液相色谱新进展 －超高效液相色谱

Waters 公司的 UPLC: Ultra Performance Liquid

Chromatography ( 超高效液相色谱）

Agilent 公司的 RRLC: Rapid Resolution Liquid

Chromatography （快速高分离度液相色谱）

一、定义：

用细粒径填料（ sub-2μm) 、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m) 的液相色谱技术，简称超高效液相色谱

为什么关注小颗粒色谱填料？根据 Van Deemter 方程 H=A+B/v+Cv

颗粒度越小， HETP 越低，柱效越高，分离度越好

对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度

对于小颗粒，提高流速时HETP 不会提高－提高分离速度

二、基本原理二、基本原理

节约时间 节约溶剂 超高灵敏度 超高分离度缺点： 高压力 Agilent RRLC 约 450bar

Waters UPLC 约 700bar

优点：

三、优缺点：三、优缺点：

4.4

61

4.6

91

8.0

80

8.1

89

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

分钟0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00

Rg1

Re

Rb1

西洋参成分的分离比对

HPLC

UPLC

4.6×250mm ， 5μm

2.1×50mm ， 1.7μm

1 、提高分离速度

小颗粒填料的速度优势

分离度 RS L/ d∝ p ，即保持 L/ dp ，同比缩短柱长 , 以提高分离速度

提高流速－小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度

提高速度的辅助手段温度

不同色谱柱和温度的分离速度比对

2 、提高分离度和灵敏度 提高 L/ dp （ dp 变小）－提高柱效－提高分离度 对于 4.6×150mm ， 5μm 色谱柱， L/ dp ＝ 30

对于 4.6×150mm ， 1.8μm 色谱柱， L/ dp ＝ 83.3

- 改善分离度，保持分离速度 对于 4.6×100mm ， 1.8μm 色谱柱， L/ dp ＝ 55.6

- 改善分离度，提高速度

分离度：颗粒对药物杂质分离的影响

改善分离度和灵敏度

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

1 、分离目标化合物： 根据中国药典（ 2005 年版）确定分离人参皂苷 Rg1 、 Re 与 Rb1 ，结构如下：

2 、药典色谱条件样品：西洋参提取液

仪器： Agilent 1100 高效液相色谱系统流动相：以乙腈为流动相 A ，以 0.1 ％磷酸为流动相 B ，按下表进行梯度洗脱

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

时间（分钟） 流动相 A（％） 流动相 B（％）

0～25 19→ 20 81→ 80

25～60 20→ 40 80→ 60

60～90 40→ 55 60→ 45

90～100 55→ 60 45→ 40

色谱柱： ZORBAX SB C18 4.6×150 mm ， 5μm柱温： 40 ºC 流速： 1.0 mL/min 检测波长： 203 nm 进样量： 5μL

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

HPLC 色谱柱规格 : 4.6 x150 mm ， 5μm , (L/dp=30) 。

根据 L/dp 值初步确定 RRLC 色谱柱规格： 4.6 x 50mm ， 1.8μm ， (L/dp≈28 ）

故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。

3 、色谱柱的选择：

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

4 、方法转换的初步参数确定在 Method Translator 相应栏目中输入原始 HPLC 条件，包括 HPLC 色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择 RRLC 色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的 RRLC 分离的初步参数。

五、方法优化：

由于人参皂苷 Rg1 、 Re 未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）6 、 RRLC 色谱条件确定：

RRLC 色谱条件：Agilent 1200 高分离度快速液相色谱 (RRLC) ，色谱柱： ZORBAX SB C18 4.6x50mm, 1.8um流动相： A: 0.1% H3PO4 ， B: 乙腈， 梯度分离柱温： 25ºC 流速： 2mL/min 检测波长： 203nm 进样量： 5μL

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

7 、西洋参分析： HPLC 与 RRLC 分离色谱图比较

在 RRLC 系统上可以实现 HPLC 分离 , 此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。

与 HPLC 相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的 RRLC 可以显著改善分离灵敏度。

温度对 RRLC 分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间

四、应用实例：西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪）

8 、结论

五、展望及结语 填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和通量。 提高温度（流动相的粘度和温度成正比，适当的提高温度

可进一步降低压力，同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。但要注意安全性。）

总之，随着商品仪器的应用及逐渐推广，超高效液相色谱将成为复杂样品分析的一个强有力的工具。