选修一 生物技术实践

专题 5 DNA 和蛋白质技术

课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段

教学目标 重点难点 问题探讨 教学过程 知识结构 教学反馈 课后习题 教学参考

课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片断

【课题目标】（一）知识与技能 1 、了解 PCR 技术的基本操作 2 、理解 PCR 的原理 3 、讨论 PCR 的应用（二）过程与方法　 在多聚酶链式反应扩增 DNA 片段的实验过程

中，应避免外源 DNA 污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观 通过对 PCR 实验的操作及结果分析，培养学生

严谨的科学态度和实事求是的科研精神

【课题重点与难点】

课题重点： PCR 的原理和 PCR 的基本操作。

课题难点： PCR 的原理。

★ 　分子生物学研究中最强大的实验技术之一★ 　其本质是在体外模拟胞内 DNA 分子复制的过程

美国科学家　穆利斯(K

.B.M

ullis

)

发明了P

CR

技术　1

993

年诺贝尔奖

一、多聚酶链式反应

是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。

　　能以极少量的 DNA 为模板，在几小时内复制出上百万份的ＤＮＡ拷贝。

　　广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定等。

二、 DNA 分子的结构1 、基本组成单位——脱氧核苷酸脱氧核苷酸

脱氧核苷

磷酸脱氧核糖

含氮碱基

嘌呤

嘧啶

腺嘌呤（ A ）

鸟嘌呤（ G ）胞嘧啶（ C ）

胸腺嘧啶（ T ）

脱氧核苷酸结构式

3

5

　　一个核苷酸上的磷酸基团上的“－ OH”和另一个核苷酸分子的第 3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的 3’和 5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过 3'， 5'- 磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。 通常将 DNA 的羟基 “－ OH”末端称为 3’端，而磷酸基团的末端称为 5’端。

2 、多脱氧核苷酸链的形成

OOP

O

HO碱基

O

OH

OOP

O

HO

OH

碱基5’

3’

3’

5’

碱基碱基

脱氧核糖脱氧核糖

磷酸基团磷酸基团碱基碱基

脱氧核糖脱氧核糖

碱基碱基

脱氧核糖脱氧核糖

5’

3’

多脱氧核苷酸链结构简图

连

接

连

接

A

T

G

C

A

T

G

C

5，端含磷酸基团5，端含磷酸基团

3，端（含羟基）3，端（含羟基）

3，端3，端

5，端5，端

DNA 单链两端的命名

3 、 DNA 分子的双螺旋结构特点① DNA 分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－ 5’，另一条链为 5’－ 3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。

②脱氧核糖与磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。

③两条链上的碱基通过氢键连接起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。

三、 DNA 的复制

2 、时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期3 、场所细胞核（主）（线粒体、叶绿体）4 、模板DNA 母链

1 、概念由一个 DNA 形成两个完全相同的 DNA 的过程

5 、原材料 脱氧核苷酸6 、基本条件 酶、 ATP 、原料、模板7 、复制过程

① DNA 的解旋 亲代 DNA 分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链② RNA 引物的合成　　以单股 DNA 为模板，在引物酶的作用下合成小段的 RNA 引物。

③ DNA 的生成　　以单股的 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下，在 RNA 引物的末端由 5’端→ 3’端合成 DNA 。

边解旋边复制 (过程）8 、复制特点

半保留复制（结果）

9 、遵循原则碱基互补配对原则

10 、精确复制的原因

11 、复制的意义

　　 DNA 分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。

①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板

②碱基互补配对保证了复制准确无误的进行

参与的组分 在 DNA 复制中的作用

解 旋 酶

DNA 母链

4 种脱氧核苷酸

DNA 聚合酶

引 物

总结：胞内 DNA 复制的基本体系

打开 DNA 双链

提供 DNA 复制的模板

合成子链的原料

催化合成 DNA 子链

使 DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

四、 PCR( 多聚酶链式反应）

1 、 PCR 原理①在 80－ 100℃的温度范围内， DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 DNA 链又会重新结合成双链。③ PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，现在使用的 PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

变性

复性

延伸

加热到 95℃， DNA 双链解旋为单链

降到 55℃，引物通过碱基互补配对与单链 DNA 结合

升温到 72℃，四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下，根据

碱基互补配对原则合成新的 DNA链

2 、细胞内和细胞外 DNA 复制环境的区别

体内 DNA 的复制 体外的模拟模板（母链）

引物

4 种脱氧核苷酸

DNA 聚合酶

反应环境

细胞内源

引物合成酶

细胞内源

细胞内源

细胞内环境

外源加入

外源加入

外源加入

外源加入

缓冲液

① PCR 过程需要的引物不是 RNA ，而是人工合成的 DNA 单链，其长度通常为 20－ 30个脱氧核苷酸。

3 、细胞内复制和 PCR 的主要不同点

② PCR 过程中 DNA 的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

4 、 DNA 聚合酶特性

　　不能从头合成 DNA ，只能从 DNA 的 3′端开始延伸 DNA 链，因此， DNA 复制需要引物。

5 、 DNA 聚合酶作用过程　　当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后， DNA 聚合酶就能从引物的 3′端开始延伸 DNA 链， DNA 的合成方向总是从子链的5′端向 3′端延伸。

　　高温解决了打开双链的问题，　　但又导致 DNA 聚合酶失活的问题，耐高温的 Taq DNA 聚合酶解决了高温导致 DNA聚合酶失活，促成了 PCR 技术的自动化。

6 、 Taq DNA 聚合酶的应用

7 、 缓冲液需要为 PCR 反应提供的物质　　 DNA 模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的 DNA 聚合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA 复制在体外反复进行。

　　 PCR 技术是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等特性。

8 、 PCR 技术的特点

五、 PCR 的反应过程

1 、 PCR 的反应步骤　　 PCR 一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸

① 变性（模板 DNA 解旋）　　模板 DNA经加热至 950C左右。一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

2 、循环过程

靶序列靶序列

靶序列靶序列

PCR 循环第一步：高温变性

② 复性（退火）—— 低温复性

　　模板 DNA经加热变性成单链后，温度降到 550C左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。

靶序列

靶序列

引物 Ⅰ引物 Ⅱ

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火

③ 延伸 —— 中温延伸

　　 DNA 模板－引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的 DNA 链。

靶序列靶序列

靶序列靶序列

引物引物ⅠⅠ

引物引物ⅡⅡ

5’5’

33’’

5’5’

5’5’

3’3’

5’5’

3’3’

3’3’

Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶

PCR 循环第三步 ：引物延伸

靶序列靶序列

靶序列靶序列

第 1 个 PCR 循环完成后 ：得到两个靶序列

（ 1 ） PCR 循环 -- 变性

95℃变性

（ 1 ） PCR 循环 --变性

95℃变性

（ 1 ） PCR 循环 -- 变性

95℃变性

（ 2 ） PCR 循环—复性

55℃复性

（ 3 ） PCR 循环—延伸

（ 3 ） PCR 循环—延伸

（ 3 ） PCR 循环—延伸

（ 3 ） PCR 循环—延伸

循环特点：

①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代 DNA 分子中 ③其它子代DNA 分子都为双引物分子式 ④处于两引物之间的 DNA 序列呈指数增长 1×2N

循环次数 DNA数量

1 2

2 4

3 8

20 1,048,576

30 1,073,741,824

3 、 30次循环后靶序列扩增的数量

六、 PCR 的实验操作

1 、 PCR仪（一）设备及用具

实质上一台能够自动调控温度的仪器

2 、微量离心管

一种薄壁塑料管，总容积为 0.5ml

3 、微量移液器用于定量转移 PCR 配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

PCR仪 微量离心管

一 次 性吸液枪头

调节轮

卸枪头按钮

推动按钮

卸枪头器

微量移液器

（二）实验操作步骤①准备好 PCR 反应体系的配方

② 用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分

③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁

④离心 10 分钟

⑤将离心管放入 PCR仪上，设置好循环程序

⑥电泳检测 PCR 结果

（三）、操作提示： 1．为避免外源 DNA 等因素的污染， PCR 实验

中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

2． PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约 10s，使反应液集中在离心管底部，再放入 PCR仪中进行反应。目的： 避免外源性 DNA 大量扩增造成假阳性反应。

（一）理论上 DNA 扩增数目的计算七、课题成果评价

1 、一条 DNA ，复制 n 次， DNA 为 2n

2 、 a 条 DNA ，复制 n 次， DNA 为 a×2n

（二）实验中 DNA 含量的测定原理

　　可以通过计算 DNA含量来评价扩增的效果， DNA 在 260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与 DNA 的含量有关。

光吸收

波长／ nm260240220 280

0.1

0.2

五、课题延伸

1 、 PCR优点：

2 、 PCR 技术的意义

原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作

复习： PCR 技术与体内 DNA 复制的区别：

1. PCR 不需要解旋酶；体内 DNA 复制需要；

2. PCR 需要耐热的 DNA 聚合酶（常用 TaqDNA 聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；

3. PCR 一般要经历三十多次循环，而生物体内 DNA 复制需要生物体自身的复制。

知识结构多聚酶链式反应扩增D

NA

片段

PCR 原理DNA 的复制需要酶、原料、能量、引物DNA 的变性和复性受温度影响

PCR 过程 变性 复性 延伸

操作步骤 配制 PCR 反应体系 移入离心管

放入 PCR设置工作参数DNA 扩增

测定含量 稀释 调零 测定并读数 计算

教学反馈1． DNA 分子复制时，解旋的两条链中（ ） A仅一条作为复制模板 B 两条链作为模板并复制出两个不同的 DNA 分子 C 两条链作为模板并复制出两个相同的 DNA 分子 D 两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合

为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的 DNA 分子2.下列关于 DNA 复制过程的正确顺序是（ ） ①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③ DNA

分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构

A B C D①③④②⑤ ①④②⑤③ ①③⑤④② ③①④②⑤3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ ） ①DNA 复制② RNA 复制③转录④翻译⑤逆转录 A B C D①②③④⑤ ①②③④ ①②③⑤ ①③④⑤

C

D

A

4. 实验室内模拟生物体 DNA 的复制必需的一组条件是（ ） ① 酶②游离的脱氧核苷酸③ ATP DNA④ 分子 ⑤mRNA tRNA⑥ ⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度 A B ①②③④⑤⑥ ②③④⑤⑥⑦ C D②③④⑤⑦⑧ ①②③④⑦⑧5. 利用 PCR 技术，把一个双链 DNA 分子当作第一代，经过 3次循

环，在第四代 DNA 分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（ ）

A 2 B 4 C 8 D 16 6.关于 DNA 分子的叙述中，正确的是（ ） A .DNA 的两条链是极性相同，同向平行 B.DNA 的两条链是极性相同，反向平行 C.DNA 的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA 的两条链是极性不同，同向平行7.假设 PCR 反应中，只有一个 DNA 的片段作为模板，请计算在 3

0次循环后，反应物中大约有多少这样的 DNA 片段（ ） A 215 B 230 C 260 D 231

C

D

A

B

8.DNA 的合成方向总是（ ）延伸。 A从 DNA 分子的左端向右端 B从 DNA 分子的右端向左端 C从子链的 5 ，端向 3 ，端 D从子链的 3 ，端向 5 ，端9. 要使 PCR 反应在体外的条件下顺利地进行，需要

严格的控制（ ） A 氧气的浓度 B 酸碱度 C 温度 D 大气的湿度10.DNA 分子经 PCR 反应循环一次后，新合成的那

条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ） A 模板母链相同 B非模板母链相同 C 两条模板母链相同 D 两条模板母链都不相同

C

C

B

( 课堂检测 )•1 、 DNA 单链的 ________ 末端为 3,

端 , ________ 末端为 5,端 ,在 DNA复制时 ,引物从模板链的 _____端配对结合 .在 ___________酶的作用下 ,引物提供 ____端 , 使子链向下延伸 .

•2 、每次循环可以分为 ______________________ 这三个过程 ,对应温度分别为 __________________.

磷酸基团羟基

羟基DNA 聚合3'

变性、复性、延伸95℃、 55 ℃ 、 72 ℃

( 课堂检测 )•3 、一个 DNA 片段经过 30次循环后

能形成 ________个这样的片段 .•4依据 DNA吸收紫外光的情况 ,用紫

外分光光度计测得•DNA=_____________________________

230

50 x(260nm的读数 )x稀释倍数

教学参考1.琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分离范围的关系 凝胶浓度要依据 DNA 分子的大小来确定。 编码双歧杆菌 16srRNA 的 DNA 片段大小约为 1 500 个

核苷酸的长度，因此根据表中选用 1％（ 1 g/100 mL ，下同）的凝胶浓度。

表中琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分离范围的关系琼脂糖凝胶浓度 (%) 线型 DNA 分子的分离范围 (千碱基对， kb)

0.3 5～ 60

0.6 1～ 20

0.7 0.8～ 10

0.9 0.5～ 7

1.2 0.9～ 6

1.5 0.2～ 3

12.0 0.1～ 2

2. 核酸电泳的指示剂与染色剂 核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条

件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：能够增加样品密度，确保 DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。

核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭 (EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。 EB可嵌入 DNA 双链的碱基对之间，在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入 EB ，使其终浓度为 0.5 μg/mL；一种是在电泳后，将凝胶浸入 0.5 μg/mL 的 EB溶液中，染色 10～ 15 min 。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡 30 min 后再观察。

3.PCR 的常见问题 PCR 实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性

结果的常见原因有： Taq DNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及 PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入 Taq DNA 聚合酶，并增加 5～ 10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用 Taq DNA 聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取 DNA 模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管 Taq DNA 聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。 PCR 扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶 DNA 的互补情况，尤其需要保证引物的 3′ 端与靶基因互补。

PCR 技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标 DNA 片段的大量扩增，因此模板 DNA 的污染是 PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果， PCR 操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等