   и   развития высших   растений   [1].   В   этих   экспериментах   было   показано,   что   при 

134

использовании   технологии,   позволяющей   максимально   полно   обеспечить потребности   исследуемых   организмов,   они   способны   нормально   расти, развиваться и размножаться в этих условиях.В период с 2003 по 2005 гг. на борту РС МКС были проведены эксперименты по культивированию генетически маркированной линии карликового гороха в ряду 4­х последовательных вегетаций. Растения гороха при культивировании в течение четырех последовательных полных циклов онтогенеза («от семени до   семени»)   в   условиях   космического   полета   сохраняли   репродуктивные функции  и  формировали  жизнеспособные  семена   [2].  Генетический  анализ растений   гороха   не   выявил   полиморфизма,   что   указывало   на   отсутствие изменений   генетического   аппарата   клеток   растений.  Такая  же   тенденция была   отмечена   ранее   при   выращивании   пшеницы   сорта   Апогей   из «космических» семян [3].В 2006 году на борту РС МКС в оранжерее «Лада»был проведен эксперимент по выращиванию ячменя H. vulgare сорта Haruno Nijo. Cемена ячменя H. vulgare сорта Haruno Nijo, размещенные в полиэтиленовом пакете, были доставлены на РС  МКС  на  борту  грузового  корабля   (ГК)  «Прогресс­М56»  24  апреля  2006. После доставки на борт РС МКС укладка была размещена около оранжереи «Лада»   в  Служебном   модуле  МКС.   31   августа   2006   года   командир   13­й основной   экспедиции   на  МКС  П.В.  Виноградов   посадил   семена   ячменя   в корневой модуль оранжереи «Лада». Рост и развитие растений проходили при круглосуточном освещении, колебаниях температуры 22­27 ºС и относительной влажности 40­60 %. Через 26 дней культивирования проростки были срезаны, помещены в пластиковый пакет и спущены на Землю на борту транспортного корабля (ТК) «Союз­ТМА­8». Контрольные растения культивировали на Земле при аналогичных условиях температуры, влажности и освещения. Более 90% семян сорта Haruno Nijo, отправленных на МКС в 2006 году, проросли через   3   дня   после   посадки   и   увлажнения   корнеобитаемой   среды,  что указывает   на   сохранение   высокой   жизнеспособности   семян   этого   сорта, несмотря на  4­х месячное  нахождение  на  орбите. Рост  и развитие  растений ячменя в условиях космического полета и на Земле не отличались, в частности прорастание семян в обоих случаях зарегистрировано на третьи сутки после посадки. Высота побегов в космических и земных условиях достигала 50­60 см, кроющий  лист  открылся  на   26  день.  Таким  образом,  развитие  растений  в космосе   проходило   идентично   развитию   в   нормальных   земных   условиях. Однако отсутствие фенотипических изменений не дает основание говорить о том,   что   растительные   организмы   не   испытывают   стресса   в   условиях космического полета. Для понимания молекулярных процессов, лежащих в основе ответа организмов на  влияние  факторов  космического  полета,  мы  провели  анализ  экспрессии целого  генома  методом  биологических  микрочипов.  Было  обнаружено  более 500   генов,   экспрессия   которых   изменилась   более   чем   в   два   раза. Подавляющее  большинство   этих   генов  кодирует  белки  стрессового  ответа, включая   белки   теплового   шока   (БТШ),   белки,   нейтрализующие   АФК   и патогенез­связанные   белки   (PR­протеины).   Экспрессию   основных представителей этих семейств подвергали дальнейшему анализу методом ПЦР в реальном времени.

135

В качестве дополнительного контроля в этих экспериментах использовали «земные»   растения,   которые  подвергали   тепловому   шоку   и   действию повышенных   концентраций   соли.   Эти   виды   стрессов   являются   известными индукторами экспрессии определенных генов, представляющих интерес в данном исследовании.

Изучали экспрессию БТШ (hsp17, hsp 18, hsp 26, hsp 70 и hsp 90), биосинтез которых   считается   универсальным   клеточным   ответом   на   действие повышенных температур, а  также некоторых других видов стресса. В ячмене, выросшем   на   борту   МКС,   а   также   в   ячмене,   подвергшегося   воздействию повышенных концентраций соли, увеличения экспрессии малых БТШ обнаружено не   было,   в   то   время   как   воздействие   повышенных   температур   привело   к значительному увеличению биосинтеза этих белков. Уровень экспрессия hsp70 и hsp90  возрастал   во   всех   трех   вариантах   стресса.   Причем,   минимальное увеличение   наблюдалось   в   случае   космического   стресса.  Скорее   всего,   это является   не   результатом   специфического   ответа   на   космический   стресс,   а указывает на наличие общего стрессового состояния организма и мобилизацию его внутренних ресурсов.При  исследовании  общего  профиля  экспрессии  белков  «космического» ячменя были  обнаружены  изменения  в  уровне  мРНК  некоторых  патогенез­связанных белков.  Дальнейший анализ  экспрессии  генов  представителей  этого  семейства (PR1a,  PR3,  PR5   и  PR10)  методом  ПЦР   в   реальном   времени  не   выявил повышения   уровня   транскрипции   этих   генов   по   сравнению   с   контрольными «земными» растениями. Наблюдали значительное увеличение биосинтеза мРНК этих генов при повышении концентрации соли в среде, что может указывать на их участие в регуляции осмотического стресса 

Солевой   стресс   является   известным   индуктором   окислительного   шока   в клетках  растений  и  вызывает  увеличение  биосинтеза  белков,  нейтрализующих активные   формы   кислорода   (АФК)   [4].   Подобный   эффект   также продемонстрирован  в  ряде  случаев  при  изучении  действия  теплового  шока.  В наших экспериментах уровень экспрессии гена супероксиддисмутазы увеличился в  2  и  2.5  раза  в  ответ  на  тепловой  и  солевой  шок,  соответственно.  Влияние космической среды привело к увеличению экспрессии этого гена в 6 раз. Уровень мРНК   гена   глутамилтрансферазы   (gst),  являющегося   компонентом   системы элиминации  АФК  с  использованием  глутатиона  в  качестве  донора  электронов, был в 24 раза выше в «космическом» ячмене по сравнению с «земным». Тепловой и  солевой  стрессы  увеличивали  экспрессию  gst  в   2  и   5  раз  соответственно. Уровень экспрессии генов каталазы (cat) увеличился в 18 раз в космических по сравнению с земными условиями. Транскрипция гена apx, кодирующего фермент аскорбатпероксидазу,  окисляющую  аскорбат   с   участием  пероксида   водорода, увеличилась   в   3   раза   в   «космическом»   ячмене.  В   растениях,   подвергшихся действию   теплового   и   солевого   стрессов,   экспрессия   каталазы   и аскорбатпероксидазы также увеличивалась, однако, в меньшей степени.Таким   образом,   показано,   что   космический   стресс   вызывает   нарушение тонкого баланса в редокс­статусе клеток, вызывая усиленную продукцию АФК. В свою очередь, клетки индуцируют повышение синтеза и активности белков­антиоксидантов, что позволяет им успешно противостоять внешнему стрессу. 

136

Нами впервые получены данные о наличие окислительного стресса на борту МКС.   Наиболее   вероятной   причиной   является   космическая   радиация   и микрогравитация. Также, следует помнить, что космическая станция является закрытой  системой  с постоянно  меняющимся  газовым  составом среды,  четко коррелирующим с частотой пристыковок транспортных и грузовых кораблей к МКС.  Предполагается,  что  живые  организмы,  в  частности  растения,  могут быть   использованы   в   качестве   биоиндикаторов   на   борту   космических кораблей,   помогая   поддерживать   нормальную   жизнедеятельность космонавтов и космических туристов на борту МКС.

1. Souza K.A., Ilyin E.A., Sychev V.N., Jahns G.C. 2009. Biological Research in Space. Space biology and medicine ­ U.S. and Russian cooperation in space biology and medicine. Joint U.S.­Russian Publication. AIAA, Reston, Virginia, Chapter 1. 1­43

2. Левинских   М.А.,   Сычев   В.Н.,   Дерендяева   Т.А.,   Сигналова   О.Б., Подольский  И.Г.,  Гостимский  С.А.,  Бингхем  Г.   2005.  Характеристика роста,   развития   и  генетического   статуса   растений   гороха   при выращивании   в   космической   оранжерее   «Лада».  Авиакосмическая   и  экологическая медицина. 39, 38­43.

3. Левинских   М.А.,   Сычев   В.Н.,   Сигналова   О.Б.,   Дерендяева   Т.А., Нефедова Е.Л., Масгрейв М.Е., Кэмпбелл У.Ф., Конлин Д., Бингхейм Г.Е. 2002.   Некоторые   характеристики   сформировавшихся   в   условиях микрогравитации   семян   растений.  Авиакосмическая   и   экологическая  медицина. 36, 62­64.

4. Esfandiari E., Shekari F., Shekari F., Esfandiari M. 2007.  The effect of salt stress  on  antioxidant  enzymes’activity  and   lipid  peroxidation  on   the  wheat seedling. Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. 35, 48­56.

137

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХШамсиева Р.Р., Рябичко С.С.Невзорова Т.А., к.б.н., доцентКазанский государственный университет им. В.И. Ульянова­ЛенинаNUCLEIC ACIDS OF HUMAN BLOOD CELLS IN HEALTHY INDIVIDUALS AND PATIENTS WITH AUTOIMMUNE DISEASESShamsieva R.R., Ryabichko S.S.Nevzorova T.A., с.b.s., associate professorKazan State University named by V.I. Ulyanov­Lenin

Изучение  этиологии и патогенеза  аутоиммунных  заболеваний, которые характеризуются   утерей   толерантности   иммунной   системой   организма   к собственным  нормальным  тканям  и  клеткам,  является  одной  из  актуальных вопросов   современной  иммунологии.  К   числу   таких   заболеваний  относятся системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА), при которых повреждаются   различные   органы.   Предположительно,   одной   из   причин развития СКВ является повышенное содержание в крови больных аутоантител (ААТ)   к   нативной  ДНК   класса   IgG,   которые   могут   взаимодействовать   с клетками   организма   и   вызывать   их   разнообразные   функциональные изменения.   ААТ   могут   обуславливать   развитие   клинических   проявлений заболеваний  как  непосредственным  воздействием  на  клетки­мишени,  так  и опосредованно  через  формирование  и  отложение  иммунных  комплексов  АТ­ДНК с последующей  индукцией иммунного воспалительного ответа.Известно, что среди антител к ДНК присутствуют антитела, обладающие ДНК­гидролизующей   активностью.   Согласно   современным   представлениям, наличие   в   крови   каталитических   антител   является   основным   признаком протекания в организме аутоиммунных процессов. Но  механизм индукции,  чрезмерной  выработки  аутоантител  к ДНК  иммунной системой   не   выяснены.   Вероятно,   некоторые   изменения   в   строении нуклеиновых  кислот  могут  инициировать  образование  патологических  ААТ  к ДНК.  Однако,  детальных  данных  о свойствах нуклеиновых  кислот  в  норме  и при   аутоиммунных   заболеваниях,   механизмах   их   распознавания   и взаимодействия с аутоантителами в литературе не имеется.Целью  работы  явилось  изучение  свойств  нуклеиновых  кислот  клеток  крови человека в норме и при аутоиммунной патологии. В   качестве   объектов   исследования     были   использованы   ДНК   и   РНК, выделенные нами ранее из клеток крови здоровых доноров, больных СКВ и РА фенольным   методом   и   охарактеризованные   методом   электрофореза   в агарозном геле. Оказалось, что ДНК больных СКВ более высокомолекулярна по   сравнению   с  ДНК   здорового   донора.  ДНК   больного   РА   содержит   и низкомолекулярные   фрагменты.   Одноцепочечная   РНК   характеризуется высокой электрофоретической подвижностью. После инкубации полученных препаратов нуклеиновых кислот с антителами к ДНК   в   норме   и   при   патологии   было   изучено   изменение  флуоресценции комплекса этидий бромид­нуклеиновая кислота. В результате было показано, 

138

что   инкубация  ДНК   с  АТ   к  ДНК   приводит   к   уменьшению  флуоресценции комплекса   этидий   бромид­ДНК   здорового   донора   и   к   увеличению флуоресценции  ДНК  больного  РА.  Инкубация  РНК  с  АТ  к  ДНК  здорового донора   приводит   к   снижению   флуоресценции   этидий   бромида   с   РНК здорового  донора  и   к   увеличению  флуоресценции   этидий  бромида   с  РНК больного   СКВ.   АТ   к   ДНК   больного   СКВ   не   приводят   к   значительным изменениям флуоресценции комплекса этидий бромид­РНК здорового донора и больного СКВ.Таким  образом,  можно  предположить,  что  при  аутоиммунных  заболеваниях происходит  изменение  структуры,  свойств  ДНК  и  РНК,  а  также  изменяются свойства АТ. 

139

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERRATIA MARCESCENS И ЕЕ БИОСИНТЕЗ В СУБОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХШах Махмуд Р., Галиева Г. М., Нигматуллина Л. Ш.Филимонова М. Н., д. б. н., ст. науч. сотр.Казанский государственный университет им.В.И. Ульянова­Ленина, Россия CHANGING ACTIVITY OF SERRATIA MARCESCENS NUCLEASE AND ITS BIOSYNTHESIS AT SUBOPTIMAL CONDITIONSShah Mahmud R., Galieva G. M., Nigmatullina L. Sh. Filimonova M. N., Dr. Sci., Associated ProfessorKazan State University by V.I.Ul’ianov­Lenin, Russia

В   настоящее   время   внеклеточная   эндонуклеаза   (КФ   3.1.4.9) Грамотрицательных   бактерий  Serratia   marcescens  –  один   из   наиболее изученных   ферментов   в   ряду   бактериальных   нуклеаз   с   широкой специфичностью. Эта нуклеаза расщепляет одно и двухцепочные ДНК и РНК с образованием   фрагментов   разной   степени   полимерности, фосфорилированных  в  5´­положении.  Установлены  основные  биохимические свойства,   структура,   каталитически   значимые   аминокислотные   остатки, предложены  модели  механизма  действия.  Сведения  о  ней  представлены  в большинстве   банков   данных.   Ее   применяют   на   практике   в   качестве противовирусного препарата. Наряду с этим изменение активности фермента под действием внешних факторов и его биосинтез в субоптимальных условиях требуют   дополнительного   исследования,   так   как   изучены   недостаточно глубоко.Исследование   изменения   активности   в   процессе   трехкратного 

замораживания/оттаивания выявило понижение активности эндонуклеазы на 20­40%,   что,   вероятно,   обусловлено   ослаблением   гидрофобных   связей.  К аналогичному   результату   приводила   25­минутная   инкубация  ферментного раствора  при  пониженных   температурах.  Остаточная  активность  после   6­часовой инкубации была ниже на 25 %. Добавление к ферментному раствору этанола   усиливало   процесс   в   течение   первых   25   мин.   и   дополнительно уменьшало активность примерно на 20%. Инкубация фермента в присутствии этанола  при  37о  в  течение  10 мин.  приводила  к  полной  потере  активности. Полученные   результаты   свидетельствовали   о   существенной   роли гидрофобных   связей   в   поддержании   нативной   конформации   белковой молекулы. Культивирование   бактерий  S.   marcescens  на   обогащенной   питательной 

среде   в   присутствии   0,1%   сульфаниламидного   препарата   2­(пара­Аминобензолсульфамидо)­тиазола,   ингибирующего   биосинтез   пуринов   в микробных клетках, приводило к подавлению роста культуры, увеличению  в 1,5  раза  биосинтеза  эндонуклеазы  и  2,6  раза  продуктивности  бактерий  по этому ферменту.   Добавление в среду аденина или аденозина не оказывало влияния   на   рост   культуры   ни   в   присутствии,   ни   в   отсутствии сульфаниламидного препарата.  В отсутствии сульфаниламидного препарата наличие   в   среде   аденина   или   аденозина   не   влияло   ни   на   биосинтез эндонуклеазы, ни на продуктивность бактерий по этому ферменту. Напротив 

140

в  условиях  блокирования  биосинтеза  пуринов  присутствие  в  среде  аденина или   аденозина   приводило   к   снижению   биосинтеза   эндонуклеазы   и продуктивности  бактерий  по  эндонуклеазе  по  сравнению  с  их  отсутствием. Таким образом,  показано,  что  при росте  культуры  в  условиях блокирования биосинтеза   пуринов   наблюдается   повышение   биосинтеза   эндонуклеазы   и продуктивности бактерий по этому ферменту, что, очевидно, служит ответом бактериальных клеток на неблагоприятные условия среды. 

141

УМНИКРАЗРАБОТКА ДНК­БАНКА ПО ПОВОЛЖСКОМУ ФЕДЕРАЛЬНОМУ ОКРУГУ. ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА НЕМАТИВИРОВАННОЙ АГРЕССИИ У ПОДСЛЕДСТВЕННЫХ Шарипов А. А., Рафиков. Р. И.Научный руководитель: к. б. н., доцент Фаттахова А. Н., соруководитель: начальник отдела биологических экспертиз, майор милиции Степущенко Ю. Г. ЭКЦ МВД по РТDEVELOPMENT OF ДНК­BANK ON VOLGA REGION FEDERAL DISTRICT. DIAGNOSTICS OF A SYNDROME AMOTIVATIONAL   AGGRESSIONS AT PERSON ON REMANDSharipov A. A., Rafikov. R. I.The supervisor: c. b. s., senior lecturer   Fattakhova A. N., second supervisor: head of the Department of Biological examinations, militia major Stepuschenko J. G.EKTS Police in RT

Проект направлен на разработку инновационной методологии создания и функционирования  информационной  базы  для  банка  ДНК  по  Поволжскому федеральному округу. Реализация Проекта  позволит  значительно  сократить расходы госбюджета и улучшить криминальную обстановку в регионе.

Известно,  что  мутантные  аллели  гена  МАО  А,  определяющие  низкий  и нулевой   уровень  моноаминоксидазы  в   тканях  человека  является  первым  и главным  составляющим   генетического  набора,  определяющего  склонность  к немотивированной агрессии, депрессии, суициду и инцесту. Генная мутация в области структурного гена МАО А приводит к продукции абортивного белка и развитию клинических симптомов синдрома Брюннера. 

Нами установлено, что уровень МАО А в слюне человека составляет 10­15%  от   уровня  МАО  А  в  астроцитах  и  нейронах  в   ткани  мозга  человека. Установлены уровни МАО А в слюне условно здоровых лиц и у лиц в группе риска  по  здоровью  и  профессии.  Разработан  лабораторный  экспресс­метод определения  МАО  А   в   слюне   человека,   с   помощью     которого   проведены популяционные исследования фенотипов МАО А в популяции1500 человек. В ходе  проделанной  работы  были  определены  значения  активности  МАО  для нормальных,   низких,   нулевых   и   повышенных   уровней   по   катехоламинам: адреналину, норадреналину и серотанину. 

Установлено,  что  уровень  МАО  адреналина  и  норадреналина  в  слюне здоровых людей в  возрасте 20­25 лет статистически достоверно различается с   уровнем  МАО   в   слюне   лиц,   страдающих   наркотической   зависимостью   и шизофренией.   Так,   скорость   окисления   биогенных   аминов   в   слюне   лиц, страдающих  шизофренией,  понижена  и  не  превышает  12 % от  нормального уровня,   а   скорость   окисления   катехоламинов   в   слюне   лиц,   страдающих наркотической зависимостью, не превышает 5­15 % от нормального уровня.

С  целью  апробации  полученных   критериев  МАО  адреналина   в   слюне человека были исследованы доноры 22­30 лет обоего пола из группы риска по 

142

профессии   (студенты   школы   милиции),   не   стоящие   на   учете   в психоневрологическом   диспансере,   не   употребляющие   наркотические   и психотропные   препараты   и   не   страдающие   алкогольной   зависимостью. Установлено, что 30 % испытуемых обладали нормальным уровнем окисления адреналина   в   слюне,   таким   образом,   не   были   предрасположены   к немотивированной  агрессии и наркомании.  56,3 % испытуемых имели низкий уровень и, возможно, были предрасположены к немотивированной агрессии и депрессии.  В  эту  же   группу  включили     5,8  %  от  всего  числа  испытуемых, имевших нулевой уровень окисления адреналина в слюне, что характерно для лиц,   страдающих   синдромом   Брюннера.   11,6   %   испытуемых   обладали аномально   высоким   уровнем   окисления   адреналина,   характерным  для   лиц пожилого возраста, склонных к болезни Паркинсона   и тремору конечностей. Один   из   испытуемых   с   нулевым   уровнем  МАО  А   в   слюне   действительно проявил криминальную активность.

Полученные  в результате  НИРС  по  проекту  данные  можно  применить в сфере расследования криминальных преступлений и улучшения криминальной обстановки в нашем регионе в целом в РФ. Шанс, что преступление совершил человек   с   предрасположенностью   к   немотивированной   агрессии   намного выше.   Кроме   того,   высока   вероятность   того,   что   самые   активные   члены преступных группировок, а также сотрудники силовых структур, проявляющие чрезмерную  агрессивность  и  неадекватность  по  отношению  к  гражданам,  а примеров тому много,  из числа носителей мутации в гене МАО А. 

В   ходе   выполнения   проекта   предполагается   выявление   синдрома Брюннера   на   генетическом   уровне.  Мы   предлагаем   создать   банк   данных людей с мутацией в области гена МАО А, с фенотипом синдрома Брюннера. Для   этого   надо   провести   определенную   исследовательскую   работу. Важнейшим  является  определение  областей  и  типов  мутации,  характерных для нашего региона и синтез соответствующих праймеров для амплификации конкретного  участка  гена,  которые  необходимы  в  дальнейшем  для  быстрого генетического  анализа  подозреваемого.  Для этого  нужно  секвенировать  все возможные   аллели   гена   МАО   А   встречающихся   в   нашем   регионе. Секвенировать,  в  первую  очередь,  нужно  всех  осужденных  и  отбывающих наказание – вероятнее всего, что здесь собраны все возможные мутации по гену  МАО  А.  Кроме  того,  мы  разработали  технологию,  которая  значительно упрощает и удешевляет анализ на синдром Брюннера. Также наша методика поможет  сэкономить на  судебно­криминалистических экспертизах  до  10 раз, за счет того, что можно значительно сузить количество подозреваемых, если проверить   их   предварительно   на   синдром   Брюннера   поэтапно,   как   мы предложим   ниже.   Так   как,   по   данным   литературы   людей   с   синдромом Брюннера  примерно  10 % от населения, то и круг подозреваемых снизиться примерно на 90 %. Если учесть, что один анализ генотипирования стоит 5000 рублей,   то   получим   значительную   экономию.   Конечно,   это   не   является гарантией того, что преступник окажется среди подозреваемых с синдромом Брюннера,   однако,   в   большинстве   случаев   это   поможет   избежать генотипирования всех подозреваемых и, таким образом, сэкономить огромные деньги. Также, зная круг подозреваемых с синдромом Брюннера значительно упростится работа следователей и укоротится время следствия.  

143

Для удешевления самого анализа по выявлению мутации мы предлагаем поэтапный анализ. На первом этапе следует выявить лиц с низкой и нулевой активностью МАО А в слюне с помощью биохимического теста. Для этого нами созданы лабораторная экспресс­методика. Один анализ стоит 1,2 рубля. 

В  плазме  крови  лиц  с  нулевым  уровнем  МАО  А  в  слюне  определяется соотношение   нормальных   и   патологических   метаболитов   адреналина   и норадреналина. Наличие орто­метилированных производных норадреналина в крови будет служить основанием для молекулярно­генетического анализа лиц из   этой   группы.   Предлагаемая   нами   методология   выявления правонарушителей   с   немотивированной   агрессией   значительно   снижает затраты на повышение информативности Банка ДНК преступников.

Реализация   методики   выявления   лиц   с   немотивированной   агрессией позволит предупредить преступления в группе риска по профессии, таких как сотрудники силовых структур. 

  Избежать   преступлении   со   стороны   сотрудников   силовых   структур поможет  контроль  всех устраивающихся  туда  на  наличие  мутации в  области гена МАО А, то есть синдрома Брюннера. Понятно, что это нужно проводить совместно  с  психологическими  тестами.  Они  должны  дополнять  друг  друга, потому что часто случается так, что психологически тест дает неоднозначный ответ.

Все данные, получаемые во время этих анализов, будут занесены в базу данных ДНК. В дальнейшем, это поможет избежать повторных анализов.

144

ВЛИЯНИЕ ИММОРТАЛИЗАЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЗАЧАТКОВ ЗУБОВ МУДРОСТИ ЧЕЛОВЕКА НА ЭКСПРЕССИЮ МАРКЕРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИШафигуллина  А.К.1,  Ялвач  М.Э.2,  Салафутдинов  И.И.3,  Блатт  Н.Л.3,  Ризванов А.А.1,2,3 

Руководители:   Ризванов   А.А.,   доцент   кафедры   генетики   КГУ   биолого­почвенного факультета, к.б.н.;     Киясов А.П., зав. кафедрой анатомии КГМУ, профессор, д.м.н.1 ГОУ ВПО Росздрава Казанский государственный медицинский университет;2 Университет Едитепе, Стамбул, Турция;3 ГОУ ВПО Казанский государственный университет

EFFECT OF IMMORTALIZATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS DERIVED FROM   HUMAN   THIRD   MOLAR   TOOTH   GERMS   ON   DIFFERENTIATION MARKERS EXPRESSIONShafigullina A.K.1, Yalvach M.E.2, Salafutdinov I.I.3, Blatt N.L.3, Rizvanov A.A.1,2,3

Science advisers: Rizvanov A.A., associate professor, Department of Genetics, PhD; Kiyasov A.P., Chairperson of Anatomy Department of KSMU, M.D., Dr.Sci, professor1 Kazan State Medical University;2 Yeditepe University, Istambul, Turkey;3 Kazan State University

Клетки  в  организме  животных  и   человека   способны   к  определенному числу делений (обычно не более 50, так называемый предел Хейфлика) после чего   наступает   стадия   старения   и   смерти.  Для   применения   в   клеточной терапии   зачастую   необходимо   проводить   экспансию   клеток.   Применение первичной   культуры   мезенхимальных   стволовых   клеток   (МСК)   ограничено нашей возможностью поддерживать рост и клеточное деление на протяжении длительного   времени,   при   этом   сохраняя   их   первоначальные   стволовые свойства. Некоторые типы клеток, такие как плюрипотентные эмпбиональные стволовые  клетки  и  раковые  клетки,  обладают  практически  неограниченным пролиферационным   потенциалом.   Существуют   методы     иммортализации клеточных культур, приводящие к тому, что клетки приобретают способность к длительной   пролиферации   с   сохранением   первичного  фенотипа.   В   тоже время   остается   малоизученным   влияние   иммортализации   на   фенотип различных стволовых клеток взрослого организма. 

Цель работы: исследование влияния различных методов иммортализации на  фенотип   мезенхимальных   стволовых   клеток   зачатков   зубов   мудрости человека. 

Материалы  и  методы.  Нами  выделена  культура  клеток  зачатков  зубов мудрости   человека   и   проведен   анализ   экспрессии   маркеров дифференцировки   методами   иммуноцитохимии   и   проточной цитофлуорометрии.   Иммортализация   клеток   проведена   2   методами: трансфекцией   геном   каталитического   компонента   теломеразы   (hTERT)  и трансфекцией   геном   большого   Т   антигена   вируса   Симиана   (SV40­LT). Селекцию  иммортализованных клеток  проводили  культивированием клеток  в 

145

среде   с   антибиотиками:   гидромицином   –   для   клеток,   иммортализованных введением  hTERT,   пуромицином   –   для  SV40­LT.   После   иммортализации проведен анализ экспрессии маркеров дифференцировки.

Результаты   и   обсуждение.   Согласно   результатам   проточной цитофлуорометрии  и  иммуноцитохимии  первичная  культура  клеток  зачатков третьих   моляров   человека   обладала   фенотипом,   характерным   для мезенхимальных стволовых клеток: позитивна по антиенам CD29, CD73, CD90, CD105 и  негативна  по  антигенам  СD14,  CD34,  CD44,  CD45,  CD133,  CD166. После иммортализации генами hTERT и SV40­LT  антигенный профиль клеток не   изменился.   Дополнительные   эксперименты   позволят   исследовать пролиферативный   и   дифференцировочный   потенциал,   а   также биологическую безопасность полученных клеток.   

146

КСИЛАНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ РОДА TRICHODERMAШишкин А.В.Алимова Ф.К. д.б.н., профессорГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова­Ленина», г. Казань

XYLANASE ACTIVITY OF FUNGI TRICHODERMA Shishkin A.V.Alimova F.K.Kazan State University, Kazan

Одним  из  наиболее  изучаемых  грибов  в  настоящее  время  является  род Trichoderma.   Причиной   этого   интереса  является   большая   практическая   и значимость   рода.   Виды  Trichoderma  являются   продуцентами   ферментов (целлюлаз,   хитиназ,  пектиназ,   ксиланаз,   серинзависимых  протеиназ  и  др.), используемых   в   целлюлозно­бумажной   и   пищевой   промышленности,   в производстве  моющих  средств,  в  получении  спирта,  в  получении  кормовых добавок [1] в  преобразовании отходов, содержащих целлюлозу в глюкозу [2]. Актуальным   является   поиск   новых   штаммов­продуцентов  ферментов   и   их изучение.Целью   данной   работы   являлся   скрининг   штаммов   рода  Trichoderma  с 

высокой ксиланазной активностью.

В работе  были использованы  штаммы  грибов  Trichoderma  выделенные  с мертвой древесины. В качестве контроля был выбран промышленный штамм T. reesei, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Выделение   грибов   рода  Trichoderma  с  мертвой  древесины   проводили методом   выкладывания   древесины   на   плотную   питательную   среду   – картофельно­глюкозный агар. Состав картофельно­глюкозный агара (PDA) (г/л): картофель – 200, агар ­ 20, глюкоза – 20, стрептомицин ­1. Моноспоровые культуры грибов получали методом, предложенным А.Н. Лихачевым [3]. 

Для   культивирования   грибов   использовали   природную экспериментальную среду ­ экстракт ржаных пентозанов (%): пентозаны – 0.2, белок – 0.5;    (NH4)2SO4  – 0.5. Культуральные среды, засевали 2% инокулята. Культуры выращивали в 150 мл колбах, содержавших 50 мл среды в течение 36 – 192 часов на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об./мин при температуре  28˚С.  Пробы  для  определения  ферментативной  активности отбирали каждые 24 часа. Клетки отделяли центрифугированием.

Определение  ксиланазной  активности  проводили  в  трех  повторностях. Разбавленный образец в количестве 0.06 мл помещали в пробирку. Пробирку помещали на 5 минут в 40°С на водяную баню. Добавляли 0.6 мл субстрата и перемешивали.  Через  20  минут  инкубация  прерывалась  добавлением  0.3  мл раствора динитросалициловой кислоты (DNSA).

Субстрат  для  исследования  активности   ксиланаз   готовили   следующим образом, 750 мг ксилана (Sigma X0502) помещали в 40 мл ацетатного буфера. Растворяли  ксилан  перемешиванием  на  кипящей  водяной  бане  в  течение   5 

147

минут.  После  охлаждения  до  комнатной  температуры  рН раствора  доводили 25% HCl до 5.0. Обьем раствора доводили до 50 мл ацетатным буфером.

Для построения калибровочного графика стандарты глюкозы и ксилозы помещали в 0.06 мл ацетатного буфера в пробирку. Образцы не инкубировали при 40°С, а сразу добавляли DNSA.

После   окончания   описанной   процедуры   для   образцов   и   стандартов растворы в пробирках центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость. Полученный  раствор  инкубировали  точно  10 минут  в  кипящей  водяной  бане, затем   охлаждали   в   ледяной   бане   5   минут,   добавляли   3   мл   воды   и перемешивали.   Абсорбцию   измеряли   при   530   нм,   используя   двулучевой спектрофотометр  Lambda  35  Perkin  Elmer  Ins.  Одна   единица   активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля   восстанавливающих   сахаров   в   минуту   при   гидролизе соответствующего субстрата. Выход восстанавливающих сахаров определяли по   калибровочным   графикам,   построенным   по   глюкозе   и   ксилозе, соответственно. 

Идентификация  по  морфологическим  признакам  проводилась  по  ключу Samuels  [4]  на  среде  SNA.  Состав  среды  SNA  (г/л):  KH2PO4  –  1,  KNO3  –  1, MgSO4х7H2O – 0,5, KCl – 0,5, глюкоза – 0,2, сахароза – 0,2, агар – 20.

Прирост численности популяции вследствие размножения особей можно охарактеризовать  скоростью  роста  популяции,  которую  считали по  формуле [5]. 

Определение   диапазона   размеров   исследуемых   ксиланаз   определяли методом мембранной фильтрации.

Для   статистической  обработки  данных  использовали  программу  Excel. Для сравнения применяли интервальные оценки. Уровень значимости р < 0,05. Данные на рисунках представлены как среднее ± стандартное отклонение [6].

В   природе   популяции   микроорганизмов,   как   правило,   представлены гетероспоровыми   популяциями.   Из   9   образцов   мертвой   древесины   нами выделено 37 штаммов грибов рода Trichoderma (T.spp.1(1) – T.spp.7(9)). 

Проведено   культивирование   выделенных   и   очищенных   клонов Trichoderma   с использованием жидкой среды на основе ржаного экстракта и сравнительное изучение ксиланазной активности. Ранее было сказано, что в качестве контроля был выбран промышленный штамм T. reesei, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Ранее  нами  был  проведён  скрининг  клонов  Trichoderma,  выделенных  из антропогенно­нарушенной   почвы   республики   Татарстан.   Сравнивая ксиланазную активность почвенных клонов Trichoderma с активностью клонов, выделенных  с  мёртвой  древесины,  можно  сделать  вывод  о  сопоставимости способности к синтезу ксиланаз клонов, выделенных из этих источников.

Нами   проведено   исследование   динамики   накопления   ксиланаз культуральной   жидкости   в   процессе   роста  Trichoderma.  В   результате проведённых   исследований   у   клона  T.spp.7(8)   максимальная   активность ксиланаз 4,8 IU/ml была выявлена на 96ч. 

Исследованный   клон  T.spp.7(8)   по   морфологическим   признакам относится к виду: T. viride секции Trichoderma. 

148

Исследование кинетических параметров клона 7(8) при температуре 28ºС на  среде  PDA  позволило  отнести  его  к  группе  со  средней  скоростью  роста 0.15­0.2 см/час.  Исследование  кинетических  параметров  клона  T.spp.7(8) при температуре   28ºС   на   среде  SNA  позволили   его   отнести   к   группе медленнорастущих штаммов со скоростью роста до 0.015мм/час

В   результате   проведённых   нами   исследований   максимальную продуктивность  по  ксиланазе  показал  клон  T.spp. 7(8).  Активность  ксиланаз этого  клона  составила  4,8  IU/ml.  Культуральная  жидкость  клона  T.spp.  7(8) была последовательно пропущена через мембраны с диаметрами пор 100, 50, 15,   5   кДа.  Данные   анализа  фракций  фильтрата   на   наличие   активности ксиланаз   показали,   что   молекулярная   масса   исследуемого   фермента находится в диапазоне от 50 до 100 кДа. 

1. Скворцов   Е.   В.   Биосинтез   ксиланаз   аборигенными   изолятами Trichoderma  /   Е.В.Скворцов,  Ф.К.Алимова,  Д.М.Абузярова   //   Вестник Казанского технологического университета.– 2005.– №1.– С.251­255.

2. Селиванов   А.   С.   Комплексная   переработка   целлюлозосодержащих отходов  лесоперерабатывающих  и  сельскохозяйственных  предприятий на  основе  биоконверсии   /  А.С.  Селиванов   //  Биотехнология  на  рубеже веков: проблемы и перспективы. Киров.– 2001.– С. 89­91.

3. Лихачев  А.  Н.  Культуральные  и  биологические  особенности  штаммов Trichoderma  lignorum /А. Н. Лихачев // Вестник МГУ.   Биология. – 1998.– Вып.3. – С.103­104.

4. Samuels G. J.  Trichoderma stromaticum  sp.  nov.,  a  parasite  of   the cacao witches broom pathogen / G. J. Samuels, R. Pardo­Schultheiss, K. P. Hebbar, R. D. Lumsden., C. N. Bastos, J. C. Costa, J. L. Bezerra // Mycol. Res. ­ 2003. ­ V.104. ­ Р. 760­764.

5. Паников  Н.  С.  Кинетика  роста  микроорганизмов   /  Н.С.  Паников   ;  М.: Наука, 1992. – 311 с.

6. Акберова   Н.   И.   Описательная   статистика.   Интервальные   оценки: Учебно­методическое   руководство   и   сборник   задач   к   практическим занятиям   по   курсу   «Математические   методы   в   биохимии»   /   Н.   И. Акберова. – Казань: Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова­Ленина. − 2004. – 40с.

149

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ТЕНОКСИКАМА И НАПРОКСЕНА В ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХЭль Али Ф.А., Насыбуллина Н.М.Науч. руководитель­ Насыбуллина Н.М., д.ф.н., доцентКазанский государственный медицинский университетESTIMATION OF TOXICITY ACTION OF  TENOXICAM ET NAPROXEN IN EXPERIENCES ON ANIMALSEl Ali  F.A., Nasibullina N.M.Scientific adviser­ Nasibullina N.M., a Doctor of Pharmaceutical Science, docent Kazan Medical University

В   настоящее   время   хронические   заболевания   опо­рно­двигательного аппарата являются одной из наибо­лее частых патологий, занимая второе место по   частоте   после   артериальной   гипертензии.   Часто   для   лечения   данных заболеваний используются препараты, подавля­ющие продукцию ЦОГ­1 и ЦОГ­2, являющиеся  медиа­торами  процесса  воспаления.  К  таким  препаратам  отно­сятся   производные   1,2­бензотиазина   –   теноксикам   (ТК)   и   производное пропионовой кислоты – напроксен (НП), которые в пероральных лекарственных формах   (ЛФ)   проявляют   ульцерогенное   побочное   действие   [1],   при   этом альтернативой   к   их   использованию   являются   эмульгели   с   ТК   и   НП,   для разработки   которых   требу­ется   определить   токсические   свойства   данных лекарст­венных веществ. На этапе доклинического изучения ТК и НП в его ЛФ необходимым является оценка острой и хронической токсичности, проводимой на  животных   (крысах  и  мышах),   которые  были  разделены   на   4   группы   –   2 опытные  и  2  контрольные   (по  6  животных  в  каждой)  группе).  Животным  при помощи зонда внутрижелудочно однократно в различных дозах  вво­дили в виде суcпензии НП и ТК, а   контрольным живот­ным вводили ту же суспензию в тех же   дозах,   но     без   самих     действующих     веществ.  За   животными   вели клиническое  наблюдение  в  течение   10  дней.  При  этом  учитывали  состояние волосяного   покрова,   слизистых   оболочек,   подвижность,   отношение   к   корму, время   возникновения   и   характер   интоксикации,   ее   тяжесть   и   обратимость, сроки   гибели   или   их   выздоровления.   Определение   параметра   острой токсичности НП и ТК для животных проводили по методу Кербера [2].

Оценка  острой  токсичности  НП  и  ТК,  проведенной  на  животных,  показала, что   однократное введение мак­симальных доз суспензии из НП   в соотношении 1:2   приводит   к   незначительным   нарушениям   со   стороны   общего   состояния животных, в т.ч. к резкому угнетению общего состояния спустя 30 минут после введения  НП.  Но   смертельных  исходов,   как   в  опыте,   так  и   в   контроле    не наблюдалось. К 10 дню  после  введения препарата  общее  состояние  животных нормализуется, волосяной покров становится чистым и гладким.  и блестящим. 

Так как большие дозы НП животным  ввести не удалось не было возможности определить ЛД50.  При  определении  острой  токсичности ТК  выяснилось,  что  от введенной   суспензии  ТК   в   соотношении   1:2  погибают   100   %  животных,  при введении   ТК   в   соотношении   1:10   ­   75   %,   а   при   введении  животным   ТК   в соотношении  1:20   остаются  живы  98 % крыс  и  мышей.    При  этом  нами  было 

150

установлено,   что   для   белых   крыс   ЛД50    ТК   при   однократном   введении внутрижелудочно  равна   1150  мг/кг,  а  для  белых  мышей  при  том  же  способе введения равна  1500 мг/кг 

Таким   образом,   проведенные   нами   исследования   по   оценке   острой токсичности  ТК  и  НП  свидетельствуют  о  том,  что  исследуемые  лекарственные вещества   относят­ся   к   малотоксическим   соединениям   и   могут   быть   вост­ребованы при разработке ЛФ наружного применения.

Библиографический список1.  Насонов Е.Л.Нестероидные   противовоспалительные   препараты   при ревматических   заболеваниях:   стандарты   лечения   //   Русский   медицинский журнал.­ 2001.­ Т. 9, № 7­8.­ С. 265­270. 2. Фисенко В.П.   Руководство   по   экспериментальному  (доклиническому) изучению  новых  фармакологических  веществ. – М., 2000. – 238 с.

151

УМНИКСНИЖЕНИЕ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ПОЛУПРОДУКТОВ В ТЕХНОЛОГИИ ЭТИЛОВОГО СПИРТАЯмашев Т.А., Симонова Н.Н., Решетник О.А.Научный руководитель Решетник О.А., д.т.н., профессорКазанский государственный технологический университетREDUCING MICROBIAL CONTAMINATION OF MASH IN TECHNOLOGY OF ETHYL SPIRITYamashev T.A., Simonova N.N., Reshetnik O.A.Supervisor of studies Reshetnik O.A.Kazan State Technological University

Увеличение   объемов   мирового   выпуска   этилового   спирта,   рост инвестиций  в  биотехнологические  предприятия  и  научные  исследования  по переработке   растительного   сырья   в   этанол   создали   предпосылки   для динамичного развития спиртовой промышленности. 

На современном этапе в спиртовой отрасли активно внедряются схемы механико­ферментативной   обработки   сырья,   исключающие   стадию высокотемпературного  разваривания   зернового   замеса  под  давлением,  что серьезно   обострило   проблему   развития   микроорганизмов­контаминантов   в ходе   технологического   процесса.   В   результате   жизнедеятельности посторонней   микрофлоры   в   сусле   накапливаются   метаболиты,   негативно влияющие   на   бродильную   активность   дрожжей,   и   подавляющие   их размножение,   что   приводит   к   снижению   выхода   и   ухудшению   качества этанола. 

Одним  из  возможных  решений  данной  проблемы  является  обработка полупродуктов   различными  дезинфектантами   и   консервантами.  В   пищевой промышленности в этих целях часто применяется соединение окислительного действия – пероксид водорода. 

Цель настоящей работы заключалась в повышении выхода и улучшении качества   пищевого   этанола   путем  дезинфекции   полупродуктов   спиртового производства пероксидом водорода.

Анализ  научных  публикаций  показал,  что  антимикробную  обработку  в технологии   спирта   проводят   на   стадиях   подготовки   сырья  и   брожения.  В литературе отсутствовали данные о возможном проведении данной обработки на стадии разваривания. 

В  связи  с  этим  нами  было  исследовано  влияние  пероксида  водорода добавляемого   на   стадии   разваривания   на   микробную   обсемененность зернового замеса и показатели производства этилового спирта. 

Режимы   тепловой   гидродинамической   и  ферментативной   обработки (ТГФО) представлены в таблице 1. 

152

Таблица 1 Режимы тепловой гидродинамической и ферментативной обработки зернового замесаНаименование показателя  1 Режим ТГФО 2 Режим ТГФО

Разваривание

Разваривание Стерилизация

Температура, °С 70 95 70 83 105Продолжительность   стадии, мин 150 30 90 90 30

При проведении разваривания по второму режиму ТГФО использовали два контроля: первый контроль подвергали стерилизации 30 минут при 105 °С, второй  контроль  осахаривали  непосредственно  после  выдержки  при  83 °С. Опытные варианты вместо стерилизации обрабатывали пероксидом водорода.

На начальном этапе работы было установлено, что пероксид водорода целесообразно   добавлять   на  финальной   стадии   разваривания,   чтобы   не препятствовать   гидролизу   зернового   замеса   ферментными   препаратами. Кроме того, такой способ внесения пероксида водорода не вызывает сильного вспенивания   полупродукта,   что   имеет   существенное   значение   при промышленном применении. 

Исследования   показали,   что   без   добавления   пероксида   водорода микробная контаминация разваренной массы сохраняется на высоком уровне вне зависимости от режима ТГФО (таблица 2).

Таблица   2   Влияние   режима   ТГФО   на   количественное   содержание микроорганизмов в разваренной массе

Наименование показателя  

1 Режим ТГФО 2 Режим ТГФО

КонтрольКонтроль 1

(разваривание + стерилизация)

Контроль 2

Количество микроорганизмов, КОЕ/мл

6,8∙105±35000 3,1∙103±150008∙105±3500

0

Обработка   разваренной   массы   пероксидом   водорода   приводила   к снижению   выживаемости   микроорганизмов   со   100   до   0   %   за   короткий промежуток времени 5­30 минут. 

Содержание  несброженных  углеводов  и  нерастворенного  крахмала  в зрелой  бражке  является  показателем  эффективности  стадий  разваривания, осахаривания и брожения. 

Показано, что опытные образцы бражек содержали меньшее количество нерастворенного крахмала по сравнению с контрольными (табл. 3). 

153

Таблица 3 Влияние антимикробной обработки на содержание нерастворенного крахмала (г/100 мл) в зрелых бражках

Концентрация пероксида водорода, %0 

(контроль)

0,03 0,05 0,10 (контроль 

1)0 (контроль 

2) 0,2 0,3

1 Режим ТГФО 2 Режим ТГФО0,2 0,2 0,16 0,09 0,18 0,21 0,1 0,09

По   всей   видимости,   пероксид   водорода   вызывает   деструкцию крахмальных  гранул,  деполимеризует  крахмал  за  счет  уменьшения  размеров кристаллических   областей   и   переводит   его   в   растворимую  форму.  Более полное   растворение   крахмала   приводит   к   ускорению   его   гидролиза амилолитическими   ферментами,   в   результате   чего   в   сусле   повышается содержание сбраживаемых углеводов. 

Содержание  несброженной   глюкозы  в  опытных  бражках  также  было ниже,   чем   в   контроле,   и   зависело   от   концентрации   вносимого   пероксида водорода, а также режима ТГФО (табл. 4). 

Таблица   4  Содержание  несброженной   глюкозы   (мг/л)  в   зрелых  бражках  в зависимости   от   концентрации   пероксида   водорода   в   водной   фазе разваренной массы

Концентрация пероксида водорода, %0 

(контроль)

0,03 0,05 0,1 0 (контроль 1)

0 (контроль 2)

0,2 0,3

1 Режим ТГФО 2 Режим ТГФО1,9 0,86 0,85 0,84 1,8 6,47 0,31 0,288

Известно,  что  качество  пищевого  этанола  зависит  от  содержащихся  в нем   примесей.   Микробная   контаминация   сусла   в   процессе   спиртового брожения может привести к повышенному содержанию примесей в конечном продукте. 

Установлено,  что  обработка  разваренной  массы  пероксидом  водорода приводила   к   снижению   суммарного   содержания   высших   спиртов   в   зрелых бражках (табл. 5). 

154

Таблица 5 Содержание высших спиртов в бражных дистиллятах в пересчете на безводный спиртПримеси  Контроль

1 режим ТГФООпыт 1* Опыт 2**

Изопропанол, мг/л 5,7345 14,4261 12,1902Пропанол, мг/л 527,3155 471,8769 464,9091Изобутанол, мг/л 2055,7789 1008,4349 623,4980Бутанол, мг/л 4,6556 ­ 8,1539Изоамилол, мг/л 1193,6242 1131,0666 1613,7795Амилол, мг/л ­ 2,6034 2,2900Гексанол, мг/л 70,8392 40,7545 14,8466Фенилэтанол, мг/л 174,3993 141,6620 169,3229Суммарное содержание высших спиртов, мг/л

4032,3472 2810,8244 2908,9902

* 1 режим ТГФО (0,1 % Н2О2 в водной фазе)** 2 режим ТГФО (0,3 % Н2О2 в водной фазе)

Вероятно,   повышенное   содержание   высших   спиртов   в   контрольных бражках связано с жизнедеятельностью микроорганизмов­контаминантов.

В   результате   проведенной   антимикробной   обработки   содержание этилового   спирта   в   зрелых   бражках   увеличивалось   на   0,3­0,9   об.   %. Максимальное   количество   спирта   в   зрелой   бражке   образовывалось   при добавлении  пероксида  водорода  до  концентрации   0,3  %  в  водной  фазе  и проведении разваривания по 2 режиму ТГФО. 

Данный  эффект  может  быть  объяснен:  снижением  уровня  микробной контаминации полупродуктов, в результате чего в сусле происходит меньшее накопление   органических   кислот,   токсичных   для   дрожжей,   а   также окислительной   деструкцией   пероксидом   водорода   компонентов   среды, отрицательно влияющих на физиологическую активность дрожжей. 

Другой  причиной  повышения  концентрации  этилового  спирта  в  зрелых бражках   может   быть   окислительный   стресс,   вызываемый   пероксидом водорода  у  клеток дрожжей.  Известно,  что  при обработке  микроорганизмов нелетальными дозами различных стрессоров, у них развивается устойчивость к  более  высоким  концентрациям  этих  веществ.  Возможно  также  появление перекрестной   устойчивости,   когда   обработка   клеток   одним   соединением повышает их резистентность к другим. При проведении качественной реакции на   пероксид   водорода   было   установлено,   что,   некоторое   его   количество содержалось   в   сусле   к   моменту   внесения   дрожжей.   Вероятно,   дрожжи, развивающиеся   в   таком   сусле,   становились   более   устойчивы   к неблагоприятному действию органических кислот, высших спиртов и этанола, в результате   чего   они   эффективнее   сбраживали   углеводы   и   образовывали больше спирта. 

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о   том,   что   пероксид   водорода   проявляет   угнетающее   действие   на микроорганизмы­контаминанты   зернового   замеса,   в   результате   чего 

155

снижается содержание несброженных углеводов и высших спиртов в зрелой бражке,  что,  в  конечном  итоге,  приводит  к  повышению  выхода  и  улучшению качества  этилового  спирта.  Кроме  того, проведение  дезинфекции  зернового замеса на стадии разваривания позволит снизить затраты энергоресурсов на проведение температурной стерилизации. 

Ожидаемый   экономический   эффект   от   внедрения   антимикробной обработки на стадии разваривания в технологии этилового спирта для завода производительностью 1000 дал/сут составит 7­15 млн. руб. в год в зависимости от концентрации пероксида водорода в водной фазе полупродукта.

156

ХИМИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ МЕМБРАН РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ЯРОВОЙ ШЕНИЦЫ ПРИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХВалиуллина Р.Н., Хохлова Л.П.Казанский государственный университетCHEMICAL   MODULATION   OF   MEMBRANES   IN  DIFFERENT   SPRING   WHEAT GENOTYPES UNDER INCREASED TEMPERATURESValiullina R.N., Khokhlova L.P.Kazan State University

Плазматические   мембраны   как   высокочувствительные   клеточные структуры  способны  одними  из  первых  реагировать  на  различные  сигналы внешней и внутренней среды.  Реактивность и функционирование биомембран зависит от физико­химических изменений, происходящих в них при действии стрессоров.  При   этом  важное   значение  имеет     сохранение  избирательной проницаемости   мембран   за   счет   поддержания   оптимального   уровня   их ключевых свойств – термостабильности и текучести. Проницаемость мембран является одним из интегральных показателей их структурно­функционального состояния,   о   котором   можно   судить   по   выходу   электролитов   из   тканей. Усиление  экзосмоса  электролитов  при  действии  на  растения  экстремальных факторов широко используется для оценки степени повреждения мембран и устойчивости растений [1]. 

Цель работы заключалась в выяснении сортоспецифической зависимости проницаемости   мембран   яровой   пшеницы   в   связи   с   действием   теплового стресса   и   мембранотропных   препаратов.   Модификацию     физического состояния мембран проводили с помощью двух мембранотропных препаратов – бензилового   спирта   (БС),   повышающего   текучесть   мембран,   и диметилсульфоксида (ДМСО), повышающего ригидность мембран [2].

Объектом исследования служили 7­суточные проростки шести разных по теплоустойчивости  сортов  яровой  пшеницы:  высокоустойчивый  –  Омская  33, среднеустойчивые   –  Дебют,   Амир   и   Тризо,   низкоустойчивые   –   Тимер   и Закамская,   выращенные   в   водной   культуре   при   температуре   23оС.   Были поставлены 2 серии экспериментов. В первой изучали проницаемость мембран корней  при  действии  на  них  теплового  стресса   (42оС,   2ч)  совместно  с  БС (0,01%)  и  ДМСО   (2%  и   3%),  во  второй   –  при  последействии  на  растения теплового стресса (42оС, 2ч) и последующей инкубации корней в растворах БС (0,2%) и  ДМСО  (5%) в  течение  3ч.  Проницаемость  мембран  контролировали общепринятым методом по экзосмосу электролитов из тканей путем измерения электропроводности   водных   вытяжек   на   кондуктометре   оригинальной конструкции. 

Инкубация корней в 0,01%­ом растворе БС у двух сортов пшеницы Омская 33  и  Дебют  практически  не  изменяла  выход  электролитов   (ВЭ)  из  тканей, однако   у   остальных   сортов   эта   концентрация   вызывала   небольшое,   но достоверное  увеличение  экзосмоса  электролитов  из  тканей  по  сравнению  с контрольным вариантом (рис. 1). Поскольку между устойчивостью растений и проницаемостью   мембран   существует   обратная   зависимость,   можно предположить, что мембраны растений сортов Омская 33 и  Дебют проявляют 

157

более высокую устойчивость к их «разжижителю» на фоне теплового стресса. Обработка  2%­ым  раствором  ДМСО  при  42оС  вызывала  усиление  экзосмоса электролитов  у  всех  шести  сортов.  При  этом  наибольшая  чувствительность мембран к данному агенту на фоне гипертермии установлена у сорта Тризо, остальные     сорта   реагировали   слабее.  Индуцируемое  ДМСО   возрастание проницаемости   мембран,   по­видимому,   связано   с   усилением   пористости мембран в результате повышения их жёсткости. 

Инкубация   корней   в   3%­ом   раствора   ДМСО   приводила   к   резкому усилению выхода электролитов из тканей от 40 до 60% от полного выхода, что 

свидетельствует   о   начале необратимых деструктивных   изменений мембран,   поскольку   этот уровень   проницаемости является   для   клетки летальным.

Эти   результаты подтверждают,   что мембраны   устойчивого сорта Омская 33 реагируют в   меньшей   степени   не только  на   «разжижитель» мембран   (БС),  но  и  на  их «затвердитель»   (ДМСО), т.е.   проявляют стабильность     к модификаторам физического   состояния мембран.

Рис.  1.  Влияние  БС  и  ДМСО  на  выход  электролитов  из  тканей  корней яровой  пшеницы  при  действии  повышенной  температуры   (42оС,  2ч).    Цифры над столбиками показывают значения ВЭ в процентах от контроля.

В  опытах  по  изучению  последействия  теплового  шока   (ТШ)  применяли более   высокие   концентрации  препаратов   (0,2%­ный  раствор  БС  и   5%­ный раствор   ДМСО),   поскольку   именно   они   начинали   вызывать   нарушение избирательной   проницаемости   мембран.   Усиление   ВЭ   из   тканей   под действием   0,2%­ного  раствора  БС  при   23оС   (рис.   2)  было  ожидаемым,  т.к. известно, что данный препарат, имитирует действие повышенных температур, индуцируя   увеличение   текучести   мембран   [2]   и,   следовательно,   их проницаемости.   После   того,   как   растения   испытали     действие   ТШ,   у большинства   сортов  Дебют,  Амир,   Тимер,  Закамская   и   особенно   у   Тризо наблюдали  вызываемое  БС  повышение    проницаемости  мембран,  в  то  время как  у  теплоустойчивого  сорта  Омская  33, проницаемость  уменьшалась.  Этот результат  указывает  на  то,  что  проницаемость  мембран  у  данного  сорта  по сравнению  с  другими  в  меньшей  степени   зависит  от  повышения  текучести 

158

мембран, вызываемого БС после действия теплового шока. Вероятно, эффект БС  на   корни  растений  Омская   33   снижался   за   счет   того,  что  в   условиях последействия теплового шока происходило более быстрое восстановление и последующая температурная адаптация  клеточных мембран. 

5%­ный раствор ДМСО также значительно повышал ВЭ из тканей корней у всех сортов (рис. 2).   Поскольку ДМСО увеличивает жёсткость мембран [2, 3],   значит,   должен   снижать   их   проницаемость,   однако,   в   наших   опытах выявлен обратный эффект. Аналогичные результаты были получены ранее на нашей  кафедре  на  корнях  озимой  пшеницы   [4].  Можно  предположить,  что индуцируемое   ДМСО   увеличение   жёсткости   мембран   сопровождается формированием   белково­липидных   доменов   с   нарушенной   мембранной структурой  и   вызывает  образование  дополнительных   «дефектных»  пор     с повышенной  проницаемостью,  отражением  чего  явилось    усиление  ВЭ  под влиянием ДМСО. По данным литературы, существует три типа взаимодействия ДМСО с фосфолипидами мембран в зависимости от концентрации препарата. При низких концентрациях ДМСО вызывает утончение мембран и увеличивает ее  текучесть,  при    повышении  концентрации  –  образование  в  ней  пор,  еще более   высокие  концентрации   приводят   к   десорбции   отдельных   молекул липидов из мембраны и разрушению ее бислойной структуры  [5].

Кроме того, ДМСО способен опосредованно влиять на состояние мембран через   единый   мембрано­цитоскелетный   континуум [6]   и   систему кортикальных   МТ, связанных   латерально   с плазмалеммой   и   друг   с другом   белковыми мостиками [7]. Чрезмерная стабилизация   МТ, индуцируемая   ДМСО, может  приводить   к нарушению трансмембранных взаимодействий   и     тем самым  –  к  деструктивным изменениям плазматической мембраны,   что   является ещё   одной   причиной увеличения   мембранной проницаемости.

Рис.  2.  Влияние  БС  и  ДМСО  на  выход  электролитов  из  корней  яровой пшеницы  в  норме  и  после  действия  высокой  температуры:  К­контроль,  1­БС (0,2%),  2­ДМСО   (5%).  Цифры  над  столбиками  показывают  значения  выхода электролитов в процентах от контроля. ТШ – тепловой шок.

159

Влияние  ДМСО  на  проницаемость  мембран  после  действия  теплового шока   у   разных   сортов   пшеницы   оказалось   неоднозначным   и   менее значительным по сравнению с БС (рис. 2). Экзосмос электролитов из корней растений сортов Амир, Тризо и Закамская повышался после действия высокой температуры,   тогда   как   корни   Омской   33,   Дебюта   и   Тимера характеризовались   снижением   этого   показателя.   Наибольшие   изменения отмечены  у  сорта  Тризо   (ВЭ  более  чем  в   2  раза).  В  этих  опытах,  как  и  в предыдущих   (с   БС)   обнаружено,   что   наибольший   вклад   в   повышение проницаемости   мембран,   индуцируемое   совместным   действием   ДМСО   и повышенной   температуры,     вносит   химическая   модуляция   мембран, обусловленная усилением их жёсткости. 

Таким   образом,   установлено,   что   мембранотропные   агенты   –   БС   и ДМСО  повышают  проницаемость  клеточных  мембран  корней  у  исследуемых сортов   яровой   пшеницы   как   при   нормальной   температуре,   так   и   после действия на растения повышенной температуры, что может быть следствием изменения   текучести   мембран.   После   гипертермии   выявлена   обратная зависимость между повышением проницаемости мембран под влиянием БС и уровнем   теплоустойчивости   сортов.   Из   этого   можно   сделать   вывод,   что клеточные   мембраны   устойчивых   растений   в   отличие   от   неустойчивых характеризуются более ускоренной репарацией и температурной адаптацией в условиях последействия теплового стресса.

Литература1. Лукаткин   А.С.  Холодовое   повреждение   теплолюбивых   растений   и 

окислительный стресс. – Саранск: Изд­во Мордов. Ун­та, 2002. 208 с.2. Sangwan V., Örvar B.L., Beyerly J., Hirt H. Opposite changes in membrane 

fluidity  mimic  cold  and  heat  stress  activation  of  distinct  plant  MAP kinase pathways // The Plant J. – 2002. – V. 31. – P. 629­638.

3. Örvar B.L., Sangwan V., Omann F., Dhindsa R.S.  Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity // The Plant J. – 2000. – V. 23. – P. 785­794.

4. Бочкарева   М.А.,   Чепуренкова   М.А.,   Хохлова   Л.П.  Действие мембранотропных   агентов   на   проницаемость   мембран   и водоудерживающую   способность   корней   разных   генотипов   озимой пшеницы   //  Итоговая  научно­образовательная  конференция  студентов Казанского   государственного   университета   2005г.:   Сб.статей   / Казан.гос.ун­т. – Казань, 2005.

5. Gurtovenko  A.,   Anwar   J.  Modulating   the   structure   and   properties   of   cell membranes:   the molecular  mechanism of  action  of  dimethyl  sulfoxide   //   J. Phys. Chem. B. – 2007. – V. 111. – No. 35. – P. 10453­10460. 

6. Baluška F., Samaj J., Wojtaszek P. et al. Cytoskeleton­plasma membrane­cell wall continuum in plants. Emerging links revisited // Plant Physiol.  – 2003.  – V. 133. – P. 482­491.

7. Lloyd C.W. Toward a dynamic helical model for the influence of microtubules on wall patterns plants // Internat. Rev. Cytol. – 1984. – V. 86.  – P. 1­51.

160

УМНИКБИОФУНГИЦИДНОЕ СВОЙСТВО РИЗОСФЕРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВГабитов Р.А., Закирова А.Р.Багаева Т.В., д.б.н., профессорКазанский государственный университетRIZOSPHERIC MICROORGANISMS AND PLANT EXTRACTS HAVING OF BIOFUNGIZIDIC PROPERTYGabitov R.A., Zakirova A.R.Bagaeva T.V., Dr. Sc., prof.Kazan State Univesity,  Dept. of Physiology and Biotechnology Plant

В   современных   условиях,   повышение   урожайности сельскохозяйственных  культур  можно  достичь  на  основе  высокой  культуры земледелия. Одним из основных приоритетов в данном направлении является изучение  болезней  растений,  вызываемых  различными  микроорганизмами,  в том числе, микроскопическими грибами и поиск   способов борьбы с данными заболеваниями.

Среди  наиболее  значимых  и  распространенных  заболеваний  растений выделяют   группу   заболеваний,   связанных   с   развитием   фитопатогенных микромицетов рода Fusarium.

Род  Fusarium    в   целом   представляет   обширную   биологически неоднородную   группу   грибов.  Среди   них   есть   и   достаточно   выраженные паразиты   растений,   и   группы   полупаразитов,   способных   поражать   только ослабленные  организмы,  и,  наконец,  сапрофиты,  живущие  на  растительных остатках, в почве и на отмерших частях растений. Известны штаммы Fusarium, паразитирующие   на  насекомых,  а   также   вызывающие  микозы  и   токсикозы человека и теплокровных животных.

 Однако, большинство грибов этого рода — фитопатогены. Интересным является  факт,   что   грибы   рода  Fusarium    одного   вида   могут   поражать растения   из   самых   разнообразных   семейств,   вызывая   у   них   различные патологические   явления   —   гниль   корней,   семян,   плодов,   а   также   общее угнетение и преждевременное увядание. 

В   основе   биологических   методов   борьбы   с   фитопатогенными микромицетами   лежат   антагонистические     взаимоотношения   между микроорганизмами.   Так,   положительные   результаты     были   получены   при применении   биофунгицидов   на   основе     грибов   рода  Trichoderma, бактериальных   препаратов   на   основе  Bacillus  subtilis,  Pseudomonas aureofaciens,  Pseudomonas  fluorescens,  Streptomices  griseus и других. Однако, поиск   новых   штаммов,   обладающих   высоким   уровнем   биофунгицидной активности   и   штаммов,   соответствующих   определенным   эколого­географическим условиям   продолжается. Кроме того, в литературе имеется незначительное количество работ, связанных с возможностью использования растений в борьбе с фитопатогенными микромицетами, в том числе, грибами рода Fusarium.

161

Настоящая   работа   посвящена   изучению   действия   различных микроорганизмов   и   растительных   экстрактов   на   развитие   грибов   рода Fusarium  sp.,   выделенных   с   поверхности   картофеля   и   музейного  штамма Fusarium  oxisporium.

Из образцов различных типов почв Татарстана, с поверхности овощных культур (картофель), с поверхности семян и вегетативных органов зерновых культур   (пшеница,  кукуруза),  из  ризосферы  декоративных  растений   (розы), выделяли   различные   бактерии.   Родовую   принадлежность   штаммов определяли   по   принятым   морфологическим   и   физиолого­биохимическим показателям.   Полученные   25   штаммов   были   использованы   для   изучения биофунгицидного влияния на грибы рода Fusarium.

Результаты исследований показали, что антагонистическую активность к   изучаемым   фитопатогенам   проявляли   многие   выделенные   и идентифицированные   штаммы   бактерий.   Однако,   наибольшей антагонистической   активностью,   среди   выделенных   штаммов,   обладали   7 вариантов: 3 штамма рода Bacillius (предположительно B.subtilis, B. megaterium, B.mycoides),   1   штамм   рода  Pseudomonas,   1   штамм,   отнесенный   к  Seratia marcescens и 1 штамма Microccocus sp. и 1штамм  Arthrobacter sp. (табл.1).

Таблица 1. Биофунгицидное действие  ризосферных микроорганизмов

№     Родовая принадлежность

Антагонистическая активность (зоны подавления, мм)Fusarium oxysporium  Fusarium sp.

1. Bacillus subtilis 35,6  2,0 40,2  2,22. Bacillius megaterium 28,0 1,8 30,2 1,93. Bacillus mycoides 36,6 2,8 41,6  2,44. Micrococcus sp. 17,2 0,9 18,4  0,85. Seratia marcescens 20,8  0,4 22,4 0,66. Arthrobacter sp. 17,6  0,4 18,2 0,47. Pseudomonas sp. 30,0 1,2 32,01,4

Многократная   проверка   действия   этих  штаммов   на  фитопатогенные грибы   рода  Fusarium,   выявила   группу   микроорганизмов,   обладающих наибольшей  антагонистической  активностью  – ими  оказались бактерии  рода Bacilius.  Особенно   высокую  антагонистическую  активность  проявлял  штамм Bacillus  mycoides  (размер   зоны   подавления   роста  Fusarium  oxysporium  и Fusarium  sp. ­36,6мм и 41,6 мм,  соответственно). Однако, не менее  активным был штамм отнесенный к роду Pseudomonas sp.

Таким   образом,   получены   штаммы   бактерий,   обладающие   высокой антагонистической активностью к фитопатогенным грибам рода Fusarium.

Как отмечалось выше, в литературе имеется незначительное количество работ   посвященных   антибиотическому   действию   растительных   экстрактов относительно   фитопатогенных   микроорганизмов.   Поэтому   нами   были проведены   исследования   по   изучению   действия   различных   водных растительных экстрактов  на  грибы  рода  Fusarium. Результаты  исследований показали, что  из 17 экстрактов, только 3 вида: экстракт из чеснока, чистотела и   зверобоя   оказывали   влияние   на   задержку   роста   грибов   рода  Fusarium (табл.2). 

162

Таблица 2Влияние различных  растительных экстрактов на грибы рода Fusarium

№ Названия растений Биофунгицидное действие, %1. Urtica dioica (крапива) Эффект отсутствует2. Allium sativum (чеснок)  F.oxysporium –30%, F.sp.­ 45%3. Achillea millefolium (тысячелистник) Эффект отсутствует4. Taraxacum officinale (одуванчик) Эффект отсутствует5. Artemisia absinthium (полынь) Эффект отсутствует6. Allium cepa (лук) Стимуляция образования мицелия7. Chelidonium majus (чистотел) F.oxysporium –23%, F.sp.­ 32%8. Hypericum perforatum (зверобой) F.oxysporium –36%, F.sp.­ 36%9.  Plantago major (подорожник) Эффект отсутствует10. Melilotus officinalis (донник) Эффект отсутствует11. Matricaria chamomilla (ромашка) Эффект отсутствует12. Tanacetum vulgare (пижма) F.oxysporium – 9% F.sp.­ 10%13. Rosa cinnamomea (шиповник) Эффект отсутствует14. Arctium lappa (лопух) Эффект отсутствует15. Quercus robur (дуб) Эффект отсутствует16. Pinus silvestrius (сосна) Эффект отсутствует17. Sorbus sibirica (рябина) Эффект отсутствует

 Наибольшим     биофунгицидным   действием   против   активного 

фитопатогена   растений   ­  Fusarium  oxisporium,   обладал   водный   экстракт, полученный из   зверобоя (Hypericum  perforatum), задержка роста составляла 36%  относительно   контроля.  Другие   экстракты  оказывали  менее   значимое действие.

Таким образом, проведенное исследование показало, что ризосферные бактерии   и   отдельные   растительные   экстракты   обладают   выраженным биофунгицидным   действием   относительно   фитопатогенных   грибов   рода Fusarium.

163

УМНИКФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КАРАКАТИЦ И СЕПИОЛИД (CEPHALOPODA: SEPIIDA, SEPIOLIDA)Голиков А. В., студент 4 курса, кафедра зоологии беспозвоночных, биолого­почвенный факультет, Казанский Государственный УниверситетНаучный руководитель: Сабиров Р. М., к.б.н., доцент, кафедра зоологии беспозвоночныхКазанский Государственный Университет; Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии, г. Мурманск; Морская биологическая станция Хиросимского Университета, о. Мукаишима, Япония

FUNCTIONAL MORFOLOGY OF REPRODUCTIVE SYSTEM IN MALES OF SEPIIDA AND SEPIOLIDA ORDERS (CEPHALOPODA)

Golikov A. V., 4th year student, Department of Invertebrate Zoology, Faculty of Biology and Soil Science, Kazan State UniversitySupervisor: Sabirov R. M., ph.d., associate professor, department of invertebrate zoologyKazan State University; Polar Research Institute of Fisheries and Oceanography, Murmansk; Marine Biological Station of Hiroshima University, Mukaishima, Japan

Головоногие   моллюски   Cephalopoda   –   это   давно   возникший   и высокоспециализированный   класс   типа  моллюсков   Mollusca.  Эти  животные играют   важнейшую   роль   в   экосистеме   Мирового   Океана,   и   являются важнейшими   нерыбными   объектами   промысла.   Представители   отряда каракатиц  (Sepiida) являются  наиболее  дорогостоящим  ресурсом,  и  наряду  с представителями   отряда   сепиолид   (Sepiolida)   рассматриваются   как перспективный объект для марикультуры (Jereb, Roper, 2005). Отряды  Sepiida и  Sepiolida  разделены  совсем  недавно   (Бизиков,   2008;  до  этого  сепиолиды входили   в   состав   каракатиц)   на   основании   различий   в   строении   опорно­двигательного  аппарата.  Биология  размножения  многих  видов  каракатиц  и сепиолид не изучена, или изучена недостоточно. Между тем эти данные лежат в   основе   биологического   прогнозирования   промысла   и   рационального использования ресурсов. Так же без этих данных нельзя ответить на вопрос о возможности   воспроизводства   этих   животных   в   искусственной   среде обитания.   Таким   образом,   актуальность   нашей   работы   определяется следующим рядом обстоятельств:

­  oдин  из  взятых  нами  для  исследования  видов  – золотая  каракатица Sepia esculenta Hoyle, 1885 (Sepiida) имеет важнейшее промысловое значение, находится на одном из первых мест по промыслу среди каракатиц (добывается в объеме около 100 тыс. тонн/год по данным ФАО)

­   другой   вид,   взятый   для   изучения   –   арктическая   россия  Rossia palpebrosa  Owen,   1834   (Sepiolida)   является   самым  массовым   видом  донных головоногих в Баренцевом море.

Репродуктивная   система   самцов   этих   видов   не   описана,  между   тем знание по строению репродуктивной системы изучаемых видов может помочь 

164

в решении вопросов систематики рода  Rossia в северо­европейских  морях, а также  подойти  с  новым  взглядом  на  макросистематиматическое  положение отрядов   каракатиц   и   сепиолид.   Исходя   из   этого,   цель   нашей   работы   – изучение   макроморфологии,   особенностей   функционирования   и онтогенетической   изменчивости   репродуктивной   системы   самцов представителей отрядов Sepiida и Sepiolida.

Материалом для работы послужили пробы репродуктивной системы 22 экземпляров   арктической   россии   и   13   экземпляров   золотой   каракатицы. Материал  по  R.  palpebrosa  был  отобран  автором  лично  из  экспедиционных сборов  лаборатории  промысловых  беспозвоночных  Полярного  НИИ  морского рыбного   хозяйства   и   океанографии   (г.   Мурманск)   во   время   научной стажировки.  России  были   собраны  в  научных  рейсах  Всероссийского  НИИ рыбного  хозяйства  и  океанографии   (ВНИРО,  г.Москва)  ­  НИС  «Мензелинск» (1984)   и   Полярного   НИИ   рыбного   хозяйства   и   океанографии   (ПИНРО, г.Мурманск) ­ НИС «Ф.Нансен» (2004­2006 гг.), НИС «Вильнюс» (2007 г.), НИС «Смоленск» (2007 г.). Облов каракатиц производился тралом “Campelen­1800” на глубинах 40­585 м. Сбор производился по всей акватории Баренцева моря с 68,50  до   820  N  и  с   100  до   600  E.  Пойманные  каракатицы  фиксировались  в растворе 4 % формалина. Поймано 176 особей R. palpebrosa, из них 97 самцов. У  всех  экземпляров  определены  пол,  стадия  зрелости,  длина  мантии  и  вес, если это самец, то указывалось, какая рука гектокотилизирована, и она кратко описывалась.  Большая   часть   наших   проб   пришлась   на   район   восточного шельфа архипелага Шпицберген и Шпицбергенской банки ­ 43 самца. В данном исследовании   мы   изучали   в   основном   самцов   из   этого   района.   Полному биологическому анализу подвергнуто 22 самца, от III – до V2 стадии зрелости, с длиной мантии 2,0 – 4,3 см, на глубине от 72 – до 368,5 м. Сепии были собраны на   территории   Японии,   у   островов   Ириоматэ   (240N   –   1240E;   31   экз.)   и Мукаишима (340N – 1320E; 4 экз.). Каракатицы были пойманы ставными сетями и на удочку с блесной в верхней батиали у данных островов. Репродуктивная система   самцов  извлекалась   из   свежих  животных   и  фиксировались   в   700 

спирте.   Длина   мантии   каракатиц   составила   от   15,3   –   до   15,8   см.   Все исследованные самцы  S. esculenta V2 ст. зр.. Полным биологическим анализом исследованы  13 проб  по  золотой  каракатице.  Полный  биологический  анализ самцов   включал   измерение   около   20   показателей   тела   и   репродуктивных органов.   Для   записи   результатов   биологического   анализа   разработана оригинальная  карточка.  Объем  семенного  резервуара   (мм3)  определялся  по формуле   объема   цилиндра.   Для   статистической   обработки   материала применялся   пакет   программ  MS  Excel.   Обработка   материала   велась   в лаборатории гидробиологии кафедры зоологии беспозвоночных КГУ.

Впервые  описана  макроморфология  репродуктивной  системы  золотой каракатицы   и   арктической   россии.   Общий   план   строения   типичен   для десятируких головоногих моллюсков, но у каждого вида есть специфические особенности.   Репродуктивная   система   у   обоих   исследованных   видов расположена в задней части мантии. У R. palpebrosa она относительно больше, занимает более центральное положение. Строение семенника у них примерно одинаково, но отличны количественные показатели и положение – у россии он перпендикулярен главной оси тела, а у каракатицы параллелен ей. У золотой 

165

каракатицы семяпровод имеет вид веретена с сечением треугольной формы. Его   проток   в   виде   многочисленных   петель   и   изгибов   уложен   в   разных плоскостях.   Просвет   протока   из­за   перистальтических   сокращений   своих стенок варьирует в 5­7 раз. Дорсальная стенка сперматофорного мешка несет крупную   ламеллу   из   полупрозрачной   ткани,   которая   распределяет накапливающиеся сперматофоры по спирали в виде 2,5 оборотов. Для роста всех   отделов   сперматофорного   комплекса   органов   (СКО)   в   онтогенезе характерна отрицательная аллометрия, кроме 2 и 5 отделов, которые растут практически   изометрично.   Семяпровод   R.   palpebrosa   имеет   вид   трубки уложенной   петлеобразно   в   одной   плоскости.   Ширина   всего   семяпровода уменьшается от ампулы – до сфинктера примерно в 3­4 раза. СКО арктической россии имеет своеобразную особенность – петлю, образованную  дистальной частью  сперматофорного  протока  и  фундусом  сперматофорного  мешка.  Его функция   –   разворот   сперматофоров   и   место   начала   их   созревания. Сперматофоры  в  мешке  за  счет  ламелл  и  крист  в  его  стенках  уложены  по спирали  в   1,5  оборота.  Рост  отделов  СКО  характеризуется  положительной аллометрией, за исключением изометричных 1 и 3 отделов. У сперматофоров S. esculenta есть небольшая, слабо заметная связка между цементым телом и семенным резервуаром, характерная для каракатиц. Длина сперматофоров 13 – 16,3  мм   (в  среднем,  8–10,5% от  ДМ).  С  увеличением  размеров  каракатиц абсолютная  и  относительная  длина  образуемых  сперматофоров  снижается. Семенной  резервуар  составляет   63,3  –  75  % от  длины  сперматофора,  его средний объем 1,5 – 2 мм3. Количество образуемых сперматофоров 146–486, в среднем 322. Индивидуальная эффективная продукция спермы (объем спермы во   всех   сперматофорах)   245,4   ­   869,5   мм3.  Сперматофоры   R.   рalpebrosa отличает характерная небольшая связка между цементым телом и семенным резервуаром. Длина сперматофоров 8,9 – 19,6 мм (в среднем 29,4 – 51,5% от ДМ).   С   увеличением   размеров   россии   абсолютная   длина   образуемых сперматофоров   растет,   а   относительная   снижается.   Длина   семенного резервуара   ­   40–60   %   от   длины   сперматофора,   его   объем   0,7   –   1   мм3, индивидуальная   эффективная   продукция   спермы   9,6   –   64,3   мм3. Индивидуальная   плодовитость   сперматофоров   очевидно   менее   сотни,   в среднем   40­60.   Описана   продукция     наладочного   сперматофорогенеза: сперматофороподобные образования (III – IV ст. зр.), псевдосперматофоры (III – IV, иногда V1 ст. зр.), ранние (IV – V1 ст. зр.) и поздние (IV – V1, изредка V2 ст.  зр.)  квазиспрематофоры.  Квазисператофоры  промерялись,  их  длина  6  – 11мм,  объем  семенного  резервуара  0,03  –  0,3  мм3.  Для  арктической  Росси нами   разработана   Так   же   эти   виды   различаются   по   репродуктивной стратегии. Самцы S. esculenta тяготеют к r­стратегии. Они продуцируют много относительно   небольших   сперматофоров,   длиной   не   более   15   %   длины мантии. r­стратегия обычно характерна для головоногих, населяющих теплые тропические  воды.  С  большей   вероятностью  полученный  результат  можно распространить   на   отряд   Sepiida,   все   его   представители   ведут   примерно одинаковый  образ  жизни,  и  вероятно,  что  они  все  тяготеют  к   r­стратегии. Самцы   R.   palpebrosa   тяготеют   к  К­стратегии.  Они  продуцируют  несколько десятков относительно крупных сперматофоров (30 – 50 % от длины мантии). К­стратегия обычно характерна для головоногих, населяющих холодные воды 

166

и   глубины.  О   представителях   рода   Rossia   (и   скорее   всего   подсемейства Rossiinae)   с   достаточной   вероятностью   можно   сделать   вывод   на   основе изучения  R.  palpebrosa – скорее  всего  все  они  являются  К­стратегами.  Все полученные   результаты   дополняет   различия   между   отрядами   Sepiolida   и Sepiida,   которые   прежде   основывались   практически   только   на   строении опорно­двигательного   аппарата.   Таким   образом,   разделение   этих   отрядов выглядит более оправданым.

У  особей  из  района  настоящего  исследования   (шельф  Шпицбергена, Шпицбергенская   банка   и   возвышенность  Персея)   гораздо   больше   разброс значений  промеров  репродуктивной  системы,  чем  в  других  районах   (шельф Мурмана   +  Южная   часть  Центральной   впадины   и  шельф  Новой  Земли   + Северная часть Центральной Впадины): например, длина сперматофора в 1­ом районе 8,9 – 19,6 % от длины мантии, во 2­ом – 9,8 – 13 %, в 3­ем – 8,9 – 14,5 %; вес СКО в 1­ом районе 1,9 – 14,64 % от веса тела, во 2­ом 1,69 – 6,26 %, в 3­ем – 0,58 – 6,15%; длина  4  отдела  СКО  в  1­ом  случае  36,36 – 75 % от  длины мантии, во 2­ом – 42,11 – 76,26 %, в 3­ем – 51,72 – 70 %, и такое наблюдается почти  по  всем  показателям.  Так  же  наблюдается  большой   (почти  в  2  раза) разброс   в   длине   мантии   зрелых   самцов   из  Шпицбергенского   района   при примерно  одинаковом  числе   сперматофоров   в  их  мешках.  У  более  мелких самцов   сперматофоры   относительно   крупнее.   Были   обнаружены незначительные  отличия  в  строении  мандибулярно­радулярного  аппарата  и рядности   присосок   на   руках.   Все   сказанное   уже   можно   принять   как подтверждение неоднородности популяции арктической россии в Баренцевом море. Можно  предположить существование здесь нескольких  популяций или обособленных   нерестовых   группировок,   приуроченных,   вероятнее   всего,   к приуроченных   к   восточному   шельфу   Шпицбергена,   Новоземельскому мелководью и Мурманскому мелкодью.

Настоящая   курсовая   работа   выполнена   в   рамках   гранта   PINRO/IMR (Норвежско­Российский)   «Joint   Norwegian­Russian   environmental   status   2008, Barents Sea Ecosystem».

Результаты   работы   доложены   на  IX  Международной   конференции «Комплексные исследования природы Шпицбергена» в г. Мурманске, 12 – 13 ноября 2009.

167

УМНИКЗАКОНОМЕРНОСТИ СОЗРЕВАНИЯ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ И ПЛОДОВИТОСТЬ САМОК ROSSIA PALPEBROSA (CEPHALOPODA: SEPIOLIDA) НА ВОСТОЧНОМ ШЕЛЬФЕ АРХИПЕЛАГА ШПИЦБЕРГЕНМоров А.Р.., студент 4 курса, кафедра зоологии беспозвоночных, биолого­почвенный факультет,Научный руководитель: Сабиров Р. М., к.б.н., доцент, кафедра зоологии беспозвоночныхКазанский Государственный Университет; Полярный НИИ Морского Рыбного Хозяйства и Океанографии (ПИНРО), г. Мурманск; MATURING’S REGULARITIES OF REPRODUCTIVE SYSTEM AND FECUNDITY OF FEMALES ROSSIA PALPEBROSA (CEPHALOPODA: SEPIOLIDA) ON THE EASTERN SHELF OF ARCHIPELAGO SPITSBERGENMorov A.R.., 4th year student, department of invertebrate zoology, faculty of biology and soil scienceSupervisor: Sabirov R. M., ph.d., associate professor, department of invertebrate zoologyKazan State University; Polar Research Institute of Marine Fisheries and Oceanography (PINRO), Murmansk

Головоногие   моллюски   (Cephalopoda)   –   это   очень   разнообразная, малоизученная   и   представляющая   огромный   интерес   со   стороны исследователей  всего  мира  группа  беспозвоночных  животных.  Цефалоподы являются   важным   и   перспективным   объектом   промысла.   Из­за   высоких пищевых   качеств,   короткого  жизненного  цикла   и   необыкновенно   быстрого роста  они  также  выступают  ценным  продуктом  марикультуры   (Несис,   1982; Лаптиховский,   2005).   Важнейшая   составляющая   экологической   стратегии видов   ­   репродуктивная   стратегия.   Для   её   описания   важным   является изучение   морфологии   отдельных   частей   половой   системы   и   их функционирования,  а   также  функционирование  половой   системы  в  целом. Репродуктивная   стратегия   видов  представляет   собой   комплекс  адаптаций, обеспечивающих  успех  размножения,  и  включает  скоординированные  черты жизненного  цикла:  плодовитость,  размер  яиц,  возраст  полового  созревания, размеры   взрослых   особей,   продолжительность   репродуктивного   периода, степень заботы о потомстве. Моментами, заслуживающими особого внимания в репродуктивной стратегии, являются морфо­функциональные характеристики половой  системы,  закономерности  формирования  плодовитости,  дальнейшая её   реализация.   При   этом   данные   вопросы   у   самок   многих   головоногих моллюсков   изучены   недостаточно,   особенно   этот   пробел   заметен   у арктических видов цефалопод.

Объектом   наших   исследований   является   аркто­бореальный приатлантический   вид   из   семейства  Sepiolidae,   подсемейства  Rosiinae  – арктическая  россия  Rossia  palpebrosa  (Owen,   1834).  Сведения   о   строении половой   системы   и   плодовитости   самок  R.  palpebrosa  в   литературе отсутствуют,   если   не   считать   нескольких   попутных   упоминаний.   Поэтому 

168

целью  данного   исследования   явилось   морфо­функциональное   описание половой системы самок арктической россии и изучение ее плодовитости.

В качестве материала нам послужили сборы, сделанные в рейсах   НИС «Ф.Нансен» (2005 ­ 2006 гг.), НИС «Вильнюс» (2007 г.), НИС «Смоленск» (2007 г.). Сборы россий производились учетным тралом “Campelen­1800” на глубинах 40 ­ 585 м. Всего было обработано 39 экземпляров самок R. palpebrosa длиной мантии   (ДМ)  0,6   ­  4,8 см,  стадий  зрелости  от  I   до  V2,  собранных  в  районе восточного шельфа архипелага Шпицберген (от 750 с.ш. до 810 с.ш. и от 170 в.д. до   440  в.д.)  Полный  биологический  анализ   самок  россий  при   камеральной обработке был сделан для 12 экземпляров россий (3 самки из 2005 г., 4 – из 2006 г. и  5 – из 2007 г.). Анализ ооцитов был сделан у самок от II до V2 стадии зрелости  и  с  ДМ  от  1,6 см  до  4,5 см.  В  общей  сложности  у  12 экземпляров россий было измерено 1532 ооцита, при этом использовались микроскопы МБИ и   Микмед­2   с  USB­окуляром   и   окуляр­микрометром.   У   остальных   27 экземпляров  анализ ооцитов не  проводился.  Относительные размеры частей половой   системы   рассчитывались   в   %   к   ДМ.   Статистическая   обработка материала   проводилась   с   использованием   стандартного   пакета   программ Microsoft Excel. 

Половая система самки R. palpebrosa, как и у всех каракатиц, состоит из яичника,  в  котором  сконцентрированы  ооциты  разных  генераций;  яйцевода, где   располагаются   ооциты,   готовые   для   вымета;   яйцеводной   железы; нидаментальных и добавочных нидаментальных желез. У зрелых самок масса репродуктивной системы может составлять примерно 1/3 от общего веса самки (индекс репродуктивной системы (ИРС) = 28,1 %).

В   ходе   онтогенеза   происходит   увеличение   относительной   длины нидаментальной железы. У незрелых самок они вытянутые, достаточно узкие, превышают   по  длине   всю   гонаду.  При   минимальной  ДМ   1,3   см   значение относительной   длины   составляет   менее   20   %.   У   более   зрелых   самок нидаментальные  железы   массивнее.  По   мере   созревания   это   значение   в среднем составляет около 30 %. У зрелых не нерестившихся самок значение относительной длины нидаментальной железы может достигать более чем 50 %. С момента вступления самок в нерестовый период происходит уменьшение размеров нидаментальных желез, что связано с интенсивным расходованием железистых   продуктов.   При   этом   значение   относительной   длины нидаментальной железы у зрелых нерестящихся самок снижается до 35 %.

Было   выявлено   различие   в   массе   и   длине   между   правой   и   левой нидаментальными   железами.   Это   может   говорить   о   слабовыраженной ассимметрии  данных  желез.  Масса  и  длина  правой  нидаментальной  железы по   мере   созревания   самки   становятся   меньшими,   чем   у   левой   железы. Слабовыраженная  асимметрия  очевидно   связана   с   тем,  что   у  арктической россии,  как  и  у  всех  каракатиц,  есть  только  один  яйцевод,  открывающийся вблизи левой нидаментальной железы. У зрелых самок яйцевод набит яйцами, и он давит на левую нидаментальную железу. В связи с этим правая железа получает   чуть   большее   развитие.   По   середине   каждой   железы   хорошо заметен   внутренний   выводной   проток,   который   заканчивается   выводной дистальной частью. У некоторых зрелых самок в выводных дистальных частях 

169

присутствует  застывший  секрет,  выделяемый  железами.  Он  необходим  для образования четвертичной оболочки яиц. 

Нами   обнаружен   необычный   организм   в   застывшем   секрете нидаментальных  желез,   предположительно   это   стадия  жизненного   цикла дициемид ­ ромбоген с развивающимися аксобластами. России не насиживают кладки, как это  делают  осьминоги, поэтому,  скорее  всего,  последняя  стадия развития,  дающая  начало  инфузориформам,  а  именно   –  ромбогены,  могут заключительный   период   формирования   инфузориформов   находится непосредственно   в   отложенных   яйцах   или   на   их   оболочках.  Их   развитие синхронизировано   с   развитием   эмбрионов   под   оболочкой   яиц.   В   момент выхода   молоди   россий   из   яйцевой   оболочки   происходит   выход инфузориформов,   которые   заражают   молодых   сепиолид   аксобластами, дающими начало нематогену основателю. 

Ушковидные   нидаментальные  железы   с   углублением  на   вентральной поверхности  располагаются   таким  образом,  что  в  него  подходит  выводная дистальная часть нидаментальной железы. Они на ранней стадии онтогенеза закладываются   примерно   таких   же   размеров,   как   и   нидаментальные.   С началом активного созревания самок рост добавочных нидаментальных желез начинает резко отставать от роста нидаментальных желез. И у зрелых самок они уже составляют лишь 21 – 34 % длины нидаментальных желез, тогда как у самых  мелких  незрелых  самок  в  нашем  материале   (ДМ   1,3  см)  составляли около   90   %   длины   нидаментальных   желез.   На   дорсальной   поверхности железы   видна   пятнистость,   особенно   у   самок   стадий   зрелости  V1,  V2. Вероятно, это скопления симбиотических бактерий в виде отдельных пятен. 

Яйцевод   ­   трубка   с   эластичными   полупрозрачными   стенками.   Его проксимальная  часть с  половой  воронкой  располагается  в  центре  гонады.  В дистальном направлении яйцевод делает S­образный изгиб влево, идет вдоль левой нидаментальной железы и открывается вблизи ее выводного отверстия и   сосочка   левой   почки.   На   дистальном   конце   яйцевода   располагается массивная яйцеводная железа. Она состоит из двух частей, проксимальной и дистальной,  которые  в  виде   «бубликов»  насажены  на  выводное  отверстие яйцевода.

У зрелых самок гонада шарообразной формы с крупными ооцитами. Она составляет   приблизительно   1/5   от   общего   веса   самки (гонадосоматический   индекс   (ГСИ)=21   %).  У   незрелых   самок   гонада небольшого размера, размещена позади нидаментальных желез. 

Все  ооциты  были поделены  на  6 фаз  развития,  при этом  учитывалась степень   зрелости,   размерные   характеристикам   и   цвет.   У   более   зрелых ооцитов  также  учитывалось наличие  фолликулярной  оболочки.  По  динамике размерного   состава   ооцитов   развитие   гонады   арктической   россии   можно отнести к пульсирующему типу. Нерест происходит мини­порциями, очевидно, не  более  10­20 яиц  за  один  нерестовый  период.  Можно  предположить,  что самки  R. palpebrosa откладывают яйца до 5­8 раз.  Вероятно, расходуется не весь  фонд  ооцитов,  а  часть  остаётся  так  и  недоразвитой  и  представляет ооциты  нетипичной  формы.  Они  на  стадии  протоплазматического  роста  не развиваются, а в последующем ­ резорбируются. Это свойство является одним из механизмов оптимизации репродуктивных усилий самки, когда реализуется 

170

плодовитость   в   соответствии   с   возможностями   энергетических   затрат   на генеративную составляющую обмена.

У   зрелых   самок   (V1  стадия   зрелости)   при   разной  ДМ   наблюдается различное  максимальное  количество  ооцитов: у самки  с ДМ  3,6 см  основная доминирующая генерация ооцитов характерна для 1­ой и 2­ой фазы, тогда как у   самки   с   наибольшей  ДМ   4,5   см   максимальное   количество   ооцитов   (15) соответствует 3­ей фазе развития ооцитов, и их размеры лежат в пределах от 4,9 до 5,1 мм. Максимальное количество ооцитов у самок V2 – 27 (при размерах ооцитов 0,7­0,9 мм) 

Значение   индивидуальной   потенциальной   плодовитости   (ИПП) арктической  россии  варьировало  от  46 у  незрелых  и  созревающих  самок  до 189  ооцитов   –  у  зрелых.  У  других  представителей  подсемейства  Rossiinae потенциальная плодовитость выше и составляет от нескольких сотен до более тысячи ооцитов. У R. macrosoma значение ИПП составляет 382 ­ 837 (ДМ 2,4­5,9 см; длина зрелых ооцитов 5,6­9,2 мм), у R. pacifica – 355 ­ 1246 (ДМ 6,9­8,6 см; длина зрелых ооцитов 7,9­9,1 мм), у  R. moelleri – 200 ­ 385 (ДМ 3,2­3,4 см; длина зрелых ооцитов 7­11 мм). Размеры зрелых ооцитов примерно совпадают, но ИПП у Rossiinae имеет тенденцию к увеличению в бореальном направлении. 

Настоящая работа выполнена в рамках гранта PINRO/IMR (Норвежско­Российский)   «Joint   Norwegian­Russian   environmental   status   2008,  Barents  Sea Ecosystem».   Результаты   были   представлены   на  IX  Международной конференции «Комплексные исследования Шпицбергена» в г. Мурманск 12 – 13 ноября 2009 года.

171

УМНИКСОЗДАНИЕ СПРАВОЧНО­ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ ПО БЕЗОПАСНОСТИ НАНОТЕХНОЛОГИЙХалиуллин Т.О., Фатхутдинова Л.М.Руководитель профессор кафедры гигиены, медицины труда с курсом мед.экологии КГМУ, д.м.н. Фатхутдинова Л.М.ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

В   условиях   экспоненциального   роста   публикаций,   отсутствия специализированных справочных баз данных и растущего числа инвестиций в отрасль  наноиндустрии,  необходимо  принимать  опережающие  меры,   в   том числе  по  информационному  обеспечению  заинтересованных  лиц.  Важность информирования   руководителей   инновационных   проектов   в   области нанотехнологий,   специалистов   по   гигиене   и   охране   труда   продиктована необходимостью  проектирования  и  внедрения  безопасных  нанопроизводств, формирования   системы   профилактических   мероприятий   для   сохранения здоровья работников.

Базы  данных  по  наноматериалам  начинают  появлятся  в  мире  на  базе университетов   и   научно­исследовательских   центров,   выпускаются рекомендации   и   пособия   по   безопасному   обращению   с   наноматериалами, однако   в   России   подобные   работы   до   сих   пор   находятся   в   зачаточном состоянии.

Цель   данного   проекта   ­   создание   полноценной   удобной   в использовании,  дружественной  пользователям  с  разным  уровнем  знаний  по предмету нанотехнологий справочно­информационной системы, включающей в себя   гигиенические   и   токсикологические   характеристики   искусственных наночастиц,  полученные  в  результате  обзора  последних  публикаций,  ссылки на  публикации  в  периодических  центральных  и  международных  изданиях,  а так   же   виды   производств,   листки   безопасности   для   работодателей   и работников,   рекомендации   по   обеспечению   безопасности   здоровью работников   и   других   лиц,   связанных   с   производством   и   применением наноматериалов.   Планируется   включить   сравнительные   материалы   по эффективности   различных   методов   оценки   вредного   воздействия наноматериалов, экспозиции к наночастицам, на современном уровне знаний. Все данные будут приводиться на русском языке.

В  работе  будут  использоваться  программные  методы,  предполагается размещение   системы   на   интернет­сервере   Казанского   государственного медицинского университета с защищенным доступом, а так же на оптических носителях. Планируется регулярное обновление информации. 

По   итогам   первого   года   исследования   будет   представлен   опытный образец   справочно­информационной   системы,   по   истечении   двух   лет   – готовый к внедрению коммерческий программный продукт. 

Целевыми  потребителями  будут  являться  предприятия  наноиндустрии, государственные   контрольно­надзорные   органы,   научно­исследовательские коммерческие и некоммерческие организации и прочие субъекты.

172

ПДРФ­АНАЛИЗ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЛКРС)Шаева А. Ю.Научный руководитель – доктор ветеринарной медицины, профессор Хазипов Н. З.Казанская государственная академия ветеринарной медицины

THE RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) ANALYSIS OF BOVINE LEUKEMIA VIRUSShaeva A.Yu.Khazipov N.Z.Kazan state academy of veterinary medicine

Лейкоз  крупного  рогатого  скота  – хроническая инфекционная  болезнь опухолевой   природы,   основной   признак   которой   ­   злокачественное разрастание   клеток   кроветворных  органов   с  нарушением  их   созревания,  в результате   чего   происходит   диффузная   инфильтрация   органов   этими клетками или появляются опухоли.

В структуре инфекционных болезней  лейкоз крупного рогатого скота в РФ   занимает   ведущее   место.   В   системе   противолейкозных   мероприятий ранняя диагностика и изолированное содержание инфицированных животных являются   основным   методом.   Существующие   способы   диагностики   (РИД, гематологические   исследования   и   ИФА)   не   учитывают   генетическое разнообразие   вируса   лейкоза.   Между   тем   появляются   сведения,   что некоторые   подтипы   ВЛКРС   влияют   на   эффективность   диагностических исследований и на характер эпизоотического процесса. Методы ПЦР и ПДРФ (полиморфизм   длины   рестрикционных  фрагментов)   позволяют   определить генотипы вируса лейкоза, циркулирующие в организме животных [1, 2, 3, 4].

Целью  работы  было  изучить   генотипическое  разнообразие  ВЛКРС   в хозяйствах Республики Татарстан.

Исследования   проводились   на   коровах,   принадлежащих сельхозпредприятиям 12 районов Республики Татарстан. Всего было взято 182 пробы  крови, в том числе  РИД  положительных  162, РИД  отрицательных  20. 120 проб оказались ПЦР положительными, из них 66 проб было подвергнуто генотипированию.  Общее   количество   проб,   отобранное   для   исследований, представлено в табл. 1.

173

 Таблица 1. 

№№ п/п Район РТ

Общее количество 

проб

В том числе:ПЦР «+»

Генотипировано пробРИД 

«+»РИД «­»

1 Арский 9 9 ­ 7 72 Высокогорский 23 10 13 10 ­3 Дрожжановский 19 19 ­ 12 94 Заинский 38 38 ­ 25 ­5 Зеленодольский 36 34 2 25 106 Кайбицкий 9 9 ­ 7 77 Лениногорский 8 8 ­ 8 88 Мензелинский 8 8 ­ 4 49 Муслюмовский 6 1 5 1 ­10 Рыбнослободский 8 8 ­ 8 811 Спасский 8 8 ­ 3 312 Чистопольский 10 10 ­ 10 10

ИТОГО 182 162 20 120 66

Изолирование ДНК проводилось с помощью тест­системы «Лейкоз КРС­провирус» строго по протоколу, рекомендованному производителем. 

С   выделенными  ДНК  осуществлялась  полимеразная  цепная  реакция. При постановке ПЦР использовались праймеры фрагментов гена  env вируса лейкоза, рекомендованные М. Liсursi [4]. С целью генотипирования проводился ПДРФ анализ с использованием рестриктаз Pvu II, BamH I, Bcl I. 

Все   ампликоны   анализировали   с   помощью   горизонтального электрофореза   в   1,7%   агарозном   геле   и   тестировали   в   УФ­свете видеосистемой   «Gel  Imager  2».   Продукты   рестрикции   анализировали электрофоретически в 7% полиакриламидном геле.

Результаты   генотипирования  ВЛКРС,  циркулирующего  на  территории Республики Татарстан, представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Район РТ ГенотипированоГенотип ВЛКРС

1­й 2­й 3­й 4­й 5­й 6­йАрский 7 1 ­ ­ ­ ­ 6Дрожжановский 9 8 ­ ­ ­ ­ 1Зеленодольский 10 10 ­ ­ ­ ­ ­Кайбицкий 7 ­ ­ ­ ­ ­ 7Лениногорский 8 3 ­ ­ ­ ­ 5Мензелинский 4 ­ ­ ­ ­ ­ 4Рыбнослободский 8 ­ ­ ­ ­ ­ 8Спасский 3 3 ­ ­ ­ ­ ­Чистопольский 10 7 ­ ­ ­ ­ 3ИТОГО 66 32 ­ ­ ­ ­ 34

174

Таким образом, среди исследованных нами 182 проб крови в 120 случаях был   обнаружен   провирус   лейкоза,   из   них   66   проб   было   подвергнуто генотипическому  исследованию.  В  34  случаях  вирус  был  отнесён  к  шестому подтипу,  в  других  32­х  пробах  вирус  принадлежал  первому  подтипу.  Картин рестрикции, характерных для 2, 3, 4 и 5­го подтипов, получено не было.

Эпизоотическая   ситуация   по   лейкозу   крупного   рогатого   скота   в Республике   Татарстан   является   напряжённой.   По   данным   Главного управления ветеринарии РТ, в 2008 году методом РИД было происследовано 688  тыс.  голов  КРС,  117 тыс.  из  них  оказались  сероположительными,  т.  е. степень   инфицированности   составила   17%.   Степень   заболеваемости составила 2,8% ­ из 279 тыс. исследованных животных было выявлено 7,8 тыс. гематологически   больных.  Экономический   ущерб   от   лейкоза   в   2008   году составил   205,6   млн.   руб.,   а   предотвращённый   ущерб   за   счёт   снижения инфицированности и заболеваемости скота – 133 млн. руб.

В системе мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота ранняя   диагностика   является   ведущим   методом,   а   полимеразная   цепная реакция   –   наиболее   эффективным   способом   обнаружения   возбудителя.  В связи с этим, использование метода ПЦР для диагностики лейкоза, а также изучение гетерогенности возбудителя значительно повышает эффективность противолейкозных мероприятий и заслуживает внедрения в производство.

1. Дробот Е.В. и др. //Вестник РАСХН, №1, 2007, с.82­84. 2. Зиннатов Ф.Ф. и др. //Учёные записки КГАВМ, т.189, 2006, с.71­78. 3. Лиманский А.П. и др. //Вопросы вирусологии, №2, 2005, с.39­44. 4. Licursi M. et al. //Virus Res., 86, 101­110.

175

USING OF PHYTIC ACID AS AN IMPROVING AGENT IN BLOOD AND LIVER RATS TREATED WITH AFLATOXIN B1 (AFB1)ABD EL­RAHMAN, A.A.*; EL­MORSI, E.A.**; EL­SHAFEI, M.A.**and ABD El­NAEM, G.F.***Department of Biochemistry, Faculty of biology and soil, Kazan State University,  Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation**Department of Agricultural chemistry, Faculty of Agriculture, Minia University, Minia, Egypt.

Inadequately   stored  products   and   agricultural   byproducts   exposed   to   high humidity and high temperatures facilitate the development of fungi. The presence of these microorganisms, in addition to spoiling the products, reduces their quality and favors   the   development   of   mycotoxins,   which   are   fungal   secondary  metabolites. These   substances  are   important,   since   some  are   responsible   for   serious  health problems for animals and man. Contamination of the foods with aflatoxin B1 (AFB1) is one of   the  important   risk  factors  responsible  for  human  liver  cancer.   It  has been known in the last several years that using of alternative medicine such as botanicals and   nutritional   supplements   has   became   popular   with   inflammatory   and   cancer cases. In animal studies, phytic acid (IP6) has been shown to inhibit cancer growth in multiple types of cancer including breast, colon, prostate and liver. 

Therefore, This study was conduct to examine the influence of phytic acid on some hematological indices as well as histopathological examination in liver sections of rats treated with   Aflatoxin B1  (AFB1). Eighty five white male albino rats (Rattus norvegicus)  were randomly grouped into four groups (20 rats each), and five rats were scarified before divided the rats into groups at the beginning of the experiment (Week 0) for estimated all parameters which studied in the present work. 

In  the present  study we put  stress on the changes  in  some hematological parameters and histopathological examination of liver induced by AFB1 treatment and the   relieving   effect   of   treatment   with   phytic   acid.   The   tested   hematological parameters include: Red blood cells (RBCs), hemoglobin percentage (Hb%), packed cell volume (PCV), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH) and mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC). Broadly speaking, it is worthly to mention that main feature characterized rats treated with AFB1 is that different hematological parameters responded  in an apposite way. RBCs, Hb and PCV showed gradual decreases, but these decreases tend to increase when the rats treated with phytic acid. While MCV, MCH and MCHC exhibited variable increases due   to  AFB1  application   for  2  weeks.  Histopathological  examination  showed  that animals  treated with AFB1  revealed a hepatocellular  cytoplasmic vacuolar change characterized   by   cell   swelling   and   cytoplasmic   membrane   bound   clear   space formation, but treatment with phytic acid after treatment with AFB1 revealed more or less normal hepatic structure. Finally, from all results and data in the present study, we can recommend that use of phytic acid as an improving agent in both blood and liver cells which damaged due to treatment with AFB1. Key Words: Phytic acid, hematological parameters, histopathological examination, 

liver, Albino rats, AFB1.

176

CHANGES IN WEIGHT OF SOME ORGANS IN ALBINO RATS TREATED WITH AFLATOXIN B1 (AFB1) AND CARBON TETRACHLORIDE (CCl4) AND THE EFFECT OF GREEN TEA EXTRACT ON THESE CHANGES

SALLY, M.A. EL­SHAFEI; EL­MORSI, E.A.; TURKE, S.A. AND ABD EL­ KADER, S.M.Department of Agricultural chemistry, Faculty of Agriculture, Minia University, Minia, Egypt.

Mycotoxins   are   secondary   metabolic   products   of   low   molecular   weight generated   by   diverse   moulds.   Aflatoxins   are   a   subclass   of   mycotoxins   mainly produced  by  Aspergillus   flavus  and  Aspergillus   parasiticus  that   can   contaminate various kinds of  foodstuffs.  Carbon tetrachloride (CCl4)  a well  known hepatotoxin, plays   an   important   role   in   the   promotion   of   hepatic   carcingenesis   induced   by exposure to various chemicals, including AFB1 and administration of CCl4 and AFB1 

has been reported to accelerate carcinogenesis. Green tea is being widely studied for its alleged beneficial properties in the treatment or prevention of human diseases. To date, more than 1,500 articles referencing “green tea” are listed in Medline. Green tea   is   reported   to   delay   or   prevent   certain   forms   of   cancer,   arthritis,   and cardiovascular and other disorders. 

Therefore the present work takes into consideration a study on the influence of green tea extract (GText.) on relative weights of some organs to body weight in rats treated with aflatoxin B1  (AFB1)   initiated and carbon tetrachloride (CCl4)  promoted hepatic  carcinogenesis.   One   hundred   and   sixty   five   male   albino   rats   (Rattus  norvegicus) were randomly divided into four groups of 40 rats each, and five rats were scarified at the beginning of the experiment (Week 0) to weigh organs which studied  in  the present work. We have chosen carefully  four organs (liver,  kidney, spleen and testes) in the present study to testify the inflation in these organs due to treatment rats with AFB1  and CCl4  respectively, and to what extent treatment with green tea extract may decrease this inflation. Results clearly indicate that, treating rats   with   AFB1+CCl4  increased   the   relative   weight   of   liver,   kidney   and   spleen compared with those of untreated rats, while testes revealed opposite trend. Anyhow the   enlargement   of   liver,   kidney   and   spleen   tended   to   decrease   markedly   after treatment with green tea extract, but testes tended to increase. Depending upon the above mentioned findings we can conclude that, green tea extract have a big ability to reduce an inflation in organs due to treatment with AFB1 and CCl4. 

Key Words: organs, albino rats, aflatoxin B1, carbon tetrachloride, green tea extract

177