СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ – ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК

Институт аналитического приборостроенияРоссийской академии наук

В.Е. Курочкин

28 марта, 2013 г. Санкт-Петербург

Основные этапы молекулярно-генетических исследованийОсновные этапы молекулярно-генетических исследований

Пробоподготовка Инактивация

Выделение ДНК и РНК

Количественный анализ методом ПЦР-РВ

Определение последовательности (секвенирование) ДНК

Ручное Автоматизированное

Полимеразная цепная реакция в реальном Полимеразная цепная реакция в реальном времени – ПЦР-РВвремени – ПЦР-РВ

Приборы для ПЦР-РВПриборы для ПЦР-РВ

Основные характеристики:

• Принцип и скорости нагрева/охлаждения

• Формат термоблока

• Число каналов измерения флуоресценции

• Источник излучения

• Детектор

• Нагрев крышки термоблока

• Алгоритмы обработки данных

• Программное обеспечение

Приборы для ПЦР-РВПриборы для ПЦР-РВ

Принцип и скорости нагрева/

охлаждения

Формат

термоблока

Число

каналов измерения

флуоресценции

Источник

излучения

Детектор Нагрев

крышки термоблока

Габариты

ШхГхВ, мм

вес

Элементы

Пелтье

3°С / сек

2,5°С / сек

32 пробирки по 0,2 мл

2 светодиод ПЗС-

матрица

Есть 350х350х220

11 кг

Элементы

Пелтье

3,3°С / сек

2,1°С / сек

96 пробирок по 0,2 мл

(опционально

384-луночный планшет)

4

(5-й канал опционально)

светодиод ПЗС-

матрица

Есть 2I0х540х540

27 кг

Элементы

Пелтье

5°С / сек

2,5°С / сек (для 48 блока)

3,5°С / сек

2°С / сек (для 192 блока)

48 (8х6)

пробирок по

0,2 мл

192 (16х12)

пробирок

4 — 5

470-750 нм

светодиод ПЗС-

матрица

Есть

105°С

210х480х210

17 кг

Разработки ООО «ДНК-Технология», Россия

Принцип

и скорости нагрева/

охлаждения

Формат

термоблока

Число

Каналов измерения

флуоресценции

Источник

излученияДетектор

Нагрев

крышки термоблока

Габариты

ШхГхВ, мм

вес

Элементы

Пелтье

3°С / сек

2,5°С / сек

16 или 32

пробирки по

0,2 мл

4-5Галогеновая

лампаФЭУ

9 порядков

Регулируемый нагрев от

95 до 110°С

340х400х420

26 кг

Элементы

Пелтье

5°С / сек

3,5°С / сек

48

пробирок по

0,2 мл

8Галогеновая

лампаФЭУ

9 порядков

Регулируемый нагрев от

95 до 110°С

340х400х420

26 кг

Воздушное

З,5°С / сек

З,5°С / сек

4 пробирки

по 0,2 мл4 4 светодиода

ФЭУ

9 порядков

Регулируемый нагрев от 95 до

110°С

З20х259х220

5,5 кг

Разработки ИАП РАН

Уникальная оптико-тепловая схемаУникальная оптико-тепловая схема

№Возбуждени

еЭмиссия Красители

Ширина пропускания

1 480 520FAM, Eva Green,

SyberGreen+/- 30

2 490 530FAM, Eva Green,

SyberGreen+/- 15

3 530 550R6G, HEX, JOE,

VIC+/- 15

4 550 580 TAMRA, Cy3 +/- 15

5 580 610 ROX, Tex-Red +/- 15

6 630 650 Cy5 +/- 15

7 670 700 Cy5.5 +/- 15

Элемент ПелтьеЭлемент Пелтье ФЭУФЭУОптическое световолокноОптическое световолокно

Основные области приложения наших Основные области приложения наших разработокразработок

• Диагностика возбудителя туберкулезаДиагностика возбудителя туберкулеза

• Диагностика возбудителей особо-опасных инфекцийДиагностика возбудителей особо-опасных инфекций

• Судебно-медицинская генетикаСудебно-медицинская генетика

• Диагностика однонуклеотидных полиморфизмовДиагностика однонуклеотидных полиморфизмов

• Диагностика возбудителей заболеваний растений и животныхДиагностика возбудителей заболеваний растений и животных

• Научно-исследовательские работы в биологии, медицине, сельском Научно-исследовательские работы в биологии, медицине, сельском

хозяйстве и др.хозяйстве и др.

Образец

• Мокрота

• Культура клеток

• Осадок

• Биологические

жидкости

Пробоподготовка, инактивация Выделение ДНК Анализ ПЦР-РВ Протокол

• Ручное

• Автоматическое

• выявление ДНК МБТ

• дифференциация

• количественный

анализ

• устойчивость МБТ

Диагностика возбудителя туберкулезаДиагностика возбудителя туберкулеза

Время исследования – 1 деньВремя исследования – 1 день

Первый этап – количественная оценка содержания ДНК Первый этап – количественная оценка содержания ДНК МБТ в образцеМБТ в образце

Автоматический анализ по шаблонуАвтоматический анализ по шаблону

Второй этап – определение множественной лекарственной Второй этап – определение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)устойчивости (МЛУ)

Автоматический анализ МЛУ по шаблонуАвтоматический анализ МЛУ по шаблону

Для образца Для образца 751751 необходимо проведение исследования на устойчивость МБТ к необходимо проведение исследования на устойчивость МБТ к

антибиотикам 2-ого ряда (широкую лекарственную устойчивость)антибиотикам 2-ого ряда (широкую лекарственную устойчивость)

География лабораторий для диагностики География лабораторий для диагностики туберкулеза методом ПЦР-РВтуберкулеза методом ПЦР-РВ

Регионы РФ, оснащенные лабораториями ИАП РАН и ООО «Синтол», отмечены зеленым цветом.

Вариант ПЦР-РВ лаборатории в мобильном Вариант ПЦР-РВ лаборатории в мобильном исполненииисполнении

Диагностика возбудителей карантинных и особо опасных заболеванийДиагностика возбудителей карантинных и особо опасных заболеваний

Секвенирование ДНК в приборе Секвенирование ДНК в приборе капиллярного электрофорезакапиллярного электрофореза

Приборы для секвенирования ДНК на Приборы для секвенирования ДНК на основе капиллярного электрофорезаоснове капиллярного электрофореза

Идентификация личности по следам ДНКИдентификация личности по следам ДНК

Сравнение результатов, полученных наприборе Нанофор-05М (ИАП РАН) и ABIPrism3500 DNA Sequencer (США)

Нанофор-05М

Динамика роста лабораторий молекулярно-Динамика роста лабораторий молекулярно-генетических исследованийгенетических исследований

Ежегодно в России появляется несколько сотен лабораторий МГИЕжегодно в России появляется несколько сотен лабораторий МГИ

рост числа лабораторий МГИ

500

2500

5000

7500

12000

0

5000

10000

15000

2001 2005 2010 2012 2015

год

кол

ич

еств

о

Целевые группы:Целевые группы:НИИ, ВУЗы, Университеты медицинского, биологическогои сельскохозяйственного профилейМедицинские центры (КДЛ)Противотуберкулезная службаОнкологические центрыЦентры кровиРоспотребнадзорРоссельхознадзорФМБАМЧСФСБМинобороныИ т.д.

Благодарю за внимание!Благодарю за внимание!