СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ И ПРОСТРАНСТВЕННОГО КОНЦЕНТРАЦИИ И ПРОСТРАНСТВЕННОГО

РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ НА ОСНОВЕ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ГЛАЗНОМ ДНЕСОЕДИНЕНИЙ НА ГЛАЗНОМ ДНЕ

Модель Сергей СеменовичМодель Сергей Семенович

Лаборатория лазерной биоспектроскопии, Лаборатория лазерной биоспектроскопии, Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАНИнститут общей физики им. А.М. Прохорова РАН, ,

МоскваМосква, , РоссияРоссия

E-mail: biospec@nsc.gpi.ru

Web: www.nsc.gpi.ru/lbs.html, www.biospec.ru

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Лаборатория лазерной Лаборатория лазерной биоспектроскопии ИОФРАНбиоспектроскопии ИОФРАН

Направление работ:• исследование оптических свойств биологических тканей;

• разработка новых методов диагностики и терапии;

• разработка оборудования для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

ВведениеВведениеВ современной офтальмологии существует ряд заболеваний, лечение которых

затруднительно. Одним из таких заболеваний является сенильная макулодистрофия (СМД) с неоваскуляризацией, оказывающая разрушительное действие на центральное зрение. Вероятность потери зрения при СНМ колеблется значительно и зависит от стадии заболевания, возраста, расы, пола.

В настоящее время существуют многочисленные оптические (гиперокуляры, телескопические очки, оптико-телевизионные методы увеличения изображения, комбинация очки-контактные линзы), консервативные (медикаментозная терапия), хирургические (удаление субретинальных мембран, транслокация сетчатки) и лазерные методы лечения данной тяжелой группы пациентов, что свидетельствует об отсутствии единого подхода к терапии заболевания.

Несколько лет назад единственным доступным методом лечения, который довольно спорно можно было назвать успешным, и который применялся у небольшого числа больных, была лазерная коагуляция сетчатки (ЛКС). 

В связи с недостатками лазерной коагуляции в настоящее время наиболее успешным методом воздействия на СМД с субфовеальной неоваскуляризацией, является фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ является значительно более безопасной, чем ЛКС, так как используемые уровни энергии для ФДТ значительно ниже.

Таким образом, разработка аппаратуры для проведения ФД и ФДТ является актуальным направлением в современной медицинской инженерии. В процессе создания таких систем приходится преодолевать ряд трудностей.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Взаимодействие излучения с Взаимодействие излучения с тканями глазатканями глаза

Ткани глаза человека являются многокомпонентной структурой. Поэтому необходимо учитывать характер их взаимодействия с излучением разного спектрального состава.

Даже такая прозрачная ткань, как роговица глаза человека, рассеивает свет, поэтому полное и аксиальное (коллимированное) пропускания не являются идентичными. Благодаря слабому рассеянию пики поглощения воды хорошо видны на 300, 980, 1180, 1450, 1900 и 2940 нм, они обеспечивают малое пропускание через роговицу в УФ и ИК спектральных областях.

В видимой области нормальный хрусталик менее прозрачен, чем роговица, поскольку в дополнение к рассеянию важным является поглощение различными хромофорами, включая 3-гидрокси-L-кинуренин-O-β-глюкозид и возрастной белок (ответственный за пожелтение хрусталика с возрастом человека).

Склера является малопрозрачной тканью за счет сильного рассеяния света на структурных элементах (полидисперсной системе упакованных нерегулярных коллагеновых цилиндров, внедренных в основное вещество с меньшим показателем преломления).

Для эффективной терапии и диагностики заболеваний глазного дна спектры поглощения и флуоресценции фотохимических агентов (фотосенсибилизаторов (ФС)) должны быть согласованы с соответствующими спектрами хромофоров и флуорофоров в тканях глаза.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Спектры поглощения основных хромофоров и Спектры поглощения основных хромофоров и флуорофоров, а также спектр поглощения ФС флуорофоров, а также спектр поглощения ФС «Фотосенс»«Фотосенс»

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Спектры флуоресценции основных Спектры флуоресценции основных флуорофоров, а также ФС «Фотосенс»флуорофоров, а также ФС «Фотосенс»

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Методы получения количественной Методы получения количественной информацииинформации

Для повышения оперативности в данной работе представлена следующая методика. Для получения точной количественной информации о концентрации фотосенсибилизатора в определенных точках биоткани осуществляется ряд точечных замеров конфокальным микроспектрофлуориметрическим методом. Концентрационная карта строиться посредством освещения равномерной лазерной подсветкой всего операционного поля и съемки на высокочувствительную камеру флуоресцентного отклика ткани в соответсвующем спектральном диапазоне.

Метод конфокальной микроспектрофлуориметрии позволяет получать количественную информацию о концентрации фотосенсибилизатора в малом, локализоанном объеме биоткани. Как было показано выше, точная информация о положении диагносцирующего пятна для тканей глаза очень важна вследствие ее сложного состава.

В данном проекте разработана система, позволяющая проводить оперативный контроль пространственного распределения концентрации фотосенсибилизатора «Фотосенс» на глазном дне.

Препарат «Фотосенс», разработанный ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», предназначен для проведения ФД и ФДТ, в том числе и в офтальмологии. Этот препарат выгодно отличается от других ФС тем, что диагностику и терапию можно проводить в рамках одной процедуры, что существенно сокращает время лечения. Традиционно ФД и ФДТ проводились с различными ФС. Из-за этого возникала необходимость ждать, пока выведется один фотохимический агент, прежде чем вводить другой.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Фантомные средыФантомные средыВ качестве фантомной среды для построения калибровочных кривых использовался раствор «Фотосенса» в интралипиде 1% (Fresenius Kabi Austria (Австрия)). Использованные концентрации: 10-5 г/л, 5*10-5 г/л, 10-4 г/л 5*10-4 г/л, 10-3 г/л, 5*10-3 г/л.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Структурно-функциональная Структурно-функциональная схема системысхема системы

Система анализа концентрации фотосенсибилизатора на глазном дне базируется на щелевой лампе XCEL 250 (Reichert, США) с лазерным адаптером для проведения ФД и ФДТ и системой визуализации глазного дна. Структурно-функциональная схема комплекса представлена ниже.

Для получения количественной информации о концентрации ФС в системе визуализации выделен дополнительный измерительный канал (прерывистые линии).

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

ОборудованиеОборудованиеСПЕКТРОМЕТР

Излучение флуоресценции подается на спектрометр ЛЭСА-2 (ЗАО «БИОСПЕК»). С помощью программного обеспечения данного спектрометра вычисляется интегральная мощность в диапазоне флуоресценции в относительных единицах. Для того, чтобы данные измерения были корректны, необходимо построить калибровочные кривые в тех же относительных единицах. Таким образом, калибровочные кривые строятся с использованием комплекса операционно-диагностического оборудования, только ткани глаза заменены фантомными средами.

ВИДЕОАНАЛИЗАТОР

Для анализа спектрально-разрешенных видеоизображений использовалась монохромная камера Видеоскан 415-USB (НПО «Видеоскан»), позволяющая программно задавать время экспозиции и усиление сигнала. Перед камерой был установлен интерференционный фильтр, подавляющий возбуждающее лазерное излучение, а также широкополосное излучение щелевой лампы, пропускающий флуоресцентное излучение в красной и ближней инфракрасной области оптического спектра.

Для сопоставления видеосигнала и результатов спектроскопических измерений видеокадры, содержащие изображение фантомных сред с различной концентрацией исследуемого фотосенсибилизатора, сохранялись в формате DAT.

Для определения оптимальных характеристик приема осуществлялся анализ видеокадров, полученных при различных временах экспозиции и значении усиления.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Алгоритм расчета глубины Алгоритм расчета глубины проникновенияпроникновения

Глубина проникновения света в ткань может быть рассчитана с помощью следующего выражения:

,

где μa - суммарный коэффициент поглощения, μs`- транспортный коэффициент среды. Для сетчатки он равен 230 см-1.

Коэффициент поглощения «Фотосесна» варьирует в зависимости от его концентрации от 0,24 см-1 до 120 см-1. Зная диапазон изменения концентраций фантомных сред (от 10-5 г/дм3 до 5∙10-3 г/дм3) вычислим коэффициент пропорциональности:

.

Вводим зависимость от концентрации ФС, теперь формула для расчета глубины проникновения излучения в ткань глазного дна выглядит так:

,

Где χaft=24*103 см-1*дм3/г, μs` =230 см-1.

`)(3

1

saa

13

31024 смг

дм

Ca

aft

`)(3

1)(

saftaft ССС

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Калибровочные кривыеКалибровочные кривые

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

РезультатыРезультатыДля построения калибровочных кривых производились замеры мощности

флуоресценции для различных концентраций «Фотосенса» в фантомной среде.

Калибровочная кривая, полученная методом микроспектрофлуориметрии, позволяет определять концентрацию фотосенсибилизатора «Фотосенс» в диапазоне от 10-

5 г/л до 5*10-3 г/л. Для повышения точности калибровочной кривой необходимо провести более подробные измерения. Точность определения концентрации данным методом составляет 10-5 г/л.

При анализе спектрально-разрешенных видеокадров происходит съемка всего операционного поля. С каждого пикселя матрицы снимается информация о мощности флуоресценции от малого объема биоткани. Чувствительность и точность этого метода ниже, чем у метода микроспектрофолуометрии, так как на каждый пиксель попадает часть излучения от других областей биоткани, а также из ее глубины. Точность определения концентрации ФС этим методом примерно на порядок ниже, чем методом микроспектрофлуориметрии и составляет 10-4 г/л.

Оптимально использовать метод анализа спектрально-разрешенных видеокадров для получения общей картины распределения фотосенсибилизатора на глазном дне, а с помощью метода микроспектрофлуориметрии производить уточненные измерения на границах локализации новообразований.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

ЗаключениеЗаключение

Разработана система анализа пространственного распределения концентрации фотосенсибилизатора «Фотосенс» на глазном дне, которая позволяет контролировать процесс накопления ФС в пораженных и здоровых тканях. Комбинация микроспектрофлуориметрического метода, реализованного в одном из приемных каналов системы, с анализом спектрально-разрешенных видеокадров, реализованным в другом канале, обеспечивает возможность прецизионного определения границ пораженной области и исследования взаимодействия ФС с биотканью на молекулярном уровне. Для обоих методов построены калибровочные кривые на основании экспериментов с фантомными средами. Зная концентрацию ФС в каждой конкретной точке операционного поля, можно определить глубину проникновения излучения в биоткань по предложенному алгоритму. Система проста в эксплуатации и может быть использована в повседневной врачебной практике для ускорения диагностики и повышения безопасности лечения.

ww

w.n

sc

.gp

i.ru

/lb

s.h

tml

Работы выполнены в рамках гранта РФФИ «Исследование взаимодействия лазерного и широкополосного излучения с тканями глазного дна в условиях гипоксии»

Оборудование выпускается на

производственной базе ЗАО «БИОСПЕК».