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第四节 分子生物学方法第四节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用及其在中医研究中的应用

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本节的教学目的和要求：本节的教学目的和要求： 1 ．掌握分子生物学实验研究方法的特点和优势。 2 ．掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的分子生物学实验技术和综合多种技术。 3 ．了解分子生物学的主要方法及其在中医研究中的应用。

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什么是分子生物学？ 分子生物学分子生物学在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子（核酸、蛋白质）的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程，比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。

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分子生物学是 20 世纪中叶才诞生并迅速发展起来的学科，被誉为当代最伟大的科学成就之一。如今，分子生物学技术已成为医学领域中使用最为广泛的技术，在揭示新的生命现象、认识和战胜种种疾病等方面起着越来越重要的作用，是带动医药研究的前沿学科。当前，各种分子生物学仪器、试剂盒等纷纷涌现和发展，并迅速地商品化，极大地推动了分子生物学技术的发展与普及应用。 近几十年来，实验中医学取得了突飞猛进的发展，中医药，包括针灸、推拿、气功在防治疾病方面的疗效已被大量的实验所证实、重复，在此基础上，中医的实验研究已深入到细胞、组织基因表达和调控的层次上来，开始关心中医治法的作用机制，揭示中医药理论的分子内涵；与此同时，以分子生物学技术为核心的基因工程、生物工程在中药及其有效成分产业化方面显示出辉煌的前景。

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分子生物学的主要方法有哪些？ ● 教材介绍的分子生物学主要方法有：载体、分子克隆常用酶（限制性核酸内切酶、 DNA 聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶 I 、反转录酶）、重组载体、 DNA 的凝胶电泳、真核细胞 RNA 的制备、 Northern blot 、基因表达谱芯片和 DNA阵列技术、标记 DNA或 RNA探针、 cDNA文库构建、真核细胞 DNA 的提取、 DNA文库构建、Southern blot 、 DNA 的测序、 PCR 和 RT-PCR 、 DNA的诱变、克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培养细胞中表达、克隆化基因所表达蛋白质的检测和分析、 Western blot 、蛋白双向电泳。

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● 与教材其它几类实验技术相比，分子生物学技术的显著特点是揭示生命及其调控机制生命及其调控机制（包括所涉及的中医药理论和方法的作用机制）。关心和解释“为什么为什么？”

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推荐参考书： （ 1 ）黄培堂等译《分子克隆实验分子克隆实验指南指南》，科学技术出版社， 2002 年8月，第 3版。 （ 2 ）方肇勤主编《分子生物学技分子生物学技术在中医药研究中的应用术在中医药研究中的应用》，上海科学技术出版社， 2008 年 9月，第 2版 由于分子生物学技术与方法发展十分迅速，日新月异，因此，我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道，及各有关公司的最新产品介绍。

一、分子生物学的主要技术和方法一、分子生物学的主要技术和方法

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（一）载体（一）载体 什么叫载体？常用的载体有哪些？什么叫重组载体？ 载体载体：在基因工程重组 DNA 技术中将 DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA 分子。 重组载体重组载体：把目的基因片段插入载体的实验称之为重组载体。其主要目的在于扩大某一目的 DNA片段，用以标记探针、测序、建立基因组或 cDNA文库等。 常用载体如下：

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11 ．质粒．质粒 何谓质粒？在分子生物学中具有什么作用？

质粒质粒是一些双链、闭环的 DNA 分子，其大小范围为 1kb至 200kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，是最常用的载体。

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通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性： ① 含有多克隆位点区域，即有多个单切点内切酶云集的区域，可方便地插入目的 DNA片段。 ② 具有自主复制能力，进入宿主细胞后，能独立于宿主细胞染色体进行复制。 ③ 有药物筛选标志基因。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。 ④ 在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫 pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达 500～ 700个。 因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。

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22 ．． λλ噬菌体噬菌体 λλ 噬菌体噬菌体的基因组是一组长度约为 50kb 的双链 DNA 分子。在 λ噬菌体颗粒内，该 DNA 为一双链分子，其末端为长 12个核苷酸的互补单链（黏端）。当 λ噬菌体进入宿主细胞后，其黏端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔 12bp 有两个交错切口。宿主体内的 DNA 连接酶很快将切口封闭而形成闭环 DNA 分子，该 DNA 分子在感染早期充当转录模板。实验用 λ噬菌体，在其 DNA 的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入 DNA 之用。 λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的 DNA片段，如有的λ噬菌体可插入长达 20000bp 的外源性 DNA 。

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33 ．酵母人工染色体．酵母人工染色体 酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome ， YAC ）载体技术是 Olson建立的。它含有质粒 pBR322 中的Ampr抗性基因和 ori 复制起始序列，使 YAC 载体可以在大肠杆菌中复制，以便制备大量的 YAC DNA 。 YAC 载体能克隆 500～ 1000kb 的 DNA片段。重组的 YAC 载体转化酵母细胞，外源基因在酵母细胞内复制，使外源基因稳定扩增。 此外还有 SV40 病毒基因组、考斯质粒、噬菌粒、细菌人工染色体等。

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（二）分子克隆常用酶（二）分子克隆常用酶 分子克隆常用哪些酶？ 分子克隆常用的酶分子克隆常用的酶有：限制性核酸内切酶、 DNA 聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶 I 、反转录酶。

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何谓限制性核酸内切酶？常用的有哪些？ 11 ．限制性核酸内切酶．限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能特异性地结合于一段该酶能识别的双链 DNA序列上，通常为 4～ 8个碱基对，水解 DNA磷酸二酯键，从而切割双链 DNA 的核酸水解酶。 常用的限制性内切酶常用的限制性内切酶有：

名称 识别位点 名称 识别位点BamH Ⅰ

G▼GATCC Kpn Ⅰ GGTAC▼C

Bgl Ⅱ A▼GATCA Nae Ⅰ G▼CCGGC

EcoR Ⅰ G▼AATTC Pst Ⅰ CTGCA▼G

Hae Ⅲ GG▼CC Sca Ⅰ AGT▼ACT

Hind Ⅲ A▼AGCTT Sst Ⅰ GAGCT▼C

Hpa Ⅰ GTT▼AAC Sst Ⅱ CCGC▼GG

Hpa Ⅱ C▼CGG Xho Ⅰ C▼TCGAG

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（（ 1 ）黏性末端）黏性末端：即指 DNA片段双链的两端含有几个延伸等长的碱基互补配对的核苷酸单链末端，称为黏性末端。限制酶在二重对称轴的 5’侧切割底物 DNA 的每条链，则双链 DNA交错割开，产生带突出的黏端的 DNA片段。例如， PstI 识别双链 DNA 的这样一段序列并切割如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A GC T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T CG A C G T C N N N N N5’ ↑ 切割后产生两片段：

5’N N N N N C T G CC T G C AA pGG N N N N N3’ 3’N N N N N GGp A C G T CA C G T C N N N N N5’

这类限制酶主要有： BamH I 、 BglⅡ、 EcoR I 、 Hind Ⅲ、 Kpn I 、 Pst I 等等。

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（（ 2 ）钝性末端）钝性末端：有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA 的两条链，则产生带平端的 DNA片段。例如： HaeⅢ识别双链 DNA 的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C CG G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G GC C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段：

5’N N N N N N G GG G pCC CC N N N N N N3’ 3’N N N N N N CC CCp G GG G N N N N N N5’

这类限制酶主要有： HaeⅢ、 Mst I 、 Sca I 、 Sma I等等。

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什么叫 DNA 聚合酶？主要有哪些？有什么作用？ 22 ．． DNADNA 聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶催化 4 种脱氧核苷酸合成 DNA ，催化脱氧核苷酸 3’-OH 与脱氧核苷酸 5’-P 之间形成磷酸二酯键的反应。主要用于催化 DNA 体外合成反应。 真核细胞有 5 种 DNA 聚合酶；原核细胞有 3 种 DNA聚合酶，都与 DNA链的延长有关。 DNA 聚合酶 I 是单链多肽，可催化单链或双链 DNA 的延长； DNA 聚合酶 II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关； DNA 聚合酶 III 在细胞中存在的数目不多，是促进 DNA链延长的主要酶。 最常用 DNA 聚合酶有 PCR 用的 Taq 酶、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I （全酶）和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段（ Klenow片段）等。

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连接酶的用途是什么？ 33 ．连接酶．连接酶 连接酶连接酶使各具有游离的 5’-P 和 3’-OH 的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两段 DNA 连接起来。最常用的是T4噬菌体连接酶。

何谓脱氧核糖核酸酶？ 44 ．脱氧核糖核酸酶 ．脱氧核糖核酸酶 II

DNA 酶酶 I 为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。产物为 5’端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在 Mg2+存在下， DNA 酶 I可独立地存在于每条 DNA链且切割位点随机分布。

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反转录酶的用途是什么？ 55 ．反转录酶．反转录酶 反转录酶反转录酶能以 RNA 为模板催化合成互补 DNA链。

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（三）重组载体（三）重组载体 重组载体的方法重组载体的方法：采用某限制酶切割开载体，用 DNA连接酶将载体 DNA片段与拟插入的目的 DNA片段重新连接成一个环状的 DNA 分子。连接时，插入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的黏端与载体的黏端对接，两个黏端的序列互补。实现载体重组。 载体重组后，转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落。可以采用原位杂交；或扩增阳性单菌落，小量制备 DNA ，限制酶酶切、电泳，鉴定重组成功与否。重组成功者可用于各有关实验。

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左上：质粒载体。左下： λ噬菌体载体。右质粒重组示意图。

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（（四）四） DNADNA 的凝胶电泳的凝胶电泳 为什么要 DNA 凝胶电泳？常用的 DNA 凝胶电泳有哪些？ 为了鉴别或分离分子量不同大小的 DNA或 RNA片段，最常用的方法就是凝胶电泳。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。

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11 ．琼脂糖凝胶电泳．琼脂糖凝胶电泳 为水平电泳，可分离 200bp～ 50kb的 DNA ，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至 50ng 的 DNA ，甚至 10ngDNA也能辨别得出来，分子生物学中常用此分离和鉴定 RNA 和 DNA 。

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22 ．聚丙烯酰胺凝胶电泳．聚丙烯酰胺凝胶电泳 多为垂直电泳，多用于分离5～ 500bp 的 DNA ，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的 DNA ，所以常用来测序。 DDPCR 、 Footprint 等 DNA电泳，以及蛋白电泳也常用此胶。

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（五）真核细胞（五）真核细胞 RNARNA 的制备的制备 为什么要制备 RNA ？在 RNA 制备过程中需要注意什么？ 真核细胞 RNA 的制备方法有多种，还有许多种商品试剂盒出售，性能稳定，重复性好。 实验室比较常用的是制备总 RNA 一步法。该方法操作简便，一次可以分离大量的 RNA ，原理是采用强 RNA酶抑制剂异硫氰酸胍等，抑制 RNA 的降解，并使 RNA与蛋白质分离进入溶液，离心后， RNA 选择性地进入无DNA 和蛋白质的水相，之后被异丙醇沉淀。 提取的 RNA可用于 Northern blot 和过 Oligo dT柱。后者用于分离 mRNA 。

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以上依次为匀浆设备、匀浆管和杵、匀浆过程、酚氯仿抽提结果

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（（六）六） Northern blotNorthern blot 什么叫 Northern blot ？什么叫 Southern blot ？各自具有什么作用？ Northern blot 即 RNA印迹法。 该方法首先将 RNA 电泳分离，再把 RNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，固定，然后用已知 DNA或 RNA作探针，杂交，分析所检测的 RNA 。这是常用的分析 RNA 的方法。 近似的还有 RNA 的斑点杂交和狭缝杂交。

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RNA 转移示意图，以及 Northern blot放射自显影结果

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Northern blot 的用途的用途： （ 1 ）鉴定某一基因是否有所转录，有则可见杂交带。 （ 2 ）估计目的 RNA 的分子量大小。 （ 3 ）比较不同组织或细胞的某一基因转录量的差异；并可以对杂交带进行光密度扫描，对某一基因转录的情况作定量分析。

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在中医药实验中通常用此方法来检测某一病理组织基因表达水平和某一中医药方法对某一基因转录的调控作用。方法是采用琼脂糖凝胶电泳，使 RNA 分子由小到大排列于凝胶之中。运用虹吸法或电转移印迹法将 RNA 转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使 RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记或其他方法标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或直接观察杂交结果（适用于一些非放射性标记探针的方法），在胶片上出现被检测的 mRNA 显影条带；也可以用冷 CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测 mRNA杂交条带。

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（七）基因表达谱芯片和（七）基因表达谱芯片和 DNADNA阵列技术阵列技术 这类技术主要用于检测目标组织多 RNA 转录的差异。主要有两种检测方式： 11 ．基因芯片（．基因芯片（ Micro arrayMicro array ）） 什么叫基因芯片？派什么用处？基因芯片与 Northern blot 的目的有何异同？ 基因芯片基因芯片又称基因表达谱芯片，特点是把成千上万个基因高密度地点涂或压印在包被的载体上，一次检测可多达数万个基因。该方法进而发展出外显子芯片（ Exon Array ），可以进一步观察某基因各外显子剪接的差异。

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22 ．． cDNAcDNA阵列（阵列（ cDNA ArraycDNA Array ）） 该技术把几十至上万个基因点涂在 96孔板大小的硝酸纤维素膜上，一次检测可多达上万个基因。 实验时，将用荧光或同位素标记的待测核酸样品与以上Array 进行杂交，杂交后用高分辨率的激光扫描仪检测荧光标记，再用数字成像软件分析每个点发出的信号，即可获得基因表达谱；或放射自显影（适用于同位素标记的探针）。用此方法可将实验样品与对照组的基因表达谱进行差异分析。

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（八）标记（八）标记 DNADNA或或 RNARNA探针探针 什么叫探针？探针是用来做什么的？ 探针探针：探针是一小段单链 DNA或者 RNA片段（大约是 20 到 500bp ），用于检测与其互补的核酸序列。 标记探针标记探针：把已知 DNA或 RNA 作为模板，用一些特定的方法把一些易于检测的化学物质标记到合成的另一条核酸链上，以便检测之用。 用途用途：通过杂交，使探针与被检测的样本 DNA或 RNA结合，使痕量的 DNA或 RNA 得以显示出来。常用的标记放射性同位素有 32P 和 35S ，能用于检测极微量的靶 DNA或 RNA ；非放射性标记物有生物素、地高辛、荧光素等。

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（九）（九） cDNAcDNA文库构建文库构建 cDNA文库文库：以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA ，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA ，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA信息的 cDNA克隆集合称为该组织细胞的 cDNA文库。 DNA 文库文库：某一特定来源 DNA 通过细胞－ DNA 克隆技术构建呈含有所用 DNA片段的重组 DNA 分子，并转化至细菌内，构成 DNA文库。

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cDNA文库的构建方法：构建方法： 把目的细胞所有的带聚腺苷酸（ poly A ）的 mRNA 经酶促反应转变为双链 DNA ，进而将此 DNA插入原核或真核载体，扩增，回收扩增了的 DNA ，这一工作称之为构建 cDNA文库。构建文库对 RNA 质量要求高，既要保证不污染，又要保证 mRNA 的完整性。构建的文库主要用于识别或分离某一或若干特定的 cDNA全部序列。

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左图： cDNA库构建原理

右图： cDNA库的滴定

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cDNA文库与 DNA文库的区别是什么？ cDNA 文库与文库与 DNA 文库的区别文库的区别：基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以 cDNA文库具有组织细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组 DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组 DNA文库获得的基因与从 cDNA文库获得的不同，基因组 DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从 cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的 cDNA 。

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（十）真核细胞（十）真核细胞 DNADNA 的提取的提取 提取真核细胞 DNA 有不同的方法，通常在含有 EDTA和 SDS 一类去污剂的溶液中，用蛋白酶 K消化细胞，再用酚抽提得到高分子量（ 100～ 150kb ）的 DNA 。适用于 Southern blot 分析和构建 DNA文库。

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（十一）（十一） DNADNA文库构建文库构建 对所提取的 DNA 用一至多种限制酶消化（基因组 DNA 分子量太大，难以建库），使消化后的 DNA片段在一定的长度内，适合所用的载体。载体多用 λ噬菌体。重组载体及随后的工作与 cDNA文库建立方法相似。

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（十二）（十二） Southern blot Southern blot

Southern blot 是 DNA印迹杂交，是常用的分析 DNA 方法。即用一种或多种限制酶消化 DNA ，琼脂糖凝胶电泳把分子量大小不等的 DNA 分开，运用虹吸或电印迹法将DNA 转移至硝酸纤维素膜上，固定，使 DNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记或非放射性标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或 X光片曝光，在胶片上出现被检测的 DNA 显影条带；也可以用冷 CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测DNA杂交条带。 Southern blot 主要用于基因组 DNA 特定序列定位和定量。

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（十三）（十三） DNADNA 的测序的测序 DNA测序最常用的是双脱氧链终止法。 原理原理：采用了 2’ 、 3’ddNTP ，在 3’位置上缺少一个羟基，当这些 ddNTP掺入到正在延长的 DNA链上，由于缺乏 3’羟基，后继的 dNTP 不能与之形成磷酸二酯键，从而使 DNA链终止延伸。于是，在 DNA 合成反应混合物的 4 种 dNTP 中加入少量的一种 ddNTP ，将得到一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在 4 组独立的反应体系中，加入 4 种不同的 ddNTP （和一种经标记的 dNTP ），结果将产生 4 组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链的每一个 A 、 C 、 G或 T 的位置上。然后采用能分辨长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，把 4 组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上，电泳分离之后，从凝胶的放射自显影片上可直接读出 DNA 上的核苷酸序列。

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目前使用最为广泛的是 DNA自动测序仪，及其配套的试剂盒。自动测序仪是 20 世纪 80 年代早期发展起来的，用荧光染料标记 DNA 分子来代替同位素标记。染料分子用激光激活，荧光信号被放大，再被 CCD相机捕获，计算机根据不同染料的颜色（发射波长）来判断不同的核苷酸，根据荧光峰的形状和连续峰之间的距离识别每个碱基。自动测序仪极大地提高了测序效率，一个熟练的研究员运用毛细管测序仪一星期能处理 5000个样品，每个可平均读 600个碱基。

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（十四）（十四） PCRPCR 、、 DDPCRDDPCR 和和 RT-PCR RT-PCR

什么是 PCR ？ PCR 的用途是什么？ 11 ．． PCRPCR

PCR 是 Polymerase chain reaction 的缩写，聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量 DNA（含由 RNA 反转录成的微量 DNA ）扩增达 106倍，得到μg级的 DNA！该技术发明于 20 世纪 80 年代中期，到了80 年代末，由于引用了耐热 DNA 聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的作用。

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PCR 的原理是选用两段引物，分别与拟扩增的模板 DNA两条链上各一段序列互补，且分别位于模板 DNA 中拟扩增 DNA片段两条链的 3’端。加热使模板 DNA变性，解链；随后的降温，使两段引物分别与靶序列发生退火，然后两引物在 DNA 聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和 4 种 dNTP 的反应体中，位于两段引物间的 DNA 在反复变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过 30～ 40个循环，目的 DNA可由原来的 1pg扩增到1μg 。

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实时荧光定量 PCR 与普通 PCR原理的区别？ 22 ．实时荧光定量．实时荧光定量 PCRPCR 技术技术 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 技术技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 该技术通过不同浓度模板标准品扩增，所得到的标准曲线，可以用以判断待测样品起始拷贝数。该技术可以选择采用多种化学燃料，常用的是 SYBR Green I ，为双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 的小沟结合而所产生荧光大大增强。在通常 PCR 反应中加入 0.2～ 1单位的 UNG 酶，以及 1:20000稀释的 SYBR Green I 。

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左上：实时定量PCR 仪

右上：该仪的部分工作原理

下：实验结果的输出

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荧光实时定量 RT-PCR结果 RT-PCR 结果的定量分析

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

正常 邪毒 气虚 阳虚 阴虚

芯片

读数

计算

值

0

0. 2

0. 4

0. 6

0. 8

1

1. 2

1. 4

正常 邪毒 气虚 阳虚 阴虚

PomcmRNA/β

actinmRNA

0

0. 2

0. 4

0. 6

0. 8

1

1. 2

1. 4

1. 6

1. 8

2

正常 邪毒 气虚 阳虚 阴虚

Pomc

相对

表达

量

芯片检测结果 RT-PCR 结果

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33 ．． DD-PCRDD-PCR 技术技术 DD-PCR 是 20 世纪 90 年代以来在 PCR 技术之上发展起来的新技术。 DD-PCR 是 Differential display PCR 的缩写，通常被译作“差异展示 PCR” 。该技术主要用于快速呈现2个或 2个以上细胞系或组织基因转录的差异，并快速扩增那些不同转录的基因片段。

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DD-PCR 的原理：的原理： 取无 DNA污染的总 RNA ，分别加入 3个锚引物， H-T11-C 、H-T11-G 和 H-T11-A ，使 3个引物的 11 个 T （胸苷）选择性地结合到 mRNA 的 A （腺苷）尾上，在反转录酶的作用下，将所有的 mRNA 反转录成 cDNA 。再以这一含 cDNA 的反应液为模板，分别加入以上 3个锚引物，和若干随机引物，如 AAGCTTGATTGCC ， AAGCTTCGACTGT 等， PCR 扩大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有 cDNA ，反应体中加入 α[33P]dATP或 α[35S]dATP 。把 2个或 2个以上细胞系或组织锚引物与随机引物相一致的 PCR 产物相邻上样于变性测序凝胶上，电泳，放射自显影，曝光。 2个或 2个以上细胞系或组织相同 mRNA 所反转录的 cDNA 在 X片上会出现并列的显影条带，而不同 mRNA 所反转录的 cDNA会出现独特的显影条带。

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什么叫 RT-PCR ？与 Northern blot 的异同如何？ 44 ．反转录．反转录 PCRPCR （（ RT-PCRRT-PCR ）技术）技术 采用寡聚胸苷引物或随机引物与模板 mRNA退火，反转录所有 mRNA 成 cDNA ，再用拟扩增片段两端的两段引物， PCR扩增该段 cDNA 。 RT-PCR 的目的是判断、比较不同组别某一 mRNA 转录与否或转录多少。 为校正样本 RNA含量组间可能存在的误差，通常在同一试管内一起扩增 β肌动蛋白的 cDNA 。上样电泳，染色后，拍照，激光光密度计扫描定量或计算机图像处理，用β肌动蛋白校正拟扩增的基因片段灰度值，统计分析。 此外，还有原位 PCR 等由 PCR演变而来的技术。

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（十五）（十五） DNADNA 的诱变的诱变 体外诱变是改变 DNA片段的碱基序列。采用酶和化学试剂切割 DNA ；或合成含有缺失或插入的引物， PCR放大，再通过连接、转化等手段，造成目的 DNA 的缺失或插入。 基因调控区的诱变是用于分析基因调控区不同功能结构域的定位；编码序列的诱变可以推断单个氨基酸或一组氨基酸在蛋白质结构和功能的作用。

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克隆化基因的表达有什么用处？ （十六）克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培（十六）克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培养细胞中表达养细胞中表达 将目的基因重组入相应的，分别可以在原核或真核细胞中进行表达的载体，采用物理或化学方法将重组后的载体导入真核或原核细胞，使目的基因得以表达出所需的蛋白，用以研究或作为产业生产。

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（十七）克隆化基因所表达蛋白质的检测和分（十七）克隆化基因所表达蛋白质的检测和分析析 该实验分为两个步骤： 11 ．抗体的制备与纯化．抗体的制备与纯化 即将某一蛋白分离、纯化、收集，用此蛋白作为抗原，免疫激发小鼠或兔免疫系统产生抗体，采集兔血清，制备多克隆抗体；将小鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，产生能分泌抗体的杂交瘤细胞株，接种于小鼠腹腔，产生腹水，制备单克隆抗体。再将多克隆抗体或单克隆抗体进一步纯化出特异性抗体。 22 ．应用此抗体对克隆化基因所表达蛋白质是否存在及．应用此抗体对克隆化基因所表达蛋白质是否存在及其含量进行检测其含量进行检测 也可用于对某组织、细胞和体液是否存在该蛋白质进行定性定量检测。常用的方法有免疫沉淀法、固相放射免疫测定（ RIA ）法和蛋白质免疫印迹法（ Western blot ）。

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（十八）（十八） Western blotWestern blot

什么叫Western blot ？ Western 印迹法印迹法（ Western blot ）是常用的蛋白质定性和定量检测方法。该方法将待测蛋白样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分子量大小分离的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后将此膜与抗靶蛋白的非标记抗体一同温育，结合上的抗体再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白抗体反应，最后加入酶联抗体生色底物或化学发光底物，在滤膜上抗原抗体结合处原位显示特异性染色蛋白条带，或用 X 光片曝光，在胶片上出现被检测的蛋白质显影条带；也可以用冷 CCD照相机对滤膜上的化学发光进行拍照，分析被检测蛋白质显影条带。

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什么叫蛋白双向电泳？与 Western blot 的作用异同如何？ （十九）蛋白双向电泳（十九）蛋白双向电泳 蛋白双向电泳蛋白双向电泳是“等电聚焦电泳”和“ SDS-PAGE 电泳”的组合，即首先进行第一向等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后进行第二向 SDS-PAGE 电泳，蛋白质按分子量大小分离，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 与 Western blot 进行单蛋白质分析不同，蛋白双向电泳关心多蛋白表达的改变。

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你是否了解分子生物学技术在中医药某一领域中的应用？选择了哪些指标，得到什么结论？后续的工作如何？

二、实验中医学应用分子生物学方法的二、实验中医学应用分子生物学方法的现状与案例现状与案例 近十几年来分子生物学技术在中医药研究中呈现出迅速发展之势，取得了一定的研究成果，丰富了中医药学术内容，并为中医药的深入研究以及中医药研究的国际化奠定了基础。

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（一）分子生物学技术在中医基础理论研究中（一）分子生物学技术在中医基础理论研究中的应用的应用 11 ．肾本质的研究．肾本质的研究 22 ．中医药延缓衰老的研究．中医药延缓衰老的研究 33 ．瘀血和活血化瘀治法的研究．瘀血和活血化瘀治法的研究 44 ．治则治法研究．治则治法研究

（二）分子生物学技术在中医临床上的应用（二）分子生物学技术在中医临床上的应用 中药治疗 β- 地中海贫血机制的研究。 砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病机制的研究。

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（三）分子生物学技术在针灸研究中的应用（三）分子生物学技术在针灸研究中的应用 针刺镇痛的机制研究。 针灸治病的机制研究。 （四）分子生物技术在方药研究中的应用（四）分子生物技术在方药研究中的应用 11 ．在方剂研究中的应用．在方剂研究中的应用 22 ．在中药研究中的应用．在中药研究中的应用 （ 1 ）应用分子生物学技术进行中药品种鉴定与质量评价。 （ 2 ）应用分子生物学技术进行中药材药效评价与筛选。 （ 3 ）应用分子生物学技术改良中药品质，提高药品质量。

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三、展望三、展望 在 20 世纪 90 年代初，在申报中医药实验项目研究中还很少见到采用分子生物学技术，然而仅仅过去了 10 年，到了本世纪初，中医药实验项目已普遍采用了分子生物学技术，并且有些技术是跟踪国外最新发展起来的前沿技术。经过多年的探索，分子生物学技术在中医药研究中的作用愈来愈突出，广泛从基因、分子水平来认识中医药的奥秘，使中医药研究方法与手段融入了当今世界医学研究的主流。可以预计，分子生物学技术在中医实验研究中将发挥愈来愈重要的作用。

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传统的、经典的研究方法已满足不了实验中医学认识生命现象的需要，中医药对基因转录、表达的调控作用已一再被实验所证实，进一步的研究必将深入到中医药对某些目的基因启动子的调控、对核酸和蛋白的加工和修饰及信号分子的传递等层次上。中医实验将在不断吸收最新的研究方法、最新的研究技术的过程中，逐步深化对中医药的认识，为现代生命科学做出新的贡献。 分子生物学将中医学基础、临床和产业紧密联系在一起，运用分子生物学理论和技术阐明中医药理论的关键问题，揭示一些难治性疾病的机制，将迅速为临床诊断治疗提供指导，促进药物研发，使中医药为人类健康发挥越来越显著的作用。

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