Получение рекомбинантных белков как этап создания лечебно-

профилактических препаратов

М. И. Потапович

БГУ, Минск

2011 г.

Биофармацевтический рынок (C.L. Barton, 2010)

Мировой рынок биофармацевтической продукции в 2010 г. составил около $100 млрд.

К 2015 г. – более $170 млрд. (65% - рекомбинантные белки)

В сегменте негликозилированных рекомбинантных белков первую позицию занимает интерферон ($4 млрд. к 2014 г., из них альфа-интерферон – $1,5 млрд.)

Количество биотехнологических компаний

1200

225335

400

540

Франция

Великобритания

Германия

Остальная Европа

США

Получение продуцентаПолучение продуцента Культивирование Культивирование (ферментация)(ферментация)

Отделение целевого продуктаОтделение целевого продукта

Очистка рекомбинантного Очистка рекомбинантного белкабелка

Определение специфической Определение специфической активностиактивности

Создание Создание лекарственной формылекарственной формы

Этапы создания препаратов на основе Этапы создания препаратов на основе рекомбинантных белковрекомбинантных белков

Характеристики различных типов экспрессионных систем

Характеристика Бактерии

Дрожжи Клетки насекомы

х

Клетки млекопитающ

их

Образование телец включения

+/- (+)/- - -

Секреция +/- + + +

Гликозилирование - + + +

Протеолитическая деградация

+/- +/- - -

Другие посттрансляционные модификации

- + + +

A. B.

Накопление свиного (A) и куриного (B) ИФН-α в клетках E. coli BL21 (λDE3) и E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL

A.

B.

A. Структурная часть гена куриного ИФН-αB. Структурная часть гена свиного ИФН-αЦветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотные кодоны.AGG/AGA/CGA – аргинин, CTA – лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин

Посадка праймеров при замене редких кодонов в структурной части гена

свиного ИФН-α

Схема синтеза гена свиного ИФН-α при замене редких кодонов

agg → cgtaga → cgtccc → ccggga → ggc Стадия 1

(матрица – тотальная ДНК, выделенная из крови)

Стадия 2

Стадия 3

Стадия 4

A. Структурная часть гена лошадиного ИФН-αB. Структурная часть гена бычьего ИФН-γЦветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотныекодоны.AGG/AGA – аргинин, CTA – лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин

A.

B.

Codon Adaptation Index (CAI)

CAI – величина, показывающая частоту использования кодонов в данном гене относительно частоты использования кодонов в референсном наборе генов

Ген куриного ИФН-α: CAI = 0,435Ген свиного ИФН-α: CAI = 0,330Ген свиного ИФН-α с заменой редких кодонов = 0,544Ген лошадиного ИФН-α: CAI = 0,340Синтетический ген бычьего ИФН-γ: CAI = 1,0

(Расчет с использованием программы CodonW (J. Peden))

Накопление лошадиного ИФН-α (A) и бычьего ИФН-γ (B) в клетках E. coli BL21 (λDE3)

A. В.

В. С.

А.А. Тельца включения в клеткахТельца включения в клетках E.E. coli coli (S. Betts, 1998)(S. Betts, 1998)В.В. Электронная микрофотография клеток Электронная микрофотография клеток E. coli E. coli BL21BL21--CodonPlus(DE3)-CodonPlus(DE3)-RIPL-pIP2403 RIPL-pIP2403 (трансмиссионный электронный микроскоп Philips CM120 (трансмиссионный электронный микроскоп Philips CM120 BioTwin), выращенных без индукции ИПТГBioTwin), выращенных без индукции ИПТГС.С. Электронная микрофотография клеток Электронная микрофотография клеток E. coli E. coli BL21BL21--CodonPlus(DE3)-CodonPlus(DE3)-RIPL-pIP2403 RIPL-pIP2403 послепосле индукции 0,5 ммоль/л ИПТГ в течение 3 часовиндукции 0,5 ммоль/л ИПТГ в течение 3 часов

А.

Бычий ИФН-α (А) после очистки из телец включения (5 стадий) и бычий ИФН-γ (B), очищенный из супернатанта после разрушения клеток (1 стадия)

A. В.

Видоспецифичность интерфероновВидоспецифичность интерферонов

Интерферон птиц ≠ Интерферон КРС

Рекомбинантные α-интерфероны

Субстанция интерферона

рекомбинантного Вирусные

заболевания Иммуномодулятор Стрессовые

состояния

Интерферон + антибиотики

(Гентаферон, Линкоферон и др.)

Смешанные инфекции

Иммуномодулятор

Интерферон + витамины

Гиповитаминозы Вирусные

заболевания Иммуномодулятор

Действие ИФН в составе препаратовДействие ИФН в составе препаратов1 - противовирусный эффект;1 - противовирусный эффект;

2 - подавление роста и развития внутриклеточных инфекционных агентов 2 - подавление роста и развития внутриклеточных инфекционных агентов

невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие);невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие);

3 - увеличение лизоцимной активности сыворотки крови;3 - увеличение лизоцимной активности сыворотки крови;

4 – увеличение бактерицидной активности сыворотки крови;4 – увеличение бактерицидной активности сыворотки крови;

5 – антитоксическое и антистрессовое действие;5 – антитоксическое и антистрессовое действие;

6 – радиопротективный эффект;6 – радиопротективный эффект;

7 – стимуляция макрофагов и усиление фагоцитоза;7 – стимуляция макрофагов и усиление фагоцитоза;

8 – усиление продукции антител;8 – усиление продукции антител;

9 – активизация естественных киллерных клеток;9 – активизация естественных киллерных клеток;

10 – усиление синтеза простагландинов;10 – усиление синтеза простагландинов;

11 – стимуляция освобождения гистамина базофилами;11 – стимуляция освобождения гистамина базофилами;

12 – усиление формирования антигенов ГКГ;12 – усиление формирования антигенов ГКГ;

13 – подавление гиперчувствительности замедленного типа; 13 – подавление гиперчувствительности замедленного типа;

И, возможно, самое главное!И, возможно, самое главное!14 – многократное усиление антибактериального действия антибиотиков, 14 – многократное усиление антибактериального действия антибиотиков, снимая при этом их иммунодепрессирующий эффект на организм животногоснимая при этом их иммунодепрессирующий эффект на организм животного

Спасибо за Спасибо за вниманиевнимание