第三章 第三章 发酵工业培养基设计发酵工业培养基设计

1 、单位培养基能产生最大量的目的产物 2 、能使目的产物的合成速率最大 3 、副产物合成的量最少 4 、质量稳定、价格低廉、易于长期获得 5 、尽量不影响后处理

发酵工业培养基的要求 P41

本章内容 §1 培养基的类型及功能 §2 培养基的设计及优化

§1 培养基的类型及功能

培养基的类型和用途培养基的类型和用途

发酵培养基的成分及来源发酵培养基的成分及来源

一一、培养基的类型和用途一一、培养基的类型和用途

1.根据来源分：

2.根据主要成分或使用目的分：

3.根据用途分：

天然培养基合成培养基半合成培养基 基础培养基

加富培养基鉴别培养基选择培养基

孢子培养基——供制备孢子用；种子培养基——满足菌种生长；发酵培养基——满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累

营养不能太丰富，尤其是有机氮源；无机盐浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色；注意 pH 和湿度

营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些

除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等

生理代谢

菌种筛选 种子培养

发酵培养

谷氨酸发酵种子培养基和发酵培养基配方

培养基成分 种子培养基 发酵培养基

淀粉水解糖 (%) 2.5 12.5

玉米浆 (% 2.5-3.5 0.5-0.8

K2HPO4(%) 0.15 0.15

MgSO4(%) 0.04 0.06

尿素 0.4 3

Fe2+,Mn2+ 各 2ppm 各 2ppm

不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同的。

白酒 (chinese spirit) 发酵：固体发酵培养基；

果酒 (fruit spirit) 发酵：果汁 ；

啤酒 (beer) 发酵：麦芽汁液体培养基；

酒精 (alcohol) 发酵：淀粉糖化醪 ；

氨基酸 (amino acid) 发酵：水解糖液加其他营养成分；

柠檬酸 (citric acid) 发酵：淀粉液化醪 ；

乳酸 (lactic acid) 发酵：淀粉糖化醪；

甲烷 (methane) 发酵：复杂的有机废物发酵；

抗生素 (antibiotic) 发酵：淀粉糖化醪 + 豆饼粉 + 麸皮粉

※※ 二、发酵培养基的成分及来源 二、发酵培养基的成分及来源 P42 P42

碳源碳源 氮源氮源 无机盐和微量元素无机盐和微量元素 水水 生长调节物质生长调节物质

(( 一一 )) 、碳源、碳源

碳源功能：碳源功能： 为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分成菌体所必需的碳成分

为合成目的产物提供所需的碳成分为合成目的产物提供所需的碳成分

碳源 来源葡萄糖 纯葡萄糖，水解淀粉乳糖 纯乳糖，乳清粉淀粉 大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等蔗糖 甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等

在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。

生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。

酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。

甲醇作为底物生产单细胞蛋白（ SCP ）用烷烃进行有机酸、维生素等的生产

葡萄糖：最容易利用，但过多会加快呼吸，导致溶氧不足、 pH下降，抑制生长与产物合成

糖蜜：含糖（蔗糖）、氮类化合物、无机盐、维生素等，常用于丙酮丁醇生产

淀粉糊精：需经胞外酶水解后才能利用，可克服葡萄糖代谢过快的弊端，价格低廉，常用玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉

不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大

不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响

2 、油和脂肪

油、脂肪 甘油＋脂肪酸 CO2 ＋ H2O

ATP

脂肪酶 氧气

※供氧要充足，否则会使有机酸积累，引起 pH下降

常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油

3 、有机酸 会使 pH上升 CH3COONa ＋ O2→CO2+H2O+NaOH 常用：乳酸、柠檬酸、乙酸

4 、烃和醇类 正烷烃（ C14 ～ 18)、乙醇

( 二 ) 、氮源

功能：功能： 构成菌体细胞物质和含氮代谢物构成菌体细胞物质和含氮代谢物

氮源种类 11 、有机氮源、有机氮源 种类：种类：花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体、酒糟等鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体、酒糟等

※※ 特点：特点：菌体生长旺盛、菌丝浓度增长迅菌体生长旺盛、菌丝浓度增长迅速速

22 、无机氮源、无机氮源 种类：种类：铵盐、硝酸盐、氨水等铵盐、硝酸盐、氨水等 可引起可引起 pHpH 变化变化

功能：功能： 生理活性物质的组成或生理活性作用的调生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物节物

(( 三三 )) 、无机盐及微量元素、无机盐及微量元素

1. 磷酸盐

2. 硫酸镁

3. 钾盐

4. 微量元素

磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用 K3PO4•3H2O 、K3PO4 和Na2HPO4•12H2O 、NaH2PO4•2H2O 等磷酸盐，也可用磷酸。① 除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成；

② 处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；

③ 不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成① 钾离子与细胞渗透压和透性有关；

② 是许多酶的激活剂；

③ 促进糖代谢① Zn 、 Co 、 Mn 、 Cu 等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；② 一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；③ 特例： VB12 的生产，由于钴是其组成成分， Co 的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴

（四）、水（四）、水

发酵工厂要求恒定水源发酵工厂要求恒定水源

（五）、生长调节物质（五）、生长调节物质 11 、生长因子、生长因子 广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子机物质都称为生长因子 (( 又称生长素又称生长素 )) ，包，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。生长素仅指维生素。

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。

又如目前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，均为生物素缺陷型，同时也是某些氨基酸如高丝氨酸的缺陷型，需要生物素和某些氨基酸作为生长因子。

不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。

提供生长因子的农副产品原料

1 ）玉米浆（ corn steep liquor, CSL ）◇ 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品

◇ 虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。

2 ）麸皮水解液

可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。

用量一般为 1%（以干麸皮计）左右

水解条件：

以干麸皮：水： HCl=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以 0.07～ 0.08MPa表压加热水解 70～80min。

以干麸皮：水 =1： 20，用盐酸调 pH值 1.0，以0.25MPa表压加热水解 20min。然后过滤取滤液。

3 ）糖蜜（ molasses ）

◇ 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低

◇ 甘蔗糖蜜用量为 0.1% ～ 0.4%

4) 酵母 酵母膏、酵母浸出液、酵母粉

5 ）其他 牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子

22 、前体 、前体 P47P47 ※※ 是指加到发酵培养基中的某些化合物，是指加到发酵培养基中的某些化合物，能能直接直接被微生物在生物合成过程中结合到被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其产物分子中去，而其自身的结构并没有多自身的结构并没有多大变化大变化， 但是产物的， 但是产物的产量产量却因其加入而有却因其加入而有较大的较大的提高提高。。

发现：

最早是从青霉素的生产中被发现的。

加入玉米浆后，青霉素单位可从 20U/ml增加到 100U/ml；

玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素 G 的产量。

发酵过程中所用的一些前体物质

产物 前体 产物 前体

青霉素 G青霉素 V金霉素灰黄霉素红霉素

苯乙酸及其衍生物苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇

核黄素类胡萝卜素L-异亮氨酸L-色氨酸L －丝氨酸

丙酸盐β－紫罗酮α－氨基丁酸邻氨基苯甲酸甘氨酸

33 、产物合成促进剂、产物合成促进剂 促进剂：促进剂：细胞生长非必需，但加入后却能细胞生长非必需，但加入后却能提高产量的添加剂提高产量的添加剂 ,, 称为促进剂。称为促进剂。

常用促进剂表面活性剂——洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温 80 （聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯 ）、植酸等二乙胺四乙酸（ EDTA ）大豆油抽提物黄血盐（三水亚铁氰化钾 ， K4[Fe(CN)6].3H2O ）甲醇

促进剂能促进产量增加的原因：主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。

（ 1 ）在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。

（ 2 ）抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。

抗生素的抑制剂抗生素 被抑制的产物 抑制剂

链霉素 甘露糖链霉素 甘露聚糖去甲基链霉素 链霉素 乙硫氨酸四环素 金霉素 溴化物、巯基苯并噻唑、

硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素 金霉素 磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素 C 头孢菌素 N L- 蛋氨酸利福霉素 B 其他利福霉素 巴比妥药物

（ 2 ）抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。

如： 巴比妥能够增加链霉素产生菌的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶的目的。

聚乙烯醇可以改变发酵液的物理条件，达到改善通气效果、增加细胞渗透性的目的。

酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以促进酒精发酵转入甘油发酵。

上节知识回顾上节知识回顾

培养基的分类：培养基的分类： 孢子培养基、种子培养基、发酵培养孢子培养基、种子培养基、发酵培养

基基 培养基的组成：培养基的组成： 前体前体

§2 §2 培养基的设计原理及优化方法培养基的设计原理及优化方法

培养基成分选择的原则培养基成分选择的原则 培养基的优化培养基的优化 培养基设计时应注意的问题培养基设计时应注意的问题

一、培养基成分选择的原则一、培养基成分选择的原则

1 、做好调查研究工作 2 、对生产菌种要了解 3 、做好预实验 4 、先作单因子试验，后作多因子试验 5 、注意中间补料控制 6 、根据生产和科学研究的需要选择培养基 7 、根据经济效益选择培养基原料

（一）、培养基确定方法

※※ （二）、培养基成分选择的原则 （二）、培养基成分选择的原则 P49P49 11 、菌体的同化能力、菌体的同化能力 即一些微生物由于不能分泌一些水解酶而即一些微生物由于不能分泌一些水解酶而无法利用某些大分子物质，而只能利用小无法利用某些大分子物质，而只能利用小分子物质。分子物质。

尤其碳源、氮源选择时要注意。尤其碳源、氮源选择时要注意。 以酿酒酵母为例：以酿酒酵母为例：一般不含淀粉酶，不能利用（不）可溶性淀粉；细胞内一般不含淀粉酶，不能利用（不）可溶性淀粉；细胞内缺乏将硝酸根离子还原为铵离子的所需催化酶，所以做缺乏将硝酸根离子还原为铵离子的所需催化酶，所以做培养基优化时，我们用氮源时考虑各种氨盐等而少考虑培养基优化时，我们用氮源时考虑各种氨盐等而少考虑各种硝酸盐类。各种硝酸盐类。

2 、代谢的阻遏和诱导 碳氮源要注意速效和迟效的相互搭配。 （ 1 ） C 源 葡萄糖：分解代谢物会组遏或抑制某些产物合成所需的

酶系的形成或酶的活性 诱导酶制剂生产：易利用的碳源（葡萄糖、果糖）不利

于产酶；难利用碳源（淀粉、糊精）对产酶有利。

（ 2 ） N 源 微生物利用 N 源的能力随菌种、菌龄而已。多数能分泌胞外蛋白酶的菌株在有机氮源上可良好生长。

同一微生物处于不同生长阶段对氮源的利用能力不同。生长早期易利用铵盐、氨基氮；生长中期利用蛋白质的能力强。

蛋白酶生产受蛋白质或多肽的诱导；铵盐、硝酸盐的阻遏。

3 、合适的 C 、 N 比 （ 1 ） N 源：过多，菌体生长旺盛， pH偏高，不 利于代谢物积累 过少，菌体繁殖量少，影响产量 （ 2 ） C 源：过多，易造成较低的 pH 过少，易引起菌体的衰老和自溶

一般工业发酵培养基的 C/N＝ 100（ 0.2～2.0）

谷氨酸发酵 C/N＝ 100（ 15～ 21）

4 、合适的 pH 利用营养物质后，酸碱物质积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系 pH变化

配制培养基时要充分考虑

培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

合理的实验方法多因子实验：均匀设计、

正交实验设计、

响应面分析等。

多因子实验

二、培养基的优化

类胡萝卜素高产菌 Y11 的培养基的优化

郭秒 , 食品与工业发酵， 2004

类胡萝卜素的作用：色素、营养保健

原培养基 :

初步确定可能的培养基成分 ( 以碳源为例 )

通过单因子实验确定适宜的培养基成分 ( 以碳源为例 )

考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源

进一步：乙酸钠的浓度 2% 比较好

结果：

碳源：乙酸钠 0. 2%

氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏 0.03%

无机盐 : 复合无机盐 0.05%

正交设计确定优化的配方

改进后培养基原培养基

改进后培养基的发酵结果

※※正交试验设计正交试验设计 (Orthogonal (Orthogonal experimental design)experimental design)

均匀分散，齐整可比均匀分散，齐整可比 是一种高效率、快速、经济的实验设计方法是一种高效率、快速、经济的实验设计方法 日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表 择的水平组合列成表格，称为正交表

SNL q

1、 正交表的记号及含义

正交表的列数（最多能安排的因素个数，包括交互作用、误差等）

S

正交表的行数（需要做的试验次数）

N

各因素的水平数（各因素的水平数相等）q

正交表的代号L

如 78 2L 表示

78 2L 表示各因素的水平数为 2 ，

做 8 次试验，最多考虑 7 个

因素（含交互作用）的正交表。

根据正交表的数据结构看出，正交表是一个 n 行 c列的表，其中第 j列由数码 1 ， 2 ，… Sj 组成，这些数码均各出现 N/S 次，例如表 11 中，第二列的数码个数为3 ， S=3 ，即由 1 、2 、 3 组成，各数码均出现 3次。

正交表的特点1 、正交表中任意一列中，不同的数字出现的次数相等；

表示：在试验安排中，所挑选出来的水平组合是均匀分布的（每个因素的各水平出现的次数相同） ——均衡分散性

2 、正交表中任意两列，把同行的两个数字看成有序数 对时，所有可能的数对出现的次数相同。

表示：任意两因素的各种水平的搭配在所选试验中出现的次数相等 ——整齐可比性

以上是设计正交试验表的基本准则

22 、正交实验的表头设计 、正交实验的表头设计

表头设计是正交设计的关键，它承担着将表头设计是正交设计的关键，它承担着将各因素及交互作用合理安排到正交表的各各因素及交互作用合理安排到正交表的各列中的重要任务，因此一个表头设计就是列中的重要任务，因此一个表头设计就是一个设计方案。 一个设计方案。

表头设计的主要步骤表头设计的主要步骤 (1)(1) 确定列数确定列数 (2)(2) 确定各因素的水平数确定各因素的水平数 (3)(3) 选定正交表选定正交表 (4)(4) 表头安排表头安排

(5)组织实施方案

整个设计过程一句话归纳为：“因素顺序上列 水平对号入座实验横着作”。

※ 方法 1 直观分析（极差分析） （ 1 ）计算极差，确定因素的主次顺序 第 j列的极差 max minj ij ijii

R T T

极差越大，说明这个因素的水平改变对试验结果的影响越大，极差最大的那个因素，就是最主要的因素。

3 、结果统计方法

方法 2 方差分析法

基本思想与双因素方差分析方法一致：将总的离差平方和分解成各因素及各交互作用的离差平方和，构造 F统计量，对各因素是否对试验指标具有显著影响，作 F检验。

例题例题

确定赖氨酸产生菌确定赖氨酸产生菌 FB31FB31 发酵培养基成分玉发酵培养基成分玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵适宜浓度及其对米浆、豆饼水解液、硫酸铵适宜浓度及其对发酵的影响发酵的影响

表 1 正交表因子水平表

第一步：确定因子和水平，列出因子水平表

因子水平

豆饼水解液（％）

玉米浆（％）

硫酸铵（％）

1

2

3

0.5

1.0

1.5

2.5

3.0

3.5

3

4

5

第二步：根据因子和水平数选用合适的正交表，设计表头，安排试验

第三步：实验结果及分析：极差分析

表 2 正交实验结果 列号实验号

1 2

硫酸铵3 豆饼水解液

4

玉米浆产酸（ g/l ）

123456789

111222333

123123123

123231312

123312231

21 。 042 。 031 。 038 。 022 。 033 。 024 。 036 。 030 。 0

K1

K2

K3

28 。 0

33 。 0

31 。 0

30 。 0

37 。 0

26 。 0

24 。 0

33 。 0

35 。 0

极差 5 。 0 11 。 0 11 。 0

本实验的适宜配比为：硫酸铵 4 ％、豆饼水解液 1 ％、玉米浆 3 。 5 ％影响试验的因素主次为：玉米浆＝豆饼水解液 > 硫酸铵

从直观分析图可知，进一步提高玉米浆的浓度，可能提高产酸

2

0

5

10

15

20

25

30

35

40

k1 k2 k3

3

05

10152025303540

k1 k2 k3

1

0

5

10

15

20

25

30

35

k1 k2 k3

直观分析图

作 业作 业 11 、某培养基影响因素与水平如下，试问应、某培养基影响因素与水平如下，试问应采用哪种正交表进行实验？采用哪种正交表进行实验？因素水平

玉米粉（％）

A

豆饼粉（％）

B

蛋白胨（％）

C

PH D

1 0.5 4 0.5 5.0

2 1.0 5 0.6 5.5

3 1.5 6 0.7 6.0

如果根据正交表进行实验，结果如下：19、 20、 18、 24、 30、 22 、 18、 26、 31，试对该结果进行分析。

2 、前体3 、培养基成分在进行选择时应遵循什么原则？4 、孢子培养基、种子培养基、发酵培养基有何不同？