第四章 第四章

药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证

概述概述

含金属与卤素药物须处理后进行测定。处理方法视含金属与卤素药物须处理后进行测定。处理方法视结合牢固程度而异。卤素与芳环相连牢固；与脂肪结合牢固程度而异。卤素与芳环相连牢固；与脂肪族碳相连，结合不牢固。含金属药物：金属不直接族碳相连，结合不牢固。含金属药物：金属不直接与碳相连为含金属的有机药物，不牢固，一般直接与碳相连为含金属的有机药物，不牢固，一般直接测定；金属与碳相连为有机金属药物，须适当处理。测定；金属与碳相连为有机金属药物，须适当处理。

第一节 定量分析样品前处理方法第一节 定量分析样品前处理方法

不经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法

含卤素有机药物的分析

含卤素有机药物系指药物分子结构中

所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐

结构特点： C—X

卤原子的活泼性

1. 卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系

乙烯型卤和芳卤 不活泼

CH2 CH X X

烯丙型卤和苄卤 活泼

CH2XCH2 CH CH2 X

（ 3 ）卤代烷型 介于两者之间

CH2 CH (CH2)n X n¡Ý2

分子中所含卤原子的个数

分子中所含卤原子的个数越多，

活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显

含卤素有机药物的分析

XXC 适当的处理

直接回流后测定法

碱性或酸性还原后测定法

氧瓶燃烧分解后测定法

共性：共性：卤素原子与碳相连结合的位置不同，卤素原子与碳相连结合的位置不同，结合的牢固程度不同，故在样品预处理时根据结合的牢固程度不同，故在样品预处理时根据卤素与药物结合状态的不同，采取不同的样品卤素与药物结合状态的不同，采取不同的样品处理方法将有机结合的卤素转变为无机的卤离处理方法将有机结合的卤素转变为无机的卤离子，再选用适宜的分析方法。子，再选用适宜的分析方法。

一、不经有机破坏的分析方法一、不经有机破坏的分析方法

直接测定法直接测定法 -- 键结合不牢固的有机金属药物，如键结合不牢固的有机金属药物，如富马酸亚铁中铁的测定。富马酸亚铁中铁的测定。

水解后测定法水解后测定法 -- 有机卤素药物中卤素与有机卤素药物中卤素与 CC 结合不结合不牢固药物。本类药物的分析特点是通过测定含卤牢固药物。本类药物的分析特点是通过测定含卤素的量来计算药物的含量 。素的量来计算药物的含量 。

11 、直接测定法、直接测定法

金属元素不直接与碳原子相连的含金属有机药物或金属元素不直接与碳原子相连的含金属有机药物或C-MC-M 键结合不牢的有机金属药物，在水溶液中可键结合不牢的有机金属药物，在水溶液中可电离，不须破坏直接采用适当的方法测定电离，不须破坏直接采用适当的方法测定

如葡萄糖酸钙中的钙离子如葡萄糖酸钙中的钙离子 -EDTA-EDTA 络合滴定络合滴定

22 、经水解后测定法、经水解后测定法

方法原理（卤素）：将含卤素的有机药物溶于适方法原理（卤素）：将含卤素的有机药物溶于适当溶剂中，加氢氧化钠或硝酸银溶液加热回流使当溶剂中，加氢氧化钠或硝酸银溶液加热回流使其水解，将有机结合的卤素，经水解作用转变为其水解，将有机结合的卤素，经水解作用转变为无机卤素离子，然后采用间接银量法测定。如三无机卤素离子，然后采用间接银量法测定。如三氯叔丁醇的测定。氯叔丁醇的测定。

间接银量法：定量加入过量的间接银量法：定量加入过量的 AgNOAgNO33 ，以硫氰，以硫氰酸铵为滴定剂，以硫酸铁铵为指示剂滴定过量的酸铵为滴定剂，以硫酸铁铵为指示剂滴定过量的硝酸银。硝酸银。

CCl3C(CH3)2OH + 4NaOH

△

回流(CH3)2CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O

NaCl + AgNO3 AgCl↓ + NaNO3

AgNO3 + NH4SCN AgSCN ↓ + NH4NO3

（淡棕红色）

(Ksp=1.56×10–10 )

(Ksp=1.0×1012 )

Fe3+ + SCNˉ Fe (SCN) 2+

硫酸水解后测定法：硫酸水解后测定法：硬脂酸镁加定量过量硫酸使硬脂酸镁加定量过量硫酸使药物水解，过量硫酸用氢氧化钠滴定。药物水解，过量硫酸用氢氧化钠滴定。

33 、经还原后测定法、经还原后测定法

碱性还原后测定碱性还原后测定 方法原理；在氢氧化钠和锌粉存在的条件下，使方法原理；在氢氧化钠和锌粉存在的条件下，使

有机药物（多用于含碘有机药物）加热回流，发有机药物（多用于含碘有机药物）加热回流，发生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤素离子（碘离子），继而采用间接银量为无机卤素离子（碘离子），继而采用间接银量法或其他方法进行测定，如泛影酸的测定。法或其他方法进行测定，如泛影酸的测定。

适用范围：碘原子与苯环直接相连的药物。适用范围：碘原子与苯环直接相连的药物。

例 泛影酸的测定

取本品约 0.4g ，精密称定，加氢氧化钠溶液 30ml 与锌粉 1.0g ，加热回流 30min ，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤 3 次，每次 15ml ，洗液与滤液合并，加冰醋酸 5ml 与曙红钠指示液 5 滴，用硝酸银滴定液 (0.1mol/L) 滴定。每1ml 硝酸银滴定液 (0.1mol/L) 相当于 20.46mg 的 C11H9

I 3N2O4 。

COOH

I

NHCOCH3

I

I

H3COCHN

+ 11NaOH + Zn

回流

△

COONa

N H2 H2N

+ 3NaI + 2CH3COONa

+ 2Na2ZnO2 + H2O

酸性还原后测定法酸性还原后测定法 方法原理；在醋酸和锌粉存在的条件下，有机方法原理；在醋酸和锌粉存在的条件下，有机

药物（多用于含碘有机药物），发生还原裂解药物（多用于含碘有机药物），发生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤素离子（碘离子），采用银量法测定卤素离子素离子（碘离子），采用银量法测定卤素离子的含量。的含量。

二、经有机破坏的分析方法二、经有机破坏的分析方法（一）、湿法破坏（一）、湿法破坏 硝酸硝酸 -- 高氯酸法：破坏能力强，反应激烈，需防高氯酸法：破坏能力强，反应激烈，需防

止爆炸。适用于生物样品的破坏，所得的无机金止爆炸。适用于生物样品的破坏，所得的无机金属离子为高价态。属离子为高价态。

硝酸硝酸 -- 硫酸法：适用于与碳原子结合牢固的绝大硫酸法：适用于与碳原子结合牢固的绝大多数含金属有机药物的破坏分解（但不适用于含多数含金属有机药物的破坏分解（但不适用于含碱土金属类有机药物），所得的无机金属离子为碱土金属类有机药物），所得的无机金属离子为高价态。高价态。

硫酸硫酸 -- 硫酸盐法：常用的硫酸盐为硫酸钾，所得硫酸盐法：常用的硫酸盐为硫酸钾，所得的无机金属离子为低价态。常用于含砷或锑有机的无机金属离子为低价态。常用于含砷或锑有机药物的破坏分析。药物的破坏分析。

凯氏定氮法凯氏定氮法 -- 含氮有机药物定量分析方法含氮有机药物定量分析方法

     原理：常用凯氏定氮法测定天然有机物原理：常用凯氏定氮法测定天然有机物 (( 如蛋白质、如蛋白质、核酸及氨基酸等核酸及氨基酸等 )) 的含氮量。含氮的有机物与浓硫的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和酸共热时，其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量的硼酸溶液中，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后用标准无机酸滴定，最后根据所用标硼酸吸收氨后用标准无机酸滴定，最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。 准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。

CHCH22NHNH22COOH+3HCOOH+3H22SOSO4 4 2CO2CO22+3SO+3SO22十十 4H4H22OO 十十 NHNH33     

        2NH2NH33+H+H22SOSO4 4 (NH(NH44))22SOSO44

(NH(NH44))22SOSO44 +2NaOH 2NH +2NaOH 2NH33+H+H22O+NaO+Na22SOSO44

NHNH33+H+H33BOBO3 3 NH NH44BOBO22+H2O+H2O

NHNH44BOBO22+H+H22SOSO44+2H+2H22O O (NH(NH44))22SOSO44 +2H +2H33BOBO33 （（直接滴直接滴

定法定法））

还可用剩余滴定法或甲醛法滴定还可用剩余滴定法或甲醛法滴定

消解时通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应消解时通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行应的进行。。对某些难以分解的药物（如含氮杂环对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在消解过程中常还需加入辅助氧化结构药物），在消解过程中常还需加入辅助氧化剂，以使分解完全并缩短消解时间。常用的辅助剂，以使分解完全并缩短消解时间。常用的辅助氧化剂有过氧化氢和高氯酸，但需慎用。氧化剂有过氧化氢和高氯酸，但需慎用。

某一固体样品中的含氮量是用某一固体样品中的含氮量是用 100g100g该物质该物质 (( 干干重重 )) 中所含氮的中所含氮的 gg 数来表示数来表示 (( ％％ )) 。因此在定氮前，。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。若样品为液体应先将固体样品中的水分除掉。若样品为液体 (( 如如血清等血清等 )) ，可取一定体积样品直接消化测定。，可取一定体积样品直接消化测定。

常量法取供试品的量约相当于常量法取供试品的量约相当于含氮量含氮量 25~30mg25~30mg ，，半微量法供试品取样量约相当于半微量法供试品取样量约相当于含氮量含氮量1.0~2.0mg1.0~2.0mg 。 。

中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解。对于含氮量较高的样品（超过行消解。对于含氮量较高的样品（超过 10%10% ），），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。等作为还原剂，以利于氮转变为氨。

（二）、干法破坏（二）、干法破坏11 、高温炽灼法、高温炽灼法

将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全灰化。灰化。

本法适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用本法适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用硫酸进行破坏的有机药物。硫酸进行破坏的有机药物。

22 、氧瓶燃烧法、氧瓶燃烧法

系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定。适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定。

NaCl

HClOClC

NaOH

2

溶液

点燃

适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析

本法简便、快速、破坏完全，尤其用于微量样品分析

基本原理基本原理 有机物 充有机物 充 OO22烧瓶 燃烧 产物 吸收液 →分析烧瓶 燃烧 产物 吸收液 →分析

仪器装置和设备仪器装置和设备（（ 11 ）燃烧瓶）燃烧瓶（（ 22 ）称样材料及称样方法）称样材料及称样方法 无灰滤纸：适用于固体；纸袋：适用于液体无灰滤纸：适用于固体；纸袋：适用于液体（（ 33 ）氧气：采用钢瓶氧气）氧气：采用钢瓶氧气 ,, 防止导气管污染。防止导气管污染。（（ 44 ）吸收液）吸收液 作用：定量吸收供试品的燃烧分解产物，使其转变作用：定量吸收供试品的燃烧分解产物，使其转变

为便于测定的价态。为便于测定的价态。

药物药物 破坏后破坏后 吸收液吸收液 定量方法定量方法含氟含氟 氟化氢氟化氢 水水 硒素氟蓝比色硒素氟蓝比色

法法含氯含氯 氯化氢氯化氢 NaOHNaOH 水溶水溶

液液银量法银量法

含溴含溴 溴溴 ++ 溴化氢溴化氢 NaOHNaOH 水溶水溶液液 ++ 还原剂还原剂

SOSO22

银量法银量法

含碘含碘 各种价态碘各种价态碘 NaOHNaOH 水溶水溶液液 ++ 还原剂还原剂

SOSO22

银量法银量法

含硫含硫 三氧化硫三氧化硫 HH22OO22 溶液溶液 重量法重量法含磷含磷 五氧化二磷五氧化二磷 水水 磷钼蓝比色法磷钼蓝比色法含硒含硒 四价硒四价硒 ++ 少量六价硒少量六价硒 硝酸溶液硝酸溶液 二氨基萘比色二氨基萘比色

法法

选择原则：被测物质的种类及所用分析方法选择原则：被测物质的种类及所用分析方法

33 、注意事项：、注意事项：（（ 11 ）燃烧瓶：大小适宜、干净、有防爆措施）燃烧瓶：大小适宜、干净、有防爆措施（（ 22 ）氧气要充足：燃烧完全（不得有黑色炭化）氧气要充足：燃烧完全（不得有黑色炭化

物）物）（（ 33 ）产生烟雾应完全被吸收：充分振摇）产生烟雾应完全被吸收：充分振摇烟雾颜色：碘，紫色；溴，红棕色；氟、氯烟雾颜色：碘，紫色；溴，红棕色；氟、氯 ,, 白白（（ 44 ）测定氟化物：石英制燃烧瓶）测定氟化物：石英制燃烧瓶

待分解样品量待分解样品量 燃烧瓶的体积燃烧瓶的体积

3~5mg3~5mg （微量分析） （微量分析） 150~250ml150~250ml

20~30mg20~30mg （半微量分（半微量分析）析） 300~500ml300~500ml

50~60mg50~60mg 1000ml1000ml

0.6~0.7g0.6~0.7g 或更多或更多 2000ml2000ml 或特殊或特殊结构的燃烧瓶结构的燃烧瓶

正确选用燃烧瓶的目的在于：正确选用燃烧瓶的目的在于：

样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有

利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液

中；防止爆炸的可能性。中；防止爆炸的可能性。

第二节第二节 定量分析方法特点 定量分析方法特点

一、容量分析法

（一）容量分析法的特点

操作简单、快速；

比较准确（ RSD＜ 0.5%）；

仪器普通易得。

1. 滴定度（ T ）的概念 每 1ml滴定液相当于被测物质的量(mg)

2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = M×a/b×B

3. 百分含量的计算（原料药）

（ 1 ）直接滴定法 D% = V ×F × T/W ×100%

F = 实际标定的浓度 / 规定的浓度

（二）容量分析法的计算问题

（ 2 ）剩余滴定法

%m

FVVT

s

）（

百分含量

T—— 滴定度，每 1ml 滴定液相当于被测组分的 mg 数

V—— 滴定时，供试品消耗滴定液的体积（ ml ） V0—— 滴定时，空白消耗滴定液的体积（ m

l ）F—— 浓度校正因子

ms——供试品的质量

双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g,0.3220g, 加水加水 15ml15ml ，乙醚，乙醚 30ml30ml 与甲基橙与甲基橙33 滴，用滴，用 0.1062mol/L0.1062mol/L 盐酸滴定，至水层显盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml20ml ，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积盐酸体积 21.05ml21.05ml 。计算样品中苯甲酸钠含。计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量量。苯甲酸钠分子量 144.1144.1 。。

司可巴比妥的含量测定：取供试品司可巴比妥的含量测定：取供试品 0.1301g0.1301g ，置碘，置碘量瓶中，加水量瓶中，加水 10ml10ml ，振摇使溶解，精密加溴滴定液，振摇使溶解，精密加溴滴定液（（ 0.1mol/L)25ml0.1mol/L)25ml ，再加盐酸，再加盐酸 5ml5ml ，立即密塞并振，立即密塞并振摇摇 1min1min ，暗处静置，暗处静置 15min15min 后，加碘化钾试液后，加碘化钾试液 10ml10ml ，，立即密塞摇匀，用立即密塞摇匀，用 0.0999mol/L0.0999mol/L 硫代硫酸钠滴定液硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液硫代硫酸钠滴定液 15.05ml15.05ml ，空白消耗，空白消耗 25.05ml25.05ml ，，每每mlml溴滴定液（溴滴定液（ 0.1mol/L)0.1mol/L) 相当于相当于 13.01mg13.01mg 的司的司可巴比妥。计算含量可巴比妥。计算含量

片剂含量测定结果的计算

%100/

%100%

片）标示量（

）平均片重（）供试品重（）测得量（

标示量每片含量

标示量

g

gg

g

%100%

标示量

平均片重标示量 sm

TVF

烟酸片含量测定

取本品 10 片 ,精密称定为 3.5840g,研细 ,精密称取 0.3729g, 置 100 mL 锥形瓶中 ,置水浴加热溶解后 ,放冷 .加酚酞指示剂 3 滴 ,用氢氧化钠滴定液（ 0.1005mol/L), 滴定至粉红色 , 消耗 25.02

mL. 每 1mL 氢氧化钠滴定液 (0.1mol/L) 相当12.31mg 的烟酸 . 求供试品中烟酸的标示百分含量（标示量 0.3g/ 片）

标示量%=

V × T × F × 平均片重

W × 标示量×100 %

=25.02 ×12.31/1000 ×0.1005/0.1×0.3584

0.3729 ×0.3

= 99.17%

×100 %

二、光谱分析法 （一）紫外 - 可见分光光度法（ 200nm～ 760nm)

灵敏度高，可达 10-

4g/ml ～ 10-7g/ml

1. 特点 准确度高， RSD （ % ）为 2% ～5%

仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广

2. 定量：朗伯 - 比耳定律 A = E1%1cmCL

3. 仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,

313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与 576.96nm

或用仪器中氘灯的 486.02nm与 656.10nm进行校正。

吸收度的检定：用 K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4 液至1000ml

波长 (nm) 235(最小 ) 257(最大 ) 313(最小 ) 350(最大 )

E1%1cm 124.5 144.0 48.62

106.6

杂散光检查： 试剂 浓度 (g/ml) 测定波长 透光率(%)

NaI 1.00 220nm ＜ 0.8 NaNO2 5.00 340nm ＜ 0.8

4. 对溶剂的要求 :

220～ 240nm 241～ 250nm 251～300nm 300nm以上

溶剂 + 吸收池 A ＜ 0.41 ＜ 0.20 ＜ 0.10 ＜ 0.05

5. 测定方法 要求供试品溶液的 A 应在 0.3 ～ 0.7

对照品比较法： Cx=(Ax/Ar)Cr;

含量 %=Cx×D/W×100 %

常用方法 吸收系数法： 含量 %= (E1%1cm )x/(E1%

1cm )r

×100 %

计算分光光度法： VA 的三点校正法

比色法

定量计算方法（ 1 ）对照法

对

供对供

对

供

对

供

对

供

对

供

A

Acc

c

c

A

AlcE

lcE

A

A

%1

cm1

%1cm1

硫喷妥钠的含量测定：取供试品硫喷妥钠的含量测定：取供试品 0.2500g0.2500g ，用水，用水稀释至稀释至 500ml500ml ，精密取，精密取 1ml1ml用用 0.4%NaOH0.4%NaOH 溶液溶液定量稀释至定量稀释至 100ml100ml ，作为供试品溶液；另取硫喷，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用妥对照品用 0.4%NaOH0.4%NaOH 溶液配制浓度为溶液配制浓度为 5µg/ml5µg/ml

作为对照品溶液。照分光光度法，在作为对照品溶液。照分光光度法，在 304nm304nm波长波长处分别测得供试品和对照品的吸收度为处分别测得供试品和对照品的吸收度为 0.5200.520和和0.5450.545 ，已知，已知 1mg1mg 硫喷妥相当于硫喷妥相当于 1.091mg1.091mg 的硫的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量

（ 2 ）吸收系数法

100)g/ml(

)g/100ml(

1%1cm

1%1cm

%1cm1

lE

Ac

lE

Ac

clEA

%m

VnlE

A

s

%cm

百分含量

对乙酰氨基酚的含量测定方法为对乙酰氨基酚的含量测定方法为

精密称取本品精密称取本品 40.1mg40.1mg ，置，置 250ml250ml 量瓶中，加量瓶中，加0.4%0.4% 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 50ml50ml 溶解后，加水至刻度，溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取摇匀，精密量取 5ml5ml ，置，置 100ml100ml 量瓶中，加量瓶中，加0.4%0.4% 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 10ml10ml ，加水至刻度，摇匀。，加水至刻度，摇匀。在在 257nm257nm 的波长处测定吸收度为的波长处测定吸收度为 0.5700.570 ，按，按CC88HH99NONO22 的百分吸收系数为的百分吸收系数为 715715 计算。计算。

（二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达 10-10g/ml ～ 10-12g/ml

在低浓度进行测定，防止 F 与 C 不成正比及自熄灭作用

1. 特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减

灵敏度高，但干扰因素多。

制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。

用样品量少。

2. 荧光分析仪 有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光

器；且激发光源、样品池和检测

器成直角。

3. 含量测定 常用的方法对照品比较法 :

Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) ×Cr

Ch.P 收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。

三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱

方法分类 按分离方法分为： PC ； TLC ；柱色谱；

GC ， HPLC 。

（一） HPLC 法 1. 对 HPLC 仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。

色谱柱的理论板数： n =

5.54(tR /Wh/2)2

2. 系统性试验 分离度： R = 2 （ tR1 – tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5

重复性：RSD≤2%

拖尾因子： T = W0.05h/2d1 应在 0.95

～ 1.05

正常峰和不正常峰如何判断？

用拖尾因子（对称因子）： T

T= W0.05h/2A

T ： 0.95 ~ 1.05

对称峰

> 1.05

拖尾峰

< 0.95

前沿峰

内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法

含量 = ×CR

AX

AR

外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量前提：截距接近 0 ，对照品浓度与待测组分浓度接近

内标法：内标法：

对内标物要求：a．内标物须为原样品中不含组分b．内标物与待测物保留时间应接近且 R>1.5

c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质

siis AAmm 和测混匀进样过程：

校正因子（ f）=

AS/CS

AR/CR含量（ CX）=f A’S/CS’

AX

内标法优点：内标法优点：

进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响

只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 。无关 。

内标法缺点：内标法缺点：

制样要求高；须寻找合适内标物制样要求高；须寻找合适内标物

外标法特点：外标法特点：

11 ）不需要校正因子，不需要所有组分出峰 ）不需要校正因子，不需要所有组分出峰

22 ）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大

→→每次进样量应一致，否则产生误差每次进样量应一致，否则产生误差

例：醋酸氢化可的松的含量采用例：醋酸氢化可的松的含量采用 HPLCHPLC 法测定：取法测定：取本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每mlml约含约含 0.35mg0.35mg 的溶液。精密量取该溶液和内标的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（溶液（ 0.30mg/ml0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各炔诺酮甲醇溶液）各 5ml5ml ，置，置25ml25ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取 10ul10ul

注入液相色谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同注入液相色谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg36.2mg ，样品取样为，样品取样为 35.5mg35.5mg ，测得对照液中醋，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为酸氢化可的松和内标的峰面积分别为 54678245467824和和61258436125843 ，样品液中药物和内标的峰面积分别为，样品液中药物和内标的峰面积分别为52213455221345和和 61228456122845 ，计算本品的含量 ，计算本品的含量

需验证的分析项目需验证的分析项目

1. 1. 鉴别试验；鉴别试验；

2. 2. 杂质定量或限度检查；杂质定量或限度检查；

3. 3. 原料或制剂中有效成分含量测定；原料或制剂中有效成分含量测定；

4. 4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；

5. 5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。

第三节 药品分析方法的验证

一、准确度

是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示

（一）含量测定方法的准确度

1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确

度的另一方法测定的结果进行比较。

2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原

料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD 。

具体做法：测定高、中、低三个浓度（ n=3 ） , 共 9 个数据来评价，回收率的 RSD ＜ 2% ；用 UV 和 HPLC 法时，一般回收率可达 98% ～ 102% ；容量法可达 99.7% ～ 100.3%

二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的接近程度。

（一）精密度表示方法 1. 偏差 (deviation , d) d = 测得值 -平均值 =Xi-X

2. 标准偏差（ standard deviation, SD 或 S ）

S =[(∑Xi – X)2/(n-1)]1/2

3. 相对标准差 (relative standard deviation, RSD)

RSD= 标准偏差 /平均值 ×100%=S/X ×100%

（二）重复性、中间精密度及重现性

1. 重复性 在相同条件下 ,由一个分析人员测定所得结果的精

密度 .

2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不

同设备测定结果的精密度。

3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。

三、专属性 是指在其他成分 (如杂质、降解产物、辅料等 ) 可能存在下，

采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检

查、含量测定方法，均应考察其专属性。

（一）鉴别反应

应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分

的样品均应呈现负反应。

（二）含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明

专属性。

图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。

在能

获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂

质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法和药典方法进

行对照；也可用对试样加速破坏的方法进行验证。

四、检测限

是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验 指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 （一）常用的方法 1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地 检测出的最低浓度或量。

2.仪器分析方法 GC和 HPLC法： LOD = S/N = 2或 3

五、定量限

是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应

具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求

LOQ.

常用信噪比法确定定量限，一般以 S/N=10时，相应的浓度进行测定。

六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接

呈正比关系的程度。

UV法：首先制备一个标准系列，浓度点 n =5; A = 0.3～0.7

建立回归方程 C = aA + b ;r ＞ 0.999。

HPLC法：制备一个标准系列，浓度点 n =5 ～ 7; 以 C 对 h或 A 或与

内标物的峰面积之比，建立回归方程 r ＞ 0.999。

七、范围

是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法

适用的高低限度或量的区间。 原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的 80% ～ 120% 。

制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的 70% ～ 130% 。

溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的 ±20%。

八、耐用性 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受

程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、

时间等。

HPLC 法变动因素有：流动相组成与 pH ，色谱柱，柱温，流速等。

GC 法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检

测器温度等。

分析方法效能指标的要求分析方法效能指标的要求

1 、非定量方法：用于鉴别试验、杂质的限量检查，只对专属性、耐用性和检测限有要求，其余均无须要求。

2 、用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定及溶出度测定，除了检测限和定量限外，其余均要求。

3 、杂质测定或制剂中降解物测定：属于微量定量分析，除检测限不必要求外，其余七项指标均应有所要求。。

第四节、生物样品分析方法的基本要求第四节、生物样品分析方法的基本要求

11 、被测定的药物和代谢物的浓度低；、被测定的药物和代谢物的浓度低；22 、样品大多需要分离和净化；、样品大多需要分离和净化；33 、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同的样品。同的样品。

44 、工作量较大，、工作量较大，55 、要求很快地提供结果、要求很快地提供结果 (( 毒物检测毒物检测 ))

一、样品的种类、采集和贮藏一、样品的种类、采集和贮藏

（一）血样：血浆、血清（一）血样：血浆、血清 血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。多，可供借鉴。

血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。的全血经离心后分取，量约为全血的一半。

血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，自然凝血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，自然凝结引起析出血块，离心取得。结引起析出血块，离心取得。

（二）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血（二）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度。定血浆中游离药物浓度。

（三）尿样：（三）尿样： 尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。出。尿样常需加入防腐剂。

贮藏贮藏 血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过 2h2h ，分，分

离后再置冰箱或冷冻柜中保存。离后再置冰箱或冷冻柜中保存。 尿样应立即测定，若收集尿样应立即测定，若收集 24h24h 的尿液不能立即测定时，的尿液不能立即测定时，

可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存 242436h36h ，，也可加入叠氮化钠可较长时间保存。也可加入叠氮化钠可较长时间保存。

唾液在保存过程中会放出二氧化碳使唾液在保存过程中会放出二氧化碳使 pHpH 值升高。另唾液值升高。另唾液中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻

二、生物样品的预处理技术二、生物样品的预处理技术

样品的制备样品的制备 要考虑：药物的理化性质、药物测定的目的、选要考虑：药物的理化性质、药物测定的目的、选

用的生物体液和组织的类型、待测物的浓度范围、用的生物体液和组织的类型、待测物的浓度范围、样品制备与分析技术的关系。样品制备与分析技术的关系。

待测药物的理化性质待测药物的理化性质

药物的药物的 pKpKaa值、亲脂性、溶解度等值、亲脂性、溶解度等————预处理及检测方法预处理及检测方法

具有具有亲脂性亲脂性————在适当的在适当的 pHpH 值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取

具有具有强极性或亲水性强极性或亲水性————沉淀蛋白、固相萃取、离子对沉淀蛋白、固相萃取、离子对 HPLCHPLC 法法

药物的药物的稳定性稳定性————萃取浓缩技术萃取浓缩技术

对酸碱不稳定对酸碱不稳定————酯、酰胺、两性药物避免使用强酸或强碱性溶剂，流酯、酰胺、两性药物避免使用强酸或强碱性溶剂，流

动相动相 pHpH

对热不稳定对热不稳定————避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂

具有具有挥发性挥发性———— GCGC 测定法测定法

具有具有光谱或电化学特性光谱或电化学特性———— HPLCHPLC 分析检测方法分析检测方法

待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态

体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存）浓度较低（尤其有代谢产物共存）

———— 代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定

———— 采用色谱法、采用色谱法、 LC-MSLC-MS 、、 EIAEIA 等分析检测等分析检测

技术 技术

分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求

药代动力学药代动力学————研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程

———— 血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求要求 ————同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物

检测检测 ————宽线性范围宽线性范围 ((CCmaxmax ～～ CCmaxmax 的的 1/20)1/20) 、、高灵敏度高灵敏度 (10(10-9-9g/g/

ml)ml) 和高专属性和高专属性 (( 分离能力分离能力 ))(( 原形药物及其代谢产物的分离原形药物及其代谢产物的分离 ))

方法方法 ————大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如

HPLCHPLC 、、 LC-MSLC-MS

分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求

临床治疗药物监测临床治疗药物监测

有效治疗浓度范围内药物浓度有效治疗浓度范围内药物浓度

方法方法————尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定

———— 大多采用大多采用 UVUV 、、 RIARIA 或或 EIAEIA等等

中毒患者的临床抢救中毒患者的临床抢救

药物浓度可能很高药物浓度可能很高

方法方法————强调方法的强调方法的特异性和分析速度特异性和分析速度

— —— — 大 多 采 用 色 谱 及 其 联 用 技 术大 多 采 用 色 谱 及 其 联 用 技 术 GCGC 、、 GC-GC-

MSMS 、、 RIARIA 、、 EIAEIA 、、 HPLCHPLC 或或 HPLC-MSHPLC-MS 。。

生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法

生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法 以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品

采用采用蛋白沉淀蛋白沉淀 -- 溶剂萃取溶剂萃取预处理技术预处理技术

———— 分析样品较为分析样品较为““干净干净””，可用，可用 HPLCHPLC 检测检测

用用 RIARIA 分析分析

———— 样品的预处理方法可较为样品的预处理方法可较为粗放粗放

———— 经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定直接测定

实验室条件实验室条件

在设计体内药物分析方法时，还应充分考在设计体内药物分析方法时，还应充分考

虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用

的仪器装备，合理选择可行的分析方法。的仪器装备，合理选择可行的分析方法。

（一）、蛋白质的去除（一）、蛋白质的去除

是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。物时的最先处理步骤。

11 、加入可与水混合的有机溶剂：、加入可与水混合的有机溶剂： 破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、

甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。将混合物超速离心，取上清液作为样品。

22 、加入中性盐、加入中性盐 使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用33 、加入强酸、加入强酸 与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、

高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。本法去蛋白。

44 、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 与蛋白形成沉淀，阳离子型沉淀剂与蛋白形成沉淀，阳离子型沉淀剂

（二）、辍合物的水解：（二）、辍合物的水解：

酸水解法：强酸、加热酸水解法：强酸、加热 酶解：蛋白水解酶中的枯草菌溶素使组织酶解，酶解：蛋白水解酶中的枯草菌溶素使组织酶解，

并使药物析出。优点：可避免药物在酸中水解及并使药物析出。优点：可避免药物在酸中水解及较高温度时降解；较高温度时降解；

水解可显著改善对蛋白结合强的药物的回收率；水解可显著改善对蛋白结合强的药物的回收率；可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成。可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成。

（三）有机破坏（三）有机破坏

当测定生物样品中的金属离子时，通常使用硝当测定生物样品中的金属离子时，通常使用硝酸酸 -- 高氯酸作为消解剂，破坏后所得的金属离子高氯酸作为消解剂，破坏后所得的金属离子为高价态。又如凯氏定氮法等。为高价态。又如凯氏定氮法等。

（四）分离、纯化与浓集（四）分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。

11 、液、液 -- 液萃取液萃取溶液的溶液的 pHpH调节：调节：最佳最佳 pHpH 选择主要与药物的选择主要与药物的 pKapKa值有关。值有关。体内酸性物质较多，在碱性条件下不会被有机溶剂萃取出体内酸性物质较多，在碱性条件下不会被有机溶剂萃取出来，而且多数药物碱性，故在来，而且多数药物碱性，故在 pHpH值偏高的情况下进行提值偏高的情况下进行提取较好。取较好。

提取溶剂：提取溶剂：选好提取溶剂可减少以后的净化操作，在液选好提取溶剂可减少以后的净化操作，在液 -- 液液提取中尽量采用极性小的溶剂。提取中尽量采用极性小的溶剂。

提取：提取：进行一次（至多二次）提取，进行一次（至多二次）提取，浓集浓集：：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。 常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。

酸碱度的选择酸碱度的选择

酸性药毒物：酸性药毒物： pHpH 应低于药毒物应低于药毒物 pKapKa值值 1~21~2个单位个单位

碱性药毒物：碱性药毒物： pHpH 应高于药毒物应高于药毒物 pKapKa值值 1~21~2个单位个单位

可保证可保证 90%90% 以上药毒物解离以上药毒物解离

注意酯、酰胺、亚酰胺、苷类药毒物易分解注意酯、酰胺、亚酰胺、苷类药毒物易分解

离子对提取法：离子对提取法： 提取极性大的药物。一些酸性或碱性提取极性大的药物。一些酸性或碱性有机药物在体液中呈离解状态，变成亲水性强的有机药物在体液中呈离解状态，变成亲水性强的带电荷离子，即使控制带电荷离子，即使控制 pHpH 值也不能抑制其电离，值也不能抑制其电离，使其不能用有机溶剂从体液中提取出来。使其不能用有机溶剂从体液中提取出来。

对于呈离解状态的药物，对于呈离解状态的药物，当添加与药物离子当添加与药物离子呈相反电荷的反离子呈相反电荷的反离子，，即可成为具有一定脂溶性即可成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂将其从水相中提取分离。 的离子对，用有机溶剂将其从水相中提取分离。

测定测定碱性药物碱性药物时，一般用时，一般用烷基磺酸盐类烷基磺酸盐类

（（ RSORSO33HH ）作为反离子，如庚烷磺酸钠、）作为反离子，如庚烷磺酸钠、

辛烷磺酸钠等；测定辛烷磺酸钠等；测定酸性药物酸性药物时一般用时一般用烷烷

基季铵类基季铵类化合物作为反离子，如氢氧化四化合物作为反离子，如氢氧化四

丁基铵、四乙基铵盐等。丁基铵、四乙基铵盐等。

液液萃取液液萃取 优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、

可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 缺点：乳化、污染环境、缺点：乳化、污染环境、

乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速

冷冻破坏乳化层后融化离心冷冻破坏乳化层后融化离心。。

22 、液、液 -- 固萃取法：固萃取法：

以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取故有时这种方法又称为固相提取

活化活化上样上样淋洗淋洗洗脱洗脱 洗脱液浓集洗脱液浓集

实验步骤实验步骤

第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 ——除去大部分甲醇 除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干

溶剂，备用或直接进行在线分析溶剂，备用或直接进行在线分析 血浆样品可直接上柱，样品量血浆样品可直接上柱，样品量 0.1~2ml0.1~2ml ，流速，流速 1~2ml/min1~2ml/min

柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向

与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱

进入分析柱的技术。 进入分析柱的技术。

用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不

同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是

柱切换技术。柱切换技术。

基本原理基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药

物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱

上完成色谱分析上完成色谱分析。 。

在线生物样品制备 - 柱切换高效液相色谱法

（五）、化学衍生化（五）、化学衍生化

11 、使药物变成能被分析的性质、使药物变成能被分析的性质22 、提高检测灵敏度、提高检测灵敏度33 、增强药物稳定性、增强药物稳定性44 、提高对光学异构体分离的能力、提高对光学异构体分离的能力 气相色谱衍生化气相色谱衍生化 液相色谱衍生化液相色谱衍生化

衍生化方法衍生化方法

硅烷化、酰化、烷基化硅烷化、酰化、烷基化——气相色谱衍生化方法气相色谱衍生化方法 紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性

衍生化衍生化——液相色谱衍生化方法液相色谱衍生化方法 柱前衍生柱前衍生 柱后衍生柱后衍生

三、生物样品定量分析方法验证三、生物样品定量分析方法验证

11 、特异性：空白、空白加样、用药后的谱图、特异性：空白、空白加样、用药后的谱图22 、标准曲线和线性范围：介质相同、包含所有浓度点、标准曲线和线性范围：介质相同、包含所有浓度点33 、精密度与准确度：高中低三个浓度、精密度与准确度：高中低三个浓度44 、定量下限：一般最高浓度的、定量下限：一般最高浓度的 1/10-1/201/10-1/20

55 、样品稳定性：冰冻、冻融稳定性、复溶溶液稳定性、样品稳定性：冰冻、冻融稳定性、复溶溶液稳定性66 、提取回收率：高、中、低浓度、提取回收率：高、中、低浓度77 、质控样品：随行标准、质控样品：随行标准88 、质量控制：生物样品测定、质量控制：生物样品测定

分离条件的筛选分离条件的筛选

在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性

物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：

11 ．．空白溶剂试验空白溶剂试验 ————溶剂溶剂 (( 方法特异性方法特异性 ))

22 ．．空白生物基质试验空白生物基质试验 —— —— 内源性物质干扰内源性物质干扰 (( 方法特方法特

异性异性 ))

33 ．．模拟生物样品试验模拟生物样品试验 —— —— 方法验证（效能指标）方法验证（效能指标）

44 ．．实际生物样品测试 实际生物样品测试 —— —— 代谢产物代谢产物 (( 方法特异性方法特异性 ))

（一）、方法特异性（一）、方法特异性 (( 专属性或选择专属性或选择性性 ))

方法的特异性方法的特异性 ((specificity)specificity)

————又称专属性或专一性，通常与选择性又称专属性或专一性，通常与选择性 ((selectivity)selectivity)互用互用

———— 系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力

专属性专属性————表示所检测的表示所检测的信号信号 (( 响应响应 )) 系属于系属于待测药物所特有待测药物所特有的的

选择性选择性————系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区区

分分 (( 分离分离 )) 的能力的能力

考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几

点：点： 1. 1. 内源性物质的干扰内源性物质的干扰比较比较————待测药物或其活性待测药物或其活性

代谢产物代谢产物检测信号；检测信号； 2. 2. 代谢产物的干扰代谢产物的干扰比较比较————模拟模拟

生物样品和用药后的实际生物样品的生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号；检测信号； 3. 3.

伍用药物的干扰伍用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物还要考虑患者可能同时服用药物 (( 通通

常为数有限常为数有限 )) 的干扰。提供三张色谱图，空白生物样的干扰。提供三张色谱图，空白生物样

品图、空白加对照、实际生物样品图品图、空白加对照、实际生物样品图

（二）、标准曲线与线性范围（二）、标准曲线与线性范围

标准曲线标准曲线（（ standard curvestandard curve ））————生物样品中所测定药物浓度与响应的生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性相关性———— 除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为

线性模式线性模式———— 回归分析法为回归分析法为最小二乘法或加权最小二乘法最小二乘法或加权最小二乘法

线性范围线性范围————标准曲线的标准曲线的最高最高与与最低最低浓度的区间浓度的区间———— 模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密

度和准确度度和准确度

标准曲线要求标准曲线要求

标准曲线标准曲线————用用模拟生物样品（模拟生物样品（与待测的含药生物样品与待测的含药生物样品相同的生物基质）相同的生物基质）建立建立

———— 线性范围线性范围 (( 不包括不包括零点零点 )) 应能应能覆盖全部生物覆盖全部生物样品样品的药物浓度的药物浓度

———— 不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物样品中的求算未知生物样品中的药物浓度药物浓度

———— 要求最低浓度点的偏差在要求最低浓度点的偏差在 ±±20%20% 以内、以内、其余各浓度点的偏差在其余各浓度点的偏差在 ±15%±15% 以内。以内。

（三）、准确度（三）、准确度

方法准确度方法准确度

———— 系指用该方法系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度测得的生物样品中待测药物的浓度

与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度

———— 应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓

度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定

———— 一般用一般用相对回收率相对回收率表示表示

测定：测定：

取高取高 (( 接近上限接近上限 )) 、中、低（定量下限的、中、低（定量下限的 33 倍以倍以

内）内） 33 个浓度，每一浓度至少个浓度，每一浓度至少 55 个样本，与随行的标准曲线同法个样本，与随行的标准曲线同法

测定、计算方法回收率测定、计算方法回收率

限度要求：限度要求：

———— 相对回收率应在相对回收率应在 85%85% ～～ 115% (115% (LOQLOQ 附近附近 80%80% ～～

120%)120%)

————RERE 在在 ±15% (±15% (LOQLOQ附近为附近为 ±20%)±20%)

（四）、精密度（四）、精密度

方法精密度方法精密度 (precision )(precision )

———— 系指每次测定结果与多次测定的平均值的系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度偏离程度

————表示该分析方法的表示该分析方法的可重复性可重复性

————反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法验证的基本要点性，是方法验证的基本要点

实际生物样品的量有限实际生物样品的量有限 (( 如血浆，一般为如血浆，一般为 0.50.5 ～～ 2ml)2ml)

————使用模拟生物样品测定使用模拟生物样品测定

测定法测定法照准确度项下方法，取空白生物基质照准确度项下方法，取空白生物基质 (( 如血浆如血浆 )) 数数

份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 33 个浓个浓度的度的 QCQC 样品，并分析测定样品，并分析测定

批内批内 RSDRSD

———— 每一浓度每一浓度 55 个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定 11 次，用随次，用随行标准曲线分别计算行标准曲线分别计算 33 个浓度及个浓度及 RSDRSD

批间批间 RSDRSD

———— 每每 11 分析批内每一浓度制备分析批内每一浓度制备 11 个样品，个样品，每个样品测定每个样品测定 11 次；在不同天连续制备并测定次；在不同天连续制备并测定 3 3 个合格个合格的分析批，至少的分析批，至少 45 45 个样品。个样品。

限度要求限度要求

在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中

对对 g/mlg/ml 级水平的级水平的 RSDRSD 一般应≤一般应≤ 10%10%

ng/mlng/ml 级水平的级水平的 RSDRSD 一般应≤一般应≤ 15%15%

在在 LOQ LOQ 附近附近 RSDRSD 应≤应≤ 20%20% 。 。

（五）、定量下限（五）、定量下限

———— 系指在保证具有一定可靠性系指在保证具有一定可靠性 (( 准确度与精密度符合要准确度与精密度符合要

求求 )) 的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，

又称为方法灵敏度又称为方法灵敏度

———— 标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点 (( 最低浓度点最低浓度点

≥≥ LOQLOQ))

要求要求————应能满足测定应能满足测定 33 ～～ 55 个消除半衰期后生物样品个消除半衰期后生物样品

中的药物浓度；准确度在中的药物浓度；准确度在 80%80% ～～ 120%120% ；； RSDRSD ＜＜

20%20%

（六）、稳定性（六）、稳定性

稳定性稳定性————包括方法稳定性和样品稳定性包括方法稳定性和样品稳定性

方法稳定性方法稳定性————方法的耐用性方法的耐用性

样品稳定性样品稳定性————生物样品的存放条件和时间、生物样品的存放条件和时间、

冻冻 -- 融循环融循环 (3(3 次）、复溶溶剂中的稳定性次）、复溶溶剂中的稳定性

（七）、萃取回收率（七）、萃取回收率

萃取回收率与相对回收率的意义萃取回收率与相对回收率的意义

不同不同

萃取回收率萃取回收率————考察生物样品预处理考察生物样品预处理

过程造成的药物的损失程度过程造成的药物的损失程度

取空白生物基质取空白生物基质 (( 如血浆如血浆 )) ，照准确度项下方法，制备，照准确度项下方法，制备

高、中、低高、中、低 33 个浓度的个浓度的 QCQC 样品样品 (( 每一浓度至少每一浓度至少 55 个样品个样品 )) ，，

每个样品分析测定每个样品分析测定 11 次次

另取等量的相同另取等量的相同 33 个浓度的标准溶液，用溶解模拟生个浓度的标准溶液，用溶解模拟生

物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AATT———— 经萃取后的经萃取后的 QCQC 样品的检测信号或比值样品的检测信号或比值 (( 内标内标

法法 ))

AASS———— 未经萃取的标准溶液的检测信号或比值未经萃取的标准溶液的检测信号或比值 (( 内标内标

法法 ))

）（%100S

T

A

AR

限度要求限度要求

萃取回收率一般应≥萃取回收率一般应≥ 60%60%

高、中浓度的高、中浓度的 RSDRSD 应≤应≤ 15%15%

低浓度的低浓度的 RSDRSD 应≤应≤ 20%20% 。 。

八、质控样品八、质控样品

用空白生物介质加入待测药物对照品配制已用空白生物介质加入待测药物对照品配制已知浓度样品，考察方法稳定性知浓度样品，考察方法稳定性

九、质量控制九、质量控制

方法考察完毕后作实际生物样品的测定，每方法考察完毕后作实际生物样品的测定，每天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度。天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度。