Контроль качества и стандартизация в...

1-Feb-13

Проточная цитофлуориметрия

2 1-Feb-13

Определение :

автоматизированная световая и флуоресцентная микроскопия единичных клеток в постоянном потоке.

1-Feb-13 3

Клеточный анализ: статистика

1, 3 или 8 бластов ???

Таблица Rümke: статистические отклонения

1-Feb-13 4

Проблемы, связанные с автоматическим подсчетом

Все клетки на одной картинке: слишком медленно

Каждая клетка отдельно: слишком медленно

Детальное рассмотрение: проблемы дуплетов и «половин» клеток

1-Feb-13 5

Решение: «выстраивание» клеток

«Бороздка» на предметном стекле

Стационарная секция изображения

© CONATEX Didactic

Непрерывная подача образца

Схема цитофлуориметра

6 1-Feb-13

Лазер

Образец

Обжимающая

жидкость

Отходы

Детектор

Предмет анализа

7 1-Feb-13

Клетки крови Хромосомы

Водоросли Простейшие

Частицы размера 0,5 – 50 мкм

Пример: иммунофенотипирование

8 1-Feb-13

Пример: научные исследования

9 1-Feb-13

X

Y

Сортировка спермы Культивирование дрожжей

Жизнеспособность бактерии

Трансдукция сигнала

Какие из этого возникают сложности?

10 1-Feb-13

• Различные составляющие образца

• Сложные технологии

• Множество пользователей

Транспортировка, хранение, приготовление образца, обработка патогенов

Адекватные условия окружающей среды, спецификация и обслуживание прибора

Обучение, подготовка к работе на инструменте, документирование

Нормативы для лабораторий

11 1-Feb-13

• Фундаментальные исследования: MIFlowCyt

• Анализ в фармацевтических исследованиях и тестированиях на безопасность лекарственных средств: GLP Good Laboratory Practice – свод международных требований к лабораторным исследованиям (законодательно регулируемо)

• Анализ последующего использования в цикле разработки лекарственных средств для мониторинга пациентов в клинических испытаниях и т.д.: схожие с GLP условия

• Анализ в виде контроля качества фармацевтической продукции: GMP Good Manufacturing Practice – свод международных требований к производству

• Медицинские диагностические лаборатории: Директивы Ассоциации Медицинских Работников, Аккредитация

Общие требования

12 1-Feb-13

Персонал: экспертиза, авторизация

Помещения: доступ, условия окружающей среды

Оборудование: обслуживание, отчеты

Реагенты, логистика

Валидированные процедуры

Внутренний и внешний контроль качества

Референсные значения

Соответствующая интерпретация

Все должно быть задокументировано!

1-Feb-13 13

MIFlowCyt

1-Feb-13 14

MIFlowCyt

Good Laboratory Praxis (GLP)

15 1-Feb-13

ВНИМАНИЕ: GLP может иметь различное значение в разных странах! США: общие положения; Европа: юридический характер!

Если это не специфичные случаи, описанные государственным законодательством, правила GLP применяются ко всем неклиническим исследованиям по охране здоровья и окружающей среды, требующие соблюдения правил регистрации или лицензирования фармацевтики, пестицидов, пищевых и кормовых добавок, косметических продуктов, ветеринарных лекарственных и схожих продуктов и для установления норм дляпромышленных химических продуктов.

Что такое GLP?

16 1-Feb-13

• Документация, Документация…

Если это не написано, значит, Вы этого не делали! Лабораторные записи могут «привести» к патентам и обеспечить финансовую основу для будущей работы!

• Стандартизация

Требует постоянных условий Повышает качество результатов и, следовательно, качество публикаций, диссертаций и т.д.

Что нужно документировать?

17 1-Feb-13

• Исходные данные

• Тестовые процедуры

• Реагенты и материалы

• Записи по подготовке

• Журналы по оборудованию и оснащению

• Записи по обслуживанию инструмента

• Записи проверки оборудования

Документы по каждодневной лабораторной

работе:

• Лабораторный журнал

• Записи в журнал инструмента

• Стандартные процедуры оператора (SOP)

Стандартные процедуры оператора

18 1-Feb-13

• Разъяснить как осуществляются рутинные каждодневные

действия

• Обеспечить взаимодействие между исследователями

• Обеспечить полезность для обучения новых пользователей

• Сформировать основу для внедрения системы управления

качества

• Обновлять каждые два года

В клинических исследованиях, SOP определяются International Conference on Harmonisation (ICH – Международной Конференцией по Согласованию) как «детальные написанные инструкции для достижения единообразия в действии специфических функций". (Wikipedia)

Основные требования: персонал

19 1-Feb-13

• Квалификация и обучение

• Предписанные установленные обязанности

• Документация о знаниях и компетенциях

• Адекватное число сотрудников (вакансия!)

• Авторизации

• Периодическое обучение и тренинги

• Документация по всем тренингам

Основные требования: помещения

20 1-Feb-13

• Использовать для необходимых подтверждений (ГМО,

биологические риски и т.д.)

• Оценка риска (лазер, патогены и т.д.)

• Соблюдение условий среды (температура, влажность,

шум, выбрасываемый воздух и т.д.)

• Исключение кросс-контаминации (молекулярная

биология)

• Очистка помещения

• Процедуры по дезинфекции

• Утилизация отходов в соответствии с правилами

• Хранение расходных материалов и реагентов

Основные требования: оборудование

21 1-Feb-13

• Регулярные инспектирование и калибровка

• Отчеты по техническому обслуживанию

• Руководства, заметки производителя и SOP

• Правила в случае неисправности системы

• Авторизация сотрудников лаборатории

• Документирование рабочего времени оборудования

(журнал учета)

• Правила для коллективного использования цитометров

различными группами

• Журнал пользователя

Факторы, влияющие на ЦФ анализы

22 1-Feb-13

Подготовка

• Фиколл или лизис

• С промывкой / без

промывки

• Антикоагулянты

Флуорохромы

• 2,3,4…32 цвета

• Коньюгаты

• Контроли

• Компенсация

Гейтирование

• Иммунологическое гейтирование

• Опознание живая/неживая

• Дискримнация дуплетов

Абсолютный подсчет

(клетки/мкл)

• Одноплатформенный или

двуплатформенный

Цитометр

• Спецификации (лазер,

фильтры…)

• Контроль лазеров и проточной

системы

Нормативные директивы

• GLP, аккредитация

• Планы исследования

• Правила компенсации

Пробоподготовка

23 1-Feb-13

Антикоагулянты

• Аммоний-гепарин: наиболее стабилен (48 ч)

• ЭДТА: удобен, но должен быть использован в

течение 12 ч

• Цитрат: воздействует на поверхностные

маркеры

Лизис

• Хлорид аммония pH- нестабилен

• Versalyse подходит также для безотмывочной пробоподготовки

(абсолютный подсчет!)

• Каждый материал для лизирования приводит к различиям в

характеристиках рассеяния клеток

• Лизис с фиксацией наиболее стабилен. ВНИМАНИЕ: оценка

жизнеспособности!

Агрегаты клеток

• Клеточные фильтры (40 мкм) предотвращают засорение

• Добавление ДНКзы или Коллагеназы / Диспазы

Пробоподготовка

24 1-Feb-13

Законы Шапиро по цитофлуориметрии

25 1-Feb-13

http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/practical-flow-cytometry/index.html

Жизнеспособность клеток

26 1-Feb-13

7-AAD в зависимости от SSC : погибшие клетки 7-AAD+ исключены

Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и, следовательно, могут приводить к ложно-положительным результатам.

Абсолютный подсчет (клетки/ мкл)

27 1-Feb-13

Единая платформа: Двойная платформа:

FlowCount-Beads

WBC % Lymph

• Возможно только с неотмытыми образцами (потеря

клеток!)

• 2 метода: «единая платформа» и «двойная платформа»

«Золотой стандарт»; подсчет частиц известной концентрации, добавленных в ту же пробирку в качестве референсных частиц.

Абсолютный подсчет проведен по результатам цитометрических и гематологических данных.

Недостаток: 2 источника ошибок!

Референсные значения

28 1-Feb-13

• Могут зависеть от возраста

• Могут зависеть от пробоподготовки (напр. реагенты

для лизирования)

• Должны быть валидированы для каждого инструмента

Гематологические параметры при исследовании мышей показывают удовлетворительные штаммоспецифические различия! Ссылка: http://jaxmice.jax.org/findmice/index.html

Зависимость референсных значений от возраста

29 1-Feb-13

Comans-Bitter WM et al., J Pediatr 1997

Суточные ритмы

30 1-Feb-13

Работа иммунитета меняется в течение суток Суточные часы в макрофагах контролируют воспалительный иммунный ответ. Keller M, Mazuch J, Abraham U, Eom GD, Herzog ED, Volk HD, Kramer A, Maier B. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 15;106(50):21407-12.

Иммунологическое гейтирование

31 1-Feb-13

For

ward

Sca

tter

Side Scatter

Sid

e S

catt

er

CD3 PC7

CD3+ 76.6% C

D8 F

ITC

CD4 Pacific Blue

CD8+ LYM 26.2%

CD4+ LYM 49.4%

Debris

Monos

Lymph

Lymphocytes

Monocytes

Granulocytes

Gran

Debris

CD45-PC7

SS

C

«Иммунологическое гейтирование» (напр. CD45 от SSC) часто позволяет лучше дискриминировать популяции, чем гейтирование по рассеянию.

Обработка сигнала

32 1-Feb-13

Time (Time Of Flight)

Voltage


33 1-Feb-13

Time = Time of Flight (TOF) = Width (W)

Integral = Area (A)

Peak = Height (H)


34 1-Feb-13

Дискриминация дуплетов

35 1-Feb-13

Представленные методы:

Цитометр анализирует частицы, но не может различать единичные события от дуплетов или агрегатов.

Это приводит к ошибочным результатам, особенно когда анализируется ДНК или редкие события!

Height vs. area Ratio vs. area Height vs. area

Контроль

36 1-Feb-13

Параметры, которые необходимо

контролировать:

• автофлуоресценция

• неспецифическое связывание

антител

• спектральное перекрывание

Автофлуоресценция

37 1-Feb-13

Лазеры возбуждают не только флуорохромы, но и молекулы в клетке, такие как флавопротеины, NADPH, липиды и т.д. Чем больше составляющих клетки, тем сильнее автофлуоресценция! Автофлуоресценция зависит от длины волны возбуждения.

Контроль внутренних негативных событий

38 1-Feb-13

Негативная популяция в той же пробирке. Преимущества: негативные и исследуемые клетки обработаны при равных условиях. Часто он может заменить изотипический контроль. Комбинирует автофлуоресценцию с неспецифическим связыванием.

Изотипический контроль

39 1-Feb-13

MF=1,84 MF=164

(89,13) (1,0)

• Анализ неспецифического связывания («контрольная проба»).

• Важно когда нет «внутренних» негативных популяций.

• Контрольные изотипы должны быть связаны с одними и теми же флуорохромами.

• Дополнительное преимущество: расчет относительного изменения в

интенсивности флуоресценции.


40 1-Feb-13

• Изотип антител IgG1, IgG2a, IgM и т.д. • Количество неспецифического связывания

зависит от изотипа, особенно если клетка несет Fc рецепторы.

• Неспецифическое связывание может также

вызвать белок-белковые взаимодействия

флуорохромы могут также вногсить свой вклад.

Julian Voss-Andreae: Angel of the West, 2008 The Scripps Research Institute Florida

© Wikipedia.

Изотипический контроль:

• Из той же группы, что и антитело-мишень

• Тот же изотип

• Конъюгирован с тем же флуорохромом

• НО: без специфических мест связывания на

клетке-мишени


41 1-Feb-13

Предварительные условия для хорошего изотипического контроля: идентичные условия для изотипического контроля и специфического антитела!

• Одинаковый изотип!

• Одинаковый флуорохром!

• Концентрация антител при процессе «окрашивания».

• Температура и время инкубации.

• Одинаковый буфер для окрашивания.

• Тандемные коньюгаты от одного производителя.

Выбор антител

42 1-Feb-13

Pacific Blue®** Biotin FITC Cyanine dyes Alexa Fluor Dyes®**

Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 647 Alexa Fluor 700

PE APC Tandem Dyes

PE-Texas Red PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy7 APC-Alexa Fluor 700 APC-Cy7 APC-Alexa Fluor 750

500nm 800nm 700nm 600nm

FITC

PE ECD

PECy5

PECy5.5 PECy7/APCy7

APC

Emission Wavelength

Re

lati

ve

Flu

ore

sce

nce

**Registered Product from Invitrogen, Inc. (Molecular Probes, Inc)

Флуорохромы с минимальным или нулевым спектральным перекрытием упрощают компенсацию.

С участием тандемных красителей возможно возбуждать и детектировать сигнал до 5 флуорохромов одним лазером.

Спектральное перекрывание

43 1-Feb-13

525 BP 575 BP


44 1-Feb-13

• Необходимо: одноцветное окрашивание для каждого флуорохрома на панели • Для анализа спектрального перекрытия должны расматриваться яркие сигналы

Компенсация зависит от настройки напряжения!

Компенсация

45 1-Feb-13


46 1-Feb-13

Median fluorescence

intensity

Избегать компенсации если это возможно

47 1-Feb-13

405nm

638nm

488nm

На 3-лазерном инструменте FITC, PC7, APC и Pacific Blue могут быть проанализированы без компенсации!


48 1-Feb-13 Valid for Beckman Coulter Navios and Gallios

4 флуорохрома без компенсации

49 1-Feb-13

488nm

638nm

APC

405 nm

Pac Blue

Практические методы

50 1-Feb-13

Основное:

• Слабоэкспрессирующиеся антигены лучше работают с ярким красителем.

• Сильноэкспрессирующеся антигены работают со всеми красителями.

• НО: НУЖНО учитывать спектральное перекрывание!!

• Слабоэкспрессируемые антигены лучше работают на каналах, которые не подвержены воздействию спектрального перекрывания.

• Яркие антигены лучше работают на каналах, которые не воздействуют спектральным перекрыванием на другие каналы.

500nm 800nm700nm600nm

FITCFITC

PEPEECDECD

PECy5PECy5

PECy5.5PECy5.5PECy7/APCy7PECy7/APCy7

APCAPC

Emission Wavelength

Rela

tive

Flu

ore

sce

nc

e

500nm 800nm700nm600nm

FITCFITC

PEPEECDECD

PECy5PECy5

PECy5.5PECy5.5PECy7/APCy7PECy7/APCy7

APCAPC

Emission Wavelength

Rela

tive

Flu

ore

sce

nc

e

51 1-Feb-13

Допускается спектральное перекрывание…

• Между взаимоисключающими маркерами (например, CD3 и CD19, или CD4 и CD8)


52 1-Feb-13

Практические методы Допускается спектральное перекрывание…

• от маркеров субпопуляции к родительским маркерам (напр. CD4 к CD3)

53 1-Feb-13

Запрещается спектральное перекрытие…

• когда гейтирующий маркер перекрывает маркер субпопуляции

(напр. CD45 в CD3)


Переменные в цитофлуориметрии: Резюме

54 1-Feb-13

Cells

Детектирование

Клетки

Флуорохромы

Передача сигнала

1-Feb-13

1-Feb-13 56

Концеция Контроля Качества

Fluidiktest

Системная проверка (Ежедневно)

Проточная система + лазер

Стандартизация

Настройка инструмента



Контрольный материал

Проверка результатов

Документрование

Контроль качества (QC)

Результаты

QC Модуль

Анализ образцов

пациентов

Получение

результатов

Подготовка

отчета

Обслуживание

пприбора

ОШИБКА

Call-центр

Решение проблемы

ПРОЙДЕНО

1-Feb-13 57

Построено на ISO стандартах в целях соответствия наивысшим стандартам качества конструкции и производства

Инвестирование в тестирование продукта для достижения наивысших нормативных стандартов сложного медицинского оборудования

IVD CE соответствие для всех конфигураций, включая 3-й лазер ?!

CE / IVD - одобрение

IQ/OQ (качество на входе/выходе), GMP (Good Manufacturing Practice)

58 1-Feb-13

Контроль процесса: права и обязанности

59 1-Feb-13

Многопользовательский доступ

Управление паролем пользователя

Администрирование прав пользователя

Записи пользователя/ журнал регистрации событий

Контроль процесса: штрих-коды

60 1-Feb-13

Считывание штрих-кода карусели положения в карусели пробирок

Максимально возможная

идентификация образца

Контроль процесса: удаленный доступ

61 1-Feb-13

Система PROService автоматически идентифицирует, отслеживает и решает проблемы дистанционно

PROService обеспечивает удаленный доступ к программному обеспечению, осуществляющему мониторинг всей электроники, насосов, клапанов и т.д. внутри прибора.

Ежедневная проверка системы: Flow-Check™

62 1-Feb-13

Частицы Flow-Check™ (6605359)

– проверка проточной системы и оптики

– для Cytomics FC 500 дополнительно • Flow Check 770 от PC7 Set up Kit (737664) = конфигурация с 1 лазером

• Flow Check 675 от APC Set up Kit (737663) = конфигурация с 2 лазерами

Ежедневная проверка системы

63 1-Feb-13

Отображение параметров QC в хронологическом порядке

Ежедневная проверка системы: FCS-данные

64 1-Feb-13

8.4.8 • Инструменты с лазерами: мощность лазера должна документироваться ежедневно.

ZLG

Checklist 9, Immunology

Проверка функционирования: 8-пиковые частицы(8-Peak Beads™)

65 1-Feb-13

База данных реагентов

66 1-Feb-13

– Управление каталожными номерами и номерами партии

– документирование сроков годности и получения

– связана с графиками Леви-Дженнингса

– простое добавление новых реагентов

Журнал технического обслуживания

67 1-Feb-13

Журнал сервисного обслуживания

68 1-Feb-13

1-Feb-13 69

Стандартизация

Шаг1: Стандартизация настроек детектора

Шаг2: Анализ спектрального перекрывания

1-Feb-13 70

Полностью автоматизированные процедуры

FITC PE ECD PC5

CD45 CD4 CD8 CD3

CD45 CD56+16 CD19 CD3

FITC PE ECD PC5 PC7 APC-A750

CD45 CD56+16 CD19 CD3 IgG IgG

CD45 CD4 CD8 CD3 HLA-DR CD38

4 флуоресцентных сигнала: TBNK

Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C

6 флуоресцентных сигналов: TBNK плюс маркеры активации (дополнительно*)

Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C, FC500, Epics XL

* Возможны и другие дополнительные маркеры, напр. CD25-PC7 Только для исследовательских целей

1-Feb-13 71

Контрольные материалы

Использование контрольных материалов позволяет валидировать применяемые настройки инструмента и, следовательно, является контролем достоверности работы.

ImmunoTrolTM: иммунофенотипирование ImmunoTrol LowTM: ВИЧ StemTrolTM: CD34+ клетки-предшественники

1-Feb-13 72

Контрольные материалы

1-Feb-13 73

Программы внешнего QC

Программы внешнего контроля качества External Quality Assessment (EQA) приняты во всем мире как бесценные средства для оценки лабораториями работы своих тестирующих систем. Результаты объективно сравниваются с результатами других лабораторий, использующих ту же методологию для каждого параметра.

1-Feb-13 74

Проточная цитофлуориметрия в центральной лаборатории

1-Feb-13 75

Полная взаимосвязь

1-Feb-13 76

Концепция полезного QC модуля

Все приложения могут быть

•стандартизированы

• задокументированы (SOP)

• установлены без субъективного ручного ввода

Все параметры (QC реагенты, работы по обслуживанию,

настройки цитометра и результаты анализа) автоматически документируются QC модулем.

Контроль качества: цели

77 1-Feb-13

• Стандартизированные процессы

• Стандартизированное приготовление образца

• Контролируемые образцы

• Стандартизированная настройка протоколов

сбора данных

• Контроль действий и QC документация

Относительность результатов

• Меньше ручных манипуляций во время работы и

бОльшая высокопроизводительность

• Гибкая работа с образцами

• Упрощенная работа с образцами

Повышение эффективности

Для чего этот продукт?

78 1-Feb-13

Для чего этот продукт?

79 1-Feb-13

Он влияет на качество Ваших результатов!

Вопросы? Комментарии?

80 1-Feb-13

Спасибо за внимание!

Dr. Andreas Böhmler

Product Manager Flow Cytometry

Reagents and Applications

Europe, Middle East, Africa & India

[email protected]

Контроль качества и стандартизация в...

Documents

Transcript of Контроль качества и стандартизация в...