ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΥΛΙΚΩΝ

«ΒΙΟΡΓΑΝΙΚΕΣ ΝΑΝΟΔΟΜΕΣ»

Collagen-Related Peptides (CRP) : αυτoοργάνωση μικρών, μονόκλωνων αλυσίδων σε

λειτουργικό Βιολογικό υλικό στην κλίμακα του μικρομέτρου

Ξυνίδη Δήμητρα Α.Μ: 262

Δημιουργία αλυσίδων οι οποίες αποτελούνται από βασικά πεπτίδια κολλαγόνου (CRP) , ώστε να αυτό-οργανώνονται σε τριπλές έλικες και να συνθέτουν υπερμοριακά ινίδια κολλαγόνου ,χρησιμοποιώντας όμως μη -ομοιοπολικούς δεσμούς. Αυτό επιτυγχάνεται με την τοποθέτηση αρωματικών ομάδων στις άκρες του αντιπροσωπευτικού (CRP)

ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΟ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ?

Το κολλαγόνο είναι μια ινώδης πρωτεΐνη που εμφανίζεται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς.

Ιδιαιτερότητα να σχηματίζει αδιάλυτες ίνες με μεγάλη αντοχή στον εφελκυσμό

η πιο άφθονη πρωτεΐνη των θηλαστικών, αποτελεί το ¼ της συνολικής πρωτεΐνης του οργανισμού

βασικό συστατικό: δέρματος Οστών τενόντων χόνδρων αγγείων δοντιών

Σχήμα : Ίνες κολλαγόνου δέρματος από

ηλεκτρονική μικροσκοπία

ΔΟΜΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ

βασική δομική μονάδα αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οι οποίες διαμορφώνονται δεξιόστροφα σε τριπλή έλικα και σχηματίζουν μία άκαμπτη ράβδο. Σε κάθε περιστροφή της έλικας απαντώνται περίπου 3 αμινοξέα.

Οι αλυσίδες, ωστόσο μπορεί να διαφοροποιούνται ως προς το μέγεθος και την ακριβή σύσταση ανάλογα με τον τύπο του κολλαγόνου.

ΔΟΜΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ

δύο αμινοξέα την υδροξυπρολίνη(Hyp) και την υδροξυλυσίνη (Hyl)

αλληλουχία αμινοξέων σχεδόν περιοδική τυπική αλληλουχία : Gly- X – Y X= πολύ συχνά προλίνη Υ= πολύ συχνά υδροξυπρολίνη

κάθε τρίτο αμινοξύ είναι γλυκίνη που επιτρέπει στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες να πλησιάζουν η μία την άλλη

Το μόριο αποτελείται και από τα τελοπεπτιδια που είναι μη ελικοειδείς περιοχές στα άκρα των αλυσίδων. Η μια περιοχή είναι καρβοξυλικη και η άλλη αμινική. Σημαντικό ρόλο για σχηματισμό ινιδίων.

ΣΚΟΠΟΣ : Η ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΜΙΑΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ CRP Η ΟΠΟΙΑ ΘΑ ΜΠΟΡΟΥΣΕ ΑΥΘΌΡΜΗΤΑ ΝΑ ΑΥΤΌ-ΟΡΓΑΝΩΘΕΙ ΣΕ ΒΙΟΕΝΕΡΓΟ ΥΛΙΚΌ

Δημιουργία μιας αλυσίδας CRP 1a (σχήμα) η οποία θα αυτό –οργανώνεται με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις σε τριπλή έλικα συνθέτοντας ινίδια.

Πειράματα

1a αλυσίδα αποτελείται από την τυπική επαναλαμβανομένη αλληλουχία του κολλαγόνου Gly-Pro-Hyp

ενώ οι τελοπεπτιδικες περιοχες περιέχουν κατάλοιπα

i) Phe και F5-Phe

ii) Phe-Phe

ii) Phe-Leu

και δημιουργούν (αλληλεπιδρούν) με μη ομοιοπολικες αλληλεπιδράσεις

R : F5-Phe

Z: F5-Phe φαινυλαλανίνη υποκατεστημένη με 5 φθόρια → πιο υδροφοβικό

1b) FGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF

Phe – Phe R : Phe Αρωματικοί δακτύλιοι εκμεταλλευόμενοι την

υδροφοβικότητα τους δημιουργούν μη-ομοιοπολικούς δεσμούς

1c) FGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXL

Phe - Leu R : Leu Περιέχει τρεις άνθρακες Δεσμοί Van der Waals

1α) Phe και F5-Phe

ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF

ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ

XED (extended electron distribution)Πρόκειται για μια θεωρητική μέθοδο στην οποία με

βάση το πώς αλληλεπιδρούν μικρά μόρια μεταξύ τους μπορούν να προβλέψουν βασικές παραμέτρους

όπως ενέργειες αλληλεπίδρασης μεταξύ μακρομορίων.

ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝΥπολογίζονται οι ενέργειες αλληλεπίδρασης ανάμεσα σε πεπτίδια

μιας έλικας με σκοπό τον προσδιορισμό τις τριτοταγούς δομής.

Άρα μπορούμε να έχουμε ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντιδιαμετρικων άκρων

Entry Self-assembly pair Interaction Energy(kcal/mol): total IEcoulombicvan der Waals

Comments

1 Phe- F5-Phe(starting with face to face orientation) model of 1a

-55.2-15.0-40.2

2 Phe-F5-Phe(starting T-shaped orientation) model of 1a

-56.4-15.2-41.2

Minimizes backto face-to-faceorientations

3 Phe-Phe model of 1b

-49.2-7.0-42.2

Minimizestowards edge-to face orientations

4 Phe-Leu model of 1c -32.5-5.6-36.9

αλληλεπίδραση ανάμεσα σε πεπτίδια 1a: ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF (Z: F5-PHE) ,3 αρωματικοί δακτύλιοι υιοθετούν FTF προσανατολισμό και παρατηρειται και ένας δεσμός H στην επιφάνεια

1a START ALL PHE (EDGE) ALL PHE/F5PHE TURNED INTO REVERTED TO F5PHE (FACE) FACE/FACE

1a End

CD

Η φασματοσκοπία CD είναι μια μέθοδος απορρόφησης η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δευτεροταγούς δομής.

Διάλυμα από 1a: ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF (Z: F5-Phe)

χαρακτηριστική απορρόφηση κοντά στα 225 nm (λόγο πλευρικών ομάδων

η οποία είναι χαρακτηριστική και για το κολλαγόνο.

Αντίστοιχη θερμική σταθερότητα 1a) ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF (Z: F5-Phe)

(Tm= 570C) 2a) CH3-coo-GPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG-OH

(Tm= 700C)

NMR

Οπότε η τριπλή έλικα αρχίζει να σπάει και να αποδιατάσεται σε θερμοκρασίες πολύ

υψηλότερες από θερμοκρασία δωματίου και άρα του ανθρώπινου οργανισμού. Ηχαμηλή Tm της 1a σε σύγκριση με την 2a μπορεί να οφείλεται σε κάποιες

δομικέςδιασπάσεις στο τέλος της τριπλής έλικας από τους αρωματικούς δακτυλίους.

DLS

Τεχνική μέτρησης του σχήματος και του μεγέθους των σωματιδίων που περιέχονται στο διάλυμα.

Φως πέφτει πάνω στο διάλυμα → ένα μέρος ακτινοβολίας σκεδάζεται →συσχετίσει των σκεδαζόμενων φωτονίων που δέχεται σε τακτά χρονικά διαστήματα → μετατροπή σε μέγεθος σωματιδίων.

Οι διακυμάνσεις της έντασης είναι αποτέλεσμα της κίνησης των σωματιδίων(κίνηση Brawn)

Όταν τοποθετήσαμε το διάλυμα 1a για ανάλυση →2 είδη μεγέθους (3nm kαι 190 nm κόκκινο)

Μετά από 24 ώρες → ένα συνολικό υλικό 1000nm (πράσινο)

1a) ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF

Z: F5-Phe

Τοποθετήσαμε το διάλυμα 2a για ανάλυση →2 είδη μεγέθους (4 nm kαι 100 nm)

Μετά από 24 ώρες δεν αυξήθηκε

2a) CH3-coo-GPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG-OH

Αποτελέσματα δείχνουν ότι η αυτο-οργάνωση 1a ενισχύεται από αλληλεπιδράσεις του F5-Phe

ΤΕΜ

Αξιολόγηση της δισδιάστατης δομής και της σύστασης της 1α.

Υδατικό διάλυμα από 1α τοποθετείται πάνω σε ένα πλέγμα από χαλκό για την απεικόνιση ΤΕΜ και ξεραίνεται σε θερμοκρασία 40o C

Παρατηρούμε δημιουργία συνθετών ινιδίων που μοιάζουν με ινίδια κολλαγόνου. Αριστερή φωτογραφία ινίδια κολλαγόνου από αορτικό ιστό ποντικιού.

PLATELET AGGREGATION STUDIES.

Έλεγχος της 1a να μιμηθεί τη βιολογική λειτουργιά κολλαγόνου

Τα αιμοπεταλια είναι κύτταρα του αίματος τα οποία είναι πολύ σημαντικά για την πήξη του .

Έτσι μετά από μια αγγειακή ζημιά το εκτιθέμενο κολλαγόνο στο τοίχωμα των αγγείων προκαλεί συσσώρευση αιμοπεταλίων που δεσμεύονται σε

μεγάλες ποσότητες στις ίνες του κολλαγόνου για την πρόληψη της αιμορραγίας και την προώθηση

της επιδιόρθωσης των ιστών

PLATELET AGGREGATION STUDIES.

1a) ΖGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF Z: F5-Phe2b) PXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG

τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι με την πάροδο του χρόνου η 1a αλυσίδα μπορεί να αυτοοργανωθει σε μεγέθη κατάλληλου μήκους και να ικανοποιήσει τις απαιτήσεις

για συνάθροιση αιμοπεταλίων

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ

Δημιουργία μιας αυτοοργανωμενης αλυσίδας CRP 1a με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις σε ινίδια κολλαγόνου με τις ιδιότητες του μιμητικού κολλαγόνου.

Συγκεκριμένα δημιουργία τριπλής έλικας στην οποία σχηματίζονται σύνθετα ινίδια . Αλληλεπιδράσεις μεταξύ αρωματικών δακτυλίων δημιουργώντας ισχυρότερους δεσμούς ώστε να ενωθεί η τριπλή έλικα για μεγαλύτερο διάστημα και σχηματίζοντας ισχυρές δομές (ίνες).

Η αλυσίδα 1a ενέργησε ως μια λειτουργική πρωτεΐνη με την ικανότητα να προκαλεί συσσώρευση αιμοπεταλίων ανάλογη με το κολλαγόνο

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ