形态学研究及其 方 法 进 展
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形态学研究及其
方 法 进 展
宋天保2006 年 10 月
•形态学研究思路和方法
•免疫组化方法进展
•基于 PCR 的原位检测技术
1. 形态学研究思路和方法
1.1 形态学发展简史
•解剖学的发展Galen(130 - 200) 《论解剖过程》 ,《论身体各部器官的功能》
Vesalius(1514 - 1564) 《人体的构造》 (1543)
•光学显微镜的发明
Leeuwenhoek(1632-1723)Hooke(1635-1702)《显微图谱》( 1665 )
1. 形态学研究思路和方法
•细胞学说的建立和完善Schleiden(1804-1881)“植物发生论”( 1838 )Schwann(1810-1882)“关于动植物的结构和生长一致性的显微研究” (1839)
Virchow(1821-1902)《细胞病理学》 (1858)
“omnis cellula e cellula”
1. 形态学研究思路和方法
1. 形态学研究思路和方法
•电子显微镜的发明和超微结构研究
Knoll 和 Ruska(1932)
Nobelprize1986
1. 形态学研究思路和方法
•现代形态学的发展
细胞 (组织 )化学 ,免疫细胞化学 ,原位分子杂交 ,细胞培养等
•向定量化、自动化和数字化发展
1. 形态学研究思路和方法
1.2 形态学的作用和地位
(1) 探索生命活动的结构基础
(2) 为某些学说的建立提供形态基础
如 :神经元学说 ,肌丝滑动学说
(3) 在生命科学研究中的地位逐渐上升
(4) 与机能学研究相辅相成
Nobelprize 1906
1. 形态学研究思路和方法
1.3 形态学研究的思路
(1) 水平:
大体观测 (器官 )—立体显微镜 (组织 )-- 光镜(细
胞 )—电镜 (亚细胞 )-- 扫描探针显微镜 (分子和原
子 )
(2) 对象:活体—离体培养
—固定组织
(3) 方法 :
1. 形态学研究思路和方法
选用形态学方法时的基本思考:
•研究目的
•有无必要
•选用何种方法
•有无条件
•高质量照片
•结合其他资料分析
•注意人工假象 ( 预成论 ,凤汉小体… )
1. 形态学研究思路和方法
1.4 形态学研究的方法
(1) 普通光镜术:
•常规方法 :固定—切片 --染色 (H-E)
•特殊染色 :
1. 形态学研究思路和方法
(2) 特殊光镜术:
•荧光显微镜
•相差显微镜
1. 形态学研究思路和方法
•暗视野显微镜 •激光共聚焦扫描显微镜
1. 形态学研究思路和方法
(3) 电镜术:
•透射电镜术 •扫描电镜术 •冷冻蚀刻术
1. 形态学研究思路和方法
(4) 组织 (细胞 )化学术:
糖 ,脂类 .蛋白 ,核酸 ,酶等
1. 形态学研究思路和方法
(5) 放射自显影术:
1. 形态学研究思路和方法
(6) 免疫组织 (细胞 )化学术:
PAP,ABC,SP
1. 形态学研究思路和方法
(7) 原位杂交:
•探针 :DNA,RNA,ODN
•标记物 :
放射性核素
非放射性
•显示 : 放射自显影
免疫组化
荧光
1. 形态学研究思路和方法
(8) 细胞培养术:
1. 形态学研究思路和方法
(9) 活体与活细胞染色:
1. 形态学研究思路和方法
(10) 形态研究的定量术:
•形态计量术 (体视学 )
•显微分光光度术
•图像分析术
•流式细胞术
2. 免疫组化方法进展
2.1 EPOS 法 (enhanced polymer one step method)
原理:酶 (HRP)+ 惰性聚合物 (葡聚糖 )→酶标聚合物
+ AB1 → 酶 -聚合物 -AB1
方法:酶 -聚合物 -AB1→显色。变法: (rapid microwave one step method,RAMOS) 加酶 -聚合物 -AB1→盖玻片
→微波炉→显色
2. 免疫组化方法进展
特点:只有 1步,特异性强; 敏感性高( 70 mole 酶 /1 mole 聚合物); 简便、快速 ; 适用于石蜡、冰冻切片,细胞涂 片等。 RAMOS 法还有: 试剂用量少,成本低; 无脱片现象; 无边缘现象,染色均匀。
2. 免疫组化方法进展
2.2 EnVision 法
原理:酶 (HRP)+ 惰性聚合物 (葡聚糖 )→酶标聚合物 + AB2 → AB2- 聚合物 -酶 (含 100个酶、 15个 Ab2分子 )
方法: AB1→ AB2- 聚合物 -酶→显色
2. 免疫组化方法进展
特点: 敏感性高 ; 背景低(体内无葡聚糖) ; 孵育时间短( 37℃, 15
min ) ,适用于术中 病理诊断 ; Ab1最好用单抗,浓 度可大一点
2. 免疫组化方法进展
2. 免疫组化方法进展
2.3 CSA 法 (catalyzed signal amplification)原理:基本方法为 SP法 加用生物素标记酪胺 HRP催化酪胺使之沉积在 Ag-Ab结合位点
2. 免疫组化方法进展方法: AB1 → AB2-Bio → SA-HRP → 酪胺 -Bio →
SA-HRP → 显色
优点:敏感性高 ; Ab1稀释度高,背景染色低 ; 省时 ; 适用于信号弱的组织(戊二醛固定) ; 第 2次用的 SA亦可用荧光素、胶体金、 AKP 标记 ; 也可用于放大原位杂交信号 .
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.1 原位 PCR
定义:将 PCR 的高效扩增与 ISH 的细胞定位相结合,在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定 DNA或 RNA序列,同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。
分类:•原位 PCR :以 DNA 为起始模板→ PCR扩增→检测扩增产物。又分直接法和间接法•原位反转录 PCR :以 mRNA 为起始物→反转录成 cDNA→以 cDAN 为模板行 PCR扩增→检测扩增产物。•原位再生式序列复制反应:以 mRNA 为模板直接扩增RNA靶序列。
3.2 直接法原位 PCR
特点: PCR扩增时用标记 dNTP或引物 ,使扩增产物直接
标记
标记物:常用同位素、生物素、地高辛
操作程序:
组织细胞制备:固定、预处理
原位扩增:引物 , TaqDNA 聚合酶 ,标记 dNTP
扩增产物检测:放射自显影, ICC
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
评价:
优点:操作简便、流程短、省时 缺点:特异性差,假阳性率高(固定、包埋、制片等使
标本内 DNA受损, DNA修复时,标记 dNTP 进入非靶
序列;引物与模板的错配)
扩增效率低 不适用于切片标本(切片比细胞标本 DNA受损重)
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.3 间接法原位 PCR
特点: PCR 体系中 dNTP 和引物均不标记
PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交
标记物:以生物素、地高辛较为常用
操作程序:
组织细胞制备:固定、预处理
渗入和原位扩增:dNTP,引物 , Taq DNA 聚合酶
扩增产物检测:ICC
原位杂交: 用特异性标记探针
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
评价:目前最常用
优点:扩增效率高 特异性强(杂交探针特异性结合靶序列,不与扩增
产物中的非靶序列结合)
可用于细胞制备和石蜡切片标本
缺点:操作复杂
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
举例:石蜡切片, Dig标记标本制备: 10%福马林固定,石蜡切片 5 m。预处理:①脱蜡至水 ;
②0.2mol/L HCl, 10’;
③5 g/ml 蛋白酶 K 37 10’; ℃④RNase消化 37 30’; ℃⑤Alc脱水干燥。原位扩增:①PCR扩增反应液 30 l,加盖片封边 ;
②PCR热循环: 94 1’℃ , 55 1’℃ , 72 1.5’℃ , 25-30个循环, 72℃延伸 10’; ③去盖片, 4% 多聚甲醛后固定 10’;
④ Alc脱水干燥。原位杂交: ①Dig 标记探针, 98 ℃变性 10’, -20 ℃退火 5’, 42 ℃杂交过夜;②洗涤: 2×SSC 10’ ×3, 1×SSC 10’ ×3,缓冲液洗 10’ ×3;③AKP-Dig-Ab, 37 ℃, 2h;
④BCIP/NBT 显色;⑤脱水、透明、封固。
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.4 原位 RT-PCR
原理: 逆转录酶 mRNA 为模板 cDNA Taq聚合酶 cDNA 为模板 扩增产物 直接(直接法)或原位杂交(间接法)检测扩增产物
注意:标本先以 DNase处理过夜,破坏 DNA
反转录条件 42℃,30’-60’反转录后加热 90℃以上灭活逆转录酶
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
程序:
组织细胞制备: 10% 福马林固定。
预处理: DNase消化过夜;蛋白酶 K消化( 54℃,20’);95℃,3’灭活蛋白酶 K。
逆转录反应:反应液含逆转录酶、引物、 dNTPs,并有 RNase抑制剂 ,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。
PCR扩增:加 Taq聚合酶、引物、 dNTPs扩增;扩增后烤 80℃, 15’-30’。
原位杂交:原位杂交后或直接用 ICC 检测扩增产物。
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.5 原位再生式序列复制反应 ( 原位 3SR反应 )
原理:直接进行 RNA扩增,检测细胞内低拷贝 mRNA特点: 3种工具酶: AMV逆转录酶、 RNase H 、 T7RNA 聚合酶
引物 5’端有 T7RNA 聚合酶启动子
扩增反应 42℃, 2h,不需热循环程序:细胞固定、脱水干燥; 制备 5’端含 T7启动子的引物; PCR制备标记探针( Dig-11-dUTP ); 原位扩增(反应液含引物、 dNTPs 、 3种酶等); 原位杂交(加探针 95℃变性 10’, 40℃杂交过夜,显色 )
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.6 原位 PCR 的对照试验
已知阳性、阴性对照试验
省去或用无关引物替代特异性引物
标本用 DNase或 RNase 预处理
直接、间接原位 PCR 中省去 DNA 聚合酶
原位 RT-PCR 和原位 3SR反应中省去逆转录酶
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.7 原位 PCR 的应用
检测内源性基因
固有基因定位 --最敏感,低拷贝
异常及变异基因 -- 与遗传性疾病的研究
检测外源性基因
感染(病毒、细菌)基因 --诊断
转基因,基因治疗 -- 基因定位、有无突变
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
3.8 原位 PCR存在问题及对策 敏感性:在细胞制备高 (单拷贝 );在切片标本低,扩增效率低
特异性:间接法高,直接法低(假阳性)
原位扩增时采用热启动 PCR或套式 PCR可提高特异性
引物延伸时掺入 Bio-dNTPs→合成的新链体积大→不
易扩散
用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增→多个不
同长度扩增产物重叠交织→不易扩散,且敏感性提高
复杂性:需规范操作,需对照试验,需简化操作
定量分析:尚不成熟
3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR
4.1 免疫 PCR概述:利用细胞工程和基因工程技术,将 Ag-Ab 反 应的特异性与 PCR 的敏感性结合,用以检测 Ag分子。原理:用一中介分子同时结合 DNA 和 Ab , Ab与 Ag特异性 结合, DNA 用特异引物行 PCR扩增,通过显示扩增产 物对 Ag进行定性和定量。与 ELISA比较:本质为 ELISA,但 作用于底物的酶被结合于 Ab的标记 DNA 分子取代; 酶标显色被 PCR扩增取代。优点:敏感性提高近 1万倍,可检测含量极低的 Ag 。
4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR
4.2 中介分子的种类 蛋白 A(PA) 与链霉亲和素 (SA)嵌合分子: 利用基因工程表达的嵌合分子 PA可结合 IgG Fc段, SA可结合生物素化 DNA; 假阳性 :PA可能与标本和血清中残留 Ig结合 抗体只能是 IgG分子(Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA) : 将抗体和一段核苷酸分别生物素化,再以 SA连接二者 抗体结合 Ag ,核酸用引物 PCR扩增单链抗体 -SA融合蛋白: 利用基因工程将 McAb的重链和轻链连接成单链,再与 SA连接→ 单链抗体 -SA
4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR
4.3 原位免疫 PCR原理:将 PCR 与免疫组化结合,在组织细胞原位检测抗原 :
中介分子连接 Ag-Ab 复合物和标记 DNA→Ag-Ab-DNA复合物→
PCR扩增 DNA→检测扩增产物→间接证明 Ag 存在
4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR
方法:石蜡切片脱蜡至水;
0.3%双氧水 -甲醇 20’;
3 mol/L尿素 30’;
10%小牛血清 37℃ 30’;
Ab1 37℃ 1-2h; PBS洗 ;
生物素化 Ab2 37℃1h; PBS洗 ;
SA 1:100, 1h;
生物素化 DNA ( 20ng/片) 37℃1h;
PBS洗后行原位 PCR扩增 (25l反应液加引物 , dNTPs, Bio-dUTP, Taq 酶等 );
ABC 法呈色,复染、封片。
4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR
增加敏感性: 用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入 PCR产物 改变 Ab和中介连接物浓度 控制 PCR循环周期数、改进 PCR产物检测方法注意事项: 防止非特异性:外源性 DNA 和引物应与被检材料固有及外来基 因无互补序列 用尿素或微波替代蛋白酶消化:防止残存酶对 Taq酶的降解 充分洗涤:去除非特异结合 设立阳性、阴性对照
4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR
5. 引物介导的原位标记技术
5.1 原理 (primed in situ labelling, PRINS)寡核苷酸引物或变性 DNA 片段与标本上靶 DNA互补复性在聚合酶作用下单次延伸(用标记 dUTP ),新合成 DNA即带有标记物,检测。
组织细胞制备:固定、预处理
复性与延伸:引物 , dNTP(含标记 dUTP), Taq DNA 聚合酶
检测:荧光显微镜或 ICC
5. 引物介导的原位标记技术
5.2 方法5.2.1 染色体标本① 新鲜组织块胰酶消化成单细 胞,制备间期核或染色体 ;
② Alc脱水,空气干燥; ③ 94℃加热,并加上 50 l PCR
反应液 (含引物 , Bio-11-dUTP,
dNTP, Taq 酶 ), 加盖片 , 5 min;
④ 65℃湿盒 5’, 0.1×SSC 65℃洗 片 5 min;
⑤ 65℃干燥 10-20”, EDTA 5 min
终 止反应;
⑥ 4× SSC 含 0.1%吐温 20 42℃ 洗片 5 min,2次 ;
⑦ 30%BSA封闭 20 min;
⑧ FITC-亲合素或 CY5-亲合素 37 30’; ℃
⑨ SSC (4× 42 5 min 2℃ 次 ,
2×5 min)洗片 ;
⑩ 复染,甘油封片 ; 荧光显微镜 观察。
5. 引物介导的原位标记技术
5.2.2 石蜡切片① 脱蜡至水 ;
② 0.2mol/L HCl, 5’;
③ 25 g/ml 蛋白酶 K 37 15’; ℃ ④ Alc脱水干燥; ⑤ PCR反应液 25 l (含引物 ,
dNTP, Dig-11-dUTP, Taq 酶 ),
加盖片 , 94℃变性 5 min, 65℃湿 盒 5 min;
⑥ SSC洗 (0.1× 65 5 min, 4× ℃ 42 5min,2℃ 次 );
⑦ 20%羊血清封闭 30 min;
⑧ 地高辛抗体复合物 , RT 2h;
⑨ 洗后用 BCIP/NTB 显色 1-2h;
⑩ 中性红复染,封片。
结果:阳性信号蓝紫色, 背景细胞核红色
5. 引物介导的原位标记技术
5.3 对照试验•阳性对照:已知阳性细胞或组织;•阴性对照: 不加标记的 dUTP; 不加引物; 不加 Taq聚合酶
5. 引物介导的原位标记技术
5.4 评价•快速(扩增只需 5~ 10 min,全程只需 1~ 3h );•简便( Taq酶驱动的单次延伸,只需特异性引物,不需探针);•特异性高(避免原位 PCR 中标本上受损 DNA修复引起的非特异
性延伸和扩增,特异片段延伸和信号显示强而稳定);•既可用于细胞和染色体标本,也可用于组织切片;•可使用 Dig-11-dUTP,代替荧光标记,可用普通显微 镜,便于推广和避免荧光褪色。