Учреждение Российской академии наук Институт общей...
description
Transcript of Учреждение Российской академии наук Институт общей...
![Page 1: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/1.jpg)
Учреждение Российской академии наукИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Индуцированный мутагенез (количественные аспекты)
А.В. Рубанович
![Page 2: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/2.jpg)
История
1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) - Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии: после воздействия рентгеновых лучей вырастали колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и окраской.
XIX век – Август Вейсман: безуспешные попытки изменить наследственность используя температуру, влажность и механические воздействия.
1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный генетический конгресс в Берлине: первые удачные опыты по искусственному вызыванию рецессивных мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы.
1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и кукурузы после воздействия рентгеновых лучей.
Нобелевская премия - 1946
Расстрелян - 1939
![Page 3: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/3.jpg)
Биологическое действии радиации осознали значительно раньше!
1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей, погибших в результате действия радиации
1901 - Первый описанный случай радиационного ожога кожи
1906 - Первый летальный исход (США)
1911 - Первый описанный случай радиационно- индуцированной лейкемии
1946 – Первое описание «клинического синдрома обусловленного атомной бомбардировкой»
![Page 4: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/4.jpg)
Радиобиологический парадокс: ничтожная энергия вызывает драматический
биологический эффект!
1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»: радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание белков, что к ведет биологическому поражению.
Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал
=
1 чайная ложка горячего кофе
=
2 секунды на пляжегибель в 50% случаев
По энергетическим затратам:
![Page 5: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/5.jpg)
Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947)
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Карл Циммером (Гемания)
Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия)
Дуглас Ли (Великобритания) Откуда взялись эти положения?
В основном из характера дозовых зависимостей…
![Page 6: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/6.jpg)
Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии
Частота, %
Время гибели
100
50
Среднее время гибели
Выживаемость, %
Время воздействия, концентрация
100
50
Токсические воздействия:
Выживаемость, %
Доза облучения
100
50
Радиация:
S(D)=e-D
Экспонента - порога нет!
Порог
Кривая выживания – это функция распределения дозы (времени воздействия), вызывающей гибель
Частота, %
Доза, вызывающая
гибель
100
50
Средняя убивающая
доза
Плотности распределений
![Page 7: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/7.jpg)
Забудем на время о дозах – будем говорить о распределениях продолжительности жизни
Выживаемость, %
Возраст
100
50
75
ЧеловекВыживаемость, %
Возраст
100
50
Некоторые насекомые
Экспоненциальная продолжительность жизни - это распределение «без памяти о прошлом»
Вероятность умереть в следующемгоду не зависит от возраста
Вероятность умереть в следующемгоду увеличивается с возрастом
4000
Распределение продолжительности жизни
для бессмертных! Единственная причина смерти – попадание под
колеса автомобиля. Средняя продолжительность
жизни 4000 лет
![Page 8: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/8.jpg)
Вернемся к зависимостям «доза-эффект»
Выживаемость, %
Доза облучения
100
50
Экспоненциальная зависимость:вероятность наступления эффекта при
следующей порции облучения не зависит от предыдущей дозы
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Положения теории попаданий в мишени
Не только дозовые зависимости! Многое проясняет физика
взаимодействия излучений с веществом
![Page 9: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/9.jpg)
-частиы
-лучи
X-лучи(рентгеновское излучение)
-частицы-Рентгеновское излучение
не связано с радиоактивностью
Виды ионизирующих излученийт.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит )
Ядро атома
-
-
-
--
-
-
-
Вильгельм Конрад Рентген и рука его жены (1895)
![Page 10: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/10.jpg)
Эрнест Резерфорд (1899)
Природа ионизирующих излучений
-частицы:
-частицы:
-лучи:
Pb +
-
Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов
нестабильны за счет избытка нейтронов
Число протонов
Чи
сло
нейт
роно
в
Излучение, тип радиации Масса Заряд Защита
Ядра гелия 4 +2 Бумага, одежда
Электрон 1/1836 -1 Пластик, стекло
ЭМ-волны 0 0 Свинец, бетон
n Частица 1 0 Вода, парафин
Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов
нестабильны за счет избытка (или дефицита) нейтронов
++
-
4Не
е-
2
Фотон
Частота, Гц
-лучи X-лучи УФ
Длина волны, м
Ионизирующая способность
![Page 11: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/11.jpg)
Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ)
Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм(-лучи, X-лучи, -частицы)
Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм (- частицы, протоны, нейтроны)
ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы на единицу пути в веществе (E/s)
Ионизированный атом-
-
-
--
-
Ионизирующее излучение
![Page 12: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/12.jpg)
Бумага Бетон
-частицы
-частицы
Прохождение излучений через вещество
Источники опасны только при
поступлении в организм
-лучи
Пробег в ткани 0.1 – 3 мкм
![Page 13: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/13.jpg)
Единицы измерения доз Поглощенная доза – энергия, выделенная в 1 кг вещества: 1 Грей (Гр) =1 Дж/1 кг
Экспозиционная доза – мера ионизации (только для - и X-лучей) - заряд (одного знака), образующийся в 1 см3 воздуха
1 Рентген (Р) = 0,0088 Гр
Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и радиочувствительности пораженного органа
1 зиверт (Зв) = 100 бэр
Только для личного пользования!1 Гр = 100 рад 100 Р 100 бэр 1 Зв
Единицы измерения радоактивности
Cкорость распада атамов: 1 беккерль (Бк) = 1 распад/сек 1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк
Дозиметры меряют не дозу, а мощность дозы, т.е. поглощенную дозу в единицу времени (Гр/c)
Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…?
0.1 1 10 100 1000
1
2
3
4
ЛПЭ, кэвмкм-1 ткани
ОБ
Э
Относительная биологическая эффективность излучения (ОБЭ)
- p+
![Page 14: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/14.jpg)
Положения теории попаданий в мишени
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Что является «мишенью»?
![Page 15: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/15.jpg)
Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро):
избирательное облучение ядра Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму
Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н
(-излучатель, пробег 1-2 мкм) Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином
(BUdR подобен, но не идентичен тимину) Радиочувствительность содержание ДНК в клетках:
растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)
Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма
Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы
![Page 16: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/16.jpg)
Прямое и непрямое действие радиации
Непрямое действие - радиолиз воды и возникновение свободных радикалов при прохождении излучения через цитоплазму:
- наиболее активен радикал OH (75% повреждений ДНК) - преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи)
Прямое действие - непосредственная ионизация атомов ДНК - преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)
Свободный радикал OHэлектрически нейтрален, но имеет
неспаренный электрон на внешней орбите - высокая реакционная способность
(время жизни 10-10 с)
В любом случае речь идет о попадании в ДНК-мишень
2 мкм
![Page 17: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/17.jpg)
Действие ионизирующих излучений
«Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр) «Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному делению: низкие дозы (< 10 Гр):
Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ) Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ) Повреждение оснований (особенно пиримидиновых).
На хромосомы:
На клетку:
Репарация Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и соматических клетках (рак)
Дальнейшие события:
![Page 18: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/18.jpg)
Попадания в мишени: распределение Пуассона
- среднее число попаданий при дозе D
Распределение «редких событий»:- число рыбок, пойманных за «время» D- число изюминок в кексе «объема» D- число голосов за Жириновского в квартале с D жителями
…………
Вероятность отсутствия поражений, т.е. выживаемость при
«одноударном» механизме гибели
объем мишени
![Page 19: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/19.jpg)
Модель гибели «одна одноударная мишень»
Доза облучения
Выживаемость, %
100
50S(D)=e-D
Доза облучения
Выживаемость, %
1
0.1
0.01
Удобен «полулогарифмический» масштаб:
- доза, вызывающая 63% гибели:
1-2 Гр для клеток млекопитающих500 Гр - вирусы
По оси ординат ln S(D)=-D
D37
0.37
Первые правильные оценки размера генов в хромосомах.
Задолго до «двойной спирали»!
![Page 20: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/20.jpg)
Модель гибели «несколько одноударных мишеней»
S(D)=1 – (1-e-D)m
0.01
Доза облучения
Выживаемость, %
1
0.1
Пусть для инактивации клетки небходимо попадание в m
мишеней, например при m=2 :
Вероятность попасть в одну мишень (хотя бы раз!)
m«Плечо»
Жива Жива Погибла
Оценка «числа мишеней»!
![Page 21: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/21.jpg)
Численные оценки радиочувствительности
Выживаемость, %
D
100
50
- средняя доза, вызывающая
гибель
_D
=
Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмами вычисления D50 или D37
Выживаемость, %
D
100
D50 D37
3750
D
Выживаемость, %
100
50
_D
D37 - в радиобиологии
D50 - в токсикологии
D - в теории вероятностей_
D = Площадь под кривой выживания в линейном масштабе
_
![Page 22: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/22.jpg)
Одноударные и многоударные эффекты
………… и т.д. – распределение Пуассона
Одноударный эффект
Двухударный эффект
Доза облучения
Эффект (мутации, аберрации)
1 удар2 удара
![Page 23: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/23.jpg)
Радиационно-специфические аберрации хромосом
Центрические кольца + фрагменты (2 разрыва в одной хромосоме)
Дицентрики + фрагменты (2 разрыва в разных хромосомах)
![Page 24: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/24.jpg)
Одноударные и многоударные эффекты
2 4 60
0.4
0.8
1.2
1.6
Доза, Гр
Чис
ло д
ицен
трик
ов
на к
летк
у
2 разрыва за 1 удар
D
2 разрыва за 2 удара
D2
При увеличении ЛПЭ кривая становится
одноударной
Доза, Гр
Час
тота
ди
цент
рико
в
50
1.5
Xn
Выход дицентриков D+ D2
![Page 25: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/25.jpg)
Биодозиметрия
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Доза, Гр
Час
тота
ди
цен
три
ков
и
цет
ри
чес
ки
х к
олец
на
кл
етк
у
Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro)
y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2
Доза, полученная пациентом
Частота аберраций у
пациента
Минимальная доза, которую можно выявить при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр
Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови – доказательство недавнего облучения организма
Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным, полученным при облучении лимфоцитов in vitro
В.А. Шевченко, 2002
![Page 26: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/26.jpg)
Репарация
Повреждения ДНК Частота на Гр Доля летальных
Изменение оснований 500/Гр 0.01
Однонитевые разрывы 1000/Гр 0.01
Сшивки ДНК-белок 150/Гр ?
Двунитевые разрывы 50/Гр 0.95
Влияние мощности дозы на частоту микроядер
0
1
2
3
4
5
Контроль 10 cГр(острое)
10 cГр/2 ч 10 cГр/24 ч 10 cГр /48 ч
Час
тота
мик
рояд
ер/1
00 к
лето
к
de Toledo et al. 2006
При уменьшении мощности дозы
Ацентрические фрагменты хромосом исключенные из клеточных ядер в момент
деления клеток
![Page 27: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/27.jpg)
Репарация – зависимость выживаемости от мощности дозы
X-лучи: 0,01 Гр/мин
2 4 6 8 100
10-3
10-4
10-2
10-1
1
X-лучи: 1 Гр/мин
Доза, ГрНейтроны: 0.01 Гр/мин
Нейтроны: 1 Гр/мин
При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения
Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»:
при изменении мощности дозы
при фракционированном облучении
![Page 28: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/28.jpg)
Репарация – зависимость выхода дицентриков от мощности дозы
D.C. Lloyd (1981)
X-лучи: 1Гр/мин
X-лучи: 0,003 Гр/мин
543210
0.5
1.0
1.5
2.0
Доза, Гр
Час
тота
диц
ентр
иков
на
клет
ку
При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения
Нейтроны, энергия 0.714.7 Мэв
Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у дрозофилы не зависит от мощности дозы
в диапазоне 0.03 - 100 Гр/час
Принцип «беспороговости» и «кумулятивности» мутационного процесса
![Page 29: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/29.jpg)
Проект «MegaMouse» супругов L. B. Russell & W. L. Russell (1955-1965)
Пять главных выводов
Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз.
Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila)
Самцы более радиочувствительны, чем самки.
Генетические эффекты существенно уменьшаются, если увеличивается время между облучением и спариванием.
Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy.
Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей
7 морфологических мутаций7 миллионов мышей!
1 Гр
The frequency of radiation-induced mutations is not, as the classical view holds, independent of dose rate. W. L. Russell, L. B. Russell. Science, 19, 1958
![Page 30: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061612/568151fd550346895dc03616/html5/thumbnails/30.jpg)
Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru
Всем спасибо, и еще раз напомню:
Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от случайных и независимых актов поражения
Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм формирования эффекта
Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве 1 Гр
1 Гр 100 рентген, хотя это разные вещи
Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с воздействием на ядерное ДНК
Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на присутствие репарации