基因工程原理与技术

授课教师：林良斌 教授

参考书： 1 、《基因工程原理》 吴乃虎 主编

2 、《植物基因工程原理与技术》 王关林 主编

第一章 绪论第一节 基因工程的概念

基因工程 (gene engineering) 是现代生物技术的核心内容。 基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。 基因工程的核心内容是基因体外重组 (DNA 体外重组 ) 。 基因工程的四大要素 ( 或基本条件 ) ：目的基因、载体、工具酶、受体。 相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组 DNA 技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。 基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

第二节 基因工程的诞生与发展 基因工程诞生于 1973 年。一、基因工程诞生的理论和技术基础1 、理论基础 ①DNA 是遗传物质；

②DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制； ③ 遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2 、技术基础 ① 限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割； ②DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接； ③ 基因工程载体的构建与应用。

二、基因工程的诞生 1972 年，美国斯坦福大学 P. Berg 研究小组的 DNA 体外重组实验。 1973 年，斯坦福大学的 S.Cohen 研究小组的 DNA 体外重组和大肠杆菌转化实验。 ( 见下两张幻灯片 )

同年，加利福尼亚大学的 H.Boyer 也进行了类似的实验。

这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973 年被定为基因工程诞生的元年。

pSC101

抗四环素抗四环素

pRpR6-56-5

抗卡那霉素抗卡那霉素

DNADNA 连接连接酶酶

重组重组 DNADNA 分子分子

EcoRIEcoRI

抗卡那霉抗卡那霉素基因素基因

培养平皿培养平皿

卡那霉素平板卡那霉素平板

四环素四环素 \\ 卡那霉素平卡那霉素平板板

大肠杆菌大肠杆菌

四环素平板四环素平板

三、基因工程的发展 分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛 发展阶段。1 、基因工程的艰难阶段 (1973~1976 ，载体和受体系统的安全性改造 )

基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2 、基因工程的逐渐成熟阶段 (1976~1982 ，基因工程药物的研制 )

1976 年 , Genentech (Genetic Engineering Technology) 公司成立(by Robert Swanson and Herb Boyer) 。 1977 年 Boyer 等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子 14 肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这 14 肽 ( 见下图 ) ； 1978 年 Itakura（板仓）等使人生长激素 191 肽在大肠杆菌中表达成功； 1979 年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。

大肠杆菌大肠杆菌

生长激素释放抑制因子

重组体重组体

+

SSSS 基因基因 目的基因目的基因

基因载体基因载体

从动物脑中提取 5mg---50万只羊脑

9升工程大肠杆菌 培养液

3 、基因工程的迅速发展阶段 (1982~2000 ，动植物基因工程育种与基因治疗 )

发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。 1982 年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。

1983 年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。 1990 年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。 1991 年，美国提出人类基因组计划并实施。

4 、鼎盛发展阶段 (21世纪 )

2005 年完成人类基因组计划。 至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。 转基因植物迅速发展，目前至少有 150 种转基因植物问世。 自从 1986 年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来 , 至今国际上已有 30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验 , 涉及的植物种类达 50 多种。 自从 1994 年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有 51 种转基因植物上市。

据国际有关方面预测，到 20l0 年，全世界转基因食物的种植面积将增至 10000 万公顷。

虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。 荷兰的 GenPharm 公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是 50亿美元。

英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有 α

[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的 α[1]-抗胰蛋白酶做替代疗法， 价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售 6000

美元。

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得 5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

第三节 基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容 主要包括：基础研究（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和应用研究等。1 、载体的研究 构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。2 、受体系统的研究 包括细菌、真菌、植物、动物。 受体系统的安全性及转化效率。3 、目的基因研究 目的基因的分离、克隆及改造。

4 、工具酶的研究 开发新的工具酶。5 、转化方法的研究 开发各种受体细胞的高效转化方法。6 、生物基因组学研究 具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。7 、应用研究 包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。

二、基因工程的基本操作程序 ① 分离获得带有目的基因的 DNA 片段及载体选择与构建。 ② 限制性核酸内切酶分别切割外源 DNA 和载体。 ③ 通过 DNA 连接酶将外源基因 DNA 片段连接到载体上，形成重组 DNA 分子。 ④将重组 DNA 分子引入到受体细胞 ( 转化 ) 。 ⑤带有重组体细胞 ( 转化体 ) 的扩增及选择培养。 ⑥转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 ⑦目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达 ( 基因功能研究或基因改造研究 ) 。

第四节 基因工程的意义与发展前景一、基因工程研究的意义 ① 大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子； ② 设计构建新物种 ( 新性状乃至全新物种 ) ； ③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源 ( 基因 ) 。二、基因工程发展前景 基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。

第二章 基因工程的工具酶 工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。

第一节 限制性核酸内切酶一、宿主的限制 -修饰现象 ( 见下图 )

限制作用 (restriction) ：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA ，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰作用 (modification) ：指寄主本身的 DNA ，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使 DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。物质和外来遗传物质的作用机制。

R/M 系统①DNA甲基化酶② 限制性核酸内切酶R/M 系统的作用① 限制作用②修饰作用

1953 年， Arber 发现限制 -修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在； 1970 年， H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个 II 型限制性核酸内切酶 Hind II 。 Nathans 首次用限制性酶切割 SV40DNA 。

根据限制 -修饰系统的遗传分析，大肠杆菌 K12有以下 4 种表型：

①rk+mk

+ ：野生型，具有完整的限制和修饰功能。

②rk-mk

+ ：限制缺陷型，不能降解外源 DNA ，但具

有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。

③rk-mk

- ：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无

修饰功能，也常用于基因工程的受体。

④rk+mk

- ：修饰缺陷型，缺乏修饰自身 DNA 的功能，

但具有限制功能，故也称为“自杀性表型” (suicide phe

notype) 。

二、限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶是指一类能识别双链 DNA 分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链 DNA 的核酸内切酶。 简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近 4000 种限制酶。 www.rebase.neb.com

特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型酶分子结构功能

辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例

异源三聚体限制与修饰

ATP Mg2+ SAM

非对称序列距识别序列 1kb

处随机性切割

无EcoK、 EcoB

同源三聚体限制Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近

特异切割广泛

EcoRI、 HindIII

…

异源二聚体限制与修饰

ATP Mg2+ SAM

非对称序列识别序列下游 24-26bp处

随机性切割小

EcoPI

三、限制性核酸内切酶的命名 1973 年 H.O.Smith 和 D.Nathams提出命名系统， 1980

年 Roberts 在此基础上进行了修改。。 ① 限制性核酸内切酶第一个字母 ( 大写，斜体 ) 代表该酶的宿主菌属名 (genus) 第一个字母；第二、三个字母 ( 小写，斜体 ) 代表宿主菌种名 (species)前两个字母。 ② 第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母 ( 小写，正体 ) 或染色体外成分 ( 质粒或噬菌体，大写，正体 ) 。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示 (正体 ) 。

Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌 d株 Hind Ⅱ Hind Ⅲ

四、 II 型限制性核酸内切酶的基本特性1 、 II 型限制性内切酶的识别序列 一般为 4～ 6bp 的回文序列。也有 6bp以上的，如 NotI ，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列 ( 间断回文序列 ) ，如 SfiI 。 有些 II 型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如 Hind II可识别 4 种核苷酸序列。

酶 识别序列 酶 识别序列BamH I G↓GATCC Pst I CTGCA ↓G

Bgl II A ↓GATCT Sal I G ↓TCGAC

EcoR I G ↓AATTC Sau3A I ↓GATC

Hind II GTPy ↓PuAC Sfi I GGCCNNNN ↓NGGCC

Hind III A ↓AGCTT Sma I CCC ↓GGG

Kpn I GGTAC ↓C Xba I T ↓CTAGA

Not I GC ↓GGCCGC Xho I C ↓TCGAG

2 、 II 型限制性核酸内切酶的切割方式 大多数 II 型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链 DNA ，水解磷酸二酯键中 3’位的酯键，产生 3’端为羟基、 5’端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：① 在识别序列的对称轴的 5’末端切割，产生 5’黏性末端， 如 EcoRI

② 在识别序列的对称轴的 3’端切割，则产生 3’黏性末端， 如 PstI

③ 在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如 PvuII

有些识别序列为间断型回文序列的 II 限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如： Bgl I GCCNNNN↓NGGC

Sfi I GGCCN NNNN↓NGGCC

Xmn I GAANN↓NNTTC

有极少数 II 型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序

列，如 Mbo II识别 GAAGA序列，切割位点则是：

5’－ GAAGANNNNNNNN↓ N－ 3’

3’－ CT TC TNNNNNNNN↓ N－ 5’

同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不

同的 II 限制性核酸内切酶。

如： HpaII 与 Msp I 的识别序列和切割位点都相同 (C↓C

GG) ，但 Msp I还可以识别已甲基化的序列 CmCGG ；

SmaI (CCC↓GGG) 和 Xma I (C↓CCGGG) ，识别序列相

同，但切割位点不同。

同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏

性末端的 II 限制性核酸内切酶。

如： BamHI (5’-G↓GATCC-3’ )

Bgl II (5’-A↓GATCT-3’)

3 、 II 型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能

如 EcoRI 限制性核酸内切酶与 EcoRI甲基化酶，两者

均识别 GAATTC序列，而前者能对 G↓AATTC序列进行切

割，后者的作用是使第二个 A甲基化。目前已经分离到许多

II 型限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。

4 、 II 型限制性核酸内切酶对单链 DNA 的切割

有一些 II 限制性核酸内切酶，除双链 DNA 外，还可以特

异识别并切割单链 DNA 的相应位点，只是切割效率比较低。

如 Hha I 能切割单链噬菌体 ФX174 和 M13mp18 DNA ，只

是切割单链 DNA比切割双链 DNA效率低 50％。

五、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途

①产生具有相同粘性末端的 DNA 片段，以便重组克隆；

② 建立 DNA 分子的限制酶图谱；

③ 构建基因文库；

④构建载体。

六、 II 型限制性核酸内切酶的酶切反应1 、标准酶解体系的建立 反应体积一般为 20μl(根据 DNA量可适当扩大 ) 。 ① 10× 酶切缓冲液 2μl( 大部分酶反应缓冲液基本相似： 5

0mmol/LTris-HCl pH7.0~7.5 、 0~100mmol/L NaCl 、 10mmol/

L MgCl2 、 1mmol/L DTT)

② 酶 (根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积 10％ ③DNA样品 (μ g~mg)

④无菌水 限制性核酸内切酶的一个活力单位 (U) 为：在合适的温度和缓冲液中，在 20 μ L反应体系中， 1h完全降解 1ug 标准 D

NA所需要的酶量。

2 、酶解反应 ①混匀 ② 酶解 (温度、时间 )

③ 酶解鉴定 ④终止 a 、加 EDTA至 10mmol/L ； b 、加 SDS至 0.1%(W/V) ； c 、 65℃水浴保温 20min(有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失活，如 Ace III 、 BelI 、 BstXI 、 Taq

I) ； d 、酚 /氯仿抽提酶，乙醇沉淀 DNA

3 、限制性核酸内切酶对 DNA 的不完全酶解 ( 见下图 )

不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。

incomplete

1 2 31+3

incomplete digestion

1

2

3

Sma Icomplete

1+2+3

4 、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶； ② 加入酶的体积应不超过总体积的 10% ，否则酶液中的甘油浓度超过 5%时将会抑制酶的活性； ③整个操作应在 0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶； ④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水； ⑤当切割大量 DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量； ⑥当 DNA需 2 种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用 1 种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。

七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素 1 、酶的纯度； 要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。 2 、 DNA样品的纯度； DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA 、 S

DS 、高 NaCl 等，都能抑制酶活性。 样品中 DNase会降解 D

NA ，影响酶切。3 、酶切反应的温度、时间； 多数 II 型限制酶最适反应温度是 37℃，但 SmaI 为 25℃

或 30℃， SfiI 为 50℃， TaqI 为 65℃ 。 反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。

4 、 DNA 的甲基化程度； 限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。 这一特性有特殊用途：①改变某些限制性核酸内切酶的识别序列；②产生新的限制酶识别序列；③保护限制性核酸内切酶的切点；④利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细胞 DNA位点专一性甲基化的程度和分布。 大肠杆菌中的 DNA腺嘌呤甲基化酶 (dam) 在 5’GATC3’序列中的腺嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I 、 MboI

等，但 BamHI 、 Bgl II 、 Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的 DNA 胞嘧啶甲基化酶 (dcm) 在 5’CCAGG3’

或 5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影响的酶有 EcoRII 等，但 Bgl I 、 KpnI不受影响。 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒 DNA ，可防止DNA 的甲基化。

5 、 DNA 分子的构型 限制性内切酶对不同构型 DNA 分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋 DNA 酶解所需要的酶量，比线性 DNA 酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达 20倍。 有些限制性核酸内切酶对于同一 DNA 分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。例如， EcoR I 、 Hind III对λDNA 的酶切。6 、反应缓冲液 主要成分： pH (Tris-HCl) 、离子强度 (NaCl) 、 Mg2+ ； 辅助成分： β-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)防止酶氧化； 牛血清蛋白 (BSA) 组分 V对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。 例如 EcoRI 在高 pH(＞ 8) 、低盐 (50mmol/L) 和高浓度甘油 (＞ 5％ )存在的情况下，其识别序列由 GAATTC 改变为 NAATTN 。以 EcoRI 表示其星号活性。 引起星号活性的原因有：①高甘油含量，大于 5% ；②酶用量过大，大于 100U/微克 DNA ；③低离子强度，小于 2

5mmol/L ； ④高 pH ，大于 8.0 ；⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Zn2+

等非Mg2+ 的二价阳离子的存在。 常发生星活性的内切酶有： EcoRI 、 HindⅢ、 KpnI 、PstI 、 SalI 、 HinfI 等。

第二节 DNA 连接酶 1967 年几个实验室几乎同时发现 DNA 连接酶。一、定义与反应机理 DNA 连接酶是指能催化双链 DNA 分子内或分子间的 5’-

磷酸基和 3’-羟基生成磷酸二酯键而使 DNA链连接的一类酶。

大肠杆菌和其他细菌： NAD+

动物细胞和噬菌体： ATP

T4 DNA 连接酶连接 DNA/RNA杂合分子中 DNA链的切口

DNA 连接酶无连接

DNA 连接酶的作用机理

二、 DNA 连接酶的种类1 、 T4 噬菌体 DNA 连接酶 (T4 DNA 连接酶 )

T4 DNA 连接酶

DNA/RNA

RNA

平头末端的 Km比黏性末端的 Km高约 1000倍。提高平头末端连接效率的方法：①加大酶浓度 (10~100倍于粘性末端 ) ； ②加大底物浓度； ③加入适量的一价阳离子 (150-200 mmol/L NaCl) ； ④加入低浓度的 PEG(10%PEG10%PEG80008000) 。 ATP 的最适终浓度为 0.5 mmol/

L 。

2 、大肠杆菌 DNA 连接酶 E.coli DNA 连接酶

DNA/RNA

E.coli DNA 连接酶 无连接

3 、 T4噬菌体 RNA 连接酶

用途： RNA末端标记

pNp NNNN

T4 RNA 连接酶

三、 DNA 连接酶的反应体系 DNA 连接酶的活性单位较通用的是韦氏 (Weiss)单位，一个韦氏单位是指在 37℃， 20 min 内催化从 γ,β-32P-ATP 的焦磷酸根置换出 1nmol32P所需要的酶量。 M-L单位：以 d(A-T)n 作为底物 黏性末端连接单位：以 λDNA/Hind III 片段为底物 一个韦氏单位相当于 0.2个M-L单位或者 60个黏性末端连接单位。 反应体系： 10μL 或 20μL ， DNA 片段，连接酶， Buffer ，温度 (12~16℃或 <30 )℃ ，时间 (4~16h)

Buffer ： 50mmol/LTris-HCl pH7.6 ， 10mmol/L MgCl2 ，

0.5mmol/L ATP ， 5mmol/L DTT

四、影响连接反应的因素1 、 DNA末端的浓度 连接产物的分子构型 (线形或环状 ) 与 DNA浓度及 DNA 分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子 DNA 片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的 DNA 分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段 : 载体片段 =2:1 。2 、反应温度 介于最适温度与其 Tm 之间。＞ 30℃会导致 T4 DNA 连接酶的不稳定。 3 、 ATP浓度 ATP最适的终浓度为 0.5mmol/L ，浓度过高会抑制连接。

第三节 DNA聚合酶 DNA聚合酶分为：①依赖于 DNA 的 DNA聚合酶；②依赖于 RNA 的 DNA聚合酶。 常用的 DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA聚合酶 I 、 Klenow 片段酶、 T4噬菌体 DNA聚合酶、 T7噬 DNA聚合酶、 Taq DNA聚合酶、逆转录酶。

酶 聚合反应速度

5’→3’ 外切酶活性

3’→5’ 外切酶活性

持续合成能力

E.Coli DNA聚合酶 I 中速 有 低 低Klenow 酶 中速 无 低 低

T4DNA聚合酶 中速 无 高 低T7 DNA聚合酶 快速 无 高 高

修饰 T7 DNA聚合酶 快速 无 低或无 高Taq DNA聚合酶 快速 有 无 高逆转录酶 低速 无 无 中

一、大肠杆菌 DNA聚合酶 I

5’→3’聚合酶活性

5’→3’ 外切酶活性：双链 DNA带磷酸基团的 5’端或 DNA/RNA杂合分子中的 RNA5’端3’→5’ 外切酶活性

切口平移作用

DNA Pol I

主要用途：切口平移法制备 DNA探针 反应体系：在 25μl反应体系中含有 1 μg纯化的特定 DN

A 片断，并加入适量的 DNaseＩ、 PolＩ、 α-32p-dNTPs 和未标记的 dNTPs 。

DNaseI ， Mg2+

Pol I ， α-32p-dCTP ， dNTPs

二、 Klenow 片段 KlenowKlenow 酶具有酶具有 5’→3’ 5’→3’ 聚合酶活性和聚合酶活性和 3’→5’ 3’→5’ 外切酶活性，外切酶活性，

缺失缺失 5`→ 3`5`→ 3` 核酸外切酶活性。其主要用途如下：核酸外切酶活性。其主要用途如下：

① ①补平限制性核酸内切酶产生的补平限制性核酸内切酶产生的 5’5’黏性末端；黏性末端；

② 标记 3’凹陷末端的 DNA 分子或平末端； DNA末端标记一般标记活性不高，极少用于分子杂交探针的标记，主要用于 DNA序列测定等所需片段的标记。

③ 合成 cDNA 第二链；④双脱氧末端终止法测定 DNA序列；⑤在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外突变。

聚合酶Klenow DNA [ -32P]dNTPα

双链 DNA

粘端5'-

Ⅲ外切酶

变性

+

5'3'

3'5'

3'

5'

3'

5'

3'

3'

5'

5'

5'

5'3'

3'

标记探针

标记末端

平末端标记

三、 T4噬菌体 DNA聚合酶 具有 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’ 外切酶活性，缺少 5’→3’

外切酶活性。其 3’→5’ 外切酶活性比 Klenow 酶高 100~1000倍。 在无 dNTP时，可以从任何 3`-OH端外切 (即可降解 dsDN

A ，只是其活性比 ssDNA低很多 ) ，在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸，在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。

T4 DNA聚合酶的置换合成作用

无 dNTP时， T4 DNA聚合酶

有 dNTP时， T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶的用途：

① 切平核酸内切酶产生的 3’黏性末端

②末端标记。特别是不需要核酸外切酶帮助就可进行平末端标记，这种探针标记方法称为置换 (取代 ) 合成法。 置换合成法将产生一组末端完全标记、而从末端到中点其标记量递减的分子。

四、 T7噬菌体 DNA聚合酶与测序酶 T7 DNA聚合酶具有 5`→3`聚合酶活性及很强的单链、双链 DNA 的 3`→5` 外切酶活性，但无 5`→3` 外切酶活性。其最大特点是有最强的持续合成能力。其用途如下： ① 用于长模板 (M13 DNA) 的引物延伸； (不受 DNA 二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸 )

② 通过延伸或取代合成法标记 DNA3’末端； ③ 将双链 DNA 的 5’ 或 3’ 突出末端转变成平末端的结构。 对天然的 T7 DNA聚合酶进行修饰，使之降低或完全失去3’→5’ 的外切酶活性，而聚合酶活性增加了 3倍。因此，修饰的 T7 DNA聚合酶主要用于双脱氧测序，又称作为测序酶。此外，还用于末端标记、探针制备 (可催化较低水平 <0.1 μmol/L

的 dNTP 参入 ) 、体外诱变中 DNA链的合成。

五、 Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶具有 5’→3’聚合酶活性和 5’→3’ 外切

酶活性，缺少 3’→5’外切酶活性。其最大特点是热稳定 (95

℃以上高温半小时不失活 ) ，最适反应温度高 (70 75 )℃ 。

因此，其主要用途是 PCR及 DNA测序 ( 具有二级结构的 D

NA) 。

保真的 PCR 酶有 Tma DNA聚合酶 (Thermotoa maritim

a 海栖热袍菌 ) 、 Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis

海栖热球菌 ) 、 Pfu DNA聚合酶 (Pyrococcus furiosus 激烈

火球菌 ) 、 Pwo DNA聚合酶 (Pyrococcus woesi 沃氏火球

菌 ) 。

六、逆转录酶 ①5’→3’聚合酶活性。逆转录酶能以 RNA 或 DNA 为模板合成 DNA 分子，但是后者的合成很慢；

②RNA 酶 H活性。能从 5’ 或 3’ 方向特异地降解 DNA/

RNA杂交分子中的 RNA链。

商品化的逆转录酶主要是鸟类骨髓母细胞瘤病毒 (avian

myeloblastosis virus ， AMV)逆转录酶和 Moloney鼠白血病病毒 (Moloney murine leukemia virus ， Mo-MLV) 逆转录酶。

其用途有：

① 合成 cDNA 第一链，构建 cDNA文库；

②RT-PCR ；

③以 RNA 为模板制备 DNA探针；

④补平和标记 5’-末端突出的 DNA 片段；

⑤代替 Klenow 酶用于 DNA序列分析。

第四节 修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶 (末端转移酶 )

末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化 DNA 的聚合作用，但不需要模板，将脱氧核糖核苷酸加到 DNA 分子的3’-OH末端。

AAAAAA

Mg2+ dATP

末端转移酶效率高

Co2+ dATP

末端转移酶

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAAA

效率低

用途：①给载体和外源 DNA (如 cDNA 或随机切割 DNA) 接上同聚物尾，以便连接；

②末端标记

二、核酸酶核糖核酸酶 (RNase) ：水解 RNA

脱氧核糖核酸酶 (DNase) ：水解 DNA

核酸酶 (nuclease) ：水解 RNA 和 DNA

( 一 ) 核糖核酸酶1 、核糖核酸酶 A (RNase A)

RNase A 是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3’端磷酸酯键。其反应条件极宽，且极难失活。在低盐浓度 (0~100mmol/L NaCl) 下， RNase A 切割单链和双链 RNA 、 DNA/RNA 中的 RNA ；当 NaCl浓度为 300

mmol/L 或更高时， RNase A就特异性切割单链 RNA 。

RNase A 的用途 :

①确定 RNA 或 DNA 中的单碱基突变的位置； ② 核糖核酸酶保护分析法检测特定 RNA( 特异降解单链RNA ，对杂交双链 RNA不起作用 ) ，其灵敏度比核酸酶 S1

保护分析法高数倍； ③ 转录起始点及内含子剪接位点的分析 ④降解 DNA样品中的 RNA 分子。2 、核糖核酸酶 T1

RNase T1 也是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击 RNA

上鸟嘌呤残基的 3’端磷酸酯键。其催化活性与用途类似于 R

Nase A 。

3 、核糖核酸酶 H

RNase H 特异地降解 DNA/RNA杂交双链中的 RNA链，产生具有 3’-OH 和 5’-磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，不能降解单链或双链的 DNA 或 RNA 。 其用途是产生 cDNA 第二链合成的引物。

RNase H

Pol I dNTP

Pol I dNTP

DNA 连接酶

( 二 ) 脱氧核糖核酸酶 I

DNase I 是一种内切脱氧核糖核酸酶，可从嘧啶核苷酸5’-端磷酸随机降解单链或双链 DNA ，生成具有 5’-磷酸末端的寡核苷酸。

Mg2+

Mn2+

用途：①产生大肠杆菌 DNA聚合酶 I 切口平移的切口； ② 在 Mn2+存在下，产生构建 基因组文库的大片段 DNA ； ③DNasel足迹法测定 DNA 结合蛋白在 DNA 上的精确结合位点； ④ 除去 RNA样品中的 DNA 。

( 三 ) S1 核酸酶作用特点： ①需要 Zn2+ 和酸性条件 (pH4.0~4.5) ； ②降解单链 DNA 或 RNA ，但降解 DNA 的速度大于降解 RNA 的速度 (7倍 ) ； ③降解方式为内切和外切，内切为主； ④酶量过大时也可降解双链核酸，为单链的 1/75 000 。用途： ① 切掉 DNA 片段的单链突出末端产生平头末端； ② 在双链 cDNA 合成时切除发夹环结构； ③S1 核酸酶作图分析。 如内含子的数目、大小、位置分析及转录起始位点与终止位点分析等。

内含子数量及大小的分析DNA

mRNA

分子杂交

RE RE

S1 核酸酶

变性凝胶电泳

M A B

M ：分子量Marker

A ：未经 S1 酶处理

B ：经 S1 酶处理

但不能定位内含子

转录起始点的定位分析

RE RERE 酶切

碱性磷酸酯酶多核苷酸激酶

**

变性后与 mRNA杂交

*

S1 核酸酶

*变性凝胶电泳

M A B

三、核酸外切酶 核酸外切酶 (exonuclease) 是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。

单链核酸外切酶： E.coli exo Ⅰ、 exoⅦ双链核酸外切酶： exoⅢ

单双链核酸外切酶： Bal 31 核酸酶1 、大肠杆菌核酸外切酶 VII

3’→5’ 外切酶活性 5’→3’ 外切酶活性用途 :①抹平 DNA末端；②回收 dA/dT 接尾克隆的 cDNA 。

2 、大肠杆菌核酸外切酶 III 3’→5’外切酶活性

Exo III Mg2+

核酸外切酶活性

PP

Exo III Mg2+

3’磷酸酶活性

Exo III Mg2+

ssDNA

无反应

无嘌呤或无嘧啶位点Exo III Mg2+

核酸内切酶活性

RNA/DNA

构建单向缺失突变体库3’ 突出黏性末端5’ 突出黏性末端

Exo III

S1 核酸酶

克隆

单向缺失突变体克隆

3 、 Bal 31 核酸酶 Bal 31 核酸酶主要为 3’ 外切酶活性，同时伴有 5’ 外切及较弱的内切活性，需要 Mg2+ 和 Ca2+ 。 ①对于单链 DNA ，具有特异的内切酶活性，可从 3’-OH末端迅速降解 DNA ，而 5’端切割速率较慢； ②对于双链 DNA ，具有 3’→5’ 外切酶活性和 5’→3’ 外切酶活性，以 3’ 外切酶活性迅速降解一条链，随后在互补链上进行缓慢的 5’端内切反应，产物大部分为 5’端突出 5个碱基的双链分子 (80

%~90%) ，少量为带平头末端的双链分子 (10%~20%) 。对双链 R

NA 分子也能发生类似反应； ③当共价闭合环型双链 DNA 上出现单链缺口时，通过其内切酶活性，将其切开成线性双链 DNA ，并按上述方式进一步降解。 用途：与 Exo III 相同，构建双向缺失突变体库，分析大片段DNA 。

四、 T4噬菌体多核苷酸激酶 催化 ATP 的 γ-磷酸基团转移到单链或双链的 DNA 或 R

NA 的 5’-OH末端。

催化速度：双链 >单链 > 双链切口或缺口； 5’ 突出末端 > 平末端 >5’凹陷末端。

T4 多核苷酸激酶的激酶活性 (正向反应 )

交换反应 (过量 ADP存在时 )

T4 多核苷酸激酶的 3’磷酸酶活性 PP

P

P

PP P

N

p

P

N

P

OH

N

p

OH

N

OH

OH

T4 多核苷酸激酶

Mg2+ pH6.0

T4 多核苷酸激酶的用途

①DNA 的 5’末端标记 (如 DNA 的化学测序 ) ；

② 使 DNA5’末端磷酸化，以便连接 (如衔接头的克隆方式 ) 。

+

五、碱性磷酸酶 催化核酸分子的脱磷作用，使 DNA 或 RNA 或核苷酸的5’磷酸变为 5’-OH末端。 细菌碱性磷酸酶 (BAP) 、小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)

CIP 的活性比 BAP高 10~20倍，反应后易失活 (68 10m℃

in)

碱性磷酸酶的用途①5’末端标记前的处理 ；②去除载体片段的 5’磷酸基因，防止载体自身连接。

基因工程中常用的工具酶工 具 酶 功 能

限制性核酸内切酶 特异切割 DNA ，产生具有特定末端的 DNA 片段DNA 连接酶 DNA 片段间连接，产生重组 DNA 分子

DNA聚合酶Ⅰ①合成双链 cDNA 分子②切口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补 3´末端

Klenow 片段 cDNA 第二链合成，双链 DNA 3末端标记等Taq DNA聚合酶 PCR

反转录酶①合成 cDNA②替代 DNA聚合酶 I 进行填补，标记或 DNA序列分析

多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5´羟基末端磷酸化，或末端标记碱性磷酸酶 防止载体自身连接末端转移酶 同聚物加尾连接