第 19 章色谱分析法引论 An Introduction to Chromatography

分析化学

第 19 章

色谱分析法引论

An Introduction to Chromatography

1903/1906 年迈克尔迈克尔 ·· 茨维特茨维特 ((Michael Tswett) Michael Tswett) 华沙华沙

大学俄国的植物学家大学俄国的植物学家植物的石油醚提取液在碳酸钙吸附剂填

充的玻璃管中分离出叶绿素及其他色素

(1 ）粗叶绿素 +石油醚（ 2 ）石油醚流动相相对运动固定相（吸附剂） CaCO3

胡萝卜素利用不同物质叶黄素在流动相与固定相叶绿素作用时的行为差

异得到分离 (吸附 )

（ 3）小刀割开，用醇溶出（吸附作用）

1931 年库恩奥地利化学家胡萝卜素植物色素分离20 世纪 30 年代离子交换色谱建立1940 年吸附色谱与电泳相结合1941 年分配色谱创立1952 年气相色谱法建立1968 年高效液相色谱法建立1975 年之后离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管

电泳、场流动分级分离

Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948 年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖

吸附色谱与电泳分配色谱

19 —1 概要及术语 19 —2 色谱过程的讨论（理论）塔板理论速率理论总分离效能指标 19 —3 色谱的定性定量

第 19 章色谱分析法引论


19 -1 概要及术语

气体( 气相色谱）GC

液体

( 液相色谱） LC

超临界流体（超临界流体色谱） SFC

流动相

固定相

固定相外形

名称

1 、分类

液液固固固

键合

吸附剂

吸附剂

键合

交换

柱柱柱柱柱柱柱柱平面平面

气液色谱

气固色谱

液液色谱

薄层或纸色谱

键合相色谱

尺寸排阻色谱

离子交换色谱

超临界流体色谱

液固色谱

多孔

第 19 章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语

2 、平面色谱

薄层色谱 0.250.25mm mm 厚纤维素，硅胶厚纤维素，硅胶玻板玻板纸色谱滤纸滤纸液 - 液萃取为原理组份在两相中反复分配因毛细作用而上升溶剂溶质在水相中各种存在形式总浓度

分配比 k = c 水/c 有

溶质在有机相中各种存在形式总浓度


2 、平面色谱固定相滤纸（巳吸水 20% ）

流动相上升前沿比移值 Rf1=Zx1 / Z

Z x2 Rf2=Zx2 / Z

Zx2 图中 kx2小→快→ Rf2大 x1 kx1大→慢→ Rf1小分开

Zx1 斑点位置斑点位置 RRf f 值值定性定性斑点用荧光、光度积分值斑点用荧光、光度积分值定量定量展开剂（有机溶剂）流动相


3 、柱色谱（ 1 ）以 GLC 为例 Gas 流动相高沸点有机化合物（固定液）

固定相

化学隋性固体微粒（担体）溶解挥发现代柱色谱后加Gas 带 A 检测器组分 A L 可记录到柱后组分浓度

转换成的电信号强度


3 、柱色谱

（ 2 ）色谱图随时间 t 记录色谱流出曲线，即色谱图

I tR Wσ

t0 tR′

h

W½ h/2 0.607h

o Wb

t

进样空气组分 1 组分 2 （惰性物质）


3 、柱色谱

（ 3 ）术语基线 ot

死时间 tt0 0 柱出口处流动相的体积流速

死体积 VV00=t0·F0 通常用校正体积流速

保留时间 ttRR （即柱温和大气压的载气流速）

保留体积 VVRR=tR·F0

校正保留体积 VVRR00=tR·FC

调整保留时间 ttRR′′= tR – t0 柱内平均体积流速

调整保留体积 VVRR′′= VR –V0 = tR′· F0

净保留体积 VVRR0 0 ′′ =tR ′ ·FC


3 、柱色谱（ 3 ）术语

柱内平均体积流速 FC ?

可用皂膜流量计在柱后测得流速 F （视体积流速）进行饱和水蒸气压校正饱和水蒸气压校正 PP0 0 - - PPW W // P P00

柱温校正柱温校正 TTc / c / TTrr

压力校正因子压力校正因子 jj=(3 /2 ) ·[(=(3 /2 ) ·[(PPii//PP00))22--

1] / [(1] / [(PPii//PP00))33-1] -1]

F F ′′ 室室温和大气压力下载气流速温和大气压力下载气流速

FFC C = = F·F· （（ PP0 0 - - PPW W // P P00 ）） ·· （（ TTc / c / TTr r ）） ·· j j

FF0 0 柱柱温和大气压力下载气流速温和大气压力下载气流速

对分配色谱：分配系数 kd

kd= Cs/CmCs- 单位体积固定相中组分的质量Cm- 单位体积流动相中组分的质量

对吸附色谱吸附平衡常数 ka

ka= Cs/Cm

Cs- 每克固定相中吸附组分的质量Cm- 每毫升流动相中组分的质量


3 、柱色谱（ 3 ）术语

分配容量（容量因子，分配比）

k`=ns/nm=(CsVs)/(CmVm)=kVs/Vm=k/


3 、柱色谱（ 3 ）术语

ns, nm---- 分别为组分在固定相和流动相中的量；Vs ， Vm---- 分别为固定相和流动相的体积；---- 相比


3 、柱色谱（ 3 ）术语

色谱峰宽（区域宽度）

半峰宽度 W 1/2 = 2σ√2ln2 =2.354 σ

峰底宽 Wb = 4σ

拐点处峰宽 Wσ = 2σ


3 、柱色谱

（ 4 ）色谱图的信息

a. 色谱峰个数判断试样中所含组分的最少数判断试样中所含组分的最少数 b. 色谱保留值定性定性 c. 色谱峰面积或峰高定量定量 A A = = K CK C

d. 保留值与区域宽度评价柱分离效能依据评价柱分离效能依据 e. 两峰间距评价两组分能否分离评价两组分能否分离


3 、柱色谱（ 4 ）色谱图的信息

上面色谱图由实验得到，是实验事实但（ 1 ）为什么出这样的峰？为什么不是其

它形状？色谱过程到底如何？（ 2 ）获得色谱图的具体装置？

怎样才能获取最好的色谱信号？（ 3 ）如何解释图、具体如何定性？定量？

有何特点。


19 –2 色谱过程的讨论（理论）

1 塔板理论（以气液分配色谱作说明）（ 1 ）设想 Martin

比拟为蒸馏塔 0 1 2 3 4 5 6 ·······

气相气相 GG H H

体积体积 ΔVΔV

载气载气液相液相 LL

一个塔板、板高一个塔板、板高 HH

第 19 章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）

1 塔板理论（ 2 ）假定 a. 每一塔板内、组份迅速达到平衡。 b. 载气间歇进入，每一次为一个塔板体积。 c. 载气不可压缩。 d. 一开始组份都在 0 号塔板上，沿柱长方向扩散不

考虑。 e. 组份的分配系数 K = CL/ CG ，在每个塔板上是常

数。

（ 3 ）色谱气过程的分解动作分配比 k=p/q （组份在液相中重量 / 组份在气相中

重量）对混合组份 A ,B

若 kA=1 即 A 组份在平衡时，气液中各一半量 kB= 0 即 B 组份在平衡时，液相中不溶解进样初始态 A+B 加入载气体积数 N=0


1 塔板理论

进样初始态 A+B r=0 1 2 3 4 5 · · · · n

加入载气体积数 N=0 平衡时

N=1 ΔVΔV11

N=2 ΔVΔV22

N=3 ΔVΔV33

N=4 ΔVΔV44

········

N=n ΔVΔVn n A B B AA B B A


1 塔板理论（ 3 ）色谱气过程的分解动作

上图中的分布是一个二项式分布，可用二项式展开计算。

当 N 或 n 很大时，用数理统计，正态分布，概率分布函数给出表达式 n ， n 为塔板数。


1 塔板理论（ 3 ）色谱气过程的分解动作

（ 4 ）表达式柱效能概念上图可见，对于同一柱长上图可见，对于同一柱长 LL ，，若塔板数若塔板数 n n ↑ ↑ 即即

HH↓ ,↓ , 则平衡分配次数愈多则平衡分配次数愈多 . . 说明该物质在这个柱上的效能愈大说明该物质在这个柱上的效能愈大n 可衡量一根柱的效能 ,n 愈大，被分离的可能愈大 n 理论 =16(ttRR/W/Wbb)

2=5.545 (ttRR/ W/ W1/21/2)2

H 理论 = L/n 理论

n 表示一定条件下，柱分离能力发挥程度的标志。由于由于 ttRR 中含有中含有 tt0,,0,, 实际在分配中发挥作用仅是实际在分配中发挥作用仅是 ttRR 中的中的 ttRR′′ 部分部分

n 有效 =16(ttR R ′′ / W/ Wbb)2=5.545 (ttR R ′′/ W/ W1/21/2)2

H 有效 = L/n 有效


1 塔板理论

（ 5 ）关于塔板数计算的几个问题a. n 是人为概念，不同方法测得的塔板数相差很大，但它有用为比较相似色谱柱或制备柱时的技术好坏建立了标准

b. n 不仅决定于组分及两相的性质，还与一系列操作条件有关因此比较柱效能时，必须指定组份、固定相及含量、柱温、流动相及速度、进样量等。

c. 不同组份在同一柱上， k 值大的， n 值较大。d. 不对称色谱峰，计算会产生较大误差，可达到 10—20% ，峰愈近正态分布，误差愈小。

e. 检测器响应与浓度应有线性响应，否则 n 值不真实。f. 计算 n 时，保留值与峰宽应有相同单位。


1 塔板理论

（ 6 ）对塔板理论评价成功： a. 解释色谱流出曲线形状（呈正态分布） b. 浓度极大点位置 c. 评价柱效应能高低的塔板数计算存在问题： a. 不能说明板高的影响因素 b. 色谱宽变宽原因 c. 不能解释不同流速的 n 值不同

假定与实际不相符引起假定与实际不相符引起


1 塔板理论


2 速率理论

（ 1 ）范第姆特公式 1956 年荷兰范 ·第姆特 (Van Deemter)公式 :

H = A + B /u + Cu

概括了影响 H 的动力学效应

A项——涡流扩散项即多径项 t1

t0 t1≠ t1′ 峰变宽 t1′ A = 2λdP

不规则因子颗粒平均直径表示不均性填充物不规则性，使路径不同对空心柱 A = 0 要使H 小怎么办？


2 速率理论（ 1 ）范第姆特公式

B/u项——分子扩散项即纵向扩散

试样‘塞’ 向两边（纵向）扩散要使H 小怎么办？

GC GC 中此项不计中此项不计

BB = = BBmm + + BBss = 2 = 2γγmm DDmm + +γγss DDs s kk

流动相固定相流动相固定相弯曲因子弯曲因子扩散系数扩散系数分配比分配比 γγ＜＜ 11 DDmm :0.01 :0.01 ～～ 1cm1cm22/s/sss

扩散时的路径弯曲即扩散受阻系数 DDss:: 1010--

44～～ 1010-5-5 DDmm

要 B↓ 对一定柱 DDm m ↓ ( 组份分子量↑ 柱温↓ 柱压↑ 载气分子量↑ )

要 u↑ 即停留时间短注意 :λ 与 γγ 是有区别的 , 填充物均匀 λ↓, 而 γγ 不一定↓





Cu项—传质阻力项传质过程指什么？浓度不均匀而发生的质量迁移过程表现为两相中的扩散过程及溶解、平衡、

转移过程G—L例：组分在气相任一部位组分在气相任一部位移动速度由移动速度由气相转质阻力系数气相转质阻力系数表示表示 GG 移至界面界面 CC = = CCmm + + CCss

LL 移至移至移动速度由移动速度由液相转质阻力系数液相转质阻力系数表示表示组分在液相中任一部位组分在液相中任一部位



Cu项—传质阻力项传质阻力使峰变宽组分在气相中浓度 CG

柱距离组分在液相中浓度 CL

理想状态瞬间平衡实际情况有 CL=KCG 气相在运动平衡需要时间平衡常数若 K=1 （传质阻力存在）则柱 x 距离有等浓度 A 点： CL ＜ KCG

B 点： CL ＞ KCG



Cu项—传质阻力项 C= C Css+ C+ Cmm

构成因子固定相液膜厚度分配比与容量因子有关的系数 GLC LLCGLC LLC

CCss q·k dq·k dss22 ωωss·d·dss

22

固定相固定相 (1(1 ＋＋ kk ）） 2 2 D Dss DDss

CCm m 0.01·0.01·kk22 ddpp22 ( (ωωmm++ ωωsmsm) ·) ·ddpp

22

流动相流动相（（ 11 ＋＋ kk ）） 2 2 DDmm DDmm

流动相因流动对在微孔中滞留流动相传质阻力的贡献对传质阻力的贡献



Cu项—传质阻力项 ωωss

固定相因流动对固定相因流动对传质阻力的贡献传质阻力的贡献

ωωmm

流动相因流动对传质阻力的贡献

ωωsmsm

在微孔中滞留流动相对传质阻力的贡献



小结 H = H A +H B + H C = A + B /u + Cu


2 速率理论

（ 2 ）范氏方程的发展GL 中：1962年吉丁斯（ Giddings）“涡流扩散耦合理论 ” 展宽因素相互影响、不是简单加和、流动方式极为复杂

A项修正为与气相传质相互作用有关

AA=[(1/ =[(1/ 22λλddPP)+(1/ )+(1/ CCm m uu)])]-1-1


2 速率理论（ 2 ）范氏方程的发展

LL 中：范氏方程可进一步简化当 dP足够小时， 22λdλdPP 与 ωωmm··ddpp

22//DDmm 合并，近似表达为 Au 0.33

H = Au 0.33 + B /u + （ CCss+ C+ Cm m ） u

填充良好，粒径较大多孔膜 ddss很小时， HPLC 中纵向扩散很小

H = Au 0.33 +CCm m u


2 速率理论

（ 3 ）成功之处解释影响板高因素填充均匀度填充均匀度颗粒大小颗粒大小流动相流速流动相流速类型类型固定相厚度固定相厚度对选择操作条件具有指导意义对选择操作条件具有指导意义


3 柱的总分离效能指标

（ 1 ） n 作为柱效能指标

即反映物质在柱中达到分配平衡次数

但不能直接反映难分离物质对 A 、 B 的分离效果



（ 2 ）分离度 R 即总分离效能指标

R=2·(tR2-tR1)/(Wb1+Wb2)

浓度 [A]/[B]=1/1 时 R=1 分离程度 98% R=1.5 分离程度 99.9% 完全分离相邻两峰相邻两峰 WWb1b1++WWb2b2= = 88σσ RR= (= (ttR2R2--ttR1R1)/ 4)/ 4σσ



（ 3 ）色谱分离方程式（ R 、 k 、 n三者关系）令 WWb1b1++WWb2b2= 2W = 2W

RR= (= (ttR2R2--ttR1R1)/)/WW= (= (ttR2R2′-′-ttR1 R1 ′)/′)/WW

即 WW= (= (ttR2R2--ttR1R1)/ )/ RR= (= (ttR2R2′-′-ttR1 R1 ′)/′)/RR

又∵ n 有效 =16(ttR2R2′′ / W/ W22)2

或 n 理论 =16(ttR2R2/W/W22)2

即有 n 有效 =16[RR· · ttR2R2′′ / / ((ttR2R2′-′-ttR1 R1 ′)′)]2

=16RR22((γγ2,1 2,1 / γ/ γ2,1 2,1 ––11)2

R=R=((√√nn 有效有效 /4)[(/4)[(γγ2,1 2,1 ––11)/)/γγ2,12,1]]


3 柱的总分离效能指标（ 3 ）色谱分离方程式

R=R=((√√nn 有效有效 /4)[(/4)[(γγ2,1 2,1 ––11)/)/γγ2,12,1]]

或或 nn 理论理论 =16(=16(ttR2R2/W/W22))22

nn 理论理论 =16[=16[RR· · ttR2 R2 / / ((ttR2R2--ttR1R1))]]2 2

=16=16RR2 2 {{ （（ ttR2 R2 / t/ tR1R1) /) /[[ （（ ttR2 R2 / t/ tR1R1)-1)-1]} ]} 22

∵ ∵ ttRR= = tt00 （（ 1+1+kk) ) ∴∴（（ ttR2 R2 / t/ tR1R1) = ) = （（ 1+1+kk 2 2) / ) / （（ 1+1+kk 1 1))

即有即有 R=R=((√√nn 理论理论 /4) /4) {[{[(( ttR2 R2 / t/ tR1R1)-1)-1]/]/ （（ ttR2 R2 / t/ tR1R1)})}

R=R=((√√nn 理论理论 /4) /4) [[(( kk22--kk11) /) / （（ 1+1+kk 2 2)])]

定义定义 : : kk22//kk1 1 == α α 分离系数（选择性系数）分离系数（选择性系数） γγ2,1 2,1 == kk22//kk1 1 == ttR2R2′/′/ttR1 R1 ′′ （（相对保留值相对保留值）） R=R=((√√nn 理论理论 /4) /4) [[((αα --1) / 1) / αα ] ] ·[·[kk22// （（ 1+1+kk 2 2)])] 色谱分离基本方程式

k 2 ＞ 20

[k2/(1+k 2)]=1

n 有效 =n 理论



（ 4 ）讨论

R 是容量因子 kk22 分离系数 αα （即相对保留值 γγ2,1 2,1 ）柱效能 nn 函数


3 柱的总分离效能指标（ 4 ）讨论

提高 R 的方法 : A. 使 k↑ 则 kk22//((1+1+kk 2 2)) ↑ RR ↑ ↑ 太大 a. 延长分析时间 b. 造成检测困难 K 一般在 2~7 k＞ 10 分离度提高不明显 k＜ 2淋洗时间会出现极小值B. 使 n↑ 则 R↑。分离改善、峰变窄有利提高分析灵敏度但增加柱长使 n↑, 延长分析时间。设法使 H↓ ，才是增加 R ↑ 的最好办法


3 柱的总分离效能指标（ 4 ）讨论

提高 R 的方法 :

C. 使 αα ↑ 则（ αα ––11 ）） //αα↑ R ↑

α α ＞ 2 时短时间内组分会完全分离 αα接近 1 时延长时间才能完全分离 (α=α=1.011.01 分离时间是 α=α=1.11.1 时的 84倍 ) α =α =11 时无法分离

αα 一定， R 正比于 n 有效有效 ,,即分离度直接与 n 有效有效有关说明 n 有效有效更能正确地代表柱效能。


17 –3 色谱的定性定量

1. 色谱的定性对照利用保留值进行定性（ 1 ）用纯物质的保留值进行对照（ 2 ）用相对保留值 r 进行对照 r1,2 = tR1′/tR2′= VR1′/VR2′= k1/k2 = K1/K2

● 1 组份， 2 纯物质 ● r 值可以是文献的或测定的

（ 3 ）用保留指数 I （ Kováts 指数）进行定性 Ix={(logZx-logZN)/ (logZN+1-logZN)} ×100 ＋ 100N ● N+1, N 相邻的正构烷烃 ● 与文献对照，不需要纯物质

第 19 章色谱分析法引论 19 –3 色谱的定性定量

2 色谱的定量

（ 1 ）定量关系式

W = f·A

A = S·WW - 被测物质的量f - 定量校正因子S - 检测器的响应灵敏度

（ 2 ）相对校正因子 f 或相对灵敏度 S 的测定

fi （ m ） =f’i （ m ） /f’s （ m ） =As· mi/ （ A i· ms ）

fi （ M ） =f’i （ M ） /f’s （ M ）

=As· mi· Ms/( A i· ms · Mi ） = fi （ m ） (Ms/Mi ）

fi （ V ） =f’i （ V ） /f’s （ V ）

=As· mi· Ms · 22.4/( A i· ms · Mi · 22.4 ） = fi （ M ）

Si =1/fi


2 色谱的定量


2 色谱的定量

（ 3 ）峰高及峰面积测量 a.手工几何法对称峰 A =1.065 h·W1/2

不对称 A =h (W 0.15 +W 0.85)/2

重叠峰（分割）称重

b.仪器测量电子积分仪微电脑积分


2 色谱的定量

（ 4 ）定量校正方法

a. 外标法 b. 内标法（内标物？） c. 归一化法 Xi （ % ） =(Ai /∑Ai) ×100

× Xi （ % ） =(Wi /∑Wi) ×100 =(fi·Ai /∑fi ·Ai) ×100

√ 增量法可用吗？如何用？

《色谱分析法导论》结束

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