Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса

Повреждение и активация эндотелиальных клеток человека при гипоксии /

реоксигенации Н.М. Бибиков

Д.М. Федорова

Научный руководитель н.с. О.А.Антонова

Москва 2012

 Московская гимназия на Юго-Западе № 1543

Введение

• Гипоксия – недостаток кислорода в крови.

• Реоксигенация – восстановление нормальной концентрации кислорода.

• ФФВ – маркер начала активации эндотелия.

• В взаимодействии участвует ICAM 1.

• Гипоксия и реоксигенация ЭК стимулируют апоптоз, маркером которого является каспаза-3.

ВведениеВведение

• Изучить влияние гипоксии и реоксигенации на эндотелиальные клетки пупочной вены человека.

Цель

• Получить культуру эндотелиальных клеток из пупочной вены человека.

• Создать модель in vitro, приближенную по условиям к клиническому случаю ишемии/реоксигенации.

• Изучить влияние рН среды на ЭК в условиях гипоксии/ реоксигенации.

Задачи

• Определить методом ПЦ уровень ICAM 1 на поверхности эндотелия в процессе эксперимента.

• Определить методом ПЦ активность каспазы-3, как маркера апоптоза.

• Определить с помощью ИФА концентрацию фактора фон Виллебранда в ростовой среде клеток.

Задачи

- это однослойный плоский эпителий, выстилающий внутренние поверхности сердца и сосудов.

Эндотелий

• ФФВ- гликопротеид, синтезирующийся в клетках костного мозга и эндотелии.

• Он участвует в тромбообразовании, способствуя агрегации тромбоцитов.

Фактор фон Виллебранда

• Молекулы клеточной адгезии - это трансмембранные белки, отвечающие за взаимодействие клеток друг с другом или с элементами межклеточного пространства.

МКАД

• ICAM-1 – молекула клеточной адгезии

• Для усиления экспрессии ICAM-1 требуется стимуляция цитокинами, выделяемыми активированными тромбоцитами

МКАД

Взаимодействие МКАД с лейкоцитами

• Стадия непрочного прикрепления (роллинга)

• Стадия остановки лейкоцитов

• Трансмиграция.

Три этапа:

• Индукторный (запуск системы апоптоза, активация проапоптотических белков)

• Эффекторный (каскад каспаз)

• Деградационный (разрушение органелл)

Апоптоз

Каспазы

• семейство ферментов, мишенями которых являются ДНК-зависимые протеинкиназы

инициаторные эффекторные -2, -8, -9 и -10 -3, -6 и -7

Апоптотические пути

• Путь рецепторов смерти

• Митохондриальный путь

• Выделение ЭК из пупочной вены человека

Материалы и методы

Материалы и методы

• Создание условий гипоксии и реоксигенации с заменой среды, действие ФНО и стауроспорином.

Материалы и методы

• ПЦ

• ИФА

ФФВ100

246,88176,21

55,06127,17128,28

83,0670,0953,3378,18

0

50

100

150

200

250

300

100

Контроль

Гипоксия

ФНО

Стауроспорин

Нормоксия 6.4

Гипоксия/реоксигенация 6.4Нормоксия 7.0

Гипоксия/реоксигенация 7.0Нормоксия 7.4

Гипоксия/реоксигенация 7.4

ICAM-1

100133,58

599139,42105,23244,49140,52168,91100,41

%

0

100

200

300

400

500

600

700 Контроль

Гипоксия

ФНО

Нормоксия 6.4

Гипоксия/реоксигенация 6.4

Нормоксия 7.0

Гипоксия/реоксигенация 7.0

Нормоксия 7.4

Гипоксия/реоксигенация 7.4

Каспаза-3100

193,48573,88115,8975,272124,47276,86

128147,11

0

100

200

300

400

500

600

700Контроль

Гипоксия

Стауроспорин

Нормоксия 6.4

Гипоксия/реоксигенация 6.4

Нормоксия 7.0

Гипоксия/реоксигенация 7.0

Нормоксия 7.4

Гипоксия/реоксигенация 7.4

рН парадокс

• При гипоксии происходит ацидоз

• При реперфузии миоциты теряют жизнеспособность. Почему?

• Кислотный рН играет защитную роль при гипоксии (?)

Выводы

• Гипоксия стимулирует выделение ФФВ из ЭК, а также вызывает активацию каспазы и экспрессию ICAM-1.

• Реоксигенация вызывает активацию каспазы-3 и экспрессию ICAM-1.

Выводы

• При гипоксии/реоксигенации возникает "pH-парадокс", из-за которого наблюдается наибольшая концентрация молекул клеточной адгезии и активированной каспазы-3 наблюдается при нейтральном рН.

Благодарности

• Мы благодарим нашего научного руководителя Ольгу Александровну Антонову за чуткое руководство и сотрудников лаборатории клеточной адгезии за помощь в выполнении нашей работы, Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики и наставления по выполнению работы, Евгения Яковлевича Парнеса и Виталия Дмитриевича Арнольда за помощь в совершенствовании нашей работы.

Спасибо за внимание

• Antonova O. A., Loktionova S. A., Golubeva N. V., Romanov Yu. A., Mazurov A. V. Damage and activation of endothelial cells during in vitro hypoxia. Jr. Bull. Exp. Biol. Med., 2007, Vol. 144, № 4, р. 504-506.

• Бажанов Н.Н., Волков Б.П., Воловская М.Л. и др. Справочник фельдшера. М. : Медицина, 1993. 496 с.

• Davies M.J. Pathology of arterial thrombosis. Br Med Bull., 1994, Vol. 50, №4, p. 789-802.

• Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.:Медицина, 1995. 688 с.• Vapaatalo H., Mervaala E. Clinically important factors influencing endothelial

function. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2001, Vol. 7, № 5, p. 75-85.

• Заварзин А.А., Румянцев А.В. Курс гистологии. М.: МЕДГИЗ , 1946, 723 c.• Goon P. K. Y., Lip G. Y. H., Boos C. J., Stonelake P. S., Blann A. D. Circulating

Endothelial Cells, Endothelial Progenitor Cells, and Endothelial Microparticles in Cancer. Neoplasia, 2006, Vol. 8, № 2, p. 79-88.

• Weibel E. R., Palade G. E. «New cytoplasmic components in arterial endothelia». J. Cell Biol., Vol. 23, № 1, p. 101–112.

• Бобрик И. И., Шевченко Е. А., Черкасов В. Г. Развитие кровеносных и лимфатических сосудов. Киев: Здоровья, 1991, 206 с.

• Nilsson I. M. Commentary to Erik von Willebrand's original paper from 1926 «Hereditär pseudohemofili». Haemophilia, 1999, Vol. 5, № 3, p. 220-221.

Список литературы (1)

Список литературы (2)• Лупинская З.А. Эндотелий сосудов - основной регулятор местного кровотока. Вестник

Кыргызско-Российского Славянского университета. Бишкек: КРСУ, 2003, т. 3, № 7, 69-75.• Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М.: Литерра, 2011, 480 c.• Lemasters J.J., Bond J.M., Chacon E., Harper I.S., Kaplan S.H., Ohata H., Trollinger D.R., Herman

B., Cascio W.E. The pH paradox in ischemia-reperfusion injury to cardiac myocytes. Experientia Supplementum, 1996, Vol.76, p. 99-114.

• Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. Патол.физиол.эксп. терап., 1998, № 2, 38-48.

• Henn V., Slupsky J. R, Gräfe M., Anagnostopoulos I., Förster R., Müller-Berghaus G., Kroczek R.A. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells. Nature, 1998, Vol. 391, № 6, p. 591-594.

• Онищенко Г.Е. Варианты программированной гибели клеток. Доклады РАН, 2004, 399: 507-509.

• Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J., 1997, Vol. 326, № 1, p. 1-16.• Karaman M.W., Herrgard S., Treiber D.K. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity.

Nat. Biotechnol., 2008, Vol.21, №6, p. 127–132.• Chae H.J., Kang J.S., Byun J.O. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in

osteoblasts. Pharmacological Research, 2000, Vol. 42, № 4, p. 373–381.• Gaur U., Aggarwal B.B. Regulation of proliferation, survival and apoptosis by members of the

TNF superfamily. Biochem. Pharmacol., 2003, Vol. 66, № 8, p. 1403–1408.• Antonov A.S., Nikolaeva M.A., Klueva T.S., et al. Primary culture of endothelial cells from

atherosclerotic human aorta. Part 1. Identification, morphological and ultrastructural characteristics of two endothelial cell subpopulations. Atherosclerosis, 1986, Vol. 59 №1, p.1-19.

Приложение 1Условия инкубации Фактор Виллебранда, %Нормоксия 24 ч + ФНО 176.21Нормоксия 24 ч + стауроспорин 55.08Нормоксия 24 ч 100Гипоксия 24 ч 246.88Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 +нормоксия 5 чГипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч

78.18

127.17

83.06

53.33

128.28

70.09

Приложение 2Условия инкубации ICAM-1, %Нормоксия 24 ч + ФНО 4884.43Нормоксия 24 ч 100Гипоксия 24 ч 133.58Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 +нормоксия 5 чГипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч

168.91

105.23

140.52

100.41

139.42

244.49

Приложение 3Условия инкубации Каспаза-3, %Нормоксия 24 ч + стауроспорин 573.88Нормоксия 24 ч 100Гипоксия 24 ч 193.48Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 +нормоксия 5 чНормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 +нормоксия 5 чГипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч

147.11

115.89

124.47

128

75.272

276.86

Приложение 4

Приложение 5

• Регуляция тонуса кровеносных сосудов

• Миграция лейкоцитов

• Участие в свертывании крови

• Представление антигенов

Эндотелий