第三章 细胞生物学研究方法第三章 细胞生物学研究方法

第一节 细胞形态结构的观察方法

一、光学显微镜技术

显微镜和显微镜的分辨能力肉眼： 0.2 mm; 光镜： 0.2 um; 电镜： 0.2 nm

0.61 λ分辨率 D

N . sin α / 2=

λ: 光源波长 ; α: 物镜镜口角 ; N: 介质折射率

显微镜成像原理

普通复式光学显微镜（ light microscope ）

相差显微镜（ phase-contrast microscope ）（光程差或相位差转变为振幅差，相差板）

荧光显微镜（ fluorescence microscope ）

微分干涉显微镜（ differential-interference microscope ）（厚度差转变为明暗差；增加样品反差，立体感强）

激光共聚焦显微镜（ laser scanning confocal microscope ）

双目显微镜

正置显微镜 倒置显微镜

荧光显微镜及其照片

共聚焦显微镜及其显微图像

激光共聚焦原理

暗视野成像原理

二、电子显微镜 1 ，电镜基本知识和结构（波长小于 0.1nm ）

2 ，样品制备 （超薄切片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描）

3 ，电镜种类 扫描电子显微镜

透射电子显微镜

扫描隧道显微镜

透射电镜及其图像

扫描电镜及其图像

第二节 细胞组分的分析方法

一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物

差速离心

密度梯度离心

二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色DNA ：福尔根（ Feulgen ）反应－－紫红色

多糖类： PAS 反应－－黄色

脂肪：苏丹 III －－红色

蛋白质：米伦（ Millon ）－－红色

三、特异抗体技术免疫荧光

免疫电镜

免疫沉淀

Western blotting

四、特异核酸标记技术In situ hybridizationNorthern blot (RNA); Southern blot (DNA)

原位杂交技术

五、放射性标记技术

六、定量细胞化学技术

七、柱层析、分子筛、免疫吸附、免疫沉淀等方法分离蛋白质组分及复合物（交链和变性）

定性、定位、半定量研究（标记，自显影）32P （ 14 天） , 14C （ 5760 年） , 3H （ 12 年） , 35S （ 87 天） , 13

1I （ 8 ）

显微分光光度术

（紫外显微分光光度、可见光显微分光光度染色）

流式细胞仪

流式细胞术

第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术

一、细胞培养 1 ，植物细胞

（原代细胞培养，永生细胞系）

2 ，动物细胞

（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）

3 ，非细胞体系

（ DNA 复制， RNA 转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡 运输，细胞核装配等）

细胞提取物，细胞核提取物

植物组织培养

动物细胞培养 细胞的克隆

二、细胞工程

1 ，细胞融合与杂交 植物细胞先去壁；

融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等

同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失

2 ，单克隆抗体技术

三、显微操作技术

1975 年英国科学家 Milstein and Kohler, 1984 年获诺贝尔奖

B 淋巴细胞 + 小鼠骨髓瘤

转移细胞核、细胞器、基因等

四、转基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等

显微操作仪

显微操作示意图

单克隆抗体技术