在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制

——调控网络的研究方法

蒋舜媛 董霞 程在全2002-12-05

蒋舜媛 董霞 程在全2002-12-05

报告提纲 调控网络概述

调控网络的分类

调控网络的研究方法在基因水平上探索基因表达的代谢和遗传控制

调控网络概述 在生物机体内，所有生命活动过程都受到严格的调节控制，以最有效地方式和途径适应内外环境的变化，以有利生物机体的生存繁衍，这些调节控制可以从不同的层次水平，通过不同的途径和方式，以不同的机制进行调控，而且，不同的调节途径和方式彼此之间可以发生有机的联系，相互作用、相互影响，协调一致，从而构成了复杂的调控网络。

调控网络的分类可根据不同功能分类：

神经调控网络 免疫调控网络 代谢调控网络 激素调控网络 细胞内信号传导调控网络 基因表达水平的调控网络

调控网络的研究方法 组织及细胞学方法 基因突变技术

突变体筛选 基因工程技术

基因缺失基因过表达转基因技术

生物芯片技术 基因芯片 蛋白质芯片

在基因水平上探索基因表达的代谢和遗传控制

Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Ge

nomic Scale

Joseph L. DeRisi, Vishwanath R. Iyer, Patrick O. Brown

Science Vol. 278. 24 Oct. 1997: 680~686

目前， 10 多种微生物的基因组全序列已测定。在以后几年中，将有望知道几种多细胞生物的基因组全序列，其中包括人类基因组序列。然而，在这些基因组中，明确每一种基因的功能和作用将是一项十分艰巨的任务，而且从整体水平上了解基因组在生物机体复杂的生命历程中如何发生作用，对于我们将更是一个严峻的挑战。。

知道一个基因何时何地被表达常常为其生物学作用提供了强有力的线索。相反，在一个细胞中，不同基因的表达模式能够为细胞所处状态提供详细的信息。尽管蛋白质丰度的调节在一个细胞中绝不单独通过 mRNA 的调控来完成，但实际上细胞类型或状态的所有差异则与许多基因的 mRNA 水平的改变有关。这是偶然的，因为对特定基因测定其 mRNA含量则需要一特效试剂，即是其 cDNA 序列。 DNA 微阵列技术（基因芯片），是将数千个单个基因序列高密度排列在一张显微镜载玻片上，这种技术为在大规模的研究基因表达提供了一种实用经济的工具。

酿酒酵母是一种进行基因表达的系统观察研究特别好的研究材料。这些基因在基因组序列中容易识别，顺式调控元件通常紧凑并靠近转录单元，有关它的遗传调控机制已经了解很多，并且一套有力的工具可用于它的分析。

酵母糖代谢的一般特点酵母自然生长史中的一个重复循环包含了从厌氧（发酵作用）到需氧（呼吸作用）代谢的转换。

将酵母接种到富含糖的基质中会引发由发酵提供能量的快速生长，产生乙醇。当可发酵的糖用尽时，酵母细胞转向将乙醇作为碳源供有氧生长。

这个基于葡萄糖损耗的从厌氧生长到需氧呼吸的转换，即指如双峰转换（ Diauxic shift ） .

该转换与涉及到细胞基本代谢过程中的基因表达中普遍改变有关，这些代谢包括碳代谢、蛋白质合成，和碳水化合物储存等。

Fig. 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of

changes in gene expression.

酵母中的代谢途径糖酵解有氧呼吸

TCA 循环乙醛酸循环糖异生

我们使用 DNA 微阵列来刻画整个基

因组的基因表达过程的变化，并研究

调控和执行该过程的遗传途径

基因芯片技术研究糖代谢中基因表达调控的一般过程

DNA 微阵列制备6400 个 DNA 序列

提取制备 RNA 探针

制备荧光标记 cDNA

杂交

酵母细胞

反转录指数生长的细胞的不同培养阶段

图解说明DNA 微阵列制备：

利用购买的一组引物对 , 将酵母的开放阅读框部分通过 PCR 放大 . ，包含大约 6400 个清楚的 DNA 序列，被用一个简单的自动机械印刷装置印刻在玻璃载片上 , 构成相应的 DNA 微阵列。

mRNA探针制备：将来自以指数生长培养的酵母细胞接种到新鲜的基质中在30°C 生长 21 小时。在开始生长 9 小时后，然后依次获得经历间隔 2 小时 7 个不同阶段连续培养的样品，并分离制备 mRNA 。

cDNA制备：通过 Cy3(Cy3( 绿色绿色 )) 或 Cy5( 红色 )- 标记的 dUTP 经反转录制备荧光标记的 cDNA ，

杂交： cDNA 与微阵列杂交。观察、分析

图解说明 为使识别基因表达水平变化的可靠性最大化，我们标记

了从每个连续间隔时间点培养的细胞中获得的 cDNA, 用 Cy5标记，

然后将其与 Cy3-Cy3- 标记标记的对照 cDNA样品混合 ，后者来自于从接种后的第一个间隔时间得到的细胞。

在这个实验设计中，测量每一个排列单元 Cy3Cy3 和 Cy5荧光物质的相对荧光强度，可以提供为两个细胞群体中对应 mRNA 的相对丰度的一个可靠量度 (Fig. 1) 。

来自 7 个样品的系列数据（见 Fig. 2 ） , 由超过 43000表达率量度单位组成，被组织成一个数据库 , 以推动对实验结果的进一步探索和的高效分析。该数据库可在网上公开获得。

Fig. 1. Yeast genome microarra

y

在这个实验设计中，测量每一个排列单元Cy3Cy3 和 Cy5荧光物质的相对荧光强度，可以提供为两个细胞群体中对应 mRNA 的相对丰度的一个可靠量度

Fig. 2. The section of the array indicated by the gray box

in Fig. 1

hybridization of hybridization of thethe Cy3-dUTP-lCy3-dUTP-labeled cDNAabeled cDNA

hybridizationhybridization of of Cy5-dUTP-labelCy5-dUTP-labeled cDNAed cDNA

Genes expressGenes expressed at roughly eed at roughly equal levels befoqual levels beforere and after the and after the diauxic shiftdiauxic shift

Fig 1. Yeast genome microarr

ay

TDH1催化 PEPGA-3-P

PDC1催化丙酮酸乙醛

ALD2乙醛酸脱氢酶

Fig. 1 图解说明 荧光标记 cDNA 探针是来自于从接种后不久的细胞中分离得到的 mRNA （培养密度 <5 × 106 cells/ml ，基质葡萄糖水平为 19 g/liter ） , 在 Cy3-dUTP 存在下的通过反转录制备。

类似的，另一个探针来自培养 9.5小时后分离的同一细胞群中的 mRNA （培养密度 ~2 × 108 cells/ml ，基质葡萄糖水平为 <0.2 g/liter ） , 在 Cy5-dUTP 存在下通过反转录制备。

在这幅图中， Cy3-dUTP-labeled cDNA 的杂交（即，mRNA 在初始时间点的表达）显示为绿色信号，

Cy5-dUTP-labeled cDNA 的杂交（即， mRNA 在 9.5小时的表达）显示为红色信号。

这样，双峰转换后被诱导或抑制的基因在本图中就分别显示为红色和绿色的斑点。双峰转换前后表达水平大致相等的基因在本图中显示为黄色斑点。

在用于分析双峰转换期间基因表达的每个微阵列中

• 红点代表被诱导的与初始时刻红点代表被诱导的与初始时刻有关的基因，有关的基因，

• 绿点代表被抑制的与初始时刻绿点代表被抑制的与初始时刻相关的基因相关的基因。

在用于分析 tup1突变和 YAP1 过表达影响的阵列中

• 红点代表表达增加的基因，红点代表表达增加的基因，• 绿点代表经遗传修饰导致表达绿点代表经遗传修饰导致表达降低的基因。降低的基因。

注意区分明显的基因组是在不同的实验中被诱导和抑制的。在 600nm 的光密度下测量的细胞密度是用于测量培养物的生长情况。

Fig

. 2. Fig

. 1

中灰色方框标记的部分

阵列所显示所描述的每组实验

Fig. 2. 图解说明

酵母在 Glu培养基上进行指数生长的过程中， 其基因表达的整体情况是相当稳定的。

在比较最初两个细胞样品的基因表达情况时（间隔 2小时收获）， 19 个基因 (0.3%) 的mRNA 水平差异 2 倍或 2倍多，最大的差异也仅有 2.7倍。

Fig. 2. 图解说明 然而，当培养基中的 Glu 被逐渐消耗时，基因表达的整

体情况可发生明显的变化。 大约 710 个基因的 mRNA 水平被诱导至少增加了 2 倍 ; 大约 1030 个基因的 mRNA 水平下降了至少 2 倍 ; 183 个基因的 mRNA 水平至少增加了 4 倍 ; 203 个基因的 mRNA 水平至少减少了 4 倍。

目前，这些表达不同的基因中大约有一半其功能还没有被认识，而且也没有命名。相对于那些功能已知的基因而言 , 400 多个表达不同的基因没有明显同源性 . 因此，这些以前尚未被认识的基因对双峰转换的应答，首次为了解它们的作用提供了有益的线索。

红框白字 确定了在双峰转换中表达增加的基因。

绿框深绿字 确定了在双峰转换中表达降低的基因。

黑白框表示无显著差异表达（小于2倍）。

连接可逆酶促反应步骤的箭头方向，表示从基因表达情况中推断出的双峰转换后中间代谢物代谢方向。

基因被强烈诱导表达的酶催化的反应步骤，用突出的红色箭头表示。

宽灰色的箭头表示从基因表达情况中推断出的双峰转换后代谢物主要增加的流向。

Figure 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in g

ene expression.

Fig. 3 图解说明• 实验中，我们观察到醛脱氢酶 (ALD2) 和乙酰辅酶 A合成酶

(ACS1) 被大量诱导合成，这两种酶的作用就是一起将乙醇脱氢酶的产物，即乙醛，转化为乙酰辅酶 A ，而乙酰辅酶 A 则进一步参与三羧酸循环（ TCA ）和乙醛酸循环（支路），为其提供能量原料。

• 随着编码丙酮酸脱羧酶的基因转录停止和丙酮酸羧化酶的诱导合成，从而使丙酮酸代谢转向合成草酰乙酸，而不再生成乙醛，为 TCA循环和糖异生提供原料。

• 由于编码磷酸烯醇丙酮酸羰激酶基因 PCK1 和编码 1,6-二磷酸果糖的基因 FBP1两个关键基因被诱导转录，逆转了糖代谢过程中的两个不可逆反应的代谢方向，从而使代谢沿着糖酵解途径的可逆反应逆向朝着合成６ -磷酸葡萄糖（ 6-P-G ）方向进行。

• 诱导编码海藻糖合成酶和糖原合成酶复合体的基因转录，可进一步促进 6-P-G转化合成海藻糖和糖原进入糖储存途径。

Figure 4. Coordinated regulation of functionally related genes.

曲线代表在每个指定组中所有基因的平均诱导和抑制率。

• 几类基因，如细胞色素 C 相关基因，和那些参与 TCA/ 乙醛酸循环和糖储藏反应途径的相关基因，在葡萄糖消耗时它们同等地被诱导表达。

• 相反，蛋白质合成的有关基因，包括核糖体蛋白， tRNA 合成酶，和翻译、延长及初始因子的基因等，则表现出同等程度地表达降低。

Fig. 4. 功能性相关基因的协同调控

• 各群组中基因的总数如下：• 核糖体蛋白， 112;• 转录延长和起始因子， 25;• tRNA 合成酶 ( 不包括线粒体合成酶 ), 17;• 肝糖原和海藻糖合成和降解， 15;• 细胞色素 C 氧化酶和还原酶蛋白， 19;• TCA 和乙醛酸循环酶， 24 。

• 正如编码关键酶的基因表达的改变能增强对代谢程途径调整调认识一样，大批量功能相关基因的表达行为分析，可以为研究酵母细胞适应多变环境的系统方法提供宽广视野。

• 几类基因，如细胞色素 C 相关基因，和那些参与 TCA/ 乙醛酸循环和糖储藏反应途径的相关基因，在葡萄糖消耗时它们同等地被诱导表达。

• 相反，蛋白质合成的有关基因，包括核糖体蛋白， tRNA 合成酶，和翻译、延长及初始因子的基因等，则表现出同等程度地表达降低。

• 在双峰转换过程中，超过 95% 的核糖体基因的表达至少降低 2倍（ Fig. 4 ）。

• 一个值得注意且有启发性的例外是编码线粒体核糖体的基因在葡萄糖限制后通常是被诱导，而不是被抑制，这对线粒体的生物发生是十分必要的。

• 当从酵母基因组中了解到更多关于每个基因的功能时，通过其全体基因表达模式获得深入了解细胞适应环境变化的能力将变得愈加强大。

Fig. 4. 图解说明

Figure 5. Distinct temporal patterns of induction or repression help to group genes that share regulatory

properties.

A. 细胞密度的时序分布图B. 只在最后的时间点（ 20.5小时）表现出强诱导（大于9倍）的 7 个基因

C. 7 个在 18.5小时时间点早期诱导时 mRNA 水平上有一个峰。

D. 细胞色素 C氧化酶和泛醌细胞色素 C还原酶基因。有一个与双峰转换一致的诱导标记

E. 双峰转换前被抑制，并持续抑制进入稳定阶段的基因

F. 核糖体蛋白基因包含一大类被抑制在葡萄糖降解（阶段）的基因。

结 语使用 DNA 微阵列来描述受调控分子的活动影

响的突变的转录结果，为分析和了解调控途径和网络提供了一个简单而有力的技术方法。

这种策略同样在药物筛选中也具有重要的应用价值。 在编码候选药物靶蛋白的特定基因中，基因突变

可以作为基因表迖理想的化学抑制剂或调节因子的代用品。

DNA 微阵列可被确定基因表达导致的信号模式变化，然后分析来筛选能够产生理想信号模式的化合物。

结语 在基因组水平上探索基因表达模式， DNA 微

阵列为此提供了一个简单而经济的技术方法。 将这一方法扩展应用到任何其他组织均没有多

大的障碍。 生产和使用 DNA 微阵列所需的设备可选择价

格适中和简单的组件。 对一个研究小组来说，只要得到基因序列，在

4 个月内完成 6000 多个基因的扩增是可行的，而且只需 2天就可印制一套 110 型微阵列，每个微阵列有 6400 个单元。

结语 探针的制备、杂交，以及荧光显像也都是很简

单的操作过程。甚至概念上简单的实验，象我们这里所描述的

一样，均可以产生大量的信息。 如同每个基因的功能被了解得更多，别的实验

方法同样可以确定众多其他自然过程和遗传影响中基因表达的全局改变一样，每个这种实验所提供信息价值也将不断增加。

也许目前最大的挑战是发展有效的方法，以利于从实验提供的大量数据中组织、分配、解释和提炼观点、见解。

致谢