テーマ２摘出モルモット回腸に対する薬物の作用

薬理学実習発表会

メンバー３０１５　大野　澄美玲　　３０１６　大家　理伸３０２４　海田　美幸　　　　３０３８　小谷　有希子３０４２　左近　郁絵　　　　３０４８　杉本　倫子３０５１　瀬川　朋未　　　　３０６８　永井　涼子３０７０　中山　知倫　　　　３０８７　松尾　悠紀３１００　山本　真　　　　　３１０３　米倉　伸彦

理論編

解剖 · おさらい

腸神経系 Enteric Nervous System外来神経系　　・交感神経系　・副交感神経系 　壁内神経系 ・アウエルバッハ神経叢（筋層間神経叢）　　　　　　　　　　　…腸管の運動を制御 ・マイスナー神経叢（粘膜下神経叢）　　 　 …分泌や吸収などの粘膜機能

　平滑筋の直接的神経支配と壁内神経叢のニューロンへのシナプスを介した支配とがある

アセチルコリンについて～生理機序～

Ach の生合成＊コリンの取り込み

Cell 内

Cell 外Na+

Ach 生合成の律速段階

コリン輸送体へミコリニウムで抑制コリン共輸送

Ach の生合成 CH3

CH3 N+ CH2CH2OH

CH3

Choline

CH3

CH3 N+ CH2CH2OCCH3

CH3 O

Acetylcholine

CH3

CH3 N+ CH2CH2OH

CH3

Choline

CH3 C S CoA

O

HS CoA

CH3COOH

Acetic acid

コリンアセチル　　トランスフェラーゼ

アセチルコリン　　　エステラーゼ

Ach の貯蔵

H+

成熟した小胞体

ATP,プロテオグリカン含む逆輸送

ＡＣｈの遊離・ AC ｈ遊離は数千分子の AC ｈが一つの量子として遊離の最小単位となり、非連続的な遊離が行われるという量子的遊離の性質を持っている。量子的遊離の vesicle 説AC ｈが量子的遊離を起こすという事実

神経終末にシナプス小胞が存在し、その内に数千～数万分子の AC ｈを含むという事実＋ 遊離される AC ｈはシナプス小胞内のものである

つまり、神経興奮により終末内に流入したつまり、神経興奮により終末内に流入した CaCa ２＋２＋が、シナプが、シナプス小胞と細胞膜を融合させ、小胞内のス小胞と細胞膜を融合させ、小胞内の ACAC ｈを細胞外へ遊離ｈを細胞外へ遊離するする (exocytosis)(exocytosis) と考えられる。と考えられる。

Ach

ＡＣｈの遊離（静止状態） 神経が静止状態にある神経が静止状態にある時も１～数個のシナプ時も１～数個のシナプス小胞から自発的にス小胞から自発的にACAC ｈが遊離される。ｈが遊離される。

AChR

このこの ACAC ｈがｈが ACAC ｈｈ RR内の内の NaNa ＋＋チャネルをチャネルを開口して終板に微小開口して終板に微小な脱分極を起こさせな脱分極を起こさせている。ている。こうして起こる脱分極こうして起こる脱分極をを微小終板電位微小終板電位（（ MEPP)MEPP) と呼ぶ。と呼ぶ。

Na＋

Ｃａ２＋

Ach

ACh の遊離（神経興奮時）

電位依存性電位依存性 CaCa ２＋２＋チャネルチャネル

AChR

神経終末に活動電位が神経終末に活動電位が到達すると膜の到達すると膜の CaCa ２＋２＋チャネルが開口し、チャネルが開口し、 CaCa２＋２＋が流入する。が流入する。神経終末での神経終末での CaCa ２＋２＋増増加が引き金となり数百加が引き金となり数百の量子が同時に遊離さの量子が同時に遊離され、れ、 ACAC ｈｈ RR 内の内の NaNa ＋＋チャネルが開き、 チャネルが開き、 NaNa ＋＋が流入し、が流入し、 MEPPMEPP の相の相加によって加によって終板電位終板電位（（ EPP)EPP) を発生させる。を発生させる。終板電位により、電位終板電位により、電位依存性依存性 NaNa ＋＋チャネル付チャネル付近の電位が閾値に達す近の電位が閾値に達するとると NaNa ＋＋チャネルのゲチャネルのゲートが開き、自己再生ートが開き、自己再生的に活動電位となる。的に活動電位となる。

Na＋ Na

＋電位依存性電位依存性 NaNa ＋＋チャネルチャネル

N

AChE

AChE

ACh

Mitアセチル－ CoA ＋コリン

フィードバック阻害

分解

酢酸

N M

MＣａ２＋

電位依存性電位依存性 CaCa ２＋２＋チャネルチャネル

N: ニコチン受容体M: ムスカリン受容体

AC ｈの生成・貯蔵・遊離・分解・フィードバック阻害

アセチルコリン受容体① ニコチン受容体サブタイプ 局在 反応 アンタゴニスト チャネル遮断薬筋肉型（ NM)受容体

神経筋接合部 α ブンガロトキシン デカメトニウムガラミン

神経型（ NN)受容体

自律神経節中枢神経

神経ブンガロトキシンネオスルガトキシン

ヘキサメトニウムメカミラミン

② ムスカリン受容体サブタイプ 局在 反応 アゴニスト 特異的アンタゴニスト

M1 中枢神経神経節

ピロカルピン ピレンゼピンテレンゼピン

M2 心臓ペースメーカー ベタネコール メトクラミンビンバシンガラミン心筋

M3 心臓以外の副交感神経効果器官ベタネコール ヘキサヒドロシラジフェニドール

アセチルコリンについて ～平滑筋への作用～

交感神経系 副交感神経系自律神経系

AC ｈ

AC ｈ

AC ｈ

NE

ニコチン受容体ニコチン受容体

神経伝達物質節前神経

節後神経

アドレナリン受容体 ムスカリン受容体

① ②

細胞膜 β2Gs

NE

AC

促進ATP

cAMP↑

② ミオシン軽鎖の　リン酸化を抑制①PKA の活性化

筋弛緩

アドレナリン受容体

細胞膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ACh

cAMP ↓

GiM2 M3 Gq

PKA ↓

PLC 　促進

PLC 　促進DG

PIP2

IP3

筋小胞体 Ca2+↑ ＋ CAM 　 Complex

カルモジュリン依存ミオシン軽鎖キナーゼ　活性ミオシン軽鎖　リン酸化

ATPase 　活性化筋収縮

①

②

ムスカリン受容体

ヒスタミンについて

抗原

PLC

PKC

CaMK

PIP2

DG

IP3IP4

ER[Ca2+]

Ca2+

リン酸化

細胞骨格蛋白

ヒスタミン

ＳｙｋLyn

受容体サブタイプ 分布 細胞内情報伝達系 選択的活性薬 選択的拮抗薬

H1 平滑筋 ↑ IP3, DAG 2- (3-fluorophenyl)histamine mepyramine内皮細胞 triprolidine

脳H2 胃粘膜 ↑ AMPｃ dimaprit ranitidine

心筋 impromidine tiotidine肥満細胞 amthamine

脳H3 前シナプス性 G蛋白と連動 R-α -methylhistamine tioperamide

脳 imetit clobenpropit 壁内神経叢 immepip

他神経

ヒスタミン受容体のサブタイプ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　細胞膜H1

Gq

PLC 　促進IP3

DG

PIP2 筋小胞体

ATPase 　活性

Ca2+↑ ＋ CAM 　 Complex

MLCK 活性ミオシン軽鎖　リン酸化

筋収縮

ROC

DMPP について

DMPP

＊ジメチルフェニルピペラジニウム＊ニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニスト＊自律神経節興奮薬＊初期脱分極を起こす＊一部はムスカリン様作用を示す

化学式

ニコチン DMPP

N

CH3

N

N N+

CH3

CH3

まとめ

細胞膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　cAMP ↓

Gi

M2

PKA ↓

PLC 　促進

M3 、 H1

Gq

PLC 　促進

IP3

DG

PIP2 筋小胞体

ATPase 　活性

Ca2+↑ ＋ CAM 　 Complex

MLCK 活性ミオシン軽鎖　リン酸化

筋収縮

ROC

　　　 Ca ２＋　　　ポ　　　ン　　　　プ

筋小胞体

　 Ca²+供給源：・細胞外から　 ROC　（ receptor operated Ca²+ channel)・細胞内 Ca²+ ストアから

IICR(IP3誘起性 Ca²+放出） IP3RCICR(Ca²+誘起性 Ca²+放出） RyR

Ｒ Ｒ

4Ca 　 +CaM +MLCK( 不活化 )

Ca -CaM

Ca –CaM ・ MLCK( 活性化 )

２＋２＋

２＋４

４

結果

略語

　　 ACh （ Acetylcholine)　　 His(Histamine) DMPP (Dimethylphenylpiperazinium)　　 C ６ (Hexamethonium)　　 Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

① アゴニストを投与し収縮高を測定する② ３回洗浄、５分後１回洗浄、さらに５分待つ③ アンタゴニストを投与④ １分後アゴニストを投与し収縮高を測定する⑤ ３回洗浄、５分後１回洗浄、さらに５分待つ

方法

アゴニストAC ｈ　２ × １０－４ M 、０．２ｍｌHistamine 　 ２ × １０－４ M 、０．２ｍｌDimethylphenylpiperazinium 　２ × １０－３ M 、０．２ｍ

ｌ　

→Tyrode 液４０ｍｌの入った腸管懸垂槽に投与　　　　　アゴニスト 　　　最終濃度（ M)

AC ｈ １ × １０－６Histamine １ × １０－６

Dimethylphenylpiperazinium １ × １０－５

アンタゴニストHexamethonium 　２ × １０－３ M 、０．６ｍｌAtropine 　 ２ × １０－４ M 、０．２ｍｌDiphenhydramine 　 ２ × １０－４ M 、０．２ｍｌ

　 →Tyrode 液４０ｍｌの入った腸管懸垂槽に投与

アンタゴニスト 最終濃度（ M)Hexamethonium ３ × １０－５

Atropine １ × １０－６Diphenhydramine １ × １０－６

シンプルな腸管収縮モデル

AC ｈAC ｈ

His

ニコチン性受容体 ムスカリン性受容体

ヒスタミン受容体

His （ Histamine)

シンプルな腸管収縮阻害モデル

AC ｈAC ｈ

His

C6 Atr

DPH

His(Histamine)C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

解析

収縮率：平均値 ± 標準偏差t検定 ( 両側 ) による control に対する有意差検定

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

AC ｈによる腸管収縮と阻害

AC ｈ

ACh

Atr

DPHACh

C6

C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

Group ACh C6 Atr DPH1 100 114 0 992 100 97 0 593 100 104 0 844 100 101 0 925 100 114 4.7 54.76 100 123 0 1397 100 110.2 0 70.38 100 108.1 0 112.19 100 95.2 0 61.9

10 100 69.5 0 57.911 100 104 0 6212 100 114.8 0 33.313 100 61.1 0 31.614 100 98 0 74.515 100 101.2 0 82.116 100 104.1 0 94.6

平均 100 101.2 0.29375 75.5

標準偏差 15.95285 1.175 28.04149

T 検定 0.767631 1.464×10-30 0.003258

ACh の収縮率（％）

0

20

40

60

80

100

120

ACh　 　 　 　 　 　+C6　 　 　 　 　 　+Atr　　 　 　 　 　 +DPH

()

収縮

率％

ACh による腸管収縮と阻害

＊＊＊

＊＊

C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

Histamine による腸管収縮と阻害His

DPH

His （ Histamine)DPH (Diphenhydramine)

Group His C6 Atr DPH1 100 111 109 372 100 100 138 03 100 120 135 704 100 108 100 05 100 87.3 107.8 55.96 100 115.3 116.7 52.787 100 100 100 15.48 100 108.2 109.7 569 100 136 140 14.7

10 100 168 134 2211 100 101 104 30.312 100 118.2 118.2 3913 100 16 8 014 100 116.2 121 015 100 174 196 4016 100 95.8 94.8 21.9

平均 100 110.9375 114.5125 28.43625

標準偏差 34.8309 37.4747 22.85251755

T 検定 0.228303 0.142208 2.39931×10-9

Histamine の収縮率（％）

020406080

100120140

His　 　 　 　 　 　+C6　 　 　 　 　 　+Atr　　 　 　 　 　 +DPH

()

収縮

率％

＊＊＊

Histamine による腸管収縮と阻害

C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperaziniumによる腸管収縮と阻害

DMPP

AC ｈ

C6 Atr

DPH

DMPP(Dimethylphenylpiperazinium ）C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperazinium の収縮率（％）Group C6 Atr DPH

1 0 60 59

2 36 0 0

3 11 65 65

4 26 53 61

5 62.5 3.8 2.5

6 71.4 15.2 16.2

7 55.1 0 0

8 87 4.4 45

9 32.3 29 9.7

10 22.4 3 16.4

11 2.3 23.3 30.2

12 1.8 14.3 85.7

13 50 66.7 95.2

14 62.5 82.1 103.6

15 43.3 11.1 17.1

16 50 22.7 20

平均 38.35 28.35 39.1625

標準偏差 26.46429 27.64593 34.91844　　　　　　　　 T 検定　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.25484×10-7 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.10436×10-8 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 4.50699×10-6

Dimethylphenylpiperazinium による腸管収縮と阻害

0

20

40

60

80

100

120

DMPP　 　 　 　 　 　+C6　 　 　 　 　 　+Atr　　 　 　 　 　　 +DPH

()

収縮

率％

＊＊＊＊＊＊ ＊＊＊

DMPP （ Dimethylphenylpiperazinium ）C ６ (Hexamethonium)Atr(Atropine)DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperaziniumの個々の結果

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH収

縮率

（％）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

0

20

40

60

80

100

120

DMPP C6 Atr DPH

収縮

率（％

）

結果のまとめ

ACh の実験結果

• ACh に対する阻害作用の強さは　 Atropine ＞ Diphenhydramine

であった。

• Hexamethonium には AC ｈに対して阻害作用がみられなかった。

Histamine の実験結果• Hexamethonium 、 Atropine

には Histamine に対して阻害作用がみられなかった。

• Diphenhydramine は Histamineに対して阻害作用がみられた。

Dimethylphenylpiperaziniumの実験結果

• Hexamethonium 、 Atropine 、 Diphenhydramine すべてにおいて Dimethylphenylpiperazinium に対して阻害作用がみられた。しかし、その強弱までは今回の結果からは推測できなかった。

理論では予想しにくい結果がみうけられた

考察＜ DMPP について＞

DMPP を大量または長時間投与

脱分極性遮断を起こし他の遮断薬に対しても不応状態となる刺激作用　　　　 抑制作用

初期刺激の後、速やかな伝達遮断がおこる

（接合部後膜の電気的回復が阻害されるため）

　★ DMPP を洗浄するまでの時間が班によって異なっていた 学生実習では班によって作用時間が異なってしまったことにより、阻害作用に差異がみられたと考えられる

ジメチルフェニルピペラジニウム (DMPP) の作用の違い★作用部位の違いによると考えられる

アセチルコリンやヒスタミンが直接、受容体に作用するのに対して、DMPP は間接的に作用するためと考えられる

使用した腸管が最後まで正常に機能していたかを確認して補足：　腸管の反応自体に差異がみられたのではないか

いた班と確認しなかった班があるため全ての班で腸管の機能が正常かどうかを確認するべきであった