第 15 章分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis

第 15 章

分子发光分析法分子发光分析法

Molecular Luminescence Molecular Luminescence AnalysisAnalysis

第 15 章分子发光分析法（ Molecular Luminescence Analysis ）

分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态返回基态时发射光谱

M+ 能量→ M ＊ → M+ 热量 →M+ h ′+ 热量光子 —— 光致发光 M+ h →M ＊

阴极射线—— 阴极射线发光荧光磷光 X 射线—— X 射线发光 F P 热—— 白炽发光寿命 10-7—10-9s 10-3—10s超声波—— 声纳发光离子流—— 离子发光化学反应能——化学发光 M+ 化学能→ M ＊

第一次记录荧光现象 1575 西班牙内科医生、植物学家

荧光是光发射概念、引入荧光术语 1852 Stokes 观察奎宁、叶绿素

提出用荧光作为分折手段 1864 Stokes

第一个实际应用、铝一桑色素荧光测 1867 1965 以来 , 荧光光谱兴趣激增，生物化学

家利用它的高灵敏度。二十世纪七十年代后期，引起国内学者注意



15-1 光致发光及影响荧光发射因素15-2 荧光分析法15-3 磷光分析法15-4 化学发光分析法15-5 光化学传感器

荧光涉及吸收和发射两个过程 1 、激发态基态激发态分立轨道上 ﹡ ↑ ↑ ↓ 非成对电子平行自旋更 n ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ 稳定 ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ →﹡ n→﹡

净电子自旋 S=0 S=0 S=1

分子重态 M=2S+1=1 （跃迁几率很小） M=2S+1=3

单重基态 S0 激发单重态 S 激发三重态 T

电子从 S0 到 S 分子能量相应增加改变了分子对称性、分子净的电子自旋（多重性）可能改变

第 15 章分子发光分析法

15-1 光致发光及影响荧光发射因素

2 、去活化过程

溶液中： 10-14-10-12 s 10-13-10-11 s 10-2-10-6 s

振动弛豫内部转换体系间的跨越（发生在相同多重度间）（发生在不同多重度间） S2 S1 T1( ＜ S1) T2

10-15 s A1 A2 F P 磷光发射 10-2-10 s

基态 S0

荧光发射外部转换 10-7-10-9 s 发生在不同电子能态间（熄灭）

第 15 章分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素

2 、去活化过程

注意点 (1) 气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能(2) 实现内部转换 a. S1 ， S2 电子能级差小、易实现。 b. S1 ， S2 振动能级的位能面有交叉(3) 体系间跨越的必要条件电子自旋与磁场微扰耦合 a. S1 、 T1 位能面在某处有容易达到的能量相交激发态电子自旋反转， b. 微观磁场的微扰存在分子多重态变化产生 Br-,I-,CH3I…重原子分子 ●带电粒子的极性分子或可极化分子易产生磁效应或离子外层电子云疏松 ●顺磁性分子 O2…外层 3d5五个电子不成对内 (4) 外部转换使发光熄灭现象重原子效应 T1 →S0 比 S1 → S0 可能性更大外（溶

剂）(5) 去活化众多过程中，以速度最快、激发寿命最短的途径占优势，

相互竞争。



３、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型 (1) 从寿命 ● 瞬时荧光～ 10-8s 内发射分析中有意义 ! S1→ S0+ hν

S1+S0 (S1 S0) ﹡→2S0+ hν

受激准分子 ● 迟滞荧光波长同瞬时荧光，寿命与磷光相似刚性、粘稠介质中 E 型 T1+ 活化能 → S1→ S0+ hν

P 型 T1 + T1 → S1 + S0 三重态——三重态粒子湮没 S0+ hν 寿命为相随磷光寿命的 1/2

复合 ( 重组） A()+ hν 1 → A﹡(↑↓) + hν 2 → A .+(↑

) +e 重组↓ +e A()+ hν 3 ← A﹡(↑

↓ )

３、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型

(2) 激发光与荧光波长比较 ●Stokes荧光（溶液中） λ 荧＞ λ 激可能

●Antistokes荧光（高温稀薄气体中） λ 荧＜ λ 激 ●共振荧光（气体、晶体中） λ 荧=λ 激

(3) 荧光波长 ● X 光荧光 ● 紫外、可见荧光 ● 红外荧光


３、荧光的一些基本问题

b. 分子被激发时的散射问题激发光的能量太低、不足以外层电子跃迁到 S1 但仍可将电子激发至基态的高振动能级上受激后能量无损失 , 受激发后有能量改瞬间 (10-12) 返回原变 , 返回原来稍高能级或稍低能级上在不同方向上发射与原激不同方向伴随的波长发光相同波长λ1 的辐射发射为 λ1± Δλ 瑞利散射拉曼散射特征：散射强度 ∝ 1/λ4 （拉 )强度﹤ ﹤ (瑞 )强度 (﹤ IF/1000) 散射光波长＝激发光波长拉曼带波长随激发光波长而变 ν 拉 - νF = Δν 为定值反映了分子结构特性



c. 激发光谱和荧光光谱 (1) 激发光谱 (2) 荧光光谱

注意：１、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异 ,其真实光谱必须要对其光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正

２、真实的激发光谱与吸收光谱非常近似，而不是相同


３、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱

(3) 溶液荧光光谱的特征 ●斯托克斯位移（ λ 荧＞ λ 激）原因溶剂化效应 hν hν′

非辐射损失●荧光光谱与激发光波长无关系原因 ●荧光光谱与激发光谱成镜像对称关系光谱形状决定于 S1,S2的振动能级分布相似


３、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱

(4) 三维荧光光谱（总发光光谱、激发－发射矩阵、等高线光谱）给出三维信息



d. 荧光物质的两个重要参数 (1) 荧光分子的平均寿命 τ 各种单分子的非辐射去 τ= 1 / ( kf +∑K ) 活化过速率常数之总和荧光发射速率常数内在寿命 τ0 （即∑ K 时的 τ ） τ0 = 1 / kf 荧光强度衰变速率方程 It = I0 e - t / τ

或㏑ It = ㏑ I0 - t / τ


３、荧光的一些基本问题 d. 荧光物质的两个重要参数

(2) 荧光的量子产率 φf

定义：发射荧光的光子数／吸收辐射的光子数 φf = kf / ( kf +∑K )

φf (0.1～ 1)有使用价值注意： a. 荧光的能量产率 φeq= 荧光发射时的能量／吸收的能量 φeq﹤1

( 红移 )

b. 荧光的量子效率 ηf = 处于发射荧光的激发电子态的分子的百分率

c. φf, φeq, ηf 三个概念不同


4 、荧光、磷光的测量

一般荧光分光光度计与紫外可见区吸光光度计异同

单束 (５％光用于校正 )


⊥


荧光分光光度计


｛｝


a. 激光荧光光度计 1975 Harrington 研制

输出、反射

染料池

样品池光栅



b. 电视荧光计使用多色仪 Johnson设计入射口狭缝∥样品池长轴

波长复盖 240nm 氙灯无出射口狭缝

空间分辨 1 nm 入射口狭缝⊥样品池长轴

时间分辨 14.7 ms 无出射口狭缝摄像管


5 、影响荧光发射因素

a. 强荧光物质的结构特点（１） →﹡ 比 n→﹡ 有利 φf ↑

（２）共轭体系 φf ↑

（３）刚性平面结构 φf ↑

（４）取代基影响 ◆ 给电子基团 φf ↑

◆ 吸电子基团 φf↓(φp ↑)

◆ 取代基位置:邻、对 φf ↑

◆重原子取代基 φf ↓( φp ↑)


5 、影响荧光发射因素

b. 溶液环境因素（１）溶剂 ◆ 取决于荧光体和溶剂的化学结构 ( 溶剂～荧光物成化合物 ,荧光分子电离状态改

变 ) λf.max φf 都有影响

◆重原子溶剂存在时 φf↓(φp ↑) 外重原子效应（２）温度 T ↑ φf↓

（３） pH 平衡解离关系存在 λf.max φf 均有影响


6 、溶液荧光的猝灭

定义：荧光分子与其它分子相互作用，改使荧光强度下降。

猝灭过程实质题与发光过程相互竞争、缩短发光分子激发态寿命的过程，具体形式机理各不相同。

自学讲义内容


1 、常规方法 a. 直接法 b. 间接法与荧光试剂发生反应定量关系 If = 2.3 φf I0εb c （ εb c ＜ 0.05 时） If = k c （ I0 、 b 不变）

定量校正方法外标法增量法 2 、荧光猝灭法 F-会使 8-羟基喹啉—铝配合物荧光强度↓ , 测 F-


15-2 荧光分析法

3 、动力学荧光分析法反应物或产物中的荧光物质浓度变化，测荧光随时间变化求含量方法？

Fe (Ⅲ) + H+ + A → Fe (Ⅱ) + B

dB/dt = η [A] · [Fe (Ⅲ) ] ·[H+ ]

当 pH 一定 , [A]足够大 , 反应初期 , 积分 [B] = η′ [Fe (Ⅲ) ] · t 又 I f·B = K· [B]

则 I f·B = η′′ [Fe (Ⅲ) ] · t

或 I f·B / t = η′′ [Fe (Ⅲ) ]

Y = a x

第 15 章分子发光分析法 15-2 荧光分析法

４、荧光滴定法鲁米诺指示剂 H+ 时 UV下兰荧光 OH- 时 UV下无荧光５、胶束增敏荧光分析荧光试剂配合反应优点：a. 光学透明、稳定 b. 光化学上是非活性的 c. 价廉、使用方便 d. 对荧光测量有增溶、增敏、增稳的独特性质


A 、 B 混合物在测量条件下，荧光光谱相互重叠时，如何测量 A 、 B 两物质？

信息处理及仪器技术 6 、双波长法（三波长法） 7、导数荧光法

8 、同步荧光光谱技术（同时利用吸收和发射两个过程）

** 固定波长固定波长例 :丁省乙醇溶液 λ 荧-λ 激= 常数 =Δλ 如何决定！ Stoks 位移值


简化光谱、窄化谱峰

8 、同步荧光光谱技术

**固定能量 (1/λ 激-1/λ 荧) ·107 = Δν = 常数例: 芳环 1400 cm-1 振动带间隔

***可变角两者起始波长不同、扫描速率不同保持同一比例 ---线性

测 c 某一函数 ---非线性干扰 A

免避散光提高重叠体系分辨率

激发波长

干扰 B 发射波长


9 、时间分辨荧光技术

（利用寿命信息）排除干扰

应用 a. 荧光探针技术 b. 单分子测量技术


1. 磷光与荧光的不同点表现在 a. 峰值波长 λP＞ λF

b. τ p ＞ τF

c. τ p , I p 受重原子、顺磁性分子、离子存在增强、敏感 τF , IF 反之 2. 磷光测量方法 a.与荧光测量类同不同点：固体样发射磷光、伴随发射荧光 b. 如何解决磷光同光源散射磷光同荧光分离开来如旋转简磷光计


15-3 磷光分析法

2. 磷光测量方法

第 15 章分子发光分析法 15-2 磷光分析法

3.常规（低温）磷光法 a. 为什么要低温测量？减少非辐射跃迁对磷光发射影响 b. 如何实现低温测量？液氮 77°K EPA 明净玻璃态 c. 定量关系式（醚 5：异戌烷 5 ：：乙醇 2 ）

Ip = 2.3 φpI0εb c = Kpc

磷光的量子产率 φp： KST .. . KP .

KST +KF +ΣKi KP + ΣKj

与 S1 态有关的非辐射跃速率（除 KST外）与 T1 态有关的非辐射跃迁速率 d. 重原子效应的利用灵敏度 ↑ 选择性 ↑


4. 室温磷光法 a.为什么要引入室温磷光法 ? 常温法缺点：低温装置复杂溶剂选择操作难 b.室温法要解决主要矛盾？克服室温下 T→ S0 的非辐射跃迁↑ 使 IP↓

途径固体表面室温磷光胶束稳定的溶液室温磷光 1972 年 1980 年固体载体


5.敏化溶液室温磷光法一种间接的磷光分析法 SD1 TD1 TA1

激发 IP

SD0 S A0

能量供给体 D 能量受体 A 被测物 cx 无磷光或弱磷光发磷光 IP

IP =Kcx

关键：选择能量受体 A * D 在激发时 A 的 ε A 要小 * TD1 ＞ TA1

* A 在所测溶剂中 φpA 要大 A ： 1 ， 4—二溴荼

6. 磷光分析应用多环芳烃农药生物碱毒品药物生物分子


1. 原理 R → P* → P+ hν

或 R → P*+A →A* → A+ hν

注意 : hν 是荧光磷光

2. 实现化学发光条件 a. 提供足够的反应焓的能量，基态 S0 →S1

氧化反应裂解反应 170-300 KJ/mol

b. 要有化学反应历程，反应能至少使一种物质分子吸收至 S1

气相化学发光反应液相化学发光反应 c. S1 能发射 hν

第十五章分子发光分析法

15-4 化学发光分析

3 、化学发光效率发光分子数化学发光总量子产率 φCL = ------------------ = φCE · φEM

参加反应分子数化学激发效率激发态分子发光效率

4 、定量关系 ∫ICL （ t ） d t = φCL · c

y = a x 5 、应用环境监测

第十五章分子发光分析法 15-4 化学发光分析

光化学传感器技术光谱化学和光学波导与测量技术

第十五章分子发光分析法

15-5 光化学传感器

1. 光学波导

数值孔径波导的损耗与色散

第十五章分子发光分析法 15-5 光化学传感器

2. 测量技术

消失波 dp有效深度 (1/e)


3. 分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）


分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）


《《分子发光分析法分子发光分析法》》结束结束

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第 15 章分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis

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