生物化学实验（二）

绪　论 随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富，生物化学实验也在不断更新和提高。

本门课程在以往教学工作的基础上，结合生物化学实验教学，力求使学生能够更加深刻地学习生物化学课程。

本实验课实验项目覆盖了当今生物化学研究中常用的技术和方法。

绪　论一、实验目的 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；

掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；

培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。

绪　论 二、通过生物化学实验应该做到 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。

训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。

学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。

掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。

绪　论 三、实验室规则 １、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退。

２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因；贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作；发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。仪器使用完毕后，一定要填写使用记录。

绪　论 ３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放。

４、注意安全。对于有毒、腐蚀的试剂应避免其直接接触人体及衣物；乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。

５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔。实验结束后应将实验台整理好，并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗，方可离开实验室。

绪　论 四 、实验须知 １、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确学习目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。

２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，杜绝弄虚作假。

３、实验结束后，将实验原始数据填写到实验报告册中的原始数据栏，并当场交给老师批阅。回去后要认真书写实验报告，及时交老师批阅。

绪　论—五 实验记录与实验报告1 、 实验记录实验前写好实验预习报告 (钢笔和园珠笔 ) 。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。 (直接填写到实验报告册的原始数据栏）

实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“ 0.050” ，而不能记成“ 0.05” 。所有数据都应如实记录，不得随意涂改。

实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。

杜绝一切抄袭和弄虚作假现象，一旦发现后果自负。

绪　论—五 实验记录与实验报告

2 、实验报告 实验预习报告包括如下内容： ①实验项目名称；②详细实验目的、原理；③实验操作步骤； ④注意事项。

实验报告包括如下内容：①实验项目名称；②简写实验目的、原理；③实验结果； ④ 分析与讨论；⑤注意事项等。

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

一、目的

了解激活剂和抑制剂以及 pH 值对酶活

力的影响，掌握淀粉酶活性鉴定的方法。

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响 二、原理（一） 酶活力与环境 pH 值有密切关系。通常各种酶只有在一定pH 范围内才有活力。酶活力最高时的 pH 称为该酶的最适pH，低于或高于该 pH，酶的活力逐渐降低。

本实验通过磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的不同配比调制出不同的 pH，将淀粉与酶相混，淀粉被水解，遇碘不显蓝色，酶活力强，需时短，说明该环境 pH是酶比较适应的，反之，则说明环境 pH是酶不太适应的。根据试液颜色褪去时间的长短，推断出试验酶的最适 pH。

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

二、原理（二） 酶的活性受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为激活剂；而另一些物质则降低酶的活性，称为抑制剂。

Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。而为 抑制剂。将淀粉与酶相混，作用一段时间后，淀粉被水解，遇碘不显蓝色，酶活力强，需时短，酶活力弱，需时长，故可用反应时间表示酶活力的强弱。

Cu2+

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

四、实验器材 1 、 0.2mol/L 的 Na2HPO4

2 、 0.2mol/L 的 NaH2PO4

3 、 1% 淀粉液 : 称取可溶性淀粉 1g, 先用少量水加热调成糊状 , 再加热水稀释至 100ml.

4 、 1% 的氯化钠溶液 :1gNaCl 溶于 100ml 蒸馏水 5 、 1% 硫酸铜溶液 :1gCuSo4 溶于 100ml 蒸馏水 6 、稀碘液：于 2% 碘化钾溶液中加入碘至淡黄色。

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响 五、操作 取干净试管5只，表1（见书 167页）加入试液，加入酶后，迅速混匀，置37℃水浴保温，每隔1min从 3号管中去溶液2滴加到已有碘化钾-碘试剂的白磁盘中，观察颜色变化你，直至碘不显色时，再向各管加碘化钾-碘试剂 2滴，摇匀后观察。根据实验结果找出唾液淀粉酶的最适pH.

试剂 \管号 1 2 3 4 5

0.2mol/L的 Na2HPO4 0.16 0.56 1.47 2.43 2.84

0.2mol/L的 NaH2PO4 2.84 2.44 1.53 0.57 0.16

pH 5.6 6.2 6.8 7.4 8.0

1%淀粉液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混匀， 37℃水浴中保温 2min

稀释的唾液（ 1:30） /ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

五、操作 取试管 3 支，按表 2 编号并加入试剂。加毕，摇

匀，同时置 40℃ 水浴保温，每隔 2min 取液体 1滴置白瓷板上用碘液试之，哪支管液最先不呈现蓝色，哪支管次之，说明原因。

0.1% 淀粉液/ml

1% 的氯化钠溶液 /ml 

1% 硫酸铜溶液/ml

H2O/ml 1 ： 30唾 液 /ml

1 2.0 1.0 --- --- 1.0

2 2.0 ---- 1.0 -- 1.0

3 2.0 ---- ---- 1.0 1.0

管号

试剂

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

六、实验注意事项 1、实验过程中试剂取量一定要保证一致性，同时一定要认真观察实验现象，不能漏过实验颜色的变化点。

2、要正确找到反应终点，并记下相应反应时间。

3、要在预热 2min后加入唾液，并在加入唾液后马上记时。

实验一 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

六、实验注意事项 5、实验中一定要保留一份没有加入酶液的空白对照，以便于比对颜色变化

6、各管试剂加入后，一定要迅速充分混匀再进行试验检测。

实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

一、目的和要求 1. 了解并初步掌握吸附层析的原理。 2. 学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法。

3. 学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，并学会简易薄板的制作

实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

二、原理

1 、植物组织中的可溶性糖可用一定浓

度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可

获得较纯的可溶性糖混合物。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

二、原理 2、薄层层析是层析法的一种，层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理，化学差别，使各组分以不同程度分布在两个“相”中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相；

当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同，或吸附性质不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同速度前进，从而达到分离的目的。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

二、原理 3、薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法。

本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂（如硅胶粉），层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

二、原理 4 、糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶 G

薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。 硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟

基数目，造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来。

一般吸附力的大小为：三糖 > 双糖 > 己糖 > 戊糖。其中各种糖移动的速率可用 Rf 值表示。通过与标准糖的Rf 值比较。即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

  二、原理 5 、 Rf 计算公式： 溶质斑点中心到样点的距离 Rf( 值 ) = 溶剂前沿到点样点的距离

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

  三、实验材料、仪器和试剂 1   ． 材料：苹果或其他植物材料 2   ． 仪器： （ 1 ）离心机及离心管 （ 2 ）天平 （ 3）研钵 （ 4 ） 量筒 25ml （ 5 ）移液管 10ml （ 6） 恒温水浴 （ 7 ）毛细管 （ 8）  层析缸 （ 9） 吹风机 （ 10 ） 玻璃板 ： 7×15cm （ 11 ）烘箱 （ 12 ）   喷雾器 （ 13）   烧杯 50ml,100ml 铅笔、尺子

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

三、实验材料、仪器和试剂 3．试剂 （ 1 ） 无水酒精 （ 2 ）氯仿：冰醋酸：水，配比为 30 ： 35 ： 5 （ 3 ） 1％标准糖溶液（ 10mg/ml ）：木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖等。

（ 4 ）苯胺－二苯胺－磷酸显色剂： 2克二苯胺，加 2ml苯胺， 10ml 85％磷酸， 1ml 浓 HCl ， 100ml丙酮，溶后摇匀。

（ 5 ） 0.1M硼酸溶液

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

四、操作 1. 水果中可溶性糖提取液的制备 1.1 取洗净的苹果（或其他水果）削去果皮，称 8g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在四层洗净的纱布上。包起置于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。

1.2 取果汁 2ml于离心管中，加无水乙醇 6ml，充分混匀后，在 3000 转／分下离心 20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 四、操作

2.苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定 2.1 点样 取活化后的硅胶 G板一块，距底边 1.5厘米水平线上确定 4个点，相互间隔1厘米，其中 3个点，分别点上5％的木糖、葡萄糖、蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴，一般点 4次。

2.2 展层 以氯仿：冰醋酸：水展层剂上行展层，当展层前沿达距薄板顶端 1.0 厘米左右处，取出玻板用吹风机吹干。

2.3 染色 以苯胺－二苯胺－磷酸显色剂喷雾，于 85℃烘箱中 10分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，观察各点的颜色。

2.4 计算 根据斑点颜色及 Rf值即可初步鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

四、操作 3．板的制备： 3.1 玻璃板须表面平整、光滑、清洁。用洗涤液浸泡，洗净，晾干，否则吸附剂容易剥落。

3.2 取硅胶G粉2克，加 0.1M硼酸溶液 4.5ml于研钵中充分研磨成糊状时，倾倒在薄板上，然后用手轻轻倾斜玻璃板，使糊状吸附剂在整块板上分布均匀，表面平坦光滑。

3.3 将制好的薄板置于水平台上自然晾干后，用前于110℃烘箱中活化一小时使用。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

五、实验注意事项 1、薄板制备过程中，一定要保证玻璃板干净、干燥且无油渍

2、薄板制备过程中，加硼酸搅拌及研磨一定要快，要研磨均匀，一般研磨到发出如脂肪光泽时，且要有一定的流动性，立即涂匀为最好

3、铺好板后，要在水平台上自然晾干，用前于 110℃烘箱中活化一小时（时间计算从达 110℃开始），但活化时要在低温（ 60℃左右）时就将板放进烘箱，防止因骤然升温导致硅胶板脱落。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

五、实验注意事项 4、在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶 G板的方向点样，而且毛细管接触 G板的时间应尽量短，点样斑点直径一般不宜超过 3mm。

5、在确定点样位置时，只需在板上轻轻一点，决不能点得过深，且不能用油笔或钢笔点。样点位置一定要高于展层剂层面。

6、点样时，要等前一次的样点干燥后，再点下一次，一般每个样点点 4 次。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

五、实验注意事项 7、在进行展层前，要先在层析缸中加入一些层析剂，使整个缸内充满层析剂，以使样品能在一个稳定的环境中进行展层。

8、在展层好后，立即用尺量出溶剂前沿距离，不要等到吹干后再量。

9、在用吹风机吹干时要注意用小风吹，或者将吹风机离板较远点吹。

实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定

五、实验注意事项

10、染色完成后，放置于烘箱 85℃烘时，若烘了10min后有些点还是不显色，可以在记录已显色点的颜色和距离后，继续烘，直至显色为止。

11、为了使实验现象明显，提取糖时，宜使糖的浓度高一些。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

一、目的

通过实验要求学会装柱、洗脱、收集等离

子交换层析技术

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 二、原理 树脂（惰性支持物）结合了阳离子或阴离子后，可与阳离子或阴离子结合。改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。

由于不同的氨基酸在不同的 pH 值及离子强度溶液中所带的电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同 ,对阳离子树脂而言，氨基酸的 pI值越高，对阳离子交换树脂的亲和力越强， 洗脱速度越慢。从而可以在洗脱过程中按先后顺序洗出，达到分离的目的。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

三、实验器材

1 、层析柱（带加压装置）

2 、刻度试管（试管架） 10ml 以上 15 支

3 、烧杯 250ml 1 支

4 、吸管 1.0ml 和 5.0ml

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

四、实验试剂 1 、 732型阳离子树脂 2 、柠檬酸缓冲液（ 0.45mol/L ， pH5.3 ） 3 、显色剂（ 0.5%茚三酮） 4 、 0.1CuSO4 溶液 5 、氨基酸样品： 0.005mol/L 的 Asp 和 Ly

s （用 0.02mol/LHCl配制）

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

五、操作 1 、树脂预处理 干树脂经蒸馏水膨胀，倾去小颗粒，然后用 4 倍体积的 2mol/L的 HCl及 2mol/L的 NaOH依次浸洗，每次浸 2h，并分别用蒸馏水洗至中性。在用 1mol/L的 NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

五、操作 2、装柱（湿装法） 垂直装好层析柱，关闭出口，在柱子底部加一棉花团，加入柠檬酸缓冲液约 1cm高。将处理好的树脂加等体积缓冲液，搅匀，沿管内壁缓慢加入，柱底沉积约 1cm高时，缓慢打开出口，继续加入树脂，直至 8cm高 ( 小柱可装至 12cm)。

装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 五、操作 3、平衡 将 3倍柱床体积（约 50ml ）的缓冲液按 1ml/min的速度进行平衡，直至树脂表面约 1.5mm高液面时，关闭旋纽。

4、上样（加样） 沿管壁接近液面处加入 0.5ml样品，慢慢打开出口，使液面降至与树脂表面相平时关闭旋纽。吸少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至 4cm高。

5、洗脱（接上步骤打开旋纽） 以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速， 0.5ml/min，用试管架上的试管依次接收，每管接收 5ml，接15管。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸

五、操作 6 、测定 分别取各管洗脱液 1ml，各加入显色剂 1ml，混合后沸水浴 5min，冷却，各加 0.1%CuSO4溶液 3ml，混匀，测 A570nm。以 A值为纵坐标洗脱液累计体积（ 5ml为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线。

实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 六、实验注意事项 1、树脂预处理要严格操作，特别是转型一定要充分。

2、装柱前在柱子底部加一棉花球。 3、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻敲柱子，使基质缓缓下沉 。

4、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面。

5、要注意及时开启和关闭旋纽。 6、要注意控制流速，不宜过快。 7、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗脱液。 8、测定 A值时，一定要用空比色杯调吸光度零点。

实验四 维生素 C 的定量测定

一、实验目的：

掌握 Vc 提取和定量方法

学会计算 Vc 的含量

二、实验原理： (1)维生素C是人类营养中最重要的维生素

之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。维生素C具有很强的还原性。

(2)在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将染料 2， 6—二氯酚靛酚还原成无色的还原型 2， 6—二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。

氧化型的2，6—

二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。

因此，当用 2 ， 6— 二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的 2 ， 6— 二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦被氧化完时，则滴下的 2 ， 6

— 二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。 所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液

中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定标淮溶液时 2 ， 6— 二氯酚靛酚的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。

实验原理如下图：

该法简便易行，但有下列缺点： 在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在。它们同样地具有维生素 C 的生理作用，但不能将 2 ， 6— 二氯酚靛酚还原脱色。

生物组织提取物和生物体液中常合有其他还原性物质，其中有些也可在同样实验条件下使 2 ， 6— 二氯酚靛酚还原脱色。

在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。

三、实验器材

1 、猕猴桃 100g

2 、吸管 1.0ml 、 10.0ml

3 、容量瓶 1000ml

4 、电子分析天平5 、研钵6 、漏斗

四、实验试剂

2%草酸溶液：草酸 2g 溶于 100ml 蒸馏水中 1%草酸溶液：溶 1g草酸于 100ml 蒸馏水中 标准抗坏血酸溶液（ 0.1mg／ml ） : 准确称取 50.

0mg 纯抗坏血酸 , 溶于 1%草酸溶液 , 并稀释至 50

0ml.贮于棕色瓶中 ,冷藏 , 最好临用时配置 .

0.1% 2 ， 6— 二氯酚靛酚溶液：溶 500mg 2 ， 6

— 二氯酚靛酚于 300ml含有 104mlNaHCO3 的热水中，冷却后加水稀释至 500ml ，滤去不溶物贮棕色瓶内，冷藏。

五、实验操作：

1 、样液制备

称取 100克猕猴桃，放入研钵中，

加入适量 2%草酸研磨成匀浆，将匀浆转入 1000ml容量瓶，用草酸定容至 1000ml ，并混匀，抽滤，滤液备用。

研磨时为什么要加 2%

的草酸？

2% 的草酸抑制抗坏血酸氧化酶，防止抗坏血酸被氧化。

为 2 ， 6— 二氯酚靛酚显色提供酸性环境

2 、滴定（使用酸式还是碱式滴定管？）(1) 标准液滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液 1.0ml （含 0.1mg抗坏血酸）置 100ml锥形瓶中，加 9ml1% 的草酸，滴定管以 0.1% 的 2 ， 6— 二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持 15s 即为终点。由所用染料的体积（ V’ ）计算出 1ml染料相当于多少 mg抗坏血酸。

（ 2 ）样液滴定

准确吸取滤液两份，每份 10.0ml 分别放入两个 1

00ml锥形瓶内，滴定方法同前。

六、计算m= （ VT ） /m0×100

m ： 100g 样品中含抗坏血酸的质量（ mg ）

V ：滴定时所用去染料体积数（ ml ）

T ：每毫升染料能氧化抗坏血酸质量数（ mg／ml ）

m0 ： 10ml 样液相当于含样品之质量（ g ）

七、实验：注意事项 1 、过滤提取滤液时，若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。

2 、标准抗坏血酸溶液应贮于棕色瓶中冷藏，最好临用时配制

3 、滴定过程一般不超过两分钟，但滴定时要逐滴加入 4 、样品中某些杂质亦能还原 2 ， 6- 二氯酚靛酚，但

速度较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在 15s内为准

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 学习并掌握电泳的基本原理和操作，通过 DNA琼脂糖凝

胶电泳了解 DNA的纯度、含量和相对分子质量。

附： DNA琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳应用区分 :

聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等 , 应用较广。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是重组 DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化 DNA 片段。

不同大小、不同形状和不同构象的 DNA分子在相同的电泳条件下 (如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等 )，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。

DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中有电荷效应和分子筛效应，前者由分子所带电荷量决定，后者与分子大小和构象有关，当溶液 pH﹥PI时，分子带负电荷，在电场中向正级移动。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 在一定电场强度下， DNA的移动速率与其分子量的对数成反比，另外还有 V 闭环﹥ V线性﹥ V 开环。

凝胶中的 DNA可与荧光染料溴化乙锭 (EB)结合，在凝胶成像系统中进行观察，籍此可分析实验结果。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 三、 仪器与器材 1. 水平电泳仪 2. 水平式核酸电泳槽 3. 凝胶成像系统 4 、移液枪 5 、一次性手套 6、微波炉 7 、紫外检测仪

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 四、试剂与材料： 1. 琼脂糖 2. 6×点样缓冲液： 0.2%溴酚兰（约 0.3Kb）、 50%蔗糖、

二甲苯氰（约 2Kb） 3. DNA标准品（分子量约 0.5Kb） 4. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：每升含 Tris 242g ；冰醋酸 57.1mL0.5mol/EDTA 100mL (pH8.0)；使用时稀释成 1×TAE。

5. 0.8%琼脂糖： 0.8g琼脂糖用 100mL1×TAE微波溶解。 6. 10mg/mLEB溶液：溴乙锭 1.0g 加蒸馏水 100mL配置。 实际操作是在蒸馏水中加几滴 EB溶液至溶液呈为红色即可。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 五、操作步骤： 1. 将凝胶成形模具水平放置，并用胶条封好，将选好的梳

子放好，梳子底部与模具之间留 1mm空间。 2. 每组称取 DNA电泳用琼脂糖 0.16g（可三组共用 0.48克）放入 250ml的三角烧瓶中，加入 20mL( 三组用 60mL) 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。

3. 关闭微波炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至 50℃左右 (手握烧瓶可以耐受 ) ，（不在凝胶溶液中加入溴化乙锭，采取电泳完成后统一染色），混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 五、操作步骤： 4. 室温下待凝胶完全凝固，需时约 30 分钟，揭去胶条，拔

出梳齿，将胶板放入电泳槽中。 5. 在电泳槽加入 1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面 2mm

为宜。 6. 用加样器吸取与点样缓冲液混匀的样品 3μL。加入到

点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

7. 接通电源，调节电压至 50伏，电泳 40 分钟左右后，将凝胶板取出，放置于 EB溶液中染色约 15 分钟

在凝胶成像系统中观察结果，包括 DNA样品、Marker的描出结果图，并算出各自的迁移率。

迁移率 = 点样孔到样点的距离 /点样孔到胶带末端距离

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 六 实验注意事项 1 、注意正确使用移液枪，注意取液和放液时压手柄的位置区别。注意不要吸入气体。

2 、每厘米电压不超过 5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性 DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。（若是一台电泳仪接两个电泳槽，则宜调成 8V/cm ）

3、正确将电泳仪与电泳槽连接，即： “+”接“+” ， “ -”接“ -” 。

4 、溴乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳 六 实验注意事项 5 、样品电泳是从“ -”向“+” 方向移动。 6、用移液枪吸取样品时，注意要在进入溶液前压下手柄，并在溶液中吸取好后取出 ,在推出样液时，一定要推到底且一直摁住直到枪头到液面以上。

7 、注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

8、染色前一定要在胶的正极端左下角切一小块，以备染色完成后进行定位。

实验五 DNA琼脂糖凝胶电泳

作业：

观察实验现象，描出电泳图，算出迁移率

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取

一、目的 1．掌握 DNA 分离纯化的原理和方法 2．熟悉台式离心机的使用 3. 掌握 DNA 定量技术

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 二、实验原理 1 、核蛋白抽提：（ 1 ） 细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在。这两类核蛋白（核酸与脱氧核酸蛋白）在0.14mol／ L 氯化钠溶液中的溶解度相差很大， RNA核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度， DNA 核蛋白的溶解度却相当低，而能溶于水和高浓度盐中。

（ 2 ）制成肝匀浆后，用 0.14mol／ L 氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的水解作用。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 二、实验原理 2 、 DNA 制备：（ 1 ） SDS(十二烷基硫酸钠 ) 能使DNA核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入 SDS ， DNA 即与蛋白质分离开

（ 2 ）用氯仿将蛋白质沉淀除去，而 DNA 溶解于水相，最后用冷乙醇将 DNA析出，而获得纯化的 DN

A 。 （ 3）在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白，下层有机溶剂相维持稳定。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 二、实验原理 3 、 DNA 纯度测定（不操作）： DNA 和 RNA 在波长 260nm处有很高的吸收峰值，蛋白质则在 280

nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理，我们测定纯化样品在 260nm 和 280nm处的吸光度，可以推算出样品中 DNA 的浓度，并判断其纯度。

纯净的 DNA 样品 A260/A280 的比值约为 1.8 ，样品中含有蛋白质或其它杂质，会使 A260/A280 的比值下降。 A260/A280 的比值大于 1.6 基本能达到各种后继实验的要求。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 三、实验材料 1 、仪器：玻璃匀浆器 离心机 试管 刻度吸管 UV2450紫外可见分光光度计

2 、试剂： (1)0.1mol/L 氯化钠 -0.05mol/L柠檬酸钠溶液（ pH6.8）。 (2) 氯化钠固体（ A.R）。

(3) 0.15mol／ L 氯化钠溶液 (含 0.0015 mol／ L柠檬酸钠 ) ：称取氯化钠 0.828g 和柠檬酸钠 .2H2O 0.341g ，用蒸馏水溶解并稀释至 1000m

1 。 (4) 95％乙醇溶液 (冷藏 )

(5) 5％十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液： 5g SDS溶于 100ml水中 称取 25克 SDS 溶于 500m1 45％乙醇。 (6) 氯仿 -异戊醇混合液：氯仿：异戊醇 =20 ： 1

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取

四、实验操作

1．肝匀浆制备：新鲜猪肝，用 0.9 ％ NaCl洗去血液，称取 8g 肝组织，加 16ml 0.1mol／ L NaCl-0.05 mol／ L柠檬酸钠溶液，充分研磨（冰浴），制成肝匀浆。

2 、匀浆物在 4000r/min下离心 10min,弃上相 , 得沉淀。沉淀中再加入 25ml缓冲液，在 4000r/min下离心 20min ，得沉淀。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 四、实验操作 3 、在上述沉淀中加入 40ml0.1mol/L NaCl-0.0015

mol/L柠檬酸钠缓冲液、 21ml 氯仿 - 异戊醇混合液， 4ml 5%SDS使其终浓度为 0.41% ，振摇 30m

in ，然后缓慢加固体 NaCl 3.6克，使其终浓度为 1

mol/L 。将上述混合液在 3500r/min 离心 20min ，离心后溶液分三层，上层液为水相 (含 DNA) ，中层为蛋白质沉淀，下层为有机相，吸取上层液倒于另一试管中。得上相。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取

4 、在上述上相（水相）溶液中加入等体积的 95

%冷乙醇，边加边用玻棒慢慢搅动，将缠绕在玻

棒上的凝胶状物在空气中风干，即得 DNA粗品

5. 观察 DNA颜色与状态，并在风干后称重量，

并计算粗品 DNA 得率。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 五、注意事项 1 、在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，

并尽快加入含 0.0l mol／ L柠檬酸钠的 0.14mol/

L 氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止 DN

A 的分解以提高核酸得率。 2 、各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸

的丢失，保证定量测定的准确性。 3 、在进行匀浆液摇匀时，若是盖上盖摇，则一

定要用手扣住离心管盖，同时在摇了 5min左右后，打开盖子，防止出现盖子被冲出来。

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 五、注意事项 4 、实验当中有几次弃上清液和沉淀，一定要注意：第一次、第二次离

心是弃上清液，留沉淀，而第三次离心是弃沉淀，留上清液，其中含 D

NA 。 5 、第三次离心后，获得的三相混合物一定要将上相吸取出来，放在另

一容器中（量筒或 50ml小烧杯） 6 、实验中要进行离心，一定要注意离心管的重量平衡，离心时，一定要有专人看护。

7 、此次实验所得 DNA，是下次实验的原料，一定要在低温下保存好（可放在 4摄氏度左右保存）。

8、 SDS使用前要放在 65

实验六 动物肝脏中 DNA 的提取 五、注意事项 4 、实验当中有几次弃上清液和沉淀，一定要注意：第一次、第二次离

心是弃上清液，留沉淀，而第三次离心是弃沉淀，留上清液，其中含 D

NA 。 5 、第三次离心后，获得的三相混合物一定要将上相吸取出来，放在另

一容器中（量筒或 50ml小烧杯） 6 、实验中要进行离心，一定要注意离心管的重量平衡，离心时，一定要有专人看护。

7 、此次实验所得 DNA，是下次实验的原料，一定要在低温下保存好（可放在 4摄氏度左右保存）。

8、 SDS使用前要放在 65度下预热溶解完全。

实验七 DNA 的定量测定

一、实验目的

学习和掌握二苯胺法测定 DNA含量的方法。

熟悉标准曲线制作。

实验七 DNA 的定量测定

二、原理 核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对 DNA和 RNA的颜色反应方法。本实验采用DNA的二苯胺法测 DNA的含量。在酸性溶液中， DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，是利用 DNA分子中脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w - 羟基 -γ酮基戊醛 ，该物质在 595nm有最大吸收，在 20～ 200μg/mL范围内其峰值与 DNA 含量成正比。

实验七 DNA 的定量测定 三、试剂和器材 1. 试剂 200μg/mL DNA标准溶液 二苯胺试剂 (称取二苯胺 1克，溶于 100ml冰醋酸中，再加入 10ml 过氯酸，混匀待用，得无色试剂，临用前加入 1ml1.6 乙醛溶液，储于棕色瓶中 )

2.器材 可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平

实验七 DNA 的定量测定 四、操作步骤 1. 标准曲线的制作 取 6 只试管分成 6组，按下表操作。取 1 管的平均值，以 DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

试管 0（对照） 1 2 3 4 5

标准 DNA/mL

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 /mL

2 1.6 1.2 0.8 0.4 0

二苯胺试剂 /mL

4 4 4 4 4 4

60℃恒温水浴中保温 45min ，冷却，在 595nm波长处比色

实验七 DNA 的定量测定

四、操作步骤

2 、 DNA样液的制备

取实验六中所获得的 DNA所有粗品，用蒸馏水

溶解，定容至 50ml，控制 DNA浓度在 200微

克 /ml 左右。

实验七 DNA 的定量测定 四、操作步骤 3. 样品的测定 取待测样品 1mL，加 1mL蒸馏水，再加入二苯胺溶液 4mL，摇匀， 60℃保温 1h，然后在 595nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的 DNA的 ug数，按下式计算待测样品的 DNA的含量。

DNA%＝待测样品中测得的 DNA的 μg数 X100 % 待测样品液中样品的 μg数

实验七 DNA 的定量测定

五、注意事项

1、标准曲线可以在实验六的实验间隙中完成。

2、做标准曲线时，一定要精确，减少误差出现。

3、要注意标准曲线与实际计算中单位的统一。

4、溶解样品 DNA时，一定要尽量完全溶解，使含量准确。