第 10 章 吸光光度法10.1 概述10.2 吸光光度法基本原理10.3 分光光度计10.4 显色反应及影响因素10.5 光度分析法的设计10.6 吸光光度法的误差10.7 常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的应用

吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法

基于外层电子跃迁

10.1 概述

吸收光谱 发射光谱 散射光谱

分子光谱

原子光谱

10.2 吸光光度法基本原理1 吸收光谱产生的原因 光 : 一种电磁波 , 波粒二象性 光谱名称 波长范围

X 射线 0.1~10nm

远紫外光 10~200nm

近紫外光 200~400nm

可见光 400~750nm

近红外光 0.75~2.5um

中红外光 2.5~5.0um

远红外光 5.0~1000um

微波 0.1~100cm

无线电波 1 ～ 1000m

当光子的能量与分子的 E 匹配时，就会吸收光子

E=h=hc/

a 跃迁类型 价电子跃迁： σ→σ*, π→π*; n→σ*, n→π*

E (h) 顺序 : n→π*<π→π*< n→σ*<σ→σ*

有机化合物的生色原理

b 生色团和助色团

生色团 : 含有 π→π* 跃迁的不饱和基团 助色团 : 含非键电子的杂原子基团 , 如 -NH2, -OH, -CH3

… 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强

物质的颜色吸收光

颜色 波长范围 ( ,nm)

黄绿黄橙红

紫红紫蓝

绿蓝蓝绿

紫蓝

绿蓝蓝绿

绿黄绿

黄橙红

400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-750

2 物质颜色和其吸收光关系

互补色

吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小

A ～关关最大吸收波长 max ：光吸收最大处的波长

3 一些基本名词和概念

max

对比度 (Δ): 络合物最大吸收波长 (MR

max) 与试剂最大吸收波 (R

max) 之差

Δ

原子光谱为线光谱

分子光谱为带光谱

电子跃迁能级

分子振动能级

分子转动能级

4 朗伯 - 比尔定律

光吸收定律－朗伯 - 比尔 (Lambert-Beer) 定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律

I0 = Ir + It + Ia

I0 = It + Ia

I0

Ir

It

Ia

T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It ) ＝ lg(1/T), A: 吸光度

朗伯定律（ 1760 年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（ 1852 年）：光吸收与溶液浓度成正比

当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律

－－－光吸收定律

数学表达： A ＝ lg(1/T)=Kbc

其中， A: 吸光度， T: 透射比， K: 比例常数， b: 溶液厚度， c: 溶液浓度

注意： 平行单色光 均相介质 无发射、散射或光化学反应

摩尔吸光系数

灵敏度表示方法

A = bc

A = bcc: mol/L

表示物质的浓度为 1mol/L, 液层厚度为 1cm 时溶液的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)

c: g/LA = abc a: 吸光系数

桑德尔 (Sandell) 灵敏度： S

当仪器检测吸光度为 0.001 时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。

单位： g/cm2

S=M/

氯磺酚 S 测定钢中的铌 50ml 容量瓶中有 Nb30μg ，用 2cm 比色池，在 650nm 测定光吸收， A ＝ 0.43, 求 S. (Nb 原子量 92.91) 。有两种做法：根据 A=εbC, 求 ε

＝ 3.3×104 L·mol-1·cm-1

吸光度的加和性

A1 = 1bc1

A2 = 2bc2

A = 1bc1+ 2bc2

根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定

在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和

1 分光光度计的组成

光源 单色器 样品池 检测器读出系统

10.3 吸光光度计

常用光源

光源 波长范围 (nm) 适用于氢灯 185~375 紫外氘灯 185~400 紫外钨灯 320~2500 可见，近红外

卤钨灯 250~2000 紫外，可见，近红外氙灯 180~1000 紫外、可见（荧光）

能斯特灯 1000~3500 红外空心阴极灯 特有 原子光谱

激光光源 特有 各种谱学手段

单色器 作用 : 产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅

样品池（比色皿）

厚度 ( 光程 ): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm

材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区

检测器

作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列

光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用 625 － 1000nm 波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用 200 － 625nm波长

目视比色法—比色管

光电比色法—光电比色计 光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计

分光光度法与分光光度计 722 型分光光度计光学系统图

1. 光源； 2. 滤光片； 3,8聚光镜 4,7.狭缝； 5.准直镜； 6.光栅9. 比色池； 10. 光电管

10.4 显色反应及影响因素

要求：a. 选择性好b. 灵敏度高 (ε>104)c. 产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别 (>60nm)

没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－ 显色反应

1 显色反应

N N N N

SO3HHO3S

OH H O As32As

OO

OHM O

络合反应

氧化还原反应

2 显色反应类型

N N

Fe2+3

NH

HOOCCOOH

+ VO3- + H

+N N

COOHCOOHHOOCHOOC

+ VO2+

+ H O2

离子缔合反应

C

COOH

N N(C H )22 5 (C H )

22 5H

+O

-AuCl4.

成盐反应

(CH3)2

N

CHS

C O

C CH N

S(CH3)2

N

C

C O

C CH N

S

++ Ag AgS

褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂 III 络合物测定草酸

吸附显色反应 达旦黄测定 Mg(II),Mg(OH)2 吸附达旦黄呈红色

3 显色剂

无机显色剂 :

过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾

N N N N

SO3HHO3S

OH OHAsO H3 2 H O As32

有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂 III

三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S

O

CH3

COOH

HO

C

ClCl

SO3H

CH3

COOH

三苯甲烷碱性染料 结晶紫

C

N(CH3)2(H3C)2N

N(CH3)2

邻菲罗啉类：新亚铜灵

N N

CH3CH3

肟类：丁二肟

C C CH3

N N OHHO

CH3

4 多元络合物

混配化合物 Nb-5-Br-PADAP- 酒石酸 V-PAR-H2O

离子缔合物 AuCl4

-- 罗丹明 B

金属离子 - 配体 - 表面活性剂体系 Mo- 水杨基荧光酮 -CTMAB

5 影响因素

a 溶液酸度（ pH值及缓冲溶液） 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变 Δ

影响待测离子的存在状态，防止沉淀 影响络合物组成

形式 pH λmax(nm) 形式 pH λmax(nm)

H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530

H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550

H2L- 8.4-9.0 512

HL2- 11.4-12.0 532-538

pH 对苯芴酮及其络合物的颜色影响

b 显色剂的用量

稍过量，处于平台区

c 显色反应时间

针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定

d 显色反应温度

加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解

e 溶剂

f 干扰离子

有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率

消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 褪色空白 (铬天菁 S 测 Al ，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰 ) 选择适当波长

10.5 光度分析法的设计

1. 选择显色反应2. 选择显色剂3. 优化显色反应条件4. 选择检测波长5. 选择合适的浓度6. 选择参比溶液7. 建立标准曲线

测量条件选择

1 测定波长选择

选择原则：“吸收最大，干扰最小”

灵敏度 选择性

2 测定浓度控制

控制浓度 吸光度 A ： 0.2 ～ 0.8

减少测量误差

3 参比溶液选择

仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰

试剂空白试样空白褪色空白

4 标准曲线制作

0 1 2 3 4 5 6 7 80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

A

concentration

理论基础：朗伯 - 比尔定律

相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度 A

A ～ c 作图

10.6 吸光光度法的误差

非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差

对朗伯 - 比尔定律的偏移

1 非单色光引起的偏移

复合光由 1 和 2 组成，对于浓度不同的溶液 a

和 b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。

非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测

吸光度增加，导致线性关系上弯

2 物理化学因素

离解、缔合、异构等如： Cr2O7

2-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO4

2-

PAR 的偶氮－醌腙式

化学反应

吸光度标尺刻度不均匀

3 吸光度测量的误差

A ＝ 0.434 ， T ＝ 36. 8% 时，测量的相对误差最小

A=0.2~0.8, T=15~65% ，相对误差 <4%

dc/c= dA/A=dT/TlnT

Er=dc/c×100％ = dA/A×100％ =dT/TlnT×100％

令 ST=0.01, 计算 T 不同值时的 Sc/c ，当 TlnT 对 T

进行微分时，其值为零时， Sc/c 最小，此时 T=0.368 。

1. 示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高 ( 低 ) 浓度组分 (i.e. A 在 0.2~0.8 以外 )

问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、

精密差示吸光度法特点： 以标准溶液作空白原理： A 相对 = A = bcx- bc0= b c

准确度：读数标尺扩展 , 相对误差减少 ,

c0愈接近 cx, 准确度提高愈显著

10.7 常用的吸光光度法

例：硫脲还原－硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，硫酸－高氯酸介质中，硫脲还原铁（ III ）为铁(II),除干扰，还原钼（ VI ）为五价， 2.00mg/100ml的钼标准溶液为参比溶液，用 2.00-2.30mg/100ml 的钼标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度 ,480nm 测定 A 。

2.双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理： A = A1-A2 = （ 1- 2 ） b c 波长对的选择： a. 等吸光度点法， b. 系数倍率法

3.导数吸光光度法

选 1 为参比波长 , 2 为测量波长

得 A1= x1bcx + y1bcy

A2= x2bcx+ y2bcy

ΔA=A2-A1= ( xλ2bcx+ y2bcy)-( x1bcx+ y1bcy)

在等吸光度的位置 (G, F), y2 ＝ y

1 ，则上式成为

ΔA=( x2- x

1 ） bcx

ΔA 与 cx 成正比 , 可用于测定

例 ,苯酚与 2,4,6-三氯苯酚 (y)混合物中苯酚 (x) 的双波长分光光度法测定。

3.导数吸光光度法

目的：提高分辨率 去除背景干扰 原理： dnA/dn ~

10.8 吸光光度法的应用

1 测定弱酸和弱碱的离解常数

AHB 和 AB- 分别为有机弱酸 HB 在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以 [HB] 或 [B-] 形式存在。

HB ＝ H+ + B- [H+][B-]Ka

=

[HB]

pKa=pH+ lg [HB][B-] A=AHB+AB-

pKa=pH+ lg AB- - AA- AHB

lg AB- - AA- AHB

对 pH 作图即可求得 pKa

2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）

制备一系列含钌 3.0×10-5 mol/L (固定不变 ) 和不同浓度（小于 12.0×10-5 mol/L ）的 PDT 溶液，按实验条件， 485nm 测定吸光度 , 作图。

PDT:Ru=2:1

等摩尔连续变化法

固定 [M]+[L],改变 [M],获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的 [M] 与 [L] 的比值，即获得M:L 比值。

Co(III) 与 3 ， 5 －二氯－ PADAT 的比值为 1:2

平衡移动法

固定 [M], 不断改变 [L] ，以 lg[MLn]/[M] 为纵坐标，lg[L] 为横坐标，作图，斜率 n即是络合物中 L:M的比值；纵轴上的截距 lgK是络合物的稳定常数。

lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M])

[MLn] K =

[M][L]n

lgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)

3 分析应用

痕量金属分析

临床分析

食品分析