基础化学实验 IV（仪器分析实验）

高效液相色谱法测定葛根素注射液中葛根素含量

实验技能训练要点

高效液相色谱仪的使用（第一次训练）

进样阀的使用（第一次训练）

内标法定量过程和计算方法（第一次训练）

一、实验目的

二、高效液相色谱法简介

三、实验原理

四、实验步骤

五、结果处理

六、思考题

七、实验延伸

掌握高效液相色谱法的基本原理熟悉高效液相色谱仪各主要部件及其作用熟悉高效液相色谱仪的使用方法掌握进样阀的工作原理和进样操作掌握内标法

一、实验目的

色谱法起源

加入石油醚分层•胡萝卜素•叶黄素•叶绿素A 、 B

Chromatography

原理：基于物质在不同相之间具有不同的分配系数引起的分离

二、高效液相色谱法简介

刘志广 分析化学及实验http://course.jingpinke.com

色谱法分类

按流动相的物理状态分类： 气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱。

按固定相的形状分类： 柱色谱、纸色谱和薄层色谱。

按分离过程的物理化学现象分类： 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱 和排阻色谱。

按固定相和流动相的极性分类： 正相色谱、反相色谱

反相 HPLC

极性 : 固定相 < 流动相 固定相 - 极性弱 流动相 ( 甲醇 , 乙腈等 )- 极性强 极性小物质后出峰

正相 HPLC 极性 : 固定相 > 流动相 固定相 - 极性强 流动相 ( 己烷 , 庚烷 )- 极性弱 极性大物质后出峰正相色谱

20%反相色谱80%

正相色谱 20%

反相色谱80%

高效液相色谱（ HPLC ） 高压：对载液加高压，压力可在 30 ～ 60MPa 。 高效：分离效能高，理论塔板数在 2×103 ～ 5×104 。 高灵敏度：紫外检测器可达 0.01ng ，进样量在 uL 数量级。 应用范围广： 70% 以上的有机化合物可用 HPLC 分析， 特别是对高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析。 分析速度快：通常在 15 ～ 30min ，一般小于 1h 。

高效液相色谱（ HPLC ）

项 目 高效液相色谱法 经典液相色谱法色谱柱：柱长 /cm 柱内

径 /mm

10～ 252 ～ 10

10～ 20010～ 50

固定相粒径 /μm 5 ～ 50 75～ 600

色谱柱柱效（理论塔板数） 2×103 ～ 5×104 2 ～ 50

柱压降 /MPa 5 ～ 15 0.001～ 0.3

进样量 /g 10-6 ～ 10-2 0.1～ 10

分析时间 /h 0.05～ 1.0 1 ～ 20

表 1 高效液相色谱法与经典液相色谱法比较

项 目 高效液相色谱法 气相色谱法进样方式 样品制成溶液 样品需气化或裂解流动相 溶液 惰性气体分离原理 吸附、分配、筛析、亲和等 吸附和分配

检测器 UVD、 PDAD、 RID等 TCD、 FID、 ECD等

应用范围低、中、高沸点有机化合物

离子型无机化合物热不稳定化合物生物活性分子

低沸点有机化合物永久性气体

表 2 高效液相色谱法与气相色谱法比较

HPLC 系统

溶剂传输系统

样品引入系统

样品分离系统

信号检测系统

数据处理系统

进样器

软 件

高压泵

色谱柱

检测器

刘志广 分析化学及实验http://course.jingpinke.com

泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀

耐压 30 ～ 60MPa，能连续工作

输出流量稳定，重复性佳

输出流量范围宽，对填充柱： 0.1 ～ 100mL／ min

有恒流泵和恒压泵　

高压泵

手动进样器 - 六通阀 / 定量环

Load Inject

六通阀工作原理（流路切换）

色谱柱

柱温箱

外挂架

检测器

电学检测器：

电导、安培

光学检测器：

紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射

紫外检测器： 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高；线形范围高； 流通池可做的很小（ 1mm × 10mm ，容积 8μL ）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。

色谱工作站

物质的量与峰高（峰面积）成正比

药 物 方 面

生 化 方 面

环 保 方 面 药品预处理：片剂、油膏、水剂等 体液：血、尿、脊椎液、唾液等 抗菌素：青霉素 、甾族 ( 激素 )

蛋白质分析 肽类分析 氨基酸分析 核酸分析

农药残留分析：含氯、含磷农药等 致癌物质：霉素、亚硝胺、苯并芘等 水质分析：内分泌污染物等

高效液相色谱法的应用

内标法

1.在样品中加入一定量、色谱柱可分离、试样中其它组分峰不干扰的标准物质。

2.测定该内标物和待测组分的峰面积或峰高，即可求出待测组分在样品中的百分含量。

原 因

需要测定试样中的某几个组分，或试样中所有组分不可能全出峰时，采用内标法。

方 法

葛根素具有较强的非极性，用反相液相色谱法分析

葛根素在 250 nm 具有最大吸收峰，采用紫外检测器检测

三、实验原理

已知化合物 纯度高、量准确 性质类似，如同系物 充分分离

O

O

O

OH

OH

OH

OH

HO

OH

葛根素

O

OH

对羟基苯甲醛

内标物的选择

内标

内标

样品

样品

内标

内标

对照品

对照品

校正因子

A

CA

C

A

CA

C

f )(

定量校正因子计算

内标物标准溶液 待测物标准溶液 样品溶液

1. 溶液配制

内标液 准确称取 0.6250 g 对羟基苯甲醛于 500 mL 容量瓶中，

用甲醇稀释至 500 mL ，得 1.25 mg/mL 的内标溶液。 葛根素标准溶液 准确称取 25 mg 葛根素纯品（ 99% ）于 50 mL 容量瓶

中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。

四、实验步骤

准确移取上述标准溶液 1.00 mL 于 10 mL 容量瓶中，加

1.00 mL 内标液，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即为 0.05 mg/mL

的标准溶液。 样品溶液 取 2.00 mL 葛根素注射液于 500 mL 容量瓶中，用甲醇稀

释至刻度，摇匀 准确吸取上述溶液 2.00 mL 及 1.00 mL 内标液于 10 mL

容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

2. 色谱条件和测定方法

色谱条件

色谱柱： VP-ODS(1504.6mm) 流动相：甲醇 /0.1%柠檬酸 =40/60（体积比） 流量： 1.00 mL/min

检测波长： 250 nm

进样量： 10μL 依次测定对羟基苯甲醛内标液、葛根素标样在该色谱条件下的峰面积，记为 A 对（标） 、 A 葛（标）

测定样品溶液中对羟基苯甲醛内标液及葛根素在该色谱条件下的峰面积，记为 A 对（样） 、 A 葛（样）

注意事项

内标物必须定量加入； 检查流速、流动相组成和检测波长等参数设定是否正确； 进样前先设定好分析文件的储存位置和名称； 进样阀在 load 状态时加载样品，然后将转子选到 inject

状 态以将样品引入到分离系统中； 注意流动相的剩余量，以免吸空； 注意高压泵的压力变化情况。

确定样品中各组分的出峰顺序

推导内标法测定样品含量的计算公式

求取待测样品中葛根素的含量

五、结果处理

1. 什么是归一化法、内标法和外标法？三种方法的优缺点各是什么？

2. 绝对和相对校正因子的物理意义是什么？推导本次实验的计算公式。

3. 查阅一篇有关 HPLC 的综述文献。

六、思考题

七、实验延伸

蛋白质是重要的生物大分子，是体内生物功能的执行者。高效液相色谱法是用于制备高纯度蛋白质和多肽等生物制品的主要方法。我院耿信笃教授领导的现代分离科学研究所在蛋白质分离纯化领域具有深厚的基础，并进行与之有关的学科前沿研究。

色谱柱是液相色谱的心脏，因此高性能色谱填料的开发一直是色谱领域的主要研究内容之一。我院卫引茂教授课题组在高选择性和高容量色谱分离介质制备方面进行了一系列创新性研究工作。

参考文献

1. 彭兆斌 , 范艳冰，汤婉 . 高效液相色谱法测定颈康胶囊中葛 根 有 效 成 分 葛 根 素 的 含 量 [J]. 世 界 中 西 医 结 合 杂 志 , 2009,4(7):480-482

2. 王红团 , 吉训恋 . HPLC 测定健听颗粒中葛根素含量 [J]. 中国中药杂志 , 2008,33(15):1916-1917

3. 冯维希 , 胡虹 , 张爱丽等 . HPLC 法测定云台山葛根不同部位葛根素的含量 [J]. 西北药学杂志 , 2007,22(3):110-111